Xây dựng phương pháp phát hiện một số chất kháng histamin h1 cấm sử dụng trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng lc msms khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
MỘT SỐ CHẤT KHÁNG HISTAMIN H1
CẤM SỬ DỤNG TRONG THỰC PHẨM
BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG LC-MS/MS
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2023


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN PHƯƠNG THẢO
Mã sinh viên: 1801645

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN
MỘT SỐ CHẤT KHÁNG HISTAMIN H1
CẤM SỬ DỤNG TRONG THỰC PHẨM
BẢO VỆ SỨC KHỎE BẰNG LC-MS/MS.
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Phạm Thị Thanh Hà
2. TS. Đào Thị Cẩm Minh
Nơi thực hiện:
1. Bộ mơn Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc

2. Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm
Quốc gia

HÀ NỘI -2023


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Phạm Thị
Thanh Hà và TS. Đào Thị Cẩm Minh đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho em
trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS. Vũ Ngân Bình cũng như các thầy, cơ giáo tại
Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc, các anh/chị tại Khoa Nghiên cứu phát triển –
Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, đặc biệt là Th.s Mạc Thị Thanh
Hoa, DS. Nguyễn Quang Hùng đã đồng hành và hỗ trợ em trong suốt quá trình thực hiện
đề tài này.
Em xin gửi lời cảm ơn đến ban lãnh đạo Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc Trường
Đại học Dược Hà Nội và Khoa Nghiên cứu phát triển – Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận.
Em xin được cảm ơn sự hỗ trợ kinh phí thu thập mẫu thực từ đề tài Khoa học và Công nghệ
trực thuộc Bộ Giáo dục và Đào tạo, mã số đề tài 104.04-2020.29 do TS. Đào Thị Cẩm Minh
chủ trì. Em xin cảm ơn Th.s Nguyễn Thị Mây và sinh viên Nguyễn Thị Thùy Linh đã hỗ
trợ trong quá trình thu thập các mẫu thực.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người luôn bên cạnh ủng hộ
và động viên em trong suốt q trình học tập và hồn thành khóa luận.
Trong q trình thực hiện, dù cố gắng hết sức nhưng vẫn khơng tránh khỏi nhiều thiếu sót,
kính mong nhận được những chỉ bảo, đánh giá từ quý thầy cô và mọi người.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 23 tháng 5 năm 2023
Sinh viên
Nguyễn Phương Thảo

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ............................................................. a
DANH MỤC CÁC BẢNG..................................................................................................b
DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ ....................................................................... c
ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN .............................................................................................. 3
1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ..................................................... 3
1.1.1 Nhóm thuốc kháng Histamin H1 ......................................................................... 3
1.1.2 Một số dược liệu và sản phẩm TPBVSK hỗ trợ điều trị dị ứng, giải độc ........... 5
1.1.3 Quy định hiện hành ............................................................................................. 6
1.2 THỰC TRẠNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ....................................... 7
1.2.1 Trên thế giới ........................................................................................................ 7
1.2.2 Tại Việt Nam ....................................................................................................... 8
1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS ................................................... 10
1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ................................................................... 11
1.3.2 Khối phổ (MS) ................................................................................................... 11
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 14
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ...................................................................... 14
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................ 14
2.1.2 Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................ 15
2.1.3 Dung mơi, hố chất............................................................................................ 15
2.1.4 Chất chuẩn ......................................................................................................... 15
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .................................................................................... 15
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................ 16
2.3.1 Xây dựng và tối ưu hoá phương pháp ............................................................... 16
2.3.2 Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp ....................................................... 17
2.3.3 Phát hiện trộn trái phép Cinnarizin, Chlorpheniramin, Cyproheptadin trong một
số thực phẩm bảo vệ sức khoẻ .................................................................................... 18

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................. 19
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VA BÀN LUẬN ...................................... 20
3.1 XÂY DỰNG VÀ TỐI ƯU PHƯƠNG PHÁP .......................................................... 20
3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS ................................................................................ 20
3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu .......................................................................... 22
3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu ...................................................................... 22
3.2 THẨM ĐỊNH CỦA PHƯƠNG PHÁP ..................................................................... 24
3.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn ................................................................................. 24
3.2.2 Độ phù hợp hệ thống ......................................................................................... 25
3.2.3 Độ đặc hiệu ........................................................................................................ 26
3.2.4 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ) ............................... 30
3.2.5 Đường chuẩn ..................................................................................................... 31
3.2.6 Độ đúng và độ chính xác ................................................................................... 31
3.3 ỨNG DỤNG PHÂN TÍCH MẪU THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE .............. 34
3.4 BÀN LUẬN .............................................................................................................. 37
3.4.1 Về nền mẫu ........................................................................................................ 37
3.4.2 Về phương pháp phân tích................................................................................. 38
3.4.3 Về phương pháp xử lý mẫu ............................................................................... 38
3.4.4 Về thẩm định phương pháp phân tích ............................................................... 39
3.4.5 Về ứng dụng trên mẫu TPBVSK ....................................................................... 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .............................................................................................. 41
Kết luận........................................................................................................................... 41
Kiến nghị ........................................................................................................................ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO: ................................................................................................. i
Phụ lục 1. Khối phổ của các chất ở điều kiện lựa chọn .................................................. iii
Phụ lục 2. Đồ thị đường chuẩn của các chất trong nền mẫu lỏng và nền mẫu rắn ......... iv
Phụ lục 3: Đường chuẩn trong dung môi của các chất ..................................................... v
Phụ lục 4: Sắc ký đồ tại điểm LOD ................................................................................. vi

Phụ lục 5: Danh sách 22 mẫu TPBVSK thu thập ......................................................... viii
Phụ lục 6: Sắc kí đồ các mẫu TPBVSK dương tính ........................................................ ix


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

AOAC

Association of Official Analytical
Chemists

Hiệp hội các nhà hóa học phân
tích

CE

Collision Energy

Năng lượng bắn phá

CLO

Chlorpheniramine

Chlorpheniramin

CIN

Cinnarizine

Cinnarizin

CYP

Cyproheptadine

Cyproheptadin

ESI

Electrospray Ionization

Ion hóa phun mù điện tử

HPLC

High Performance Liquid
Chromatography

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HPTLC

High Performance Thin Layer
Chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

LC-MS

Liquid chromatography mass
spectrometry

Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ

LC-MS/MS

Liquid chromatography tandemmass spectrometry

Sắc ký lỏng kết hợp khối phổ hai
lần

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lượng

MRM

Multiple reaction monitoring

Kiểm soát đa phản ứng

R (%)

Recovery

Độ thu hồi

RSD

Relative Standard Deviation

Độ lệch chuẩn tương đối

TPBVSK

-

Thực phẩm bảo vệ sức khỏe

a


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng ................ 6

Bảng 1.2 Một số phương pháp xác định các thuốc kháng Histamin H1 .............................. 9
Bảng 2.1 Thành phần và tỷ lệ các dược liệu của nền mẫu ................................................. 14
Bảng 3.1 Các thông số máy khối phổ ................................................................................. 20
Bảng 3.2 Điều kiện khối phổ của các chất phân tích ......................................................... 21
Bảng 3.3 Chương trình gradient chạy sắc ký ..................................................................... 22
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nền mẫu ..................................................................................... 23
Bảng 3.5 Quy trình pha dãy chuẩn ..................................................................................... 25
Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ phù hợp hệ thống LC-MS/MS (n=6) ................................. 25
Bảng 3.7 Tỷ lệ cường độ tín hiệu của ion định tính/định lượng các chất phân tích .......... 27
Bảng 3.8 Giá trị LOD và LOQ của các chất phân tích ....................................................... 30
Bảng 3.9 Phương trình đường chuẩn của các chất phân tích ............................................. 31
Bảng 3.10 Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày (n=7) .......................................... 32
Bảng 3.11 Độ đúng và độ chính xác khác ngày (n=7) ....................................................... 33
Bảng 3.12 Độ tái lập của các chất phân tích (n=14)........................................................... 34
Bảng 3.13 Kết quả định tính các chất phân tích trên 22 mẫu TPBVSK ............................ 35
Bảng 3.14 Kết quả xác định các mẫu TPBVSK dương tính .............................................. 36
Bảng 3.15 Kết quả đánh giá trên mẫu TPBVSK dương tính ............................................. 37

b


DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của Chlorpheniramin .............................................................. 3
Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo của Cinnarizin ......................................................................... 4
Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo của Cyproheptadin................................................................... 5
Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS ................................................................................. 11
Hình 1.5 Sơ đồ hệ thống HPLC .......................................................................................... 11
Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực ....................................................................................... 12
Hình 3.1 Sắc ký đồ độ đặc hiệu của các chất phân tích trên nền mẫu lỏng ....................... 28
Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu cúa các chất phân tích trên nền mẫu rắn ........... 29

Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu trắng nền lỏng thêm chuẩn tại điểm LOD ................................... vi
Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu trắng nền rắn thêm chuẩn tại điểm LOD ....................................vii
a) Sắc ký đồ của mẫu HA29 cho kết quả dương tính với cả 3 chất CIN, CLO, CYP ..... ix
b) Sắc ký đồ của mẫu VNA19 cho kết quả dương tính với CLO .................................... ix
c) Sắc ký đồ của mẫu CLA24 cho kết quả dương tính với CLO ..................................... x

c


ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu chăm sóc bảo vệ sức khỏe của con người ngày càng
nâng cao. Thực phẩm bảo vệ sức khỏe (TPBVSK) ngày càng được sử dụng phổ biến trên
toàn thế giới, Việt Nam cũng nằm trong xu hướng đó. Cùng với việc phát triển của các
trang thương mại điện tử, các mạng xã hội trên internet, việc mua bán TPBVSK online xuất
hiện ngày càng nhiều. Điều này trở thành một vấn đề lớn đến sức khỏe cộng đồng nếu như
việc kiểm tra, quản lý các TPBVSK không diễn ra một cách chặt chẽ.
Hầu hết các quan niệm cho rằng TPBVSK do có nguồn gốc từ thảo dược, dẫn xuất tự nhiên
nên sẽ an tồn. Nhưng hiện nay đã có nhiều báo cáo phát hiện trong một số TPBVSK được
cho thêm vào các hóa chất tổng hợp có dược tính nhằm ngụy biện tác dụng hoặc tăng cường
mạnh tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh lý. Các thuốc hóa dược được tìm thấy điển hình là thuốc
điều trị đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc
chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng,
glucocorticoid….[15] Vấn đề này rất nguy hiểm cho người tiêu dùng, nhất là đối với những
người có sẵn bệnh lý nền như bệnh tim mạch hoặc người cao tuổi vô tình sử dụng gây ra
những tác dụng phụ trầm trọng.
Tại Việt Nam, vấn đề trộn trái phép các chất nhóm kháng Histamin H1 cũng đã được quan
tâm. Một số phương pháp phân tích phát hiện các chất thuộc nhóm này trong các chế phẩm
TPBVSK, chế phẩm đông dược đã được cơng bố như sử dụng phương pháp phân tích LCMS/MS[20], phương pháp HPLC-DAD [2] , phương pháp TLC [12]… Trong đó phương
pháp LC-MS/MS là phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để khẳng
định định tính việc trộn trái phép tân dược vào các TPBVSK.

Năm 2020, Trần Thị Lan đã xây dựng phương pháp HPLC và HPTLC để phát hiện 5 chất
thuộc nhóm kháng Histamin H1 bao gồm ba chất có trong Danh mục chất cấm trong Thông
tư 10/2021/TT-BYT. Tuy nhiên hai phương pháp trên có độ nhạy và độ đặc hiệu chưa cao,
do đó vẫn xảy ra trường hợp âm tính giả/dương tính giả. Phương pháp LC-MS/MS là
phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để khẳng định định tính việc
trộn trái phép tân dược vào các TPBVSK. Các chất kháng Histamin H1 bị cấm sử dụng trên
TPBVSK theo Thông tư số 10/2021/TT-BYT được ban hành ngày 30/06/2021 bao gồm
Chlorpheniramin, Cyproheptadin và Cinnarizin.
Ứng dụng phương pháp LC-MS/MS kết hợp khả năng phân tách chất của sắc ký lỏng (LC)
và khả năng phát hiện, định lượng của khối phổ (MS); phương pháp cho độ nhạy và độ đặc
hiệu cao, phù hợp trong phân tích trên nền mẫu phức tạp như chế phẩm TPBVSK và để mở
rộng đối tượng nghiên cứu góp phần phục vụ cho cơng tác kiểm tra, quản lý việc trộn các
chất kháng Histamin H1 bị cấm sử dụng trên TPBVSK trên thị trường, chúng tôi tiến hành
1


đề tài nghiên cứu: “Xây dựng phương pháp phát hiện một số chất kháng Histamin H1
cấm sử dụng trong Thực phẩm bảo vệ sức khỏe bằng LC-MS/MS”. Với mục tiêu:
1. Xây dựng phương pháp xác định đồng thời Chlorpheniramin, Cinnarizin và
Cyproheptadin trộn trái phép trong TPBVSK dạng lỏng và dạng rắn bằng LC-MS/MS.
2. Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định các dược chất trên trộn trái phép trong
một số TPBVSK đang lưu hành trên thị trường.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
1.1.1 Nhóm thuốc kháng Histamin H1
Các thuốc kháng Histamin H1 thường là lựa chọn hàng đầu để điều trị các trường hợp dị

ứng và thường mang lại hiệu quả tốt. Một số thuốc kháng Histamin H1 còn được sử dụng
với mục đích chống say tàu xe, máy bay; chống nơn cho bệnh nhân sau phẫu thuật, phụ nữ
thai nghén hoặc tăng cảm giác ngon miệng…
Thuốc kháng Histamin H1 có 2 thế hệ. Thuốc kháng Histamin thế hệ 1 như
Diphenhydramine, Promethazine, Chlorpheniramin, … có tác dụng ức chế thần kinh trung
ương gây an thần, tuy nhiên mức độ tác dụng không giống nhau giữa các thuốc và các cá
thể. Các thuốc kháng Histamin H1 thế hệ 2 như Loratadin, Cetirizin, … hầu như khơng có
tác dụng này.[8]
Tác dụng khơng mong muốn: Tác dụng không mong muốn hay gặp nhất của thuốc kháng
histamin H1 thế hệ 1 là gây ngủ, an thần và kháng cholinergic. Tác dụng an thần trên gây
nguy hiểm cho người sử dụng thuốc khi lái tàu, xe, làm việc trên cao, công việc cần sự tỉnh
táo. Các kháng histamin H1 thế hệ 1 làm tăng tác dụng của rượu và các thuốc ức chế thần
kinh trung ương, gây chóng mặt, mệt mỏi, mất sự phối hợp nhịp nhàng, ù tai, bồn chồn,
tăng co giật (động kinh) ở trẻ em. Ở cùng liều điều trị, các thuốc thế hệ 2 ít gây tác dụng
khơng mong muốn hơn. Các kháng histamin H1 thế hệ 1 cịn có tác dụng kháng cholinergic
nên gây khơ miệng, họng và mũi. Ngồi ra cịn gây căng ngực, đau đầu. Trên tiêu hóa, gây
ăn kém ngon, nôn, buồn nôn, tiêu chảy….
1.1.1.1 Chlorpheniramin
 Công thức cấu tạo:

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của Chlorpheniramin
 Cơng thức phân tử: C16H19ClN2 (M=274,79)
 Tên khoa học: 3-(4-chlorophenyl)-N,N-dimethyl-3-pyridin-2-ylpropan-1-amine.
 Tính chất vật lý: Rắn kết tinh trắng hoặc gần như trắng, khơng mùi. Tan tốt trong ethanol,
cloroform, nước và methanol; ít tan trong ether và benzene.[16]
3


 Chỉ định: Điều trị triệu chứng: Viêm mũi dị ứng mùa và quanh năm, mày đay. Điều trị
sốc phản vệ (điều trị bổ sung).[7]

 Tác dụng phụ: Buồn ngủ, mệt mỏi, chóng mặt, mất phối hợp động tác…[7]
 Liều dùng: Đối với chỉ định Viêm mũi dị ứng theo mùa hoặc quanh năm, mày đay:
+ Người lớn: Clorpheniramin maleat: Uống: 4 mg, cách 4 - 6 giờ/lần. Tối đa: 24 mg/ngày
(người cao tuổi tối đa 12 mg/ngày)
+ Trẻ em: Uống: 1 tháng tuổi - 2 tuổi: 1 mg, 2 lần/ngày; 2 - 6 tuổi: 1 mg cách 4 - 6 giờ/lần,
tối đa 6 mg/ngày; 6 - 12 tuổi: 2 mg, cách 4 - 6 giờ/lần, tối đa: 12 mg/ngày; 12 - 18 tuổi:
4 mg cách 4 - 6 giờ/ lần, tối đa 24 mg/ngày.
1.1.1.2 Cinnarizin
 Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Cinnarizin
 Công thức phân tử: C26H28N2 ( M= 368,5)
 Tên khoa học: l-benzhydryl-4-[(E)-3-phenylprop-2-enyl] piperazine.
 Tính chất vật lý: Rắn màu trẳng hay gần như trắng. Thực tế không tan trong nước, dễ tan
trong methylen clorid, tan trong acetone. khó tan trong ethanol 96 % và methanol.[6]
 Chỉ định: Phòng say tàu xe. Rối loạn tiền đình như chóng mặt, ù tai, buồn nơn, nơn trong
bệnh Ménière. Rối loạn mạch não và mạch ngoại vi khác.[7]
 Tác dụng phụ: Buồn ngủ, ngủ gà, nhức đầu; rối loạn tiêu hóa; triệu chứng ngoại tháp và
giảm huyết áp khi dùng liều cao.[7]
 Liều lượng:
+ Đối với chỉ định chống say tàu xe: Người lớn: 25 mg x 1-3 lần mỗi ngày. Trẻ em 5 - 12
tuổi: 1/2 liều người lớn
+ Đối với chỉ định rối loạn tiền đình: Người lớn: 30 mg x 3 lần/ngày; Trẻ em 5 – 12 tuổi:
½ liều người lớn
+ Đối với chỉ định rối loạn mạch não: Liều 75mg, ngày 1 lần.
+ Đối với chỉ định rối loạn mạch ngoại vi: Liều 75mg/lần, 2-3 lần/ngày.[7]

4

1.1.1.3 Cyproheptadin
 Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.3 Cơng thức cấu tạo của Cyproheptadin
 Công thức phân tử: C21H21N (M=287)
 Tên khoa học: 1- methyl-4-(2-tricyclo[9.43,8]pentadeca-1(15),3,5,7,9,11,13heptaenylidene)piperidine.
 Tính chất vật lý: Rắn kết tinh trắng hoặc vàng nhạt. Khó tan trong nước, dễ tan trong
methanol, hơi tan trong ethanol 96%.[6]
 Chỉ định: Dùng cho các trường hợp sau:
+ Viêm mũi dị ứng; dị ứng nhẹ, đơn thuần ở bệnh mày đay, phù mạch, da nổi quầng.
+ Chủ yếu điều trị ngứa do các dị ứng: Tại chỗ do côn trùng cắn, do dị ứng vật lý, do
thuốc, huyết thanh... ngứa do viêm da dị ứng, ngứa thủy đậu.
+ Phòng và chống chứng đau nửa đầu
+ Kích thích ăn ngon ở người gầy yếu, chán ăn, thần kinh dễ bị kích thích.[9]
 Tác dụng phụ: Chóng mặt, buồn nơn, khơ miệng, mệt mỏi, run, nhức đầu...
 Liều dùng: Người lớn: 4 mg/lần x 3-4 lần/ngày. Tối đa 0,5 mg/kg cơ thể/24 giờ.[9]
Với những tác dụng và chỉ định như trên, mục đích của việc trộn các chất nhóm kháng
Histamin H1 vào TPBVSK sẽ nhằm tăng cường hoặc ngụy tạo tác dụng chống dị ứng trong
các trường hợp viêm mũi dị ứng, viêm da dị ứng, nổi mày đay, giải độc gan, giảm ngứa,
giúp an thần, gây ngủ, tạo cảm giác ăn ngon miệng… chủ yếu vẫn là hỗ trợ ngăn chặn các
phản ứng dị ứng.
1.1.2 Một số dược liệu và sản phẩm TPBVSK hỗ trợ điều trị dị ứng, giải độc
Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều TPBVSK có số đăng ký có tác dụng điều trị và hỗ trợ
điều trị dị ứng, mẩn ngứa, giải độc gan. Chúng đa dạng về thành phần các loại dược liệu
cũng như dạng bào chế (viên hoàn, thuốc rắn, viên nang cứng, viên nén, dung dịch nhỏ/xịt
mũi). Một số vị dược liệu và TPBVSK có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề
đay, mẩn ngứa theo “Thông tư danh mục thuốc cổ truyền được Bộ Y tế ban hành” do bộ
trưởng Bộ y tế ban hành ngày 31/10/2016 được trình bày trong Bảng 1.1 dưới đây:
5

Bảng 1.1 Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng
STT

Dược liệu

Tên khoa học

Bộ phận dùng

1

Kim ngân hoa

Flos Lonicerae

Hoa

2

Liên kiều

Fructus Forsythiae

Quả chín

3

Bồ cơng anh

Herba Taraxaci

Tồn cây

4

Thổ phục linh

Smilax glabra

Thân rễ

5

Phịng phong

Radix Saposhnikoviae divaricatae

Rễ

6

Kinh giới

Spica Elsholtziae

Phần trên mặt đất

7

Cúc hoa

Flos Chrysanthemi

Hoa

8

Ngưu bàng tử

Fuctus Arctii

Quả chín

9

Bạc hà

Herba Menthae

Tồn cây

10

Ké đầu ngựa

Fructus Xanthii strumarii

Quả

11

Đạm đậu xị

Semen Sojae praeparata

Hạt

12

Đơn lá đỏ

Folium Excoecariae

Lá

13

Hoàng bá

Cortex Phellodendri

Vỏ thân

14

Xuyên khung

Rhizoma Ligustici wallichii

Thân rễ

15

Thuyền thoái

Periostracum Cicadae

Xác của con ve sầu

16

Sài đất

Herba Wedeliae

Toàn cây

1.1.3 Quy định hiện hành
Ngày 30/06/2021, Bộ Y tế ban hành Thông tư số 10/2021/TT-BYT về Quy định Danh mục
các chất cấm sử dụng trong sản xuất, kinh doanh thực phẩm bảo vệ sức khỏe. Trong Danh
mục các chất cấm sử dụng, có 3 chất thuộc nhóm kháng Histamin H1 gồm
Chlorpheniramin, Cinnarizin và Cyproheptadin.

6


1.2 THỰC TRẠNG VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
1.2.1 Trên thế giới
Trong những năm gần đây, việc tiêu thụ các TPBVSK, đặc biệt là những sản phẩm nguyên

liệu từ dược liệu, đã tăng lên do quan niệm rằng chúng là sản phẩm tự nhiên không gây
nguy hại cho sức khỏe con người. Tại Liên minh Châu Âu và Hoa Kỳ, các TPBVSK được
coi là thực phẩm/loại thực phẩm đặc biệt, do đó khơng có bất kỳ đánh giá an tồn bắt buộc
nào trước khi thương mại hóa. Trong số các vấn đề có thể ảnh hưởng đến an tồn, việc trộn
lẫn trái phép các dược chất hoặc các chất tương tự có dược tính là mối quan tâm lớn vì một
số nhà sản xuất vơ đạo đức có thể gian lận nhằm tạo ra hiệu quả nhanh chóng và tăng doanh
số cho các sản phẩm của họ. Bằng nhiều phương pháp phân tích khác nhau như HPLCDAD, LC-MS/MS, GC-MS, UHPLC, NMR,… và khảo sát trên nhiều dạng bào chế như
viên nang cứng, viên nang mềm, viên nén, rắn, cốm, dạng lỏng, túi trà, rắn trà…, với các
điều kiện xử lý thích hợp, các dược chất được phát hiện trộn trái phép trong TPBVSK trong
báo cáo thường là các chất có tác dụng giảm cân, tăng cơ/hiệu suất trong thể thao và các
chất tăng cường hoạt động tình dục.[18]
Một nghiên cứu khác đã thực nghiệm trên các các thuốc cổ truyền dược liệu tại nhiều quốc
gia như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia… bằng nhiều phương pháp phân tích khác nhau
như LC-MS/MS, HPLC, GC-MS, HPTLC,… cho ta thấy thực trạng việc trộn không khai
báo các tân dược vào thuốc cổ truyền, TPBVSK đáng báo động. Nhiều loại tân dược đã
được phát hiện bao gồm thuốc hạ đường huyết (thuốc chống tiểu đường), thuốc ức chế
phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống tăng huyết áp,
glucocorticosteroid, chất kích thích, steroid…[11]
Nhóm thuốc kháng Histamin H1 cũng được cho thấy là hay bị trộn vào các TPBVSK vì tác
dụng chống dị ứng trong nhiều trường hợp, tác dụng an thần và kích thích ăn ngon miệng,
tùy từng loại.
Trong bài báo về thực trạng việc trộn các dược chất tổng hợp vào các bài thuốc cổ truyền
Trung Quốc tại Đài Loan (1997), tổng cộng có 2.609 mẫu được thu thập bởi tám bệnh viện
đa khoa lớn và được phát hiện bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng. Kết quả cho thấy: trung
bình 23,7% (n = 618) các mẫu được thu thập từ tám bệnh viện phát hiện việc trộn tân dược.
04 mẫu có chỉ định điều trị thấp khớp hoặc chống viêm chứa sáu loại tân dược được trộn
vào khác nhau . Hơn một nửa (52,8%) các loại thuốc cổ truyền Trung Quốc bị pha trộn có
chứa từ hai loại tân dược trở lên.[17] Các tân dược được tìm thấy thường thuộc nhóm giảm
đau, chống viêm NSAIDs, nhóm glucocorticoids, các thuốc kháng Histamin H1, thuốc an
thần gây ngủ… Trong những tân dược bị phát hiện trộn trái phép, Chlorpheniramin maleat

xếp thứ hạng 14 trên tổng 25 dược chất tổng hợp, có mặt trong 16 mẫu thử nghiệm. [17]
7


Tại Trung Quốc, nhóm nghiên cứu của YE Lin-hu sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo
sát 7 chất thuộc nhóm kháng Histamin bao gồm loratadin, diphenhydramin hydrochlorid,
cyproheptadin hydrochlorid, cetirizin hydrochlorid, promethazin hydrochlorid, mizolastin,
và chlorpheniramin maleat trên 9 loại chế phẩm y học cổ truyền, kết quả phát hiện 4/9 mẫu
có sự trộn lẫn các chất phân tích nhóm kháng Histamin trên.[21]
Ở Hàn Quốc, Jung-Ah Do, Jung Yeon Kim và cộng sự đã xây dựng phương pháp xác định
đồng thời 20 chất nhóm kháng Histamin trong thực phẩm bổ sung bằng LC-MS/MS để
khảo sát trên 117 mẫu chế phẩm và đã phát hiện 1 mẫu chứa diphenhydramin.[14]
1.2.2 Tại Việt Nam
Tại Việt Nam hiện nay, việc sử dụng TPBVSK ngày càng trở nên phổ biến, đặc biệt nhu
cầu sử dụng TPBVSK có chứa các loại thảo dược có tác dụng chăm sóc, hỗ trợ điều trị
bệnh lý ngày càng tăng. Các sản phẩm TPBVSK có mặt ngày càng nhiều và được bán qua
nhiều kênh khác nhau như trong hiệu thuốc, cửa hàng bán sản phẩm chăm sóc sức khỏe,
siêu thị, qua mạng internet, trang thương mại điện tử… nên rất khó kiểm sốt, có nguy cơ
cao về việc gây ra những tác dụng khơng mong muốn.
Năm 2022, nhóm nghiên cứu của Nguyễn Trọng Linh đã sử dụng phương pháp LC-MS/MS
để tầm soát các chất hóa dược tổng hợp thuộc nhóm ức chế PDE5, kháng viêm, giảm đau,
giảm cân trên 80 mẫu TPBVSK. Kết quả phát hiện 10 mẫu dương tính nhóm tăng cường
sinh lý nam, 1 mẫu dương tính nhóm kháng viêm, và 7 mẫu dương tính với Sibutramin –
nhóm giảm cân.
Với nhóm thuốc kháng Histamin H1, năm 2011, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã
kiểm tra mẫu “Thuốc bổ Tỳ‟ của cơ sở Phước Lợi Đường tại Đà Nẵng với công dụng kích
thích ngon miệng đã phát hiện có trộn dexamethason và cyproheptadin.
Một số phương pháp xác định các thuốc kháng histamin trộn trong TPBVSK đã tham khảo
được tổng hợp trong bảng sau:

8


Bảng 1.2 Một số phương pháp xác định các thuốc kháng Histamin H1
Nền

Hoạt chất

Phương pháp phân tích

Xử lý mẫu

mẫu

Tài
liệu

Viên

Loratadin,

LC-MS/MS

Chiết mẫu bằng

nén,

Diphenhydramin

Cột Agilent Eclipse Plus

methanol 80%, siêu

thuốc

hydrochlorid,

C18 (2,1 mm × 50 mm; 3,5

âm 30 phút, ly tâm.

mỡ, kem Cyproheptadin
hydrochlorid,
Cetirizin

[21]

μm)
Pha động: 0,1% acid
formic trong nước (Kênh

hydrochlorid,
Promethazin

A) và 0,1% acid formic
trong acetonitril (Kênh B)

hydrochlorid,
Mizolastin và
Chlorpheniramin

Chương trình gradient:
Kênh B được tăng tuyến
tính từ 5% lên 95% trong

maleat

0,1 phút, duy trì ở mức
95% trong thêm 4 phút, và
sau đó giảm xuống 5%
trong 4 phút để cân bằng
lại.
Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút

Rắn,
Viên

Chlorpheniramin
maleate,

LC-MS/MS
Cột Acquity UPLC BEH

Mẫu được đồng
nhất hóa, 1g mẫu

nang,
Viên
nén,
Dạng

Cyproheptadin
hydrochloride
sesquihydrate và
18 loại chất

C18 (1.7 µm, 2.1 × 100
mm, Waters)
Pha động: Acid formic
0,1% trong nước và acid

được chiết bằng
20ml Methanol,
siêu âm 10 phút, và
lọc qua màng 0,22

lỏng,
Viên
cứng

kháng Histamin
H1 khác

formic 0,1% trong
µm
acetonitril.
Chương trình gradient: 0
phút , 5% B; 1.0 phút, 5%
B; 7.0 phút, 100% B; 8.0
phút, 100% B; 8.1 phút,

5% B; và 10.0 phút, 5% B
Tốc độ dòng: 0,25 mL/phút
9

[14]


Viên

TLC

Đồng nhất mẫu,

hoàn,
Chlorpheniramin
bột cốm, maleate,

Bản mỏng TLC Silicagel
60 GF254, hệ dung môi

cân mẫu bằng 1/2
liều. Thêm 20,00ml

viên
nang

khai triển: Cloroform –
methanol – acid acetic –
amoniac (9,5 : 0,5 : 0,2 :

methanol, lắc xoáy
5 phút, siêu âm 10
phút, Ly tâm 6000

Loratadin,

Cyproheptadin
hydrochloride

[20].

0,05), bước sóng phát hiện: vịng/phút. Cơ đặc
254 nm và thể tích chấm : 2 10 lần và lọc qua
µl
màng lọc 0,45 µm
Viên
hoàn,

Loratadin,
Chlorpheniramin

bột cốm, maleate,
viên
Cyproheptadin
nang
hydrochloride,
Betamethason,
Dexamethason

LC-MS/MS

Cột InertSustain AQ-C18

Đồng nhất mẫu,
cân mẫu bằng 1/10

(100 mm x 2,1 mm; 3,0
µm)
Pha động gồm acid formic

liều. Thêm 25,00ml
methanol, lắc xoáy
5 phút, siêu âm 10

0,1% trong nước và
acetonitril
Chế độ gradient 3: 0 → 7,5
phút: 15 → 75 % B; 7,5 →

phút, Ly tâm 6000
vịng/phút. Pha
lỗng 50 lần và lọc
qua màng lọc 0,22

8,5 phút: 75 → 15% B; 8,5

µm

[1]

→ 12 phút: 15 % B.

Tốc độ dòng: 0,3 mL/phút
Thời gian phân tích: 12
phút
1.3 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS
Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng
phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance
liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ
(Mass spectrometry – MS).

10


a) Hình 1.4 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS
1.3.1 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách
các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động là chất lỏng
dưới áp suất cao. Pha tĩnh bản chất là chất rắn ở dạng tiểu phân hoặc chất lỏng phủ lên một
chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với nhóm chức
hữu cơ. Pha động là chất lỏng, di chuyển thành dòng liên tục. Mẫu phân tích được hịa tan
trong dung mơi và cho qua cột nhờ pha động. Các chất tan là thành phần của mẫu sẽ di
chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào hệ số phân bố giữa chất
tan với pha tĩnh và pha động. Nhờ đó, các thành phần của mẫu sẽ tách riêng biệt thành dải,
làm cơ sở cho phân tích định tính và định lượng. [10]
Các bộ phận của hệ thống HPLC được thể hiện ở Hình 1.5 dưới đây:

b) Hình 1.5 Sơ đồ hệ thống HPLC
1.3.2 Khối phổ (MS)
Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hoặc bớt điện tích như loại electron, proton hóa. Từ
đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử hợp chất. Sau khi được tách
trong hệ thống sắc ký lỏng, mẫu cần phân tích sẽ đi qua một ống dẫn đến nguồn ion hóa.

Tại đây diễn ra quá trình ion hóa các chất, sau đó ion được đưa vào bộ phận phân tích khối
để tách các ion theo tỉ số m/z. Sau đó các ion đi vào bộ phận phát hiện (detector), sẽ được
11


khuếch đại và chuyển thành tín hiệu. Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào hệ thống máy
tính để nhận biết, xử lí và lưu trữ.
Các bộ phận chính của hệ thống MS:
(1) Buồng ion hóa:
Có nhiệm vụ ion hố phân tử trung hồ thành các ion mang điện tích hoặc bắn phá, phân
mảnh phân tử trung hoà thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phần tử mang
năng lượng cao.
Một số kỹ thuật ion hóa hay dùng: ion hóa bằng dịng electron (Electron ionization – EI),
ion hóa hóa học (Chemical ionization – CI), ion hóa phản hấp phụ (Desorption ionization
– DI), ion hóa phun mù electron (Electrospray ionization – ESI), ion hóa hóa học ở áp suất
khí quyển (Atmospheric pressure chemical ionization – APCI).
Trong LC-MS, kỹ thuật ion hóa hay sử dụng là ESI. Kỹ thuật ESI lý tưởng để nghiên cứu
các hợp chất rất khó bay hơi đối với phương pháp đưa mẫu trực tiếp, các chất rất phân cực
đến phân cực và các chất không bền với nhiệt. ESI cũng phù hợp để nghiên cứu các phân
tử sinh học lớn tới 10000 Da cho đến các phân tử nhỏ với trọng lượng khoảng 100 – 1.500
Da.
(2) Bộ phân tích:
Sau khi mẫu được ion hóa, chùm ion được tăng tốc bằng điện trường và sau đó đi vào bộ
phân tích. Trong vùng phổ kế khối lượng, các ion được phân tách theo tỉ số m/z. Bộ phân
tích được ứng dụng rộng rãi trong các hệ thống LC-MS là bộ tứ cực (quadrupole). Dưới
đây là sơ đồ cấu tạo của bộ tứ cực:

c) Hình 1.6 Sơ đồ cấu tạo bộ tứ cực
(3) Detector:
Hai bộ phận phát hiện ion phổ biến là bộ phận phát hiện nhân electron (electron multipler)

và bộ phận phát hiện nhân quang (photo multipler). Bộ phận phát hiện nhân electron hoạt
động theo cơ chế một ion đập vào bề mặt diot làm bật ra các electron, các electron thứ cấp
12


sau đó được dẫn tới các diot tiếp theo, quá trình khuếch đại tiếp tục tạo ra dịng electron
(105 -106). Ưu điểm của detector này là có độ nhạy cao, được ứng dụng phổ biến nhất. Bộ
phận phát hiện nhân quang hoạt động tương tự bộ nhân electron. Tuy nhiên điểm khác là
các electron thứ cấp sẽ va đập với một màn chắn phosphorus và giải phóng ra các nhân
electron. Số lượng các photon tỷ lệ với cường độ tín hiệu. Ưu điểm của detector này là các
ống nhân quang được đặt trong chân không nên loại bỏ được tạp nhiễm.
(4) Hệ thống nhận biết và xử lý tín hiệu:
Tín hiệu từ detector được dẫn qua hệ thống xử lý dữ liệu. Đối với khối phổ ba tứ cực là
máy đo khối phổ hai lần liên tiếp (MS/MS), 2 kỹ thuật ghi phổ có độ nhạy cao thường được
sử dụng là SRM và MRM.
+ Kỹ thuật SRM (Selected Reaction Monitoring) thực hiện cơ lập ion cần chọn, sau đó phân
mảnh ion cơ lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa
vào đầu dò để phát hiện.
+ Kỹ thuật MRM (Multiple Reaction Monitoring) là cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực
thứ nhất, phân mảnh ion cơ lập đó tại tứ cực thứ 2 (buồng va chạm) thu được các ion con,
cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện.
Trên thực tế, kỹ thuật ghi phổ MRM hay dùng hơn SRM. Máy khối phổ MS/MS gồm hai
hệ máy khối phổ độc lập nhau được nối liền với nhau bởi một buồng va chạm (collision
cell). MS đầu tiên để cô lập ion sơ cấp (precursor ion), tiếp theo là buồng va chạm để phân
mảnh các ion này tạo ra ion thứ cấp (product ion), thường dùng khí Ar để va chạm. Sau đó,
các ion thứ cấp đến MS thứ hai để phân tách.
Phương pháp LC-MS/MS có ưu điểm là độ nhạy và độ đặc hiệu cao nên được sử dụng để
phân tích các chỉ tiêu ở hàm lượng siêu vết (ppb/ppt). Do đó, phương pháp này được ứng
dụng rộng rãi trong lĩnh vực phân tích sinh học, phân tích mẫu mơi trường và thuốc. Tuy
nhiên nhược điểm của LC-MS là thiết bị phức tạp và đắt tiền.

Trên cơ sở các ưu điểm của phương pháp LC – MS/MS và các nghiên cứu đã thực hiện, kỹ
thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần được sử dụng trong đề tài này để xây dựng và thẩm định
phương pháp xác định đồng thời Clorpheniramin, Cinnarizin và Cyproheptadin trộn trái
phép trong TPBVSK.

13


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu
+ Đối tượng nghiên cứu: Chlorpheniramin; Cinnarizin và Cyproheptadin
+ Mẫu thử: 22 mẫu ghi nhãn “Thực phẩm bảo vệ sức khỏe” có tác dụng hỗ trợ điều trị viêm
xoang, viêm mũi dị ứng, cảm cúm, mề đay, mẩn ngứa, giải độc gan, giúp an thần, kích thích
ngon miệng.
Nơi thu thập mẫu: các trang thương mại điện tử (Shopee, Lazada), các trang web trên
internet, mạng xã hội (facebook), chợ đông y
Dạng bào chế: viên hoàn, viên nang cứng, viên nén, cao lỏng.
+ Mẫu trắng: 2 nền mẫu dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích được
chuẩn bị từ 18 loại dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng và dựa trên
nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học
về dược liệu đã công bố như bài thuốc “Ngân kiều tán”, “Liên kiều giải độc tán”, “Tiêu
phong tán gia giảm”. Các dược liệu này được nấu với dung mơi nước thành cao lỏng (nền
mẫu lỏng), sau đó sấy khô và nghiền thành cao khô (nền mẫu rắn).
Bảng 2.1 Thành phần và tỷ lệ các dược liệu của nền mẫu
STT

Thành phần

Khối lượng (g)

STT

Thành phần

Khối lượng (g)

1

Liên kiều

12

10

Khương hoạt

10

2

Bạc hà

8

11

Kim ngân hoa

10

3

Bạch thược

8

12

Kinh giới

16

4

Cam thảo

8

13

Ngưu bàng tử

12

5

Cát cánh

10

14

Phòng phong

12

6

Chi tử

12

15

Ké đầu ngựa

8

7

Đạm đậu xị

10

16

Sài hồ

12

8

Đan bì

8

17

Thăng ma

10

9

Huyền sâm

10

18

Xuyên khung

10

- Mẫu tự tạo: Mẫu trắng thêm các chất phân tích với tỷ lệ phù hợp.
14


2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

Các thiết bị, dụng cụ sử dụng thuộc sở hữu của Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh Thực
phẩm Quốc gia.
 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g XS10 (Metter Toledo, Thụy Sĩ).
 Máy ly tâm (Helma, Đức)
 Máy siêu âm (Helma, Đức)
 Máy lắc xốy vortex (IKA)
 Micropipet có thể tích điều chỉnh được: 10-100 µL, 20 - 200 µL, 100 – 1000 µL
(Eppendorf, Đức);
 Ống nhựa ly tâm 50ml có nắp kín, 15ml có nắp kín
 Bình định mức các loại
 Lọ đựng mẫu 1,5ml có nắp dùng tiêm mẫu LC-MS/MS
 Lọ đựng chuẩn 20ml
 Màng lọc 0,22mcm
 Cột sắc ký pha đảo C18 (150 x 3,0 mm, 3,5 µm)
 Hệ thống sắc ký (Waters H-class, Hoa Kỳ) kết hợp đầu dò khối phổ (Waters XEVO
TQD, Hoa Kỳ)
2.1.3 Dung mơi, hố chất
Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích.
 Dung mơi tinh khiết dùng cho chạy sắc ký (Merck): Methanol, Acetonitril, Acid formic.
 Nước cất hai lần.
2.1.4 Chất chuẩn
 Chuẩn Chlorpheniramin maleat C16H19ClN2.C4H4O4 100,0%; 150mg; Viện Kiểm
nghiệm thuốc Trung ương.
 Chuẩn Cinnarizin (C26H28N2) 99,7%; 120mg; Viện Kiểm nghiệm thuốc thành phố Hồ
Chí Minh.
 Chuẩn Cyproheptadin hydrochloride sesquihydrate 99,3%; 150mg; Viện Kiểm nghiệm
thuốc Trung ương.
2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Khảo sát các điều kiện phân tích: Điều kiện khối phổ và điều kiện sắc ký
 Xây dựng quy trình xử lý mẫu

 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu (ME%)
 Xác định giá trị sử dụng của phương pháp:
15


 Độ phù hợp hệ thống
 Độ đặc hiệu
 Đường chuẩn
 Giới hạn phát hiện (LOD) và Giới hạn định lượng (LOQ)
 Độ đúng và chính xác
 Phân tích phát hiện CLO, CIN, CYP trên một số TPBVSK.
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Xây dựng và tối ưu hoá phương pháp
2.3.1.1. Khảo sát các điều kiện phân tích
Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:
- Khảo sát điều kiện khối phổ: Lựa chọn điều kiện nguồn ion hóa, ion mẹ, điều kiện bắn
phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn ion con để định tính và định lượng.
- Khảo sát điều kiện sắc ký: Lựa chọn pha động, cột sắc ký, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu
và tốc độ dịng để có thể tách và phát hiện đồng thời các chất phân tích ở nồng độ ng/mL,
các pic nhỏ gọn, cân xứng và có tín hiệu cao nhất, thời gian phân tích khơng q dài.
2.3.1.2 Xây dựng quy trình xử lý mẫu
Quy trình xử lý mẫu được tham khảo trên một số tài liệu có nền mẫu tương tự và tùy theo
điều kiện phịng thí nghiệm: lựa chọn dung môi chiết mẫu, phương pháp chiết, làm sạch
mẫu.
2.3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu
Đánh giá tương quan giữa đường chuẩn dựng trên nền mẫu với đường chuẩn dựng trên
dung môi. Nền mẫu là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến tín hiệu phân tích bằng phương
pháp LC-MS/MS, đặc biệt trên đối tượng là mẫu thực phẩm vì sự có mặt của một lượng
lớn tạp chất gây nhiễu. Vấn đề này sẽ được giải quyết đáng kể nếu áp dụng một quy trình
xử lý mẫu tốt, tuy nhiên vẫn khơng thể triệt để. Do đó cần khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu

lên tín hiệu phân tích trong nghiên cứu này.
Quy trình khảo sát được tiến hành song song với 2 đường chuẩn, một đường chuẩn trong
dung môi (methanol) và một đường chuẩn trong nền mẫu trắng thêm chuẩn được xử lý qua
quy trình xử lý mẫu đã tối ưu. Khoảng hàm lượng được khảo sát được tính tốn tương ứng
với nồng độ trong dịch phân tích cuối cùng là 1,00 – 50,0 ng/mL đối với cả 3 chất. Ảnh
hưởng nền được đánh giá qua tương quan giữa hệ số góc của 2 đường chuẩn bằng cơng
thức:

16