Tiểu luận Công nghệ sinh học thực vật: Sản suất Anthocyanyl trong nuôi cấy rễ bất định củ cải đường L. CV. Peking Koushin

Đề tài
SẢN SUẤT ANTHOCYANYL TRONG NUÔI CẤY RỄ BẤT ĐỊNH CỦ CẢI ĐƯỜNG
L. CV. PEKING KOUSHIN
GVHD:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT


Nội dung
Tóm tắt
Giới thiệu
Vật liệu và phương pháp
Kết quả và thảo luận
4
1
2
3
I. Tóm tắt
 !"#$%&$%'( )*"+,-$ /0("+12#("3 "$45+(6"+(".("+78()*"+9:;<="+>?@A7+:<B
 !"#"18($5"+78()*"+9:;<="+>?@A7+:<B2'"C1&"#$5&"(""+D"+6(-#("18($5E)F( (G10(H"
$#(I12J"+9K+(*:"+L5@ !"#"+78()*"+có?@A7+:<B2'"C1&"#$5&"(""#(G1#M"78()*"+$D?@9#N$?@A7+:<

Quá trình thủy phân acid của các dịch chiết xuất rễ
cho thấy anthocyanidin chính là pelargonidin
Ngoài ra, so sánh tinh sạch hoàn toàn chiết xuất rễ bất định
bằng DPPH với rễ nguyên của cây cùng loại trong nghiên
cứu này
O$6&"#$5&"(" )P$2Q
ER"+"#)7L1#S$T#U7
S"#(V"
II. Giới thiệu

III. Vật liệu và phương pháp
1. Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định và củ
+(6"+"+47.F(
/#&"<WAX"+Y?T#Z
Khử trùng với 2% NaOCl
có chứa 0.1% Tween 20
trong 10 phút
N#V"78()*"+?-AX
&+&>?-AX2&$$#&2/-18($5
E)F( (G10(H"$#(I12J"+
9K#:"+L5[;A
?

Rửa một lần nước cất vô trùng
Q&Y<\"]"+")F$$.8^"+
III. Vật liệu và phương pháp
1. Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định và củ
III. _`<(H1.LT#)M"+T#JT
2. Phân tích sắc tố
a. Tách chiết anthocyanin
III. Vật liệu và phương pháp
2. Phân tích sắc tố
b.
Thủy phân acid của anthocyanin
III. Vật liệu và phương pháp
3.
Phân tích HPLC
#*(+(&"<)1$%&&"#$5&"(E("2$#a"#"+$J$7b1 !"#.L"+15V"T#4"c$#]"+, )P$22J"#.F("#d"+$#$#1U"
$%&&"#$5&"("eT/<&+"(E("$#<(E/@$5&"(E("$#<(E/@T/"(E("$#<(E/.LE/<T#("(E("$#<(E/f-
#*(+(&"<)1$%&&"#$5&"(E("2$#a"#"+$J$7b1 !"#.L"+15V"T#4"c$#]"+, )P$22J"#.F("#d"+$#$#1U"

$%&&"#$5&"("eT/<&+"(E("$#<(E/@$5&"(E("$#<(E/@T/"(E("$#<(E/.LE/<T#("(E("$#<(E/f-
Điều kiện của HPLC
Cột: TOSOH TSKgel ODS-80Ts, 4.6×150mm
Pha động: 0.4% TFA trong H2O – CH3CN (9:1→7:1 trong 25 phút)
Tốc độ dòng chảy: 0.8ml/min
Nhiệt độ cột 40
0
C, )F$2D"+A;?"7
III. Vật liệu và phương pháp
4. Phân tích định lượng anthocyanin
Chiết riêng khoảng 20mg mẫu
khô với 2ml methanol 80% có
chứa 1% TFA bằng sóng siêu
âm trong 20 phút.
,g$h1&"Z8"+@<5;7<E!$#$#(I-
 i#T#1[A;9"7.Lc"#J""j"+
i&"#$5&"(")M"+k"+
III. Vật liệu và phương pháp
5. Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH
•
Tinh sạch hoàn toàn bằng phương pháp sử 1,1–diphenyl–2–picrylhydrazyl (DPPH)
•
l&&"9?7+E!$#$#(I3)M(#N$0#8.L97<7/#&"<m?X$D$#k&9Xnj(<59??o<-
•
#V7.L7p(E1"+E!$#7b1A??o<E1"+E!$#q/#&"<?@A7.LK??o<7/#&"<m?X$D$#k&9Xn-
•
&1 D<O$"#r@#p"#PTT#'"k"+ )P$ s5V""+D"+6(;?T#Z["#(H iT#l"+j( /7 (  i#T#1[A9W"7-
t<HT#\"u7v"#2$# )P$c"#]"+$8"+#k$w
("#2$##L"L"]"+qeXfx9??e2$%&7b1T#'"k"+f:e2$%&7b10(s7$#k"+fy9??
c"#$#6"+C5#D& )P$ ]"+T#)M"+T#JTB2QER"+&$(E<("</($

III. Vật liệu và phương pháp
6. Đo hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp 2–thiobarbituric acid (TBA)
III. Vật liệu và phương pháp
6. Đo hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp 2–thiobarbituric acid (TBA)
Tỷ lệ phần trăm hoạt tính chống oxy hóa được tính bằng công thức:
Hoạt tính chống oxy hóa (%) = 100 – (Abs của mẫu phản ứng)/(Abs của mẫu kiểm chứng) × 100
Tỷ lệ phần trăm hoạt tính chống oxy hóa được tính bằng công thức:
Hoạt tính chống oxy hóa (%) = 100 – (Abs của mẫu phản ứng)/(Abs của mẫu kiểm chứng) × 100
IV. Kết quả và thảo luận
1. Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định
IV. Kết quả và thảo luận
1. Sự hình thành và sinh trưởng của rễ bất định
Sản lượng sắc tố của rễ bất định sinh trưởng trong bóng tối
thấp hơn so với rễ nhánh của cây nguyên vẹn cùng loại
trong nghiên cứu này
Sản lượng sắc tố của rễ bất định sinh trưởng trong bóng tối
thấp hơn so với rễ nhánh của cây nguyên vẹn cùng loại
trong nghiên cứu này
Sự phát triển của rễ bất định không bị ảnh hưởng bởi
hai điều kiện ánh sáng/tối. Khi nuôi cấy rễ bất định
(khoảng 45mg trọng lượng tươi/bình 100ml) trong môi
trường 1/2 MS lỏng + 0,5 mg/l IBA,chiếu sáng trong bốn
tuần, sự hình thành sắc tố tăng rõ rệt
Rễ bất định được cấy truyền vào môi trường 1/2 MS
lỏng bổ sung NAA (0,1; 0,5 mg/l) hoặc IBA (0,1; 0,5
mg/l), nuôi cấy lỏng lắc tốc độ 100rpm ở 25
0
C, chiếu
sáng 14giờ/ngày hoặc trong bóng tối.
Rễ bất định được cấy truyền vào môi trường 1/2 MS

lỏng bổ sung NAA (0,1; 0,5 mg/l) hoặc IBA (0,1; 0,5
mg/l), nuôi cấy lỏng lắc tốc độ 100rpm ở 25
0
C, chiếu
sáng 14giờ/ngày hoặc trong bóng tối.
Rễ bất định được nuôi cấy trong bình tam giác 100ml (chứa môi trường ½ MS lỏng + 0.5 mg/l IBA) khoảng 4 tuần ở
25
0
C, chiếu sáng 14 giờ/ngày

Sắc tố đỏ(Anthocyanin)
Bóng tối 14h chiếu sáng
0.1mg/l NAA
0.5mg/l NAA
0.1mg/l IBA
0.5mg/l IBA
±
±
±
±
+
++
++
+++
Bảng. Ảnh hưởng của auxin lên sản lượng anthocyanin của rễ bất định
± : Sản lượng anthocyanin rất thấp
+ : Sản lượng anthocyanin thấp
++ : Sản lượng anthocyanin trung bình
+++ : Sản lượng anthocyanin cao
IV. Kết quả và thảo luận

2. Phân tích anthocyanidin bằng HPLC
Thủy phân sắc tố đỏ tách chiết từ rễ bất
định và rễ củ bằng HCl 2M, sau đó phân
tích bằng HPLC và so sánh với bốn chất
chuẩn anthocyanidin: pelargonidin
clorua, cyanidin clorua, peonidin clorua
và delphinidin clorua
Phân tích HPLC để chứng minh rằng
anthocyanidin chính của rễ bất định và
rễ củ của Peking Koushin là
pelargonidin
Hàm lượng anthocyanin của rễ bất định
đông lạnh (0,15% trọng lượng khô) cao
hơn của rễ củ một chút (0,11% trọng
lượng khô), mặc dù sự khác nhau
không có ý nghĩa ở mức 5% của F test
Kết quả phân tích HPLC của chất chuẩn (A) và dịch
thủy phân của rễ củ (B) và rễ bất định (C).
Hàm lượng anthocyanin trong nuôi cấy rễ củ và rễ bất định.
Hàm lượng anthocyanin tương đương với lượng pelargonidin.
Cây được trồng khoảng 3 tháng và khi rễ bất định được 4 tuần
tuổi thì nuôi cấy trong điều kiện chiếu sáng đã được phân tích.
Số liệu trung bình của 3 lần thí nghiệm.
Thanh đại diện cho sai số chuẩn. 1, rễ khô; 2, nuôi cấy rễ
bất định khô.
Nuôi cấy rễ bất định (khoảng 45 mg trọng lượng tươi) trong môi trường ½ MS lỏng + 0.5 mg/l IBA ở 25
0
C, chiếu sáng 14 giờ/ngày
trong máy lắc tốc độ 100rpm
IV. Kết quả và thảo luận

3. Thời gian tăng trưởng và hàm lượng anthocyanin trong nuôi cấy rễ bất định
Trọng lượng tươi và khô của rễ bất định tăng lên nhanh chóng trong 2 tuần đầu tiên, tăng đến tuần thứ 7. Athocyanin sản xuất
giai đoạn đầu quá trình nuôi cấy, khối lượng lớn nhất trong tuần 5 (khoảng 250 μg/ bình 100ml), sau đó giảm dần.
Thời gian tăng trưởng (A) và hàm lượng anthocyanin trong nuôi
cấy rễ bất định của Peking Koushin. Rễ bất định được nuôi cấy
trong môi trường ½ MS lỏng + 0.5 mg/l IBA trong 4 tuần, ở
25
0
C, chiếu sáng 14giờ/ngày. Số liệu trung bình của 3 lần thí
nghiệm. Thanh đại diện cho sai số chuẩn
Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH của 0.2 và 1 mg/ml dung dịch phản ứng chuẩn bị từ những mẫu khác nhau đã được khảo sát.
0.2 mg/ml dung dịch phản ứng cho thấy hoạt tính thấp hơn nhiều so với 1 mg/ml dung dịch phản ứng
IV. Kết quả và thảo luận
4. Tinh sạch hoàn toàn bằng DPPH
Số liệu trung bình trong 3 lần thí nghiệm. Thanh
đại diện cho sai số chuẩn. 1, rễ Peking Koushin
tươi; 2, rễ Peking Koushin khô; 4, rễ bất định
Peking Koushin khô; 5, rễ Aokubi tươi.
IV. Kết quả và thảo luận
5. Hoạt tính chống oxi hoá đo bằng phương pháp TBA
Các hoạt tính chống oxy hóa trong rễ củ và rễ bất định được xác định bằng phương pháp TBA.
Các hoạt tính chống oxy hóa của rễ khô và tươi khoảng 25%
Các hoạt tính chống oxy hóa trong rễ củ và rễ bất định được xác định bằng phương pháp TBA.
Các hoạt tính chống oxy hóa của rễ khô và tươi khoảng 25%
Số liệu trung bình trong 3 lần thí nghiệm. Thanh đại diện cho sai số
chuẩn. 1,rễ Peking Koushin tươi; 2,rễ Peking Koushin khô; 3,rễ bất
định Peking Koushin tươi; 4,rễ bất định Peking Koushin khô; 5, rễ
Aokubi tươi.
IV. Kết quả và thảo luận
5. Hoạt tính chống oxi hoá đo bằng phương pháp TBA

Số liệu trung bình trong 3 lần thí nghiệm. Thanh đại diện
cho sai số chuẩn. 1,rễ Peking Koushin tươi; 2,rễ Peking
Koushin khô; 3,rễ bất định Peking Koushin tươi; 4,rễ bất
định Peking Koushin khô; 5, rễ Aokubi tươi.
Hoạt tính chống oxi hóa anthocyanin trong các mẫu khác nhau (phương pháp TBA)
Hoạt tính chống oxi hóa anthocyanin trong các mẫu khác nhau (phương pháp TBA)