Đa bội in vitro Phương pháp mới cải tiến giống cây trồng

THAO TÁC TẠO THỂ ĐA BỘI IN VITRO
ĐỂ CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG
Các hệ thống tái sinh in vitro cung cấp một công cụ mạnh mẽ để thao tác tạo thể
đa bội nhằm tạo điều kiện cho việc nhân giống và phát triển cây trồng mới. Cảm
ứng đa bội có thể mở rộng cơ hội nhân giống, hỗ trợ sự phát triển của các giống
cây tam bội không hạt, nâng cao đặc điểm cảnh quan cho cây trồng và tăng khả
năng chống chịu với môi trường, tăng sinh khối và phục hồi khả năng sinh sản ở
các giống lai rộng. Thao tác tạo thể đa bội in vitro thường được cảm ứng bằng
cách sử dụng các chất kháng phân bào như colchicine, oryzalin và trifluralin,
trong khi còn nhiều chất kháng phân bào khác chưa được khám phá. Sự cảm
ứng thành cơng địi hỏi sự kết hợp đồng bộ của sự xâm nhập hiệu quả của chất
kháng phân bào và có thể phụ thuộc vào thời gian tiếp xúc và nồng độ của chất
kháng phân bào, loại mô, và tương tác với mơi trường cơ bản và chất điều hịa
sinh trưởng thực vật. Các điều kiện in vitro khác nhau giữa các đơn vị phân loại
và các chi, loài và giống riêng, thường đòi hỏi các biện pháp xử lý chuyên biệt
để tối đa hóa cảm ứng đa bội. Ở một số đơn vị phân loại, sự cảm ứng đa bội ảnh
hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và hình thành rễ in vitro. Sau đây, chúng
tôi cung cấp một cái nhìn tổng quan về các chất ức chế phân bào và ứng dụng
của chúng trong thao tác tạo thể đa bội in vitro để nhân giống cây trồng và cải
thiện cây trồng.
GIỚI THIỆU
Đa bội, là trạng thái có nhiều hơn hai bộ nhiễm sắc thể, từ lâu đã được công
nhận là động lực chính của q trình tiến hóa và hình thành thực vật (Soltis và
cộng sự, 2009). Các thể đa bội tự nhiên đã được xác định trong một loạt các đơn
vị phân loại và các ước tính gần đây cho thấy rằng hầu hết tất cả các thực vật
hạt kín hiện nay đã trải qua các sự kiện đa bội trong lịch sử tiến hóa của chúng
(Soltis và Burleigh, 2009). Các lợi thế tiến hóa/ thích nghi tiềm năng của thể đa
bội bao gồm tăng ưu thế lai, dư thừa gen và độ bền đột biến, và tính dẻo kiểu
hình (Comai, 2005; Sattler et al., 2015).
Sự cảm ứng đa bội nhân tạo có thể cung cấp một cơng cụ có giá trị để hỗ trợ cho
việc tìm hiểu các q trình tiến hóa và tạo điều kiện cho các chương trình cải

tiến và nhân giống cây trồng. Các thể đa bội thường sở hữu những đặc điểm ưu
thế như lá dày hơn, màu sẫm hơn; hoa to hơn, lâu tàn hơn và cánh hoa dày hơn;
sức sống mạnh hơn; khả năng chống chịu với áp lực môi trường, sâu bệnh và
mầm bệnh cao hơn; tăng sản xuất các chất chuyển hóa và có thể phục hồi khả


năng sinh sản ở các con lai rộng vô sinh (Kehr, 1996; Comai, 2005; Ranney,
2006; Banyai et al, 2009). Tuy nhiên, việc đưa thể đa bội vào các chương trình
nhân giống cây trồng thường đòi hỏi phải tạo ra các thể đa bội mới.
Nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro chủ yếu được cảm ứng bằng cách sử dụng
colchicine, một tác nhân kháng phân bào. Tuy nhiên, thuốc diệt cỏ oryzalin và
trifluralin, thường được ưa chuộng hơn do độc tính thấp hơn, ái lực cao hơn với
tubulin thực vật và đạt hiệu quả ở nồng độ thấp hơn. Sự thành cơng của các quy
trình nhân đơi nhiễm sắc thể in vitro phụ thuộc vào hiệu quả của các chất kháng
phân bào để tạm thời ngăn chặn sự phân chia tế bào (cytokinesis) trong mơ đang
phát triển tích cực. Trong khi thời gian tiếp xúc và nồng độ của các chất kháng
phân bào là rất quan trọng cho việc nhân đôi nhiễm sắc thể, một số yếu tố khác
như loại mô, phương pháp áp dụng, điều kiện nuôi cấy và sự khác biệt về lồi
có thể ảnh hưởng đến hiệu quả của việc nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro. Các
quy trình nhân đơi nhiễm sắc thể in vitro chun biệt loài riêng cho các đơn vị
phân loại đa dạng và có giá trị đã được báo cáo rộng rãi (Bảng 1). Trong bài
tổng quan này, chúng tôi sẽ khám phá các chất ức chế phân bào và xem xét các
yếu tố ảnh hưởng đến thao tác tạo đa bội in vitro và cung cấp các lĩnh vực có
thể cho nghiên cứu xa hơn.
LỊCH SỬ
Cảm ứng đa bội nhân tạo ở thực vật lần đầu tiên được báo cáo vào cuối những
năm 1930 với Blakeslee và Avery (1937) chứng minh việc sử dụng colchicine
để nhân đôi nhiễm sắc thể của một số loài. Nhiều nghiên cứu đã khảo sát ảnh
hưởng của colchicine đến thao tác tạo thể đa bội ngay sau báo cáo đầu tiên này
(xem Dunham và Banta, 1940). Mối quan tâm đến thể đa bội tăng lên nhanh

chóng, và vào năm 1941, The American Naturalist đã xuất bản cuốn “Hội nghị
chuyên đề về các khía cạnh lý thuyết và thực tiễn của thể đa bội ở cây trồng”
(The American Naturalist, 1941). Trong tập xuất bản đó, Emsweller và Ruttle
(1941) lần đầu tiên thảo luận về giá trị của thể đa bội được cảm ứng đối với việc
cải tạo cây cảnh. Kể từ những nghiên cứu ban đầu này, sự nhân đôi của nhiễm
sắc thể đã trở thành một phần khơng thể thiếu trong các chương trình nhân
giống cho nhiều loại cây trồng quan trọng về kinh tế.
Những tiến bộ trong nuôi cấy mô thực vật vào những năm 1960 đã tạo ra những
cơ hội mới để phát triển các thể đa bội. Murashige và Nakano (1966) đã phân
lập các tế bào tứ bội từ rễ của cây thuốc lá lưỡng bội và sử dụng nuôi cấy in
vitro để ổn định và tạo ra các cây tứ bội. Ngay sau đó, Heinz và Mee (1970) đã


báo cáo việc sử dụng colchicine để tạo huyền phù tế bào mía đa bội. Hussey và
Hypher (1978) phục hồi củ cải đường tứ bội bằng cách xử lý cây con in vitro
với colchicine. Hai thập kỷ qua đã chứng kiến sự gia tăng đáng kể trong việc
ứng dụng cảm ứng tạo thể đa bội in vitro. Sự gia tăng này một phần có thể là do
sự phát triển và gia tăng của các quy trình ni cấy mơ cho một loạt các đơn vị
phân loại khác nhau.
CÁC TÁC NHÂN CHỐNG PHÂN BÀO
Thao tác tạo đa bội in vitro phụ thuộc vào việc phá vỡ chu kỳ tế bào để ngăn
chặn sự di chuyển về cực của nhiễm sắc thể trong anaphase. Các hóa chất khác
nhau, từ caffein (Thomas và cộng sự, 1997) và oxit nitơ (Taylor và cộng sự,
1976) đến thuốc diệt cỏ kháng vi ống đều được chứng minh là có thể cảm ứng
đa bội. Tuy nhiên, một số hợp chất kháng vi ống, chẳng hạn như colchicine và
oryzalin, được ưu tiên sử dụng in vitro để cảm ứng đa bội thành cơng (Bảng 2).
Colchicine
[N-5,6,7,9-tetrahydro-1,2,3,10-tetra-methoxy-9-oxobenzo
(a)
heptalen-7-yl] acetamide có lẽ là chất ức chế phân bào được sử dụng phổ biến

nhất và đã được sử dụng để phục hồi đa bội ở nhiều loài (Bảng 1). Colchicine
được chiết xuất từ củ của cây crocus mùa thu (Colchicum autumnale) và được
sử dụng rộng rãi như một loại thuốc điều trị bệnh gút và các bệnh viêm nhiễm
khác. Là một chất kháng phân bào, colchicine phá vỡ chu kỳ tế bào, bắt đầu từ
metaphase, nơi nó làm mất ổn định các vi ống bằng cách liên kết với tiểu đơn vị
ꞵ-tubulin để tạo thành phức hợp colchicine-tubulin. Do đó, colchicine ngăn
chặn quá trình trùng hợp (polymerization) vi ống, mà khơng ảnh hưởng đến quá
trình khử trùng hợp, dẫn đến sự phân hủy vi ống (Leung et al, 2015). Trong
nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro, colchicine có ưu điểm là hịa tan trong dung
dịch nước, bền nhiệt, có thể hấp khử trùng và dễ dàng áp dụng cho các mô thực
vật. Tuy nhiên, colchicine có ái lực liên kết cao với các vi ống của động vật và
có khả năng gây độc cho người (Morejohn và cộng sự, 1984). Ngược lại,
colchicine có ái lực liên kết tương đối thấp với các vi ống của thực vật, địi hỏi
nó phải được sử dụng ở nồng độ cao để duy trì hiệu quả.
Nói chung, một số loại thuốc diệt cỏ cung cấp các giải pháp thay thế khả thi cho
colchicine trong việc thao tác tạo đa bội in vitro. Người ta ước tính rằng khoảng
25% chất diệt cỏ hoạt động bằng cách ảnh hưởng đến quá trình nguyên phân
(Vaughn và Lehnen, 1991). Thuốc diệt cỏ bao gồm một số nhóm hóa học khác
nhau có hoạt tính kháng phân bào, bao gồm dinitroanilines (oryzalin, trifluralin,
lactilin) (Morejohn và cộng sự, 1987; Hugdahl và Morejohn, 1993),


phosphorothioamidates (amipro-phos-methyl) (Murthy và cộng sự, 1994 ),
benzamit (propyzamit) (Bartels và Hilton, 1973), xyanoacrylat (etyl (2Z) -3amino-2-xyano-4-etylhex-2-enoat) (Tresch và cộng sự, 2005), và cacbonat
(chlorpropham , propham).
Dinitroanilines là loại thuốc diệt cỏ phổ biến nhất được sử dụng trong thao tác
tạo đa bội in vitro. Dinitroaniline cho thấy có ái lực liên kết cao với các tubulin
thực vật ở nồng độ thấp trong khi ít có ái lực liên kết với các tubulin động vật
(Morejohn và cộng sự, 1987; Hugdahl và Morejohn, 1993). Nhóm hợp chất này
hoạt động tương tự như colchicine để phá vỡ quá trình nguyên phân trong

metaphase. Dinitroaniline liên kết với α-tubulin để tạo thành phức hợp tubulindinitroaniline để ngăn chặn quá trình trùng hợp vi ống.
Các dinitroaniline chứa nhiều hợp chất có thể được chia thành các hợp chất đối
xứng (ví dụ, oryzalin, trifluralin) và khơng đối xứng (ví dụ, lacmethalin) tương
tác khác biệt với α-tubulin (xem Ma và cộng sự, 2010). Trong một nghiên cứu
toàn diện đánh giá tác động của 12 loại dinitroaniline khác nhau lên ký sinh
trùng đơn bào, Toxoplasma gondii, biểu hiện ở kiểu hoang dã nhạy cảm với
oryzalin và đột biến α-tubulin gây ra kháng oryzalin, Ma và cộng sự (2010) phát
hiện ra rằng các hợp chất không đối xứng dinitramine và pendimethalin chứng
tỏ sự ức chế tăng lên. Tương tự, một số chất tương tự trifluralin cho thấy hiệu
quả liên kết tăng lên với α-tubulin của sinh vật đơn bào Trypanosoma brucei
(Giles et al., 2009). Những nghiên cứu này đã cho thấy rằng những khác biệt
nhỏ không đặc hiệu về đặc tính của các vị trí liên kết α-tubulin có thể ảnh hưởng
đến sự tương tác với các nhóm chức của các dinitroaniline khác nhau.
Đối với các loài thực vật, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các đột biến đối với vị
trí liên kết α-tubulin có thể làm thay đổi ái lực liên kết và tạo ra khả năng kháng
dinitroanilines, đặc biệt là oryzalin và trifluralin (Anthony và Hussey, 1999;
Chu và cộng sự, 2018). Điều này có thể có ý nghĩa đối với thao tác tạo đa bội in
vitro, vì các nghiên cứu chủ yếu về oryzalin và trifluralin (Bảng 1), chỉ có một
số báo cáo hạn chế về các dinitroaniline thay thế như pendamethalin (Ren et al.,
2018), dinitramine (Nasr et al. , 2004), ethylfluralin (Mitrofanova và cộng sự,
2003), và butralin (Nasret cộng sự, 2004). Với sự đa dạng về cấu trúc trong
dinitroanilines, các hợp chất khác nhau có thể mang lại hiệu quả cao hơn trong
việc phục hồi các thể đa bội ở các lồi khó xử lý (recalcitrant species).
Các amide phosphoric là một nhóm thuốc diệt cỏ khác có hoạt tính kháng phân
bào, trong đó amiprophos-metyl (APM) đã được sử dụng để nhân đôi nhiễm sắc


thể in vitro (Khosravi và cộng sự, 2008). Amiprophos-methyl cho thấy có ái lực
cao với α-tubulin trong cây thuốc lá và có thể nhắm mục tiêu vào các vị trí liên
kết tương tự như oryzalin (Murthy và cộng sự, 1994). Một ưu điểm của APM là

nó khả năng hịa tan trong nước tăng so với dinitroaniline, do đó sẽ giảm việc sử
dụng thêm dung môi. Tương tự, các benzamide, đặc biệt là propyzamide đã cho
thấy khả năng nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro (Cai et al., 2016). Propyzamide
cũng nhắm mục tiêu vào các vị trí liên kết tương tự như oryzalin (Bartels và
Hilton, 1973). Cyanoacrylate là một nhóm chất chống phân bào khác có cơ chế
tương tự như dinitroaniline (Tresch và cộng sự, 2005). Tương tự như APM và
propyzamide, các cyanoacrylat, ethyl (2Z) - 3-amino-2-cyano-4-ethylhex-2enoate (CA1) và CA2 liên kết với α-tubulin tại các vị trí tương tự như oryzalin
(Tresch et al. , 2005). Tuy nhiên, chúng vẫn chưa được sử dụng để cảm ứng tạo
đa bội in vitro.
Nitơ oxide cũng đã được báo cáo là cảm ứng tạo đa bội (Taylor và cộng sự,
1976). Cơ chế hoạt động vẫn chưa rõ. Tuy nhiên, Kitamura và cộng sự (2009)
cho rằng Nitơ oxide có thể cảm ứng đa bội bằng cách ức chế sự trùng hợp vi
ống. Có khả năng là Nitơ oxide tương tác với tyrosine để tạo thành nitrotyrosine
(Neill và cộng sự, 2003). Nitrotyrosine có thể thay thế tyrosine trong α-tubulin
và ảnh hưởng đến quá trình trùng hợp (Blume và cộng sự, 2013; Lipka và
Müller, 2014). Lipka và Müller (2014) nhận thấy rằng nitrotyrosine ở
Arabidopsis thaliana một mình ức chế quá trình trùng hợp vi ống, nhưng làm
giảm độ nhạy cảm với oryzalin do thay đổi vị trí liên kết α-tubulin. Tuy nhiên,
Jovanovic´ và cộng sự (2010) đã chứng minh rằng nitrotyrosine làm tăng độ
nhạy của nuôi cấy tế bào Nicotiana tabacum L. đối với oryzalin, cho thấy
nitrotyrosine có thể cung cấp thêm chất kháng vi ống (antimicrotubule
qualities).
Trái ngược với các chất kháng vi ống (antimicrotubule agents), thuốc diệt cỏ
carbamate, chẳng hạn như propham hoặc chlorpropham, hoạt động để phá vỡ
nguyên phân mà không ảnh hưởng đến quá trình trùng hợp hoặc mất ổn định
của vi ống. Thay vào đó, cacbamat hoạt động để phá vỡ và phân mảnh các cực
trong tế bào, dẫn đến sự di chuyển của nhiễm sắc thể theo đa cực chứ không
phải lưỡng cực (Vaughn và Lehnen, 1991). Do đó, khơng chắc rằng cacbamat sẽ
có hiệu quả trong việc phát triển các thể đa bội.
Khơng có báo cáo nào về việc sử dụng các chất ức chế proteasome được sử

dụng cho các thao tác tạo thể đa bội in vitro. Tuy nhiên, các chất ức chế
proteasome như lactacystin và MG132, can thiệp vào các protein điều hòa quan


trọng chi phối quá trình chuyển tiếp metaphase, anaphase và cytokinesis
(Planchais et al., 2000). Một hạn chế của các chất ức chế proteasome là các
phương pháp xử lý không thể đảo ngược hồn tồn (Planchais et al., 2000).
Một nhóm chất ức chế chu kỳ tế bào khác, bao gồm hydroxyurea và
aphididcolin, hoạt động để bắt giữ chu kỳ tế bào ở đầu pha S. Sau khi loại bỏ
chất ức chế, các tế bào tiến triển qua pha S, G2 và M một cách đồng bộ
(Darzynkiewicz và cộng sự, 2011). Mặc dù các hợp chất này không ảnh hưởng
trực tiếp đến thể đa bội, nhưng chúng có thể được sử dụng trong các phương
pháp xử lý để tạo điều kiện đồng bộ hóa chu kỳ tế bào và tối đa hóa số lượng tế
bào bị ảnh hưởng bởi chất kháng vi ống, do đó làm giảm cytochimeras (các tế
bào phân bào/ các tế bào không đồng nhất???).
TỔNG QUAN – CẢM ỨNG TẠO ĐA BỘI IN VITRO
Sự thành công của cảm ứng tạo đa bội in vitro được tích hợp rất nhiều với việc
phát triển các quy trình ni cấy in vitro hiệu quả. Các hệ thống nuôi cấy mô
thực vật thường tỏ ra khó khăn đối với nhiều đơn vị phân loại, đặc biệt là cây
thân gỗ và chỉ có một số lồi hạn chế được ni cấy mơ thành cơng. Việc phát
triển quy trình thường cần được tiến hành đối với từng lồi và thường đối với
từng dịng để tối ưu hóa các quy trình tái sinh có thể được áp dụng cho cảm ứng
tạo đa bội in vitro. Tuy nhiên, việc nhân đôi nhiễm sắc thể thành công đã đạt
được đối với một số lượng đáng kể các loài đại diện cho nhiều họ và chi (Bảng
1).
CÁC YẾU TỐ QUAN TRỌNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN CẢM ỨNG ĐA BỘI
IN VITRO
Loại mô
Thao tác tạo đa bội in vitro phụ thuộc nhiều vào sự sẵn có của các hệ thống tái
sinh in vitro thành cơng. Mặc dù mơ phân sinh đỉnh có thể được xử lý in vitro,

nhưng sự tái sinh thông qua hình thành phơi soma hoặc hình thành chồi rất được
mong muốn đối với các phương pháp xử lý cảm ứng đa bội. Khả năng tái sinh
toàn bộ cây từ một hoặc chỉ một vài tế bào có thể cải thiện sự phát triển của các
cây đa bội đồng nhất và giảm thiểu khả năng xuất hiện các tế bào phân bào
(cytochimeras). Các hệ thống tái sinh tạo cơ quan hoặc tạo phôi đã được sử
dụng để nhân đôi nhiễm sắc thể cho một số loài (Bảng 1). Đối với Echinacea
purpurea, các đa bội được tái sinh từ các cuống lá được xử lý bằng colchicine
(Nilanthi et al., 2009). Tương tự, sự phát sinh cơ quan từ lá Populus sp. được xử


lý bằng oryzalin dẫn đến đa bội. Sakhanokho và cộng sự. (2009) xử lý mô sẹo
tạo phôi của Hedychium muluense bằng colchicine hoặc oryzalin để phát triển
các thể đa bội đồng nhất. Hơn nữa, các hệ thống tái sinh trong ống nghiệm rất
cần thiết để phát triển các thể đa bội. Hansen và Andersen (1998) tái sinh đa bội
từ vi bào tử của Triticum aestivum được xử lý bằng colchicine. Trong một
nghiên cứu khác, Yuan và cộng sự (2015) tái sinh đa bội từ rễ in vitro được xử
lý bằng colchicine của thể đơn bội Brassica sp.
Tuy nhiên, các hệ thống tái sinh in vitro thông qua phát sinh cơ quan và phát
sinh phôi soma chỉ mới được phát triển cho một số lồi tương đối ít và cách tiếp
cận này có thể dẫn đến sự biến đổi dịng soma lớn hơn do đột biến và thay đổi
biểu sinh (epigenetic changes) (Bairu et al., 2007). Đối với nhiều loại cây trồng,
sự phát triển của hệ thống tái sinh in vitro có những thách thức riêng và các mơ
thay thế có thể cần được xem xét. Do đó, các đoạn nốt và đỉnh chồi là những mô
được sử dụng rộng rãi nhất để nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro (Bảng 1).
Để thu được các thể đa bội đồng nhất bằng cách sử dụng các đoạn nốt và đỉnh
chồi, tất cả các tế bào ban đầu trong ba lớp mô phân sinh cần phải chịu tác động
của tác nhân kháng phân bào (Dermen, 1953; Klekowski, 2003). Nếu tất cả các
tế bào ban đầu không bị ảnh hưởng, thể đa bội hỗn hợp (mixoploids) hoặc
cytochimeras có thể hình thành. Thể đa bội hỗn hợp (Mixoploids) đã được quan
sát thấy rộng rãi trong q trình nhân đơi nhiễm sắc thể in vitro của một loạt các

loài, bao gồm: Acer platanoides (Lattier và cộng sự, 2013), Helleborus sp.
(Dhooghe và cộng sự, 2009b), Hypericum sp. (Meyer et al., 2009),
Lagerstroemia indica (Zhang et al., 2010), Rhododendron hybrid (Väinölä,
2000; Hebert et al., 2010), Rosa rugosa (Allum et al., 2007), Ranunculus
asiaticus (Dhooghe et al., 2009a), Tulipa gesneriana (Chauvin et al., 2005), và
Vitis sp. (Notsuka và cộng sự, 2000; xem Bảng 1).
Mô đa bội hỗn hợp (Mixoploid tissue) thường khơng ổn định và có xu hướng
chọn lọc lưỡng bội cao và có thể trở lại trạng thái đa bội ban đầu. Chọn lọc
lưỡng bội có thể xảy ra khi các tế bào lưỡng bội (hoặc đa bội thấp) (có ít DNA
hơn) có thể sao chép và phân chia nhanh hơn so với các tế bào đa bội cao hơn ở
lân cận (Dermen, 1953; Klekowski, 2003). Theo thời gian, tỷ lệ tế bào đa bội
thấp hơn tăng lên dẫn đến sự mất đi các tế bào đã được chuyển đổi. Ví dụ,
Hussey và Hypher (1978) đã ghi nhận củ cải đường cytochimeral (Mô đa bội
hỗn hợp) sau khi xử lý với colchicine và quan sát thấy rằng các tế bào đa bội
biến mất qua các lần nuôi cấy tiếp theo. Tương tự, Lattier và cộng sự. (2013)


phát hiện ra rằng đối với Acer platanoides, các mô đa bội hỗn hợp trở lại thành
lưỡng bội trong khoảng thời gian 6 tháng.
Một cách tiếp cận khác là xử lý hạt bằng chất ức chế kháng phân bào trước khi
thiết lập nuôi cấy in vitro. Hannweg và cộng sự. (2013) đã xử lý hạt giống cây
cỏ Crocosmia bằng 0,25 µM colchicine qua đêm hoặc 25 µM colchicine trong 3
ngày trước khi đưa chúng vào nuôi cấy mô. Cảm ứng cao nhất của các thể tứ
bội đồng hợp (29,82%) đạt được với xử lý 0,25 µM qua đêm.
Lựa chọn và tiếp xúc với các tác nhân kháng phân bào
Cảm ứng đa bội rất khác nhau giữa các loài và giống cây trồng và phụ thuộc vào
tác nhân kháng phân bào, loại mô và điều kiện nuôi cấy (Bảng 1). Trong khi các
chất diệt cỏ dinitroaniline có ái lực cao với các tubulin thực vật và gần đây,
ngày càng được sử dụng nhiều hơn để nhân đôi nhiễm sắc thể in vitro,
colchicine vẫn là một tác nhân phân bào có hiệu quả cao đối với nhiều loài.

Morejohn và cộng sự. (1984) đã chỉ ra rằng hiệu quả gắn kết của colchicine với
tubulin thực vật khác nhau đáng kể giữa các loài, và colchicine vẫn là tác nhân
kháng phân bào hiệu quả nhất và được sử dụng nhiều đối với các loài như
Populus hopeiensis (Wu và cộng sự, 2020).
Colchicine rõ ràng là tác nhân kháng phân bào được sử dụng nhiều nhất (Bảng
1), bất kể những nhược điểm đã được ghi nhận rõ ràng (Dhooghe và cộng sự,
2009a), và đã được sử dụng cho nhiều lồi khác nhau từ thân thảo (ví dụ:
Echinacea purpurea; Nilanthi et al. ., 2009) đến cây thân gỗ (ví dụ,
Chaenomeles japonica; Stanys và cộng sự, 2006). Sự thành công rộng rãi của
colchicine như một chất ức chế kháng phân bào đã dẫn đến việc nó được sử
dụng liên tục và thường xuyên trong các nghiên cứu gần đây hơn, ví dụ như
Bletilla striata (Pan-pan và cộng sự, 2018), Petuna axillaris (Regalado và cộng
sự, 2017) và Populus Hopeiensis (Wu và cộng sự, 2020). So với colchicine,
oryzalin đã được sử dụng thành cơng để tạo ra các dịng đa bội của cây thân gỗ
và bán thân gỗ bao gồm Rosa (Kermani và cộng sự, 2003), Rhododendron
(Hebert và cộng sự, 2010), Chaenomeles (Stanys và cộng sự, 2006), Hypericum
(Meyer et al., 2009), và Acer platanoides (Lattier et al., 2013; Bảng 1). Hơn
nữa, oryzalin đã được chứng minh là hiệu quả hơn colchicine trong việc nhân
đôi nhiễm sắc thể in vitro đối với Chaenomeles japonica (Stanys và cộng sự,
2006), Rhododendron sp. (Väinölä, 2000), Watsonia lepida (Ascough et al.,
2008), và Ranunculus asiaticus (Dhooghe et al., 2009a).


Nồng độ và thời gian tiếp xúc với các hợp chất kháng phân bào là những yếu tố
luôn được khảo sát. Trong khi mức độ phơi nhiễm thấp khơng có hiệu quả và
mức độ cao gây chết mẫu, sự tương tác giữa thời gian tiếp xúc và nồng độ vẫn
chưa được hiểu đầy đủ. Đối với oryzalin, Meyer và cộng sự (2009) phát hiện ra
rằng nồng độ ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ sống sót và cảm ứng đa bội của mô
sẹo Hypericum sp.; tuy nhiên, thời gian tiếp xúc khơng ảnh hưởng gì. Tương tự,
nồng độ và thời gian tiếp xúc của oryzalin không phải là những yếu tố có ý

nghĩa trong việc gây ra đa bội ở các cây lai Rhododendron (Väinölä, 2000). Đối
với Populus hopeiensis, cả nồng độ và thời gian tiếp xúc với colchicine đều là
những yếu tố có ý nghĩa lớn ảnh hưởng đến đa bội. Đối với Rosa sp. mối quan
hệ giữa nồng độ và thời gian tiếp xúc với oryzalin dường như phụ thuộc vào
loại mô (Kermani và cộng sự, 2003; Allum và cộng sự, 2007). Kermani và cộng
sự. (2003) nhận thấy thời gian giảm đối với oryzalin được yêu cầu khi sử dụng
các đoạn nốt 1 mm so với đỉnh chồi. Tương tự, Allum và cộng sự (2007) nhận
thấy kích thước đoạn nốt ảnh hưởng đến thời gian tiếp xúc với oryzalin. Allum
và cộng sự. (2007) cho rằng để đảm bảo nhiễm sắc thể nhân đôi, thời gian tiếp
xúc phải đủ lâu để tối đa hóa số lượng tế bào trong quá trình nguyên phân và
tiếp xúc với các hợp chất kháng phân bào.
Độ hòa tan liên quan đến ái lực liên kết với tubulin là một yếu tố khác cần xem
xét khi lựa chọn một chất kháng phân bào. Ví dụ, colchicine hịa tan cao trong
nước (> 1,5M) và có thể dễ dàng thêm vào môi trường nuôi cấy tiêu chuẩn,
nhưng có ái lực liên kết tương đối thấp với các tubulin thực vật (Morejohn và
cộng sự, 1987). Ngược lại, dinitroaniline tương đối khơng hịa tan trong dung
dịch nước, với oryzalin đạt đến độ bão hịa ở <7,5 µM trong nước, nhưng
thường liên kết với các tubulin thực vật ở nồng độ dưới 500 nM (Morejohn và
cộng sự, 1987). Điều thú vị là nồng độ hoạt động của oryzalin thường được sử
dụng để cảm ứng đa bội thường vượt quá cả ái lực liên kết và nồng độ hòa tan
(Bảng 1). Trong khi sự khác biệt giữa các loài về tính đặc hiệu của oryzalin đối
với các tubulin có thể giải thích cho một số thay đổi (Ma và cộng sự, 2010), sự
tương tác giữa nồng độ oryzalin ngoại sinh và tubulin nội bào vẫn chưa rõ ràng.
Phương pháp phổ biến nhất để ứng dụng chất ức chế kháng phân bào in vitro là
xử lý trong dung dịch hoặc môi trường lỏng, sau đó là phục hồi các mơ trên môi
trường tái sinh hoặc nhân giống, tuy nhiên, trong một số trường hợp, việc bổ
sung chất kháng phân bào vào môi trường đặc đã thành công để phát triển các
thể đa bội. Đối với Hypericum sp., các thể đa bội được phát triển sau khi cho
mô sẹo tái sinh tiếp xúc với oryzalin trong môi trường lỏng từ 3 đến 9 ngày

(Meyer et al., 2009). Ngược lại, Dhooghe et al. (2009a) đã sử dụng mơi trường
đặc có chứa oryzalin để tạo ra thể đa bội ở Ranunculus asiaticus.
Thông thường, các chất kháng phân bào được thêm vào mơi trường có thành
phần tương tự như mơi trường ni cấy in vitro. Có thể các thành phần mơi
trường cũng có thể tương tác với các chất kháng phân bào để ảnh hưởng đến sự
nhân đơi của nhiễm sắc thể. Ví dụ, hiệu quả của dinitroaniline liên kết với αtubulin bị ảnh hưởng đáng kể bởi pH và sucrose (Morejohn và cộng sự, 1987;
Hugdahl và Morejohn, 1993). Trong các thử nghiệm liên kết tubulin, Hugdahl
và Morejohn (1993), cho thấy ái lực liên kết oryzalin tăng gấp ba lần khi pH
tăng từ 6,0 lên 7,0. Hơn nữa, các tác giả này lưu ý rằng sucrose có thể thay đổi
sự tương tác giữa oryzalin và tubulin (Hugdahl và Morejohn, 1993). Sucrose và
pH là hai thành phần quan trọng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật và cần
được xem xét khi phát triển các quy trình tạo đa bội in vitro.
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật cũng có thể tương tác với các chất kháng
phân bào. Lattier và cộng sự. (2013) cho thấy việc bổ sung cytokinin 6-benzyl
amino purine (BA) vào môi trường chứa oryzalin làm tăng tỷ lệ chết chồi ở
nồng độ oryzalin cao hơn. Họ gợi ý rằng BA có thể hoạt động để tăng chu kỳ
của tế bào, tạo ra các tế bào chuyển đổi nhanh hơn từ metaphase sang anaphase,
nơi chúng có thể nhạy cảm với oryzalin (Lattier và cộng sự, 2013). Xem xét các
thành phần môi trường khi phát triển các quy trình thao tác tạo đa bội in vitro có
thể tối đa hóa hiệu quả nhân đơi nhiễm sắc thể.
ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ TRƯỚC VÀ SAU
Trong một số trường hợp, các biện pháp xử lý trước đã được sử dụng để tạo
điều kiện đồng bộ hóa chu kỳ tế bào nhằm tối đa hóa tác dụng của các chất
kháng phân bào. Lattier và cộng sự. (2013) phát hiện thấy đối với các đoạn nốt
của Acer platanoides, nuôi cấy 7 ngày trên môi trường được bổ sung hỗn hợp
của 4 µM BAP và 1 µM IAA trước khi xử lý oryzalin, đã làm tăng đáng kể số
lượng các thể tứ bội ổn định được phục hồi. Tương tự, Wu và cộng sự (2020)
nhận thấy phiến lá của Populus hopeiensis được ni cấy trên 1,78 µM BAP,
0,07 µM TDZ và 0,53 µM IAA trong 7 ngày trước khi xử lý colchicine làm tăng

đáng kể cảm ứng đa bội. Ngược lại, đối với Tulipa gesneriana, ủ đĩa mẫu thân
trong 2 tuần trên mơi trường bổ sung 4 µM BAP, 15 µM 2-iP và 4 µM NAA
không ảnh hưởng đến sự cảm ứng đa bội (Chauvin et al., 2005).
Điều kiện nuôi cấy sau khi xử lý với các chất kháng phân bào cũng được chứng
minh là ảnh hưởng đến sự nhân đôi của nhiễm sắc thể. Niimi và cộng sự. (2015)


nhận thấy rằng việc nuôi cấy các cây lai Raphanobrassica trên mơi trường có
chứa nitrat bạc (AgNO3) hoặc aminoethoxyvinylglycine (AVG) sau khi xử lý
với chất ức chế phân bào APM làm tăng tỷ lệ sống của mô và đa bội hóa. Các
hợp chất này ức chế sản xuất ethylene và đã được chứng minh là làm giảm sự
úa, dẫn đến tỷ lệ phục hồi của các mô bị ảnh hưởng bởi APM cao hơn.
CẢI TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG
Các tác động của sự nhân đơi tồn bộ bộ gen có thể gây ra những thay đổi di
truyền đáng kể trong biểu hiện gen và chức năng gen và có thể có những ảnh
hưởng đáng kể đối với sự phát triển và chọn giống cây trồng. Các tác động cụ
thể của hiện tượng đa bội có thể rất khác nhau giữa các loài và các sự kiện cảm
ứng đa bội.
Những thay đổi về hình thái được báo cáo thường xuyên về phản ứng với sự
nhân đơi của nhiễm sắc thể. Tăng kích thước khí khổng thường được sử dụng để
xác định sự nhân đôi của nhiễm sắc thể (Stanys và cộng sự, 2006; Dhooghe và
cộng sự, 2010). Các đặc điểm như kích thước và độ dày của lá (Väinölä, 2000;
Dunn và Lindstrom, 2007), kích thước và số lượng chùm hoa (Kermani et al.,
2003; Allum et al., 2007; Oates et al., 2012) chiều dài lóng và chiều cao cây
(Liu và cộng sự, 2007; Oates và cộng sự, 2012) đều được báo cáo là bị ảnh
hưởng bởi sự nhân đôi của nhiễm sắc thể. Sự gia tăng đa bội cũng có liên quan
đến sự gia tăng kích thước và sinh khối. Ví dụ, nhiều loại cỏ được sử dụng làm
nguyên liệu cung cấp năng lượng sinh học là loại đa bội (Lambertini, 2019).
Cảm ứng đa bội in vitro cũng có thể tạo điều kiện phát triển các cây giống cải
tiến, không xâm lấn (non-invasive), không hạt. Một trong những phương tiện

hiệu quả nhất để phát triển cây không hạt là tạo ra các cây tam bội (cây có 3 bộ
nhiễm sắc thể) bằng cách lai giữa cây lưỡng bội với cây tứ bội được cảm ứng
nhân tạo (Ranney, 2006). Cách tiếp cận này đã thành cơng đối với một số lồi
bao gồm Miscanthus sinensis (Rounsaville và cộng sự, 2011).
Bất thụ lai (Hybrid sterility), còn được gọi là bất thụ nhiễm sắc thể
(chromosomal sterility), thường xảy ra do sự bắt cặp nhiễm sắc thể không đúng
trong quá trình giảm phân do sự khác biệt về cấu trúc trong nhiễm sắc thể của
bố mẹ (Ranney, 2006; Contreras và cộng sự, 2007). Trong nhiều trường hợp, sự
nhân đôi nhiễm sắc thể của con lai bất thụ, do đó phát triển thể dị bội, cung cấp
thể tương đồng cho các nhiễm sắc thể bắt cặp trong quá trình giảm phân và phục
hồi khả năng sinh sản. Nhân đôi nhiễm sắc thể đã thành công trong việc khôi
phục khả năng sinh sản ở các giống lai rộng Rhododendron ‘Fragrant Affinity’


(Contreras et al., 2007), × Chitalpa tashkentensis (Olsen et al., 2006), và
Rudbeckia sp. (Oates và cộng sự, 2012). Hơn nữa, việc nhân đôi nhiễm sắc thể
đã phục hồi khả năng sinh sản cho cỏ năng lượng sinh học tam bội, Miscanthus
× giganteus (Touchell và Ranney, 2012).
CÁC CƠ HỘI TRONG TƯƠNG LAI
Sự phát triển và cải tiến trong tương lai của các quy trình thao tác tạo đa bội in
vitro hiệu quả, đáng tin cậy và có thể lặp lại có thể xem xét nhiều yếu tố:
(1) Sự phát triển của các hệ thống tái sinh hiệu quả. Tái sinh thông qua phát sinh
cơ quan và phát sinh phơi soma có thể tạo điều kiện giảm cytochimeras (hỗn
hợp tế bào đa bội khác nhau ???) và tăng sản xuất thể đa bội đồng nhất. Tuy
nhiên, các hệ thống tái sinh đã được phát triển cho một số ít cây trồng và trong
hầu hết các trường hợp, các nghiên cứu cảm ứng đa bội tập trung vào việc sử
dụng các đỉnh chồi hoặc các đoạn nốt.
(2) Khám phá sự đa dạng của các chất ức chế phân bào. Các nghiên cứu thao tác
tạo đa bội in vitro chủ yếu tập trung vào một số lượng nhỏ các tác nhân kháng
phân bào. Xem xét sự đa dạng trong phạm vi cấu trúc của các chất kháng vi

ống, đặc biệt là thuốc diệt cỏ, có cơ hội đáng kể để khám phá thêm về hiệu quả
của chúng trong thao tác tạo đa bội in vitro.
(3) Xem xét tương tác với các thành phần môi trường. Quy trình in vitro thường
dành riêng cho từng lồi và mỗi đơn vị phân loại yêu cầu các thành phần môi
trường chuyên biệt. Ảnh hưởng của sự tương tác của các thành phần môi trường
đối với sự cảm ứng đa bội ít được chú ý. Xem xét pH, sucrose và các chất điều
hịa sinh trưởng có thể tương tác với các chất ức chế phân bào, điều quan trọng
là phải tích hợp các quy trình in vitro với thao tác tạo đa bội.
(4) Tinh chỉnh điều kiện nuôi cấy trước và sau khi xử lý. Một số nghiên cứu đã
phát hiện ra các phương pháp xử lý trước và sau có lợi trong việc tối đa hóa khả
năng sống sót và đa bội đồng nhất. Các phương pháp xử lý này có thể hoạt động
để đồng bộ hóa chu kỳ tế bào và điều hòa các phản ứng sinh lý đối với các điều
kiện stress do chất ức chế phân bào gây ra.