SInh tổng hợp IAA

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài: Phân lập và định danh một số chủng vi
khuẩn có khả năng sinh tổng hợp AIA


Người hướng dẫn : PGS.TS Phạm Việt Cường
NSVTH : Nguyễn Thị Hải Anh
Lớp : KS CNSH 10-04
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3
ĐẶT VẤN ĐỀ
1
ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3
3
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4
PHẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỀ
•
Phân bón vi sinh (PBVS) có nhiều ưu điểm nổi trội so với phân bón hóa học,
ngoài tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm, giảm chi

phí sản xuất thì PBVS còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường
và phát triển nền nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất PBVS ở
nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp
do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do
đó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng PBVS là việc làm hết sức
cần thiết. Trong đó, việc tuyển chọn, đánh giá hoạt tính của các chủng VSV là
khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm
•
Ngày nay thực vật sử dụng một số hoocmon để điều chỉnh quá trình sinh
trưởng và phát triển của mình, trong đó nhóm hoocmon gọi là Auxin được tìm
thấy ở hầu hết ở các loài(chất kích thích sinh trưởng ở thực vật). Chính vì đặc
điểm quan trọng đó để ứng dụng rộng rãi trong việc tạo các chế phẩm PBVS
với mục đích làm tăng năng suất cây trồng cũng như năng cao chất lượng của
ngành nông nghiệp.
•
Xuất phát từ lý do trên chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số
chủng VK có khả năng sinh tổng hợp AIA từ đất ” nhằm tìm ra các chủng
VK có hoạt tính để ứng dụng cho nền nông nghiệp nước ta
PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
•
Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu ở Đak Lak-Tây
Nguyên
2.2. Nội dung nghiên cứu
•
Phân lập các chủng vi khuẩn thuần chủng có khả
năng sinh tổng hợp AIA
•
Xác định được một số đặc điểm sinh học của các

chủng vi khuẩn phân lập được.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
•
Phương pháp vi sinh
•
Phương pháp vật lý
•
Phương pháp hoá sinh
•
Phương pháp xử lý số liệu
Phương pháp vi sinh
•
Phân lập vi sinh vật bằng phương pháp đổ đĩa
•
Phương pháp làm sạch, nuôi cấy tăng sinh,giữ chủng giống
•
Phương pháp nhuộm Gram
•
Phương pháp định lượng AIA
Phương pháp vật lý
•
Đo OD
Phương pháp hoá sinh
•
Phương pháp tách DNA tổng số
•
Phản ứng kéo dài chuỗi trùng hợp ( PCR)
•
Phương pháp điện di trên gel agarose
Phương pháp xử lí số liệu

•
Phương pháp đựng đường chuẩn AIA
Pha AIA ở các nồng độ 10,20,30,40,50µg/ml ở môi trường kiềm,mỗi nồng độ
AIA nói trên lấy 2ml cho vào các ống nghiệm chứa 8ml thuốc thử salkowski’s
cải tiến,so mẫu ở bước sóng 530nm.Đối chứng 2ml nước cất,thêm 8ml thuốc thử.Dựa
vào chỉ số OD và nồng độ AIA dựng được đường chuẩn:

Dungdịchchuẩn C(mg/l) A
1 10 0.091
2 20 0.22
3 30 0.328
4 40 0.435
5 50 0.521
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Kết quả phân lập
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn
Kí
hiệu
chủng
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Đặc điểm
hình thái tế
bào
Nhuộm
gram
BX-B4 Tròn, màu trắng đục, bề mặt trơn,
bóng, kích thước nhỏ
Hình que
dài,cỡ
nhỏ,đơn độc
-

BX-B2 Hình dạng không đều, màu vàng, bề
mặt trơn ,lồi ,kích thước trung bình
Hình que
ngắn,cỡ
nhỏ,đơn độc
+
Ti-B6 Tròn, màu trắng đục,bề mặt trơn, hơi
lồi, kích thước nhỏ
Hình que
ngắn,cỡ trung
bình,đơn độc
-
CF-B3 Tròn, màu trắng đục, bề mặt trơn
bóng, lồi,kích thước rất nhỏ
Hình que
ngắn,cỡ
tb,đơn độc
-
Bx-B6 Hình dạng không đều,màu trắng đục
,bề mặt trơn,lồi,kích thước trung
bình
Hình que
dài,cỡ tb,đơn
độc
+
Chủng BX-B2
Chủng BX-B6
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào của các
chủng vi khuẩn phân lập được
2.K t qu d ng ng chu nế ả ự đườ ẩ

Biểu đồ 3.1 : Đường chuẩn và phương trình tương
quan giữa chỉ số OD và nồng độ của dung dịch IAA
3.Anh h ng cua nông ô Tryptophan ̀̉ ưở ̉ đ ̣
trong môi tr ng lên ham l ng AIA ̀ ̀ươ ượ
trong dich nuôi cây cua cac chung ́ ̣́ ̉ ̉
nghiên c úư
Hình 3.2 Đồ thị biểu thị sự thay đổi hàm lượng AIA của chủng BX-
B4 khi bổ sung Tryptophan ở các nồng độ khác nhau
Hình 3.2 Đồ thị biểu thị sự thay đổi hàm lượng AIA của chủng BX-
B2 khi bổ sung Tryptophan ở các nồng độ khác nhau
1 M
1500bp
3.1 Kết quả kiểm tra chủng vi khuẩn BX-B2 sau khi tách DNA tổng số
và tiến hành PCR bằng cặp mồi 16S.Sản phẩm PCR được chạy kiểm tra
trên bản gel agarose 1% thể hiện hình 3.3
Hình 3.3 Điện di đồ kết quả chủng
BX-B2 nghiên cứu
•
3.2 Kết quả giải trình tự 16 S Riboxom
Hình 3.4: Bảng so sánh gen ở ngân
hàng gen quốc tế
Hình 3.5 :Trình tự bắt cặp các Nu trong tế
bào của chủng BX-B2
•
Kếtquảgiảitrìnhtựkhisosánhtrênngânhanggennhânthấycó
sựtươngđồngtới98%vớivùnggenđãđượccôngbốlàBacillus
aryabhattai strain IHB B 6821
PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
•

1. Cả 23 chủng nghiên cứu đều có khả năng sinh tổng hợp AIA trong môi trường có
bổ sung Trp. Trong đó có 5 chủng có khả năng sinh tổng hợp AIA mạnh nhất.Lượng Trp
bổ sung vào môi trường ảnh hưởng tới hàm lượng AIA đạt được, trong 3 nồng độ Trp
nghiên cứu, ở nồng độ càng cao, hàm lượng AIA thu được càng cao.
•
2. Trong các chủng nghiên cứu, 1chủng BX-B2 có khả năng sinh tổng hợp AIA mạnh
nhất.
•
3. Trong quá trình nuôi cấy, sinh khối tế bào không có mối quan hệ tuyến tính với nồng
độ AIA được tạo ra.
•
Chủng BX-B2 đã được giải trình tự 16s ARN riboxom và được so sánh với các trình tự
trong ngân hàng gen quốc tế và cho kết quả chủng BX-B2 tương đồng với Bacillus
aryabhattai strain IHB B 6821 98%
4.1. Kết luận
1. Trên cơ sở nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp
và định danh các chủng nghiên cứu, chúng tôi
kiến nghị nghiên cứu tiếp các chủng có khả năng
sinh AIA cao và ứng dụng chúng vào sản xuất
phân bón vi sinh cung cấp thêm cho cây trồng
một nguồn hoocmon sinh trưởng thực vật quí giá
từ vi sinh vật, giúp cây trồng phát triển mạnh
hơn.
4.2. Kiến nghị
Xin chân thành cảm ơn quý thầy
cô giáo và các bạn đã chú ý lắng
nghe !
Ph l cụ ụ
Thành ph n môi tr ng phân l p Burk (g/l)ầ ườ ậ
•

Môi tr ng Burk (g/l)̀ươ
•
1. Sucrose 10g
•
2. KH
2
PO
4
0,41g
•
3. K
2
HPO
4
0,52g
•
4. CaCl
2
0,2g
•
5. Na
2
SO
4
0,005g
•
6. MgSO
4
0,1g
•

7. FeSO
4
.7H
2
O 0,005g
•
8. Na
2
M
o
O
4
.2H
2
O 0,0625g
•
9. Agar 20g
•
pH =7
Dung d chị
•
Dung d ch dùng trong tách ADN t ng s : m TE pH8 (Tris-Cl: ị ổ ố Đệ
10mM, pH8; EDTA 1 mM pH8). SDS: 10%. NaCl 5M. CTAB/ NaCl
(CTAB: 10%; NaCl 0,7M. Hoà 4,1g NaCl trong 80 ml H
2
O và thêm t ừ
t 10g CTAB trong khi v a un v a khu y. D n Hừ ừ đ ừ ấ ẫ
2
O n 100 ml. đế
Phenol: chloroform: isoamyl alchohol 25:24:1. chloroform : isoamyl

alchohol 24:1). C n tuy t i. C n 70%. Natri axetat 3M pH 5, 2.ồ ệ đố ồ
•
Dung d ch dùng trong ph n ng Salkowski’s: Thu c th Salkowski’s ị ả ứ ố ử
(150 ml H
2
SO
4
c, 7, 5 ml FeClđặ
3
, 250 ml H
2
O).
•
Dung d ch dùng trong nhu m gram: Dung d ch tím k t tinh: Hoà 1 th ị ộ ị ế ể
tích tím k t tinh (20g/100 ml c n) trong 4 th tích amonium oxalat 1%, ế ồ ể
un nh n khi tan, l c. Dung d ch Lugol (g): I t tinh th : 1 (nghi n đ ẹđế ọ ị ố ể ề
tr c trong c i x ); KI: 2; Hướ ố ứ
2
O: 100 ml. Dung d ch Safranin: Hoà 100 ị
ml safranin (2, 5 g/100 ml c n) trong 1 lit n c.ồ ướ
•
Các dung d ch ng 20%: Glucoza, Saccaroza, Xycloza, Manitol, ị đườ
Lactoza.
•
Dung d ch Tryptophan 1%.ị
Ph n ng màu v i thu c th salkowski’sả ứ ớ ố ử