Phân lập Micromonospora có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ bùn hồ Bảy Mẫu - Hà Nội

Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Đặt vấn đề
Các chất kháng sinh có nguồn gốc vi sinh vật thờng đợc phân lập từ vi
khuẩn (Bacteria), vi nấm (Microfungi) và xạ khuẩn (Actinomycetes). Kháng
sinh từ xạ khuẩn chiếm 80% tổng số chất kháng nhận đợc từ vi sinh vật [14] Xạ
khuẩn có 2 chi cho kháng sinh nhiều nhất là Streptomyces và Micromonospora.
Chi Streptomyces đã đợc các nhà sinh vật nghiên cứu trong nhiều năm, rất
nhiều chất kháng sinh từ chi này đợc ứng dụng trong điều trị, song cơ hội tìm đ-
ợc những chất kháng sinh mới có giá trị từ Streptomyces ngày càng ít. Vì vậy
trong những năm gần đây một chi khác của xạ khuẩn đợc thế giới quan tâm
nhiều là Micromonospora. Ngời ta đã nhận đợc từ chi này một số chất kháng
sinh tốt, phổ rộng nh: Gentamycin, Neomycin-B, Rifamycin.....
ở Việt Nam chi Micromonospora mới đợc nghiên cứu từ những năm 90
nhng kết quả còn rất hạn chế. Với mong muốn đợc tiếp tục tìm hiểu về đặc tính
phân loại và khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Micromonospora ở Việt
Nam, hy vọng có thể nhận đợc những chủng cho chất kháng sinh có ý nghĩa .
Chúng tôi chọn đề tài:
Phân lập Micromonospora có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh từ
bùn hồ Bẩy Mẫu - Hà Nội .
Với các nhiệm vụ sau:
- Phân lập Micromonospora từ bùn hồ và thử phổ kháng khuẩn của các
chủng phân lập.
- Nghiên cứu phân loại một số chủng có hoạt tính kháng sinh tốt.
- Sơ bộ xác định một số thành phần dinh dỡng thích hợp cho sự phát triển
và sinh tổng hợp kháng sinh của các chủng đã chọn.
Từ kết quả nghiên cứu ban đầu của khoá luận chúng tôi hy vọng nó sẽ là
cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo.
1
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Phần 1. Tổng quan
1.1 Đại cơng về chi Micromonospora [ 7, 8, 12, 13,14]

1.1.1 Đặc điểm sinh thái của Micromonospora:
Micromonospora là một chi thuộc họ Micromonosporaceae, bộ
Actinomycetales, lớp Actynomycetes. Micromonospora có rất ít trong đất
Teplakova và Maximova (1957) đã chỉ tìm thấy 1,2% Micromonospora trong
các phân lập Actinomycetes. SzaboZsusza (1986) đã nhận thấy tỷ lệ của
Micromonospora trong đất núi là 2,6%, đất trồng trọt là 14%, đất than bùn từ
50%-60%.
- Đất bùn giàu nguyên liệu hữu cơ rất thích hợp cho sự phát triển của
Micromonospora. Theo Cross và Collins (1966), 1 gam bùn hồ có khoảng 4000
Micromonospora.
- Nớc hồ có rất ít Actinomycetes nhng có đến 76% là Micromonospora
streptomyces chỉ có 6% (Unbreit và McCoy, 1941).
- Gramein và Meyers (1958) đã tìm thấy Micromonospora từ nớc biển và đất
phù sa, những Micromonospora này rất chịu muối, chúng chiếm đa số trong các
phân lập Actinomycetes từ đất phù sa của biển.
1.1.2 Đặc điểm hình thái của Micromonospora :
-Micromonospora có khuẩn ticơ chất phân nhánh, thờng không có khuẩn ti khí
sinh, bắt màu Gram(+), không kháng acid. Đờng kính khuẩn ti từ 0,2 đến
0,6àm.
- Bào tử riêng lẻ không cuống hoặc có cuống nằm phân tán hoặc thành từng
đám trên hệ sợi cơ chất phân nhánh. Thành bào tử dày tạo sự khúc xạ ánh sáng
mạnh. Bào tử hình tròn, oval, hoặc các dạng khác nhau, bề mặt bào tử nhẵn, có
gai hoặc xù xì.
2
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
- Khuẩn lạc của Micromonospora có dạng hình cầu nhỏ nhô lên trên bề mặt
môi trờng. Trong những ngày phát triển đầu tiên khuẩn lạc của các loài rất
giống nhau có màu da cam nhạt đến da cam.
- Khi nuôi cấy già có thể tạo sắc tố đặc trng tuỳ thuộc vào môi trờng nuôi cấy
và điều kiện nuôi cấy . Khi hình thành bào tử khuẩn lạc có mầu nâu hoặc màu

đen, chúng có thể khô hoặc trở thành ớt và nhầy.
1.1.3 Tính chất hoá học của thành tế bào:
Cơ sở để phân biệt chi Micromonospora với các chi khác của xạ khuẩn là
không có khuẩn ti khí sinh và sự hình thành bào tử, ngoài ra còn dựa trên tính
chất thành tế bào kiểu II của nó. Thành tế bào kiểu II đặc trng bởi thành phần
hóa học có: m-diaminopimelic acid ,glycin và glutamic acid, thành phần đờng
là xylose và arabinose. Glucose, galactose, manose và rhamnose thì khác nhau
của các loài.
1.1.4 Tính chất sinh lý, sinh hoá của Micromonospora.
Micromonospora đóng vai trò vô cơ hoá các nguyên liệu hữu cơ và trong sự
mùn hoá, ngoài ra Micromonospora có thể phân huỷ cellulose, kitin, lignin,
xylan, tinh bột, casein, khử nitrat, protein.
Nhiệt độ phát triển từ 20
0
C -> 40
0
C, nhng không phát triển ở trên 50
0
C.
Hầu hết các loài hiếu khí, mẫn cảm với pH < 6,0.
- Bào tử của Micromonospora ngợc lại với bào tử Streptomyces, chịu đợc nhiệt
độ và dung môi hữu cơ. Chúng có thể tồn tại trong nớc 60
0
C trong 90 phút, nh-
ng chết ở 90
0
C trong 15 phút. Bào tử chịu đợc pH từ 6 ữ 8, thờng bị mẫn cảm ở
pH acid mạnh. Bào tử có thể sống sót trong các dung môi hữu cơ nồng độ
không quá 80%, bào tử có sự kháng cao với dioxal, aceton.
1.1.5 Khả năng gây bệnh của Micromonospora:

Micromonospora có thể gây bệnh cho ngời, động vật, tuy nhiên khả năng gây
bệnh cũng có hạn chế và cha rõ ràng, mặc dù một số tác giả đã phân lập đợc
Micromonopora từ các tổ chức bị bệnh , ví dụ : Erikson (1935) đã tìm thấy
3
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Micromonospora gallica từ máu; Morquer và Comby (1943) đã ghi
Micromonospora caballi gây bệnh cho da giống Actinomyces; Morch (1975) đã
tìm thấy một chủng M .chalcea từ tổ chức, và chủng này gây bệnh trên da của
chim bồ câu.
1.1.6 Sự tạo kháng sinh của Micromonospora :
Micromonospora có khả năng tạo kháng sinh thuộc nhiều nhóm khác nhau về
mặt hoá học nh: amynoglycosid, macrolid, ansamycin, polypeptid.
- Một số kháng sinh nhóm aminoglycosid:
Gentamycin do M.echinospora và M.purpurea.
(Weinstein & cộng tác 1963; Luedemann & Brodsky 1964).
Micromonosporin do M.sp ATCC 10026 (Wagman & cộng tác 1974).
Sisomycin do M.injoensis (Weinstein & cộng tác 1970).
Neomycin B do M.sp 69-638 (Wagman & cộng tác 1973).
Verdamycin do M.Gramisea (Weinstein & cộng tác 1975).
Fortimycin A & B do M. olivasterospora (Naro & cộng tác 1977;
Kawamoto & cộng tác 1983).
- Một số kháng sinh nhóm Macrolid:
Megalomycin do M.megalomicea (Weinstein & cộng tác 1969).
Rosamycin do M.rosarria (Wagman & cộng tác 1972).
XK - 41 do M. inositola (Kawamoto & cộng tác 1974).
Juvenimycin do M. chalcea & izumensis (Hatano & cộng tác 1976).
M - 4365 do M.capillata (Furumai & cộng tác 1977).
Erythromycin B từ M. sp. 1225 (Marquez 1976).
- Một số kháng sinh nhóm ansamycin:
Halomicins do M.halophytica (Weinstein & cộng tác 1968; Luedemann

& cộng tác 1970).
Rifamicin từ M. ellipsaspora 71372.
- Một số kháng sinh nhóm polipeptid:
4
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Chalcidin do M. chalcea H
85
(Gauze & cộng tác 1970).
1.2 Những nghiên cứu về phân loại trên quần thể Micromonospora.
[5,7,9,12,14] :
- Wagman S.A (1961) đã nhận định trong các loài đặc chủng của
Micromonospora các tính chất về hình thái là những tiêu chuẩn, ban đầu cho
việc xác định loài. Các đặc tính sinh lý, sinh hoá nh phân huỷ cellulose, khử
nitrat cũng quan trọng. Mầu và hình dạng của khuẩn lạc không đợc coi là
những đặc tính cơ bản, vì mầu của nó không cố định mà thay đổi từ vàng sang
da cam, hồng, đỏ, nâu và đen. Các loài Micromonospora là hiếu khí hoặc kỵ
khí. Chúng có thể sử dụng các nguồn nitrogen và carbon vô cơ, hữu cơ khác
nhau. Wagman S.A đã chia chi Micromonospora thành 9 loài bao gồm:
M. chalcea M. parva M. coerulea
M. gallica M. fusca M.propionica
M. globosa M. elongata M. bicolo
- Sveshmikova và cộng tác năm (1970) đã nghiên cứu những loài
Micromonospora từ đất bùn ở ngoại ô Moscow. Họ đã đa ra 5 loài mới nhng chỉ
dựa trên rất ít đặc tính nh sử dụng 6 nguồn carbon, sự tạo sắc tố trong môi trờng
và kiểu bào tử.
Nhng theo họ tiêu chuẩn này cũng không luôn luôn ổn định.
- Singal và Solovieva (1974) cũng đã nghiên cứu khả năng sử dụng nguồn
carbon của Micromonospora.Tuy nhiên không có những kết luận về phân loại từ
những số liệu này.
- Luedemann (1970, 1971), sau những nghiên cứu chi tiết trên nhiều phân lập

Micromonospora ông đã đa ra nhiều tính chất hữu ích dễ phân biệt loài trong
chi Micromonospora.
Theo ông ngoài sắc tố khuẩn ti màu da cam thì các endopigment luôn khác
nhau (nâu, hồng, tím, xanh lá cây, xanh... ) các sắc tố hoà tan này rất có ý
nghĩa.
5
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Sự hình thành bào tử không luôn luôn là những đặc tính có giá trị nhng cần dựa
trên những kiểu khác nhau của hình thành bào tử để phân loại. Phổ sử dụng
nguồn carbon cũng có ý nghĩa nhng giá trị này không đủ cho việc xác định 1
loài. Tính chất chịu NaCl và sự phát triển trên miếng khoai tây acid và trung
tính cũng là những đặc tính hữu ích cho phân loại. Tuy nhiên những chủng
riêng biệt có sự thay về mức độ và một số tính chất. Đặc biệt là phổ sử dụng
carbon có sự lặp lại thấp. Sự so sánh với chủng chuẩn là cần thiết nó giúp cho
việc phân loại nhanh và chính xác.
- Ivanitskaya và cộng tác (1983) cũng đa ra một số tính chất sinh lý, sinh hoá để
xác định 3 loài mới của Micromonospora và ngời ta cũng đã tìm thấy có sự liên
quan giữa sự tạo kháng sinh với một số đặc tính riêng về phân loại của
Micromonospora.
Sổ tay định loại vi sinh vật của Bergey (1980) đã đa ra khoá phân loại của chi
Micromonospora bao gồm 14 loài hiếu khí và 2 loại kỵ khí trên cơ sở những đặc
tính hình thái, sinh lý, sinh hoá của chúng.
- Szabó. Zsuzsa (1982) đã sử dụng phơng pháp số học để phân loại quần thể
Micromonospora của bùn hồ Bulaton (Hungari). Phơng pháp này có tính u việt
so với phơng pháp phân loại truyền thống.
- Trong khoá luận này với khả năng và giới hạn về các thông tin cho phép chúng
tôi nghiên cứu phân loại 5 Micromonospora đại diện theo khoá phân loại của
Luedemann G.M (1969) và sổ tay định loại vi sinh vật của Bergey (1980) đồng
thời đối chiếu với khoá phân loại của Waksman S.A (1961).
Có so sánh với các chủng chuẩn là:

Micromonospora chalcea ATCC 12452.
Micromonospora halophytica ssp halophytica ATCC 27596.
Micromonospora narashino ATCC 27331.


6
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Phần 2. Thực nghiệm và kết quả
2.1 Nguyên liệu và phơng pháp thực nghiệm
2.1.1 Nguyên liệu:
- Nguyên liệu để phân lập chủng, các mẫu bùn của hồ Bảy Mẫu- Hà Nội.
- Các môi trờng nuôi cấy:
Các môi trờng của Luedemann (1971) và Szabozsuzsa (1982) đã đợc sử dụng
trong nghiên cứu.
- Chủng Micromonospora dùng trong nghiên cứu:
Chủng Micromonospora dùng trong nghiên cứu đợc phân lập từ các mẫu
bùn hồ Bẩy Mẫu. Trên cơ sở phổ kháng khuẩn chúng tôi đã chọn 5 chủng để
nghiên cứu phân loại đợc ký hiệu là M
14
, M
16
, M
26
, M
30
, M
47
.
- Chủng vi sinh vật chỉ thị:
Gồm 9 vi khuẩn và 1 vi nấm.

- Vi khuẩn Gram (+):
Staphylococcus aureus ATCC 12228.
Bacillus pumilus NTCC 8241.
Bacillus subtilis ATCC 6633.
Sarcina lutea ATCC 9314.
- Vi khuẩn Gram (-) .
Escherichia coli ATCC 25922.
Salmonella typhi DT 220.
Shigella flexneri DT 112.
Proteus mirabilis BV 108
Pseudomonas aeruginosa VM 201.
- Vi nấm:
Candida albicans ATCC 10231 .
Các chủng vi sinh vật chỉ thị là chủng quốc tế hoặc đợc phân lập tại các viện
nghiên cứu của Việt Nam.
7
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
2.1.2 Ph ơng pháp thực nghiệm: theo Szabo zs. (1982) và Luedemann (1971)
2.1.2.1 Ph ơng pháp lấy mẫu và phân lập chủng Micromonospora:
Bùn đợc lấy ở lớp bề mặt từ 0 ->15cm ở các vị trí cách bờ hồ: 5m;10m; 20m;
50m, sau đó đợc trộn đều để phân lập chủng. 10g bùn đợc hoà vào 90ml dung
dịch K
2
Cr
2
O
4
0,4%, lắc đều trong 2 giờ, pha loãng tiếp thành các nồng độ 10
-2
,

10
-3
, 10
-4
cấy vào các môi trờng phân lập sau:
- Môi trờng men tinh bột: (MT1)
Tinh bột tan 20,0g.
Cao men 10,0g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml
pH: 7 0,2.
- Môi trờng Gauze I: (MT 2).
Tinh bột tan 20,0g.
K
2
HPO
4
. 7 H
2
0 0,5g.
NaCl 0,5g.
MgSO
4
. 7 H
2
0

0,5g
KNO
3

1,0g.
FeSO
4
.7 H
2
0

0,01g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml

pH: 7 0,2
Sau 5 đến 7 ngày nuôi cấy ở 28
0
C đến 32
0
C các khuẩn lạc Micromonospora
hình thành. Dựa vào hình dạng mầu sắc khuẩn lạc, hệ sợi cơ chất đặc trng để
phân biệt Micromonospora với các khuẩn lạc vi sinh vật khác. Những khuẩn lạc
sạch mọc riêng rẽ đợc cấy sang môi trờng men tinh bột và môi trờng Gauze I.
2.1.2.2 Ph ơng pháp xác định khả năng tạo kháng sinh của các chủng phân lập:
8
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Các phân lập sạch sau 1 tuần nuôi cấy trong ống thạch nghiêng đợc cấy lên bề
mặt thạch đĩa Gauze I. Sau đó 5 đên 7 ngày nuôi cấy đợc thử hoạt tính kháng
sinh bằng phơng pháp khối thạch dựa trên nguyên tắc chất kháng sinh có trong
khối thạch đợc khuếch tán vào môi trờng đã cấy vi sinh vật chỉ thị tạo vòng vô
khuẩn có đờng kính tỷ lệ thuận với logarit nồng độ. Khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh của các phân lập đợc đánh giá bằng đờng kính vòng ức chế.
- Chuẩn bị nhũ dịch vi sinh vật chỉ thị:

Các vi sinh vật sau 18 đến 24 giờ nuôi cấy trên các môi trờng thích hợp
đợc làm thành nhũ dịch (có khoảng 10
7
10
8
tế bào trong 1ml) trong NaCl
0,9%.
- Môi trờng:
Môi trờng cao thịt cao men (thử ức chế vi khuẩn): MT3
Pepton 10,0g.
Cao thịt 1,5g.
Cao men 3,0g.
Glucose 1,0g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml
pH: 7,0 0,2.
Môi trờng Sabouraud (thử ức chế vi nấm): MT 4
Pepton 10,0g.
Glucose 40,0g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml.
pH: 7,0 0,2.
- Các khối thạch của Micromonospora đợc đặt lên bề mặt của các đĩa môi
trờng đã có vi sinh vật chỉ thị với tỷ lệ 1% (v/v). Đo đờng kính vòng ức chế sau
9
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
18 24 giờ nuôi cấy ở 35
0
C đến 37
0

C (đối với vi khuẩn) và 28
0
C 30
0
C (đối
với vi nấm).
2.1.2.3 Ph ơng pháp xác định đặc tính hình thái:
Hình dạng bề mặt và mầu sắc khuẩn lạc, màu khuẩn ti cơ chất, sự hình thành
bào tử đợc theo dõi trên môi trờng: MT 1 và MT 2.
Hình dạng khuẩn ti và cuống sinh bào tử đợc quan sát bằng kính hiển vi quang
học và kính hiển vi đối quang với phơng pháp nuôi cấy microfilm.
2.1.2.4 Xác định đặc điểm nuôi cấy:
Các đặc điểm nuôi cấy nh sự phát triển, sự tạo sắc tố hoà tan, khả năng tạo bào
tử đợc nghiên cứu trên các môi trờng MT 1 & MT 2,
- Môi trờng glucose- asparagine (MT 5):
Glucose 10,0g
Asparagine 0,5g
K
2
HPO
4
0,5g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml.
pH: 7,0 0,2.
- Môi trờng Czaperk - Saccharose: (MT 6)
NaNO
3
2,0g.
K

2
HPO
4
. 7 H
2
O 1,0g.
MgSO
4
. 7 H
2
O 0,5g.
KCl 0,5g.
FeSO
4
.7 H
2
O 0,1g.
Saccharose 30,0g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml
pH: 7,0 0,2.
- Môi trờng thạch sữa (MT 7):
Cao men 5,0g.
Glucose 1,0g.
CaCO
3


1,0g.
10

Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Thạch 18,0g.
Sữa loại bơ 100,0g.
Nớc cất 1000,0ml
pH: 7,0 0,2.
Đặc điểm nuôi cấy đợc quan sát sau 7 đến 14 ngày.
2.1.2.5 Xác định sự tạo sắc tố melanin.
Khả năng tạo sắc tố melanin đợc thử trên môi trờng ISP 6 (MT 8)
Pepton 20,0g.
Sắt amoni citrat 0,5g.
K
2
HPO
4
1,0g.
Na
2
S
2
O
3
0,08g.
Cao men 1,0g.
Thạch 18,0g.
Nớc cất 1000,0ml.
pH: 7,0 0,2.
Sau 7 đến 14 ngày nuôi cấy nhận xét sự hình thành các sắc tố qua sự chuyển
màu của môi trờng.
2.1.2.6 Nghiên cứu đặc tính mẫn cảm với pH acid của Micromonospora trên
miếng khoai tây:

- Khoai tây đợc gọt vỏ cắt thành từng miếng có kích thớc khoảng
1 x 1 x 6cm. Sau đó đợc cắt vát theo chiều dọc, cho vào ống nghiệm hấp tiệt
trùng, đo pH của miếng khoai tây đã vô trùng.
Một phần các miếng khoai tây khác đợc xử lý với CaCO
3
trớc khi hấp tiệt
trùng sao cho miếng khoai tây có pH từ 6,6 7,0.
- Các chủng đợc cấy song song lên 2 loại miếng khoai tây. Quan sát sự phát
triển của chúng sau 7 10 ngày nuôi cấy.
2.1.2.7 Thử khả năng khử nitrat:
Sự khử nitrat thành nitrit đợc thực hiện trên môi trờng sau:
11
Website: Email : Tel (: 0918.775.368
Môi trờng 9 (MT 9):
pepton 5,0g.
Cao thịt 3,0g.
KNO
3
1,0g.
Nớc cất 1000,0ml
pH: 7 0,2.
Đóng ống: 5ml/1 ống.
Sau thời gian nuôi cấy 7 đến 10 ngày sự khử Nitrat đợc phát hiện bằng cách
thêm vào ống môi trờng đã nuôi cấy 1,0ml thuốc thử acid sulfanilic ( 8g acid
sulfanilic trong 1 lít acid acetic 5N) và 1ml thuốc thử dimethyl- -
naphthylamin (6 ml dimethyl- - naphthylamin trong 1 lít acid acetic 5N). Nếu
có màu đỏ là phản ứng dơng tính. Nếu không có màu đỏ thêm một ít bột kẽm
vào ống thử, nếu nitrat còn sẽ đợc khử thành nitrit, nếu có màu đỏ xuất hiện,
phản ứng âm tính. Nếu không có màu sau khi thêm bột kẽm chứng tỏ nitrat đã
đợc sử dụng hoàn toàn hoặc đã đợc khử thành NH

3
hoặc N
2
.
2.1.2.8 Thủy phân tinh bột :
Sự thuỷ phân tinh bột đợc nghiên cứu trên môi trờng 10:
Môi trờng 10 (MT10):
Pepton 5,0g. Tinh bột 10,0g
Cao thịt 5,0g. Thạch 18,0g
NaCl 5,0g. Nớc cất 1000,0ml
pH: 7,0 0,2
Đọc kết quả sau 7 đến 10 ngày nuôi cấy cho dung dịch lugol (Iod 5g; KI 10g;
nớc cất 1000ml ), lên bề mặt đĩa thạch đã nuôi cấy. Sự thuỷ phân tinh bột sẽ tạo
một vòng sáng xung quanh chỗ chủng thử phát triển. Phần tinh bột không bị
thuỷ phân sẽ có màu xanh tím.
2.1.2.9 Thuỷ phân cellulose:
- Thí nghiệm đợc tiến hành trên môi trờng 11 (MT 11):
12