0033 ứng dụng phương pháp sắc ký để phân lập evodiamin và rutaecarpin từ quả ngô thù du (fructus evodiae)

(em

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

BỘ Y TẾ
TRUONG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CÀN THƠ

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHAP SAC KY DE PHAN LAP
EVODIAMIN VA RUTAECARPIN TU QUA NGO THU DU

(EVODIAE FRUCTUS)

Cán bộ tham gia
Ths. Lê Thị Nhân Duyên

KTV. Nguyễn Thị Đặng

Cần Thơ — 2017


(em

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa họcÌ

LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên Nguyễn Thị Ngọc Vân, xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi.
Các số liệu kết quả được nêu trong luận văn là trung thực và chưa tùng được công

bố, sử dụng trong bắt kỳ tài liệu nào khác.
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2017


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

MỤC LỤC
Trang

LỜI CẢM ƠN
LOI CAM DOAN
MUC LUC cescssssssssssssssssssssscscsssssssssessenconsocsenseessesnsesgseseesssnssessesscessenscescnsseessanstessccnsesess 1
PHAN 1: TOM TAT
PHAN 2: TOAN VAN CONG TRINH NGHIEN CUU
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT 'TẮTT..........................--c-cs
8,09 91e.le:79. ca.

........

12

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐÒ................................nHeseenerenrennressrrssore 13
ĐẶT VẤN ĐÈ
Churong 1. TONG QUAN TALI LIỆ U. . . . . . . . . . . . . . .

5<. 52s

©cs2eesE+kseES2.ersesersee 3

1.1. Thực vật học về cây Ngô thù du...........

weed

1.1.1. Tên khoa học và vị trí phân loại............................-----.-~----x.e

=

1.1.2. Đặc điểm hình thái cây Ngơ thù du. . . . . . . . . . . . . .

....4

1.1.3. Phan bé,

sẽ...

--.-----

........... 4

1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến.........................------ seseeseeeeeonneeeen 4
1.2. Tổng quan về quả Ngơ thù du............................-¿5+ ©2+++xsrxsttrerkrerrrrtrkrrrrrerrke 5

1.2.1. Đặc điểm hình thái...........................--2+©22++c+et2Exettvtrtrrrrrrrrrrrrrrrrrerrrree
1.2.2. Đặc điểm vi phẫu.....

1.2.3. Thành phần hóa học

1.2.4. Tác dụng dược lý và công dụng của quả Ngô thù du....................... 8
1.3. Tổng quan về hai hợp chất evodiamin và rutaecarpin..................-....------‹«- 9
In

na.

1.3.2. RUÍa€CATDIH.....................

..

....................

HH

9

TH g0 12 0 101 00101110 111101111 155, 9

1.4. Các phương pháp sắc ký sử dụng trong luận văn.........................-..-------e- 10

1.4.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng ...........................-------s-- sreree 10
1.4.2. Sắc ký cột cổ điển (CC) [3], [12].......................---s<-ccs«scssvsexrerexssrs 11


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

1.4.3. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [7], [10]............................-.--- 12
1.5. Một số nghiên cứu về chiết xuất, phân lập hợp chất tự nhiên có trong quả

hi 8. 077.876...

::.-1A.

......

15

Chương 2 - ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................... 17

2.1. Đối tượng nghiên cỨu......................-..--s+-©5+
x2 x2 E2 .E21E11211211211211e
17
2.2. Địa điểm nghiên cứu.......................-.. sesunssssssvsavssasseeenecsssavereesnseressseensessees 17
2.3. Dung mi, héa Chat uc eccecsecsssscessscsssssvesssssesssssssstssssssesssssseseeseeareseeens 17
ZA. Trang thiét Div cecscssessssssscssssessessessessessseesesssssnsesesseesseesseseesecarsaneassensenss 17
2.5. Phương pháp nghiÊn CỨU........................
.- 5 2s k3. nh nh
ng
re

18

2.5.1. Chiết xuất alcaloid trong quả Ngô thù đu khô..................... ........ 18
2.5.2. Thu himg phan doan alcaloid trong cao TA bằng sắc ký cột cổ

0Ì 000... ..................
19
2.5.3. Tinh chế các chất phân lập......................-5-55 ccxtvzxervxrrrxrrrrrsrkx 19.

2.5.4. Xác định độ tỉnh khiết của các chất phân lập ............................... 19

2.5.5. Xác định cấu trúc các chất phân lập sau tinh chế
Chương 3. KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU............................--ss5cssecrxssorxseetsavortrsrssnsre

kh»

co 5... .... ...ẻẽ ẽ (d(4ad 4.

22

3.2. Thu hứng phân đoạn alcaloid trong cao TA bằng sắc ký cột................... 22
3.3. Tỉnh chế phân đoạn À4 Và AỐ .....................
cv H221.
re 24

3.4. Xác định độ tinh khiết của các chất phân lập......................--ccoccecccerrerrecee 25
3.5. Xác định cấu trúc hợp chất phân lập....................¿.---c-555©ccSzs2c<+seecceerkerrxee 30

Churong 4. BAN LUAN .........

38

‘4.1. Tham dị hệ đung môi khai triển sắc ký cột cho cao TA chiết xuất từ quả

208

¡0

nh...

................

38

4.2. Thu hứng phân đoạn cao AI, A2, A3, A4, A5, A6 từ cao chứa alcaloid

'

.

To°...........................

39

4.3. Tỉnh chế phân đoạn A4 VAG ccesscscssssssssssssessessssssiessssenssstesssenesieee 40


(em

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

4.4. Xác định độ tinh khiết của các chất phân lập.........................------c5ccccscec 40
4.5. Xác định cấu trúc chất phân lập.........................
¿5+ ccccc+rxerrrerrrrtrrrrrrrrrrrees 41
¡ez0n 7Š.
in

....................... 49

017.7. ........................

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

50


(em

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

PHAN 1: TOM TAT DE TAI


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

I. PHAN MO DAU
Hiện nay thuốc có nguồn gốc từ dược liệu được sử dụng với một tỷ lệ không nhỏ tại
cộng đồng cũng như trong các cơ sở điều trị. Tuy nhiên việc kiểm soát chất lượng
được liệu đang gặp khó khăn, một trong những nguyên nhân đó là thiếu chất chuẩn.
Để góp phần tiêu chuẩn hố thuốc có nguồn gốc dược liệu, việc nghiên cứu quy

trình chiết xuất và tinh chế nhằm phân lập ra chất tính khiết làm chất chuẩn là hết
sức cần thiết. Rutaecarpin là hoạt chất có nhiều trong họ cam (Rutaceae) và cũng là
một trong những chất chuẩn chưa thiết lập được mẫu chuẩn. Xuất phát từ thực tế đó,
chúng tơi tiến hành nghiên cứu chiết xuất, phân lập và tỉnh chế rutaecarpin va

evodiamin từ quả của cây ngô thù du đủ điều kiện để thiết lập chất chuẩn dùng
trong kiểm nghiệm. Cây Ngô thù du có tên khoa học là Evodia ruiaecarpa (Juss.)
Benil., phân bố rải rác khắp các vùng núi và trung du thuộc tỉnh Hà Giang và Lạng
Sơn nước ta [1,2], hoạt chất chính có tác đụng sinh học được chứng minh là hai
alkaloid evodiamin và rutaecarpin [3]
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Khảo sát điều kiện sắc ký để phân lập, tỉnh chế evodiamin và rutaecarpin tir qua

Ngô thủ du.
2. Xác định cấu trúc các chất phân lập bằng các phương pháp phổ học

H. ĐÓI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu:
Quả khô của cây Ngô thù du (Fructus Evodia)
Phương pháp nghiên cứu
Chiết xuất alcaloid trong quả Ngô thù du: Quả khô được nghiền nhỏ và qua
rây 0,3 mm thu được bột dược liệu, tiến hành chiết xuất bằng phương pháp chiết

siêu âm với dung môi methanol [11]. Cao thu được hòa tan trong lượng tối thiểu
hỗn hợp MeOH ~DCM (1:10 (tt) và trộn đồng lượng silica gel, sấy chân không,
nghiền thành đạng bột khô mịn đùng trong phân lập trên sắc ký cột cỗ điền.

Phân lấp và tỉnh chế alcaloid bang sắc ký côt: Chất hấp phụ là silicagel 60, cỡ
hạt 40 — 60 ym, hé dung môi khai triển n-hexan: ethyl acetat với tỷ lệ thay đỗi.


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Kiểm tra các phân đoạn trên SKLM, phát hiện vết bằng cách soi UV bước sóng 254
nm, 365 nm và phun thuốc thử Dragendorff.
Mẫu khô được nạp lên sắc ký cột hở pha thuận sử đụng pha tĩnh silica gel để thu
hứng được các phân đoạn alcaloid có thành phần đơn giản hơn.
Điều kiện sắc ký:
- _ Cột thủy tinh trung bình, thành day được xử lý sạch và sấy khơ.
-

Pha tinh: 200 g silica gel 60, cỡ hạt 40-63 um, phương pháp nạp cột ưới.

- _ Mẫu: 3,2 g cao TA, phương pháp nạp mẫu khô.
-

Hé dung mdi khai trién n-hexan : ethyl acetat với tỷ lệ thay đổi.

- _ Tốc độ rửa giải 4 ml/phút (80 giot/phú0.
- _ Kiểm tra các phân đoạn trên SKLM, phát hiện vết bằng cách soi UV bước sóng 254
nm, 365 nm va phun TT Dragendorff, VS.
,

Các phân đoạn có thành phẩn giống nhau được gộp chung, cô thu hồi dung môi,
can khéi lượng thu được.

Xác định cầu trúc các chất phân lập được:
Mẫu khô được nạp lên sắc ký cột hở pha thuận sử đụng pha tĩnh sỉlica gel để
thu hứng được các phân đoạn alcaloid có thành phần đơn giản hơn

Dựa trên số liệu phể khối (BSI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (H-NMR,
12©_NMR) và so sánh với số liệu phơ đã công bố.

Các kỹ thuật quang phổ hiện đại được sử đụng để xác định cấu trúc của các

chất đã phân lập và so sánh với đữ liệu phổ đã có.

- HIL KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU
Chiết xuất và phân lập các chất
Lấy 150 g bột ngô thù du nghiên cứu chiết 3 lần với methanol. Gộp dịch chiết, cất

thu hồi đung mơi đưới áp suất giảm. Cao tồn phần thu được lắc-phân bố với nước và hỗn
hợp dicloromethan — nước (10:1). Thu được 3,2 g cao methanol.

Lấy 3,2 g cao phân tách trên cột si/ica gel, rửa giải bằng n-hexan: ethyl acetat (với

'

lượng ethyl acetat tăng dần từ 0 -10%) thu được 6 phân đoạn (F1-F6). Kiểm tra bằng sắc

ký lớp mỏng, lấy phân đoạn F4 (n-Hexan — EtOAc (97:3) cô quay thu hồi dung môi thu

được 528 mg tỉnh thể màu vàng; rửa trên phễu thủy tỉnh xốp lần lượt bằng hỗn hợp nhexan: ethyl acetat (97:3) và n-hexan lạnh thu được 326 mg bột kết tỉnh hình kim vàng
nhạt, có ánh kim, ký hiệu là A4-R. Phan doan F6 (n-hexan: ethyl acetat (95:5) sau khi cô


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa hoct

thu hồi dung méi thu được 213 mg cao màu vàng đậm, lần lượt kết tỉnh lại trong cloroform
và methanol lạnh thu được 36,5 mg tỉnh thể đạng bột mịn màu vàng nhạt ký hiệu 14 A6-E.
Xác định cẫu trúc của chất chiết được

Xác định cấu trúc hai chất A4-R và A6-E

Chất A4-R

Phé khéi MS (ESI-MS): cho pic co ban véi m/z = 288,2 [M+1]*. Phổ khối phân giải cao
ion duong HRMS

cho m/z = 288,1131 tương đương với công thức phân ti C)gsHi3N30 va

phù hợp với kết quả của phổ NMR.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân:

1H-NMR. (500MHz,

CDC13)

8 ppm:

9,51

(br s, 1H, NH);

8,32 (d, 1H; J=7; H19); 7,70 (m, 1H, H17); 7,63 (m, 1H; H16); 7,42 (m, 1H; H9); 7,36 (m,

1H; H12); 7,31 (m, 1H; H18); 7,25 (s, 1H; H11); 7,17 (m, 1H; H10); 4,59 (t, 2H; H5); 3,23

(t, 2H; H6). Phd ?C-NMR (125MHz, CDCI3) 18C, đặc trưng 8C 41,16 (C-5), 19,69 (C-6);
161,56 (C-21).

Bảng 1. So sánh các đỡ liệu phổ !H-NMR và '2C-NMR của A4-R và rufaecarpin trong
CDC]; [8], DMSO-dg [9]
Cc

2
3
5
6
7.
8
9
10
11
12
13
_15
l6
17
18
19
20
21
N-H

Sc (ppm)

A4-R

Rutaecarpin

Rutaecarpmn

A4-R

CDCl;
125MH
127269
145,044
41,153
19,690
118,409
125,641
120,637
120,104
125,601
112,109
138,321
147,502
126,236
134.369
127,182
126,594
121,187
161,623

DMSO-d
300MHz
127,2
145,4
41,0

19,1
118,0
125,0
: 120,1
119,9
124,9
112,7
138,8
147,5
126,7
134,5
126,1
126,6
120,8
160,7

CDCl;
100MHz
127,7
145,5
41,7
20,1
118,7
121,7
120,4
121,0
120,4
112,6
138,8
147/7

126,0
134,9
127,1
126,8
121,0
162,0

s: singlet, d: doublet, t: triplet, m: multilet

Trong phổ H-NMR:

‘

5p (ppm,m,J)

Rutaecarpin

Rutaecarpin

CDCl,
500MHz

DMSO-d.
300MHz

CDCl;
400MHz

4,592 t
3,234 t

4,46 dd
3,18 dd

4,63 t
3,25 t

7,423
7,175
7,259
7,364

m
m
s
m

7,68 d
7,09 dd
7,28 dd
7,50d

7,12-7,81
7,12-7,81
7,12-7,81
7,12-7,81

m
m
m

m

7,638
7,701
7,310
8,325

m
m
m
d

7,80 d
7,84 dd
7,46 dd
817d

7,12-7,81
7,12-7,81
7,12-7,81
8,33-8,36

m
m
m
m

9,515 brs

11,90 br s

9,64 brs

2H-triplet của Hạ-5 và Hạ-6 ở õ = 4,59 và 3,23 ppm tương ứng. Ở

vùng trường thấp, khu vực nhân thơm thấy rõ tín hiệu của 8 proton thuộc nhân thơm 6 5 =
7,17.-7,70 ppm (7H) va ö = 8,32 ppm (1H), cũng như một singlet ở ư = 9,51 ppm của

nhóm NH. Từ những phân tích đữ liệu phổ của A4-R và so sánh số liệu phố NMR. của hợp

chất rutaecarpin trong các tài liệu tham khảo [8],[28],[38] thấy phù hợp ở tất cả các vị trí


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

tương ứng. Như vậy, hợp chất A4-R được xác định là rutaecarpin (C¡sẴHizN:©O) va có cơng
thức như sau:

Chất A6-E

,

Ỳ

Phổ khối MS (ESI-MS): cho pic cơ bản với m/z = 304,1 [M+1]”. Phổ khối phân giải cao
ion đương HRMS

cho m/z = 304,1364 tương đương với công thức phân tử C¡sHi;NO và

phù hợp với kết quả của phổ NMR.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: 'T-NMR (500MHz, CDCH) ổ ppm : 8,24 (br s, 1H, NH);
8,12 (dd, 1H; J=6.5; His); 7,59 (d, 1H; J=7.5; Hạ); 7,49 (m, 1H, Hị;); 7,41 (2, 1H, J=ổ;
Haz); 7,25 (m, 2H; Hịn, Hạc ); 7,19 (m, 2H; Hịo, Hịp); 5,92 (s, 1H; Hạ); 4,87 (m, 1H; Hạ);
3,29 (m, 2H; Hs); 2,96 (m, 2H; He); 2,505 (s, 3H; N-CH:). '”C-NMR (500MHz, CDCI;)
19C, 8c 39,54 (C-5); 20,13 (C-6); 37,24 (N-CH3) 164,74 (C-21).
Bảng 2. So sánh các dữ liệu phổ !H-NMR và °C-NMR cua A6-E va evodiamin chudn
trong CDCl; [8], DMSO-dg [9]
Sc (ppm)
C

A6-E
CDCl]
125MHz

2
3

6
7
8
9
10
11
12
13
15
16
17

18
19
20
21
22

5

Evodiamin
DMSO-d.
300MHz

Evodiamin
CDC
100MHz

129,013
68,869

130,1
68,5

125,3
68,4

20,136
113,716
126,296
118,947
123,111

124,157
111,342
136,728
150,683
122,430
133,074
123,816
128,238
120,078
164,746
37,247

19,5
111,9
125,4
118,6
119,5
121,5
111,1
136,4
149,5
117,8
132,4
119,5
128,1
118,6
164,0
35,9

19,3

117,8
121,9
117,8
121,9
118,7
110,8
136,4
150,1
122,3
132,4
128,4
128,2
120,3
164,5
36,4

39,545

.

Su (ppm,m,J)

40,2

39,1

N-H
s: singlet, d: doublet, t: triplet, m: multilet

A6-E

CDC),
500MHz
5,920 s

Evodiamin
DMSO-d¢
300MHz
5,96 s

Evodiamin
CDCl;
400MHz
5,95 s

3,295 m

4,85 m

3,32m

7,596 d
7,203 m
7,251m
7,417 d

7,54
7,13 d,d,d
7,16 d,d,d
7445 d

7,16-8,17
7,16-8,17
7,16-8,17
7,16-8,17

7,249
7,488
7,145
8,121

721d
7,53m
7,09 d,d,d
8,04 d

7,16-8,17
7,16-8,17
7,16-8,17
7,16-8,17

2,963 m

m
m
m
d

2,505 s

8,247 brs

2,97 m

2.64 s

10,71 brs

3,01m

2,54 s

8,34 brs


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Trong phổ 'H-NMR: 1H-singlet của H-3 ở ö =5,92 ppm; 2H-multilet của Hạ-5 và Hạ-6 ở ỗ
= 3,20 và 2,06 ppm tương ứng. Ở vùng trường thấp, khu vực nhân thơm thấy rõ tín hiệu
của 8 proton thuộc nhân thom 6 6 = 7,19 -7,59 ppm (7H) va 6 = 8,12 ppm (1H), cũng như
một singlet ở

= 8,24 ppm của nhóm NH va 3H- singlet cha N-CH3 6 6 =2,505 ppm. Tir

những phân tích dữ liệu phổ của A6-E va so sánh số liệu phố NMR của hợp chất
evodiamin trong các tài liệu tham khảo[§], [9] thấy phù hợp ở tất cá các vị trí trong ứng.

Như vậy, hợp chất A6-E được xác định là evodiamin

(C¡eoH¡;N:©) và có cơng thức như

sau:

IV. KET LUAN
Đã phân lập được 02 alcaloid tỉnh khiết 14 evodiamin (36,48 mg) va rutaecarpin
(326,41 mg) từ quả khô Ngô thù du (Evodia fructus).
Đã tiến hành xác định cầu trúc của evodiamin và rutaecarpin phân lập được bằng

các phương pháp phổ học: UV-Vis, MS, NMR với kết quá biện giải cấu trúc hóa
học phù hợp với cấu trúc hóa học của evođiamin và rutaecarpin phân lập từ quả
Ngô thù đu của các cơng trình nghiên cứu đã được cơng bố.


(em

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

PHẢN 2: TỒN VĂN CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa hoc!

DANH MỤC CÁC TU VIET TAT
Chữ tắt
Ag

Chữ nguyên

Asymmetry

ACN

Acetonitril

Nghĩa tiếng Việt
Hé s6 bat déi
Acetonitril

Bz

Benzen

Benzen

CE
Cf
CR
DCM

Chuan evodiamin
Chloroform
Chuẩn rutaecarpin
Dicloromethan

Chuẩn evodiamin
Cloroform
Chuẩn rutaẻcarpin
Dicloromethan

Duoc dién Viét Nam IV

Dược điển Việt Nam IV

Dimethylsulfoxide
Electrospray Ionization

Dimethylsulfoxid
lơn hóa tia điện

Ethyl acetate
High Performance Liquid

Ethyl acetat
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

MeOH

Methanol

Methanol

n-He

n-Hexane

n-Hexan

Nuclear Magnetic Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân

DDVN

DMSO
ESI
EtOAc
HPLC

IR

MS

NMR

PDA
Ry

Rg

SKC
SKD
SKLM

IV

Infrared - Red

Mass Spectroscopy

Hồng ngoại
Khối phổ

Photo Diode Array

Đầu đò đãy điod quang

Retardation factor

Hệ số lưu trữ

Resolution

Sắc ký cột
Sắc ký đồ
Sắc ký lớp mỏng

Độ phân giải

Sắc ký cột
Sắc ký đồ
Sắc ký lớp mỏng

TA

Cao chứa alcaloid lên cột CC

Cao chứa alcaloid lên cột CC

TLC

Thin layer chromatography

Sắc ký lớp mỏng

TLTK

Tài liệu tham khảo

Tài liệu tham khảo

tạ

Retention time

Thời gian lưu của pic

TT
UV
VS
WHO

Thuốc thử

DItraviolet
Vanillin - Sulfuric
World Health Organization

Thuốc thử

Tử ngoại
Vanillin - Sulfuric
Tổ chức ¥ té thé giới


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

DANH MỤC CÁC BÁNG
Trang

Bảng 1.1. Một số nghiên cứu về chiết xuất phân lập alcaloid có trong quả Ngơ thù
du (EVOdie ƒfHCH).......

HH

HH TH

Hà TH HT

HH nà TH HT TH

15

Bảng 2.1. Dung mơi, hóa chất........................
22. 5-©25< 2s EEEEtEEA2SExE7Xx SE E712215171171e173E 2e 1e. 7
Bang 2.2. Trang thiét Di...cccccccsssssssssssesnsssessssesneessesusssscsnessecsssesusssessesssessevessessnsssss 17
Bang 3.1. Kết quả trên sắc lý cột COO TA cecsessesssssssssesssessnessscseccrcsecssessssessvesteeseesnee 23

Bang 3.2. Bảng thời gian lưu, diện tích pic của A4-R và tạp...........................ccc.Bang 3.3. Bảng thời gian lưu, diện tích pic của A6-E và tạp.........................ccecc«ceecee 29

Bang 4.1. So sánh các đữ liệu phổ 'H-NMR và '“C-NMR của A4-R va rutaecarpin
04):1-499 04V2.J0..989)i90. 1E ..ồ.Ố............... 42

Bảng 4.2. So sánh các đữ liệu phố (H-NMR va 2C-NMR cia A6-E va evodiamin
trong CDCR; [28], DMSO-dạ [37]..................---2--22225-SccsecrErrreerrrrrrrrrrrreer _— 44


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỊ
Trang

;iit0RNe
ai... 088... ............. 5
Hình 1.2. Quả Ngô thù đu khô..........................¿5: 225- 2z v22 11311112111. c1xctrerrrkee 5
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học (a) và phổ UV (b) của evodiamin.........................-..----sc- 9
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học (a) và phổ UV (b) của rutaecarpin........................--..---.- 10
Hình 2.1. Sơ đồ quy trình chiết mẫu từ bột quả khơ Ngơ thù du............................... 18
Hình 3.1. SKLM chuẩn rutaecarpin (CR), chuẩn evodiamin (CE) và cao TA......... 22
Hình 3.2. SKLM các phân đoạn SKC cao TA với hệ dung mơi...........................se 23

Hình 3.3. SKĐ kiểm tra tỉnh khiết A4 và A6 với hệ dung môi ....

...24

Hình 3.4. Sơ đỗ tinh chế tỉnh thể A4..............................cc
S2 2.222 .Errcrerrrrrrerrrerreerrrrree 24

Hình 3.5. Sơ đồ tỉnh chế phân đoạn A6........................ TH... re

25

Hình 3.6. SKLM của À4-R trên trên 3 hệ dũng mơi............................ .-c---cscssreskexeksrreree 26
Hình 3.7. SKĐ dung mơi pha động (a), dung mơi pha mẫu (b) và mẫn A4-R.......... 26

Hình 3.8. Kiểm tra độ tỉnh khiết pic của A4-R trên HPLC/PDA...........................-- 27

Hình 3.9. SKLM của A6-E trên trên 3 hệ dung mơi........................----c---cccccccrcrccree 28
Hình 3.10. SKÐ dung mơi pha động (a), dung mơi pha mẫu (b) và mẫn A6-E........ 28

Hình 3.11. Kiểm tra độ tỉnh khiết pic của A6-E trên HPLC/PD..............................- 29
Hình 3.12. Chồng SKD A4-R (a) và chuẩn rutaecarpin (b) trén HPLC/PDA........... 30

Hình 3.13. Chồng phổ UV-Vis của A4-R (a), chuẩn rutaecarpin (b).....

31

Hinh 3.14, Phd MS ctta AAR oocccscccssscsssessssssessesssecssccsecsscesscssscssessecsscssesacensessscensees 32
Hinh 3.15. PhO C-NMR ctda ASR oo .............. 33
Hinh 3.16. Phé "H-NMR ctta A4-R o..cccsccssssssscsssessssssssneesecssessecssecsnecsssssecasceesesscenneets 33
Hình 3.17. Chồng SKĐ A6-E (a) và chuẩn evodiamin (b) trên HPLC/PDA............ 34
Hình 3.18. Chồng phố UV-Vis của A6-E (a), chuẩn evodiamin (b)........................ 35

Hình 3.19. Phố MS của A6-E. . . . . . . . . . .
u22 2s. H2 HH1... 36

Hình 3.20. Phố ''C-NMR của A6-E.......................5-55c ce S222... 36
Hình 3.21. Phổ !H-NMR của A6-E......................-252s2 2e. re crxeErErrrrkerrkrrrrrerrrerrree 37


(em

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa hoc

Hình 4.1. Cơng thức cấu tạo của rutaecarpin (CsH:;N:O)
Hình 4.2. Cơng thức cấu tạo của evodiamin

(C¡sH¡;N;O)


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

PHẢN MỞ ĐẦU
Một thống kê năm 2007 công bố rằng doanh số của dược liệu và các sản phẩm
từ được liệu biện nay trên tồn cầu ước tính khoảng §2 tỉ USD và theo dự đoán của

Tổ chức Y tế thế giới có thể lên đến 5000 tỉ vào năm 2050 [34]. Dự đoán cho thấy
một xu thế phát triển mạnh mẽ của các

thuốc có nguồn gốc thiên nhiên, cũng như

việc sử đụng hợp chất tự nhiên trong điều trị và chăm sóc sức khỏe con người.
Nhưng việc sử dụng cây thuốc hầu hết đựa vào kinh nghiệm dân gian nên việc chiết
xuất, phân lập các hợp chất có tác dụng được lý trong cây để ứng dụng điều trị hợp

lý, an toàn và hiệu quả là nhu cầu cần thiết.
Được biết đến như một trong những được liệu quý của y học cổ truyền dân tộc
trong 20 năm trở lại đây, quả Ngơ thù du có tên khoa hoc là Evodiae fructus thudc
họ Cam có nhiều tác dụng sinh học đáng quý đã được chứng mỉnh từ hai hợp chất

chính là evodiamin và rutaecarpin như kháng viêm, chống nhiễm khuẩn [26], điều
trị đái tháo đường type 2 [30], chống béo phì [25], chống kết tập tiều cầu, hạ huyết
áp, co thắc co trơn tử cung [35]. Đặc biệt là khả năng ức chế virus cúm HINI

[17]

và ức chế sự tăng sinh, xâm lược, di căn của các khối u, bằng chứng thuyết phục

cho khả năng kháng tế bảo ưng thư [24].
Nhiều cơng trình nghiên cứu khoa học có liên quan đến chiết xuất, phân lập,
và nghiên tác dụng được lý các hợp chất quả Ngô thù đu được công bố khiến cho
việc khai thác sử đụng loại cây này ngày càng được mở rộng. Nhưng điểm hạn chế
đáng quan tâm hiện nay là vấn đề kiểm soát chất lượng được liệu. Ứng
phương pháp phân tích hiện đại đã được WHO

dụng

nhấn mạnh trong giải quyết vấn đề

' trên. Tuy nhiên, để áp dụng các phương pháp này, một trong những yêu cầu đầu tiên
đặt ra phải có chất chuẩn đối chiếu phù hợp. Chất chuẩn hết sức quan trọng trong
kiểm nghiệm chất lượng được liệu, đông được, thực phẩm chức năng. Theo đanh
sách công bố các chất chuẩn đối chiếu của Viện kiểm nghiệm thành phố Hồ Chí
Minh cũng như tồn quốc chưa có tên evodiamin và rutaecarpin. Các chât chuẩn

(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

mua ở nước ngồi thường đắt và khơng sẵn có. Chính vì những lí do trên, chúng tơi

thực hiện dé tai:

“ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐÈ PHÂN LẬP EVODIAMIN VÀ

RUTAECARPIN TU QUA NGO THU DU (EVODIAE FRUCTUS)”
Voi muc tiéu:
1. Khảo sát điều kiện sắc ký để phân lập, tỉnh chế evodiamin va rutaecarpin từ quả
Ngô thù du.
2. Xác định cấu trúc các chất phân lập bằng các phương pháp phê học.


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Chuong 1. TONG QUAN TAI LIEU
1.1. Thực vật học về cây Ngơ thù du
1.1.1. Tên khoa học và vị trí phân loại
Cây Ngơ thù du có tên khoa học là Evodia rưiaecarpa (Juss.) Benth. et Hook. ho
, Cam (Rutaceae) [2], [11].

Ở nước ta, cây thuốc tên là Xà lạp hay Ngô thù. Trên thế giới, đặc biệt ở Trung

Quốc còn các loại Ngơ thù khác cũng dùng quả chín làm thuốc như Thạch hé
Evodia rutaecarpa (juss.) Benth.var. officinalis (Dode) Huang va So mao Ngô thù
du Evodia rutaecarpa (Juss) Benth. var. bonidieri (Dode) Huang

[20].

Vi tri phân loại của họ Rutaceae và chỉ Evođia biện nay theo khóa phân loại của
Takhtajan như sau [5]:
Giới thực vật (Plantae)

+

Phân giới thực vật bậc cao (Cormobionfa)

+

Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

+

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Ỷ

`

Phân lớp Hoa hông (Rosidae)

+

Bộ Cam (Rutales)

4

Họ Cam (Rutaceae)

+

Chi Evodia

1

Loai Rutaecarpa


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

1.1.2. Đặc điễm hình thái cây Ngơ thù du
Cây cao chừng 2,5 — 5 m. Cảnh màu nâu hay tía nâu, khi cịn non có lơng mềm, dai,
khi già nhẫn, có nhiều lỗ bì. Lá mọc đối, kép lơng chim lẻ, mang 5 — 11 lá phụ đài Š

— 15 cm, chót có đi, có lơng mềm, có đốm (túi tiết) rõ; cả cuống và lá đài độ 15 —
35 cm, mang 2 — 5 đơi lá chét có cuống ngắn; phiến lá chét ngun, có lơng mịn
màu nâu ở cả hai mặt. Hoa đơn tính khác gốc tập hợp thành tán hay chùm. Hoa màu
vàng trắng hay vàng lợt, hoa cái lớn hơn hoa đực. Quả hình cầu đẹt, dài 3 mm,

đường kính 6 mm, thường gồm 5 mảnh vỏ, lúc chín có màu tím đỏ, trên mặt có

những điểm tỉnh đầu; một hột, hột nâu đen, láng, đài 4 — 6 mm. Mùa hoa tháng 6 —

8. Mua qua tháng 9 — 10 [2], [6], [11].

1.1.3. Phan bé, sinh thái
Phân bố: chỉ Evodiae phân bố ở ving nhiệt đới và cận nhiệt đới, từ Đông
Madagascar đến vùng Nam Á, Đông —- Nam Á đến vùng Australia và một số đảo ở

_

Thái Bình Dương. Ngơ thù là lồi có nguồn gốc ở vùng ôn đới ấm cận Himalaya
thuộc Án Độ và Trung Quốc. Hiện nay, cây phân bố tự nhiên ở vùng Nam và Tây

Nam Trung Quốc, Bắc Ấn Độ. Ở nước ta, chỉ này có khoảng 10 lồi, phân bồ rải rác
khắp các vùng núi và trung du. Cây mọc ở Phó Bảng, n Ninh thuộc tỉnh Hà
Giang, cịn phát hiện ở một số vùng rừng núi Bát Đại Sơn, Tây Cơn Lĩnh cũng
thuộc tỉnh này. Ngồi ra, Ngơ thù du còn được trồng rải rác trong vườn một số gia
đình người Nùng, Tày ở huyện Cao Lộc và Văn Quan tỉnh Lạng Sơn [2], [6], [16].
Sinh thái: Ngô thù thuộc loại cây thân gỗ nhỏ, ưa sáng và có thể chịu bóng tối ở
thời kỳ cây cịn nhỏ. Cây thích nghỉ với vùng có khí hậu tương đối ơn hịa, nhiệt độ
trung bình năm từ 21 — 22°C. Cây rụng lá vào mùa đơng và có thể chịu đựng tốt khi

nhiệt độ xuống dưới 0°C. Cây tái sinh tự nhiên và được trồng chủ yếu bằng hạt [16].

1.1.4. Bộ phận dùng, thu hái, chế biến
Bộ phận dùng là quả (Ƒrucfus Evodiae). Được thu hái vào khoảng tháng 9 — 10, hai
lúc quả còn xanh hay hơi vàng xanh, chưa tách vỏ. Quả đem về được phơi nẵng hay

sấy khô. Khi dùng, quả Ngô thù đu được rửa qua vài lần với nước ấm (60-70°C),

sấy khô, giã đập, dùng sống. Có thể rửa qua với nước cam thảo, chích rượu, chích
4

(em

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

muối, tắm giấm, sao cát để giảm bớt tính mạnh của thuốc và tăng hiệu quả điều trị

[2], [6], [11].

°
i
lintuul

Hình 1.1. Cây Ngơ thù du

a
2

Hình 1.2. Quả Ngơ thù du khơ

1.2. Tổng quan về quả Ngơ thù du
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Quả hình cầu det, dài 3 mm, đường kính 6 mm, thường gồm 5 mảnh vỏ, chưa chín

có màu xanh, lúc chín có màu tím đỏ, trên mặt có những điểm tỉnh dầu. Mặt cắt
ngang quả có 5 ơ, mỗi ô chứ 1 — 2 hat, hạt nâu đen, láng, dài 4 - 6 mm. Mùi thơm

mát, vị cay, đắng [2], [4].
1.2.2. Đặc điểm vi phẫu

Bột màu nâu, lông che chở đa bào gồm 2 đến 6 tế bào, đường kính 140 um đến
350 um, vách ngồi có mấu bướu rõ rệt. Một số khoang tế bào chứa các chất màu
vàng nâu đến đỏ nâu. Lơng tiết có đầu hình bầu dục gồm 7 đến 14 tế bào, thường
chứa chất tiết màu vàng, chân có 2 đến 5 tế bào. Cụm tỉnh thé canxi oxalat hình cầu

gai hoặc hình lăng trụ, đường kính 10 #m đến 25 um. Tế bào mơ cứng có thành dày
và có ống trao đổi rõ thành từng cụm lớn hoặc rời rạc, đường kính 35 um đến
75 um. Manh mơ mềm có chứa tỉnh thể canxi oxalat hình cầu gai hoặc hình lăng
trụ. Tinh bột, khối màu, mạch vạch. Đơi khi cịn thấy các mảnh

các khoang dầu [4], [12].

vỡ màu vàng của


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

1.2.3. Thành phần hóa học

Trong quả Ngơ thù du chứa nhiều nhóm hợp chất hữu cơ như tỉnh dầu, limonoid,
alcaloid, flavonoid, acid carboxylic và policose. Hàm lượng các hợp chất rất khác

nhau tùy thuộc và điều kiện thổ nhưỡng, thời tiết khí hậu ở những vùng địa lí khác
nhau [6], [11], [39].

Tinh dầu có hàm lượng trên 0,4% [11]. Những nghiên cứu gần đây cho thấy đã có
tổng cộng 38 hợp chất tỉnh dầu được xác định trong quả Ngô thù du chưa chín. Một

số thành phần chính như: đ-myrcen (17,7%), (Z)-Ø-ocimen (14,8%), ø-phellandren
(14,7%),

y-terpinen

(6,4%),

linalool

(5,7%)

and /đ-thujen

terpineol, trans-caryophyllen... [43].

(5,1%),

B-elemen,

œ-

.

Cấu trúc một vài hợp chất tỉnh đầu trong quả Ngô thù đu.

B-myrcene

(Z)-B-ocimene

œ-Phellandrene

Limonoid là thành phần tạo vị đẳng của quá thuộc họ Cam. Các hợp chất limonoid
đã được phân lập và xác định cấu trúc như limonin evodin, evodol, obacunon,
jangomelid,
epilimonin,

rutaevin

acetat,

graucin

A,

12a-hydroxylimonin,

6a-acetoxy-5-

6f-acetoxy-5-epilimonin va 23-oxo-21&-hydroxy-21,23-dihydroevodol

(evodirutaenin), shihulimonin A là những hợp chất mới, lần đầu được công bố trên
Ngô thù du [11], [23], [37].


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Cầu trúc một vài hợp chất limonoid trong quả Ngô thù đu.

oO
oO

Limonin
Alcaloid là thành phần chính tạo nên các tác dụng được lý đang rất được quan tâm
nghiên cứu, đặc biệt là evodiamin và rutaecarpin, đây cũng chính là 2 hợp chất được

chúng tôi lựa chọn làm đối tượng cho để tài. Phân loại về mặt cấu trúc, alcaloid
trong quả Ngô thù du mang 2 khung cơ bản 1a indologuinazolin va quinolon.
Indoloquinazolin

alcaloid

gim

dihydrorutaecarpin,14—formyl

một

số

dihydrorutaecarpin,

hydroxyevodiamin, evodiaxinin... [36],

[39].

Quinolon

trên

alcaloid

cho

mau

tím

đỏ

bản

hexachlorophlatimat. Khi phân tích trên HPLC
dihydroevocarpin,

evocarpin,

pentadecyl-4(1H)-quinolon,
24[(6Z,

chất

evodiamin,

rutaecarpin,

7—carboxyevodiamin,

mỏng

với

thuốc

thử

hydrogen

cho 8 đỉnh trơng ứng 8 hợp chất;

1-methyl-2-undecyl-4(1H)-quinolon,

1-methyl-2-[(Z)-6-undecyl]-4(1H)-quinolon,

9Z)-6,9-pentadecadienyl]-4(1H)-quinolon,

tridecadienyl]-4(1H)-quinolon,

rhetisinin,

1-methyl-2-[(4Z,

l-methyl-21-methyl7Z)-4,7-

1-methyl-2-[(Z)-10-pentadecenyl]-4(1H)-quinolon

{37]1, [39].
Đặc biệt, wuchuyuamid-L, wuchuyuamid-II được tim thay thuộc một nhóm alcaloid

khác có cầu trúc là khung quinazolin [39].
N

Tm
oO

nv

Wuchuyuamid-I
7

NH


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

Hai acylgluconic acid mdi 14 trans-feruloylgluconic acid va trans-caffeoylgluconic
acid được công bố phân lập từ thành phần tan trong nước của dich chiết từ quả Ngơ
thù

du

gần

chín.

Thành

phần

tan trong

nước

này

đã phân

myo-inositol, phthalic acid dibutyl ester vA wuzhuyuamide-I

lập

3 hợp

chất

timg duge céng bé

trước đó [30].
Cơng thức cấu tạo của acylgluconic acid: trans-feruloylgluconic (a) acid

trans-

caffeoylgluconic acid (2)

1R=Me

2R=H

1.2.4. Tae dung dugc lp va công dụng của quả Ngô thù du
- Quả Ngô thù du từ lâu đã được sử đụng để chữa ăn uống không tiêu, nôn mửa, đau
bụng tiêu chảy, cơ thể tê đau, chân tay yếu, đau đầu, đau răng, miệng lưỡi lở ngứa,

cảm lạnh đùng ở dạng bột hoặc đạng sắc [2].

Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng, rutaecarpin và evodiamin ức chế kết
tập tiểu cầu, chống huyết khối, tác dụng giãn mạch, hạ huyết ap, lam tăng co bóp cơ

tim, gây co bóp cơ tử cưng, chống béo phì và đặc biệt khá năng diệt tế bào ung thư
[24], [25], [35]. Evodiamin cịn có khả năng gây chết tế bào khối n qua các con
đường khác nhau [41]. Các tác đụng lớn trén tim mach như chống oxi hóa, chống
xơ vữa thành mạch, khả năng tốt trong giảm đau, điều trị bệnh Alzheimer, gây hoại

tử khối u và bảo vệ thành tế bào [26]. Dịch chiết được liệu có trong loại quả này với
tác dụng kích thích tuyến tụy tiết insulin vả făng nhạy cảm insulin ở mô đưa đến
khả năng điều trị bệnh đái tháo đường đã được chứng minh [40]. Một số công bố
khác từ Viện nghiên cứu y học quốc gia Trung quốc và tạp chí y học nước này cho
thấy rất nhiều các thành phần trong quả Ngô thù du có khả năng ức chế virus H1N1,
8


(ae

Tài liệu phục vụ học tập, nghiên cứu khoa học

các

tác nhân

gây viêm

nhiễm,

chống

nhiễm

khuẩn

bởi

sự tác động

lên các

cyclo-oxygenase và prostaglandin [17], [26].
Ngoài ra, các quinolon alcaloid có tác dụng ức chế chọn lọc men MAO

(men tham

gia phân hủy các chất dẫn truyền thần kinh trung trơng như noradrenalin, dopamin,
serotonin) [21].
1.3. Tổng quan về hai hợp chất evodiamin và rutaecarpin
Evodiamin và rutaecarpin thuộc nhóm alealoid có cấu trúc indoloquinazolin.

1.3.1. Evodiamin [19]
Ở nhiệt độ thường là chất rắn màu trắng đến hơi vàng.
Công thức phân tử: C¡aH;;N;O.

Phân tử lượng: 303,3578.

Khối lượng riêng: 1,39 g/cm”
Nhiệt độ sơi: 575,07°C ở 760mmHg.
Nhiệt độ nóng chảy: 278°C.
Tính tan: DMSO

(5 mg/mL,

ở 40°C), tan được trong cloroform,

diclorometan,

aceton, ethyl acetat, ít tan trong nước, metanol và etanol (<1 mg/mL, ở 25°C).
'4

g2]

R

iz

|

(a)

,

(b)

Hình 1.3. Cấu trúc hóa học (a) và phổ UV (b) của evođiamin
1.3.2. Rutaecarpin

[18]

Chất rắn màu trắng ở nhiệt độ thường.
Công thức phân tử: Oi¿H;zN;O

Phân tử lượng: 287,32
Khối lượng riêng:

1,45 g/cm”