Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao định lượng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân lao

Phụ lục 1
Bộ Y tế







Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ






Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao định lợng nồng độ thuốc chống lao
trong huyết tơng bệnh nhân lao






Chủ nhiệm đề tài: TS BS Lê Thị Luyến
TS DS Nguyễn Thị Liên Hơng
Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Dợc Hà Nội

8418



Năm 2010
Phụ lục 1
Bộ Y tế







Báo cáo kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ



Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao định lợng nồng độ thuốc chống lao
trong huyết tơng bệnh nhân lao

Chủ nhiệm đề tài: TS BS Lê Thị Luyến
TS DS Nguyễn Thị Liên Hơng
Cơ quan chủ trì đề tài: Trờng Đại học Dợc Hà Nội
Cấp quản lý: Bộ Y Tế
Thời gian thực hiện : từ tháng 12/2007 đến tháng 12/2010
Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 460 triệu đồng








Năm 2010
i

mục lục

Trang
Mục lục i
Danh mục các chữ viết tắt v
Báo cáo thống kê kết quả thực hiện đề tài KHCN cấp Bộ vi
Bản tự đánh giá tình hình thực hiện đề tài và những đóng góp mới
của đề tài KHCN cấp Bộ
xiv
Đặt vấn đề
1
Phần 1: Tổng quan
1.1. Phơng pháp định lợng RMP, INH, PZA trong huyết

tơng bằng HPLC
3
1.1.1. Phơng pháp chiết RMP, INH, PZA từ huyết tơng 4
1.1.2. Chơng trình sắc ký 5
1.1.3. Độ ổn định của RMP, INH, PZA trong huyết tơng 6
1.1.4. Các chỉ tiêu thẩm định phơng pháp định lợng 8
1.2. Dợc động học của RMP, INH, PZA 8
1.2.1. Dợc động học của RMP 8
1.2.2. Dợc động học của INH 10
1.2.3. Dợc động học của PZA 11
1.3. Các nghiên cứu về nồng độ thuốc chống lao trong huyết
tơng bệnh nhân
12
1.3.1. Các nghiên cứu khảo sát nồng độ thuốc trong huyết tơng 13
1.3.2. Nghiên cứu về các yếu tố liên quan nồng độ RMP, INH,
PZA huyết tơng
14
1.3.3. Nghiên cứu về liên quan nồng độ thuốc chống lao và hiệu
quả điều trị
18
Phần 2: Đối tợng, phơng tiện và phơng pháp
nghiên cứu
ii

2.1. Đối tợng nghiên cứu
19
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu 19
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ 20
2.2. Vật liệu và phơng tiện nghiên cứu
20

2.2.1. Nguyên liệu, hoá chất, dung môi 20
2.2.2. Dụng cụ, thiết bị 20
2.2.3. Dung dịch chuẩn 21
2.2.4. Dụng cụ lấy máu và vận chuyển mẫu 21
2.3. Phơng pháp nghiên cứu
21
2.3.1. Xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng RMP,
INH, PZA trong huyết tơng
21
2.3.1.1. Xây dựng phơng pháp định lợng 21
2.3.1.2. Thẩm định phơng pháp 22
2.3.2. Khảo sát nồng độ RMP, INH, PZA trong huyết tơng
bệnh nhân lao
25
2.3.2.1. Thiết kế nghiên cứu 25
2.3.2.2. Phơng pháp tiến hành 26
2.3.3. Phơng pháp thống kê, xử lý số liệu 28
Phần 3: Kết quả nghiên cứu
3.1. Xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng
29
3.1.1. Xây dựng phơng pháp định lợng 29
3.1.1.1. Phơng pháp chiết RMP, INH, PZA từ huyết
tơng
29
3.1.1.2. Chơng trình sắc ký 30
3.1.2. Thẩm định phơng pháp định lợng 32
3.1.2.1. Tính chọn lọc 32
3.1.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính 35
3.1.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lợng 36
3.1.2.4. Độ chính xác 37

3.1.2.5. Độ đúng 37
iii

3.1.2.6. Độ ổn định 38
3.2. Kết quả khảo sát nồng độ RMP, INH, PZA huyết tơng
bệnh nhân lao
39
3.2.1. Đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu 39
3.2.2. Nồng độ RMP, INH, PZA trong huyết tơng sau 2h uống
thuốc
42
3.2.2.1. Nồng độ trung bình RMP, INH, PZA ở thời điểm
2h sau uống thuốc
42
3.2.2.2. Nồng độ RMP huyết tơng 43
3.2.2.3. Nồng độ INH huyếttơng 44
3.2.2.4. Nồng độ PZA huyết tơng 45
3.2.2.5. So sánh tỷ lệ bệnh nhân phân bố theo khoảng
nồng độ điều trị
46
3.2.2.6. Số lợng bệnh nhân có nồng độ thuốc thấp hơn
phạm vi điều trị
47
3.2.3. Phân tích một số yếu tố liên quan đến nồng độ RMP,
INH, PZA huyết tơng
48
3.2.3.1. Những yếu tố có thể ảnh hởng đến nồng độ
RMP, INH, PZA huyết tơng
48
3.2.3.2. ảnh hởng của nồng độ thuốc đến đáp ứng điều

trị
55
Phần 4: Bàn luận
4.1. Phơng pháp định lợng RMP-INH-PZA trong huyết
tơng
59
4.1.1. Phơng pháp chiết RMP, INH, PZA từ huyết tơng 59
4.1.2. Phơng pháp phân tích 60
4.1.3. Thẩm định phơng pháp phân tích 61
4.2. Nồng độ RMP, INH, PZA huyết tơng bệnh nhân ở thời
điểm 2h sau uống thuốc
63
iv

4.2.1. Nồng độ trung bình RMP, INH, PZA ở thời điểm 2h sau
uống thuốc
63
4.2.2. Phân bố tỷ lệ bệnh nhân theo phạm vi nồng độ điều trị 65
4.2.3. Các yếu tố liên quan đến nồng độ RMP, INH, PZA
huyết tơng
69
4.2.4. ảnh hởng của nồng độ thuốc tới đáp ứng 2 tháng đầu
điều trị
72
*Những ứng dụng bớc đầu và những hạn chế của nghiên cứu 75
Kết luận
77
Đề xuất
79

Tài liệu tham khảo
Các phụ lục
Phụ lục 1: Danh mục các bài báo đã công bố liên quan đến kết quả
nghiên cứu
Phụ lục 2: Các sản phẩm về đào tạo liên quan đến đề tài
Phụ lục 3: Phơn
g

p
há
p
định lợn
g
RMP và PZA tron
g
hu
y
ết tơn
g

Phơng pháp định lợng INH trong huyết tơng
Phụ lục 4: Hồ sơ về đạo đức trong nghiên cứu
Phụ lục 5: Phiếu theo dõi bệnh nhân nghiên cứu

v

Danh mục Những chữ viết tắt
AFB
- Trực khuẩn bền với acid (kháng acid) (Acid Fast Bacilli)
ALT

- Alanin aminotransferase
AST
- Aspartat transaminase
AUC
- Diện tích dới đờng cong nồng độ huyết tơng - thời gian
(Area Under the Curve of Plasma Concentration - Time)
CDC
- Trung tâm Kiểm soát và dự phòng bệnh tật Mỹ
(Center for Diseases Control and Prevention)
Cmax
- Nồng độ tối đa của thuốc trong huyết tơng
CTCLQG
- Chơng trình chống lao quốc gia
E, EMB
- Ethambutol
FDA
- Cơ quan quản lý Thực phẩm Dợc phẩm Mỹ (Food and Drug
Administration)
FDC
- Thuốc viên hỗn hợp cố định liều (Fixed Dose Combination)
H, INH
- Isoniazid
HPLC
- Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid
Chromatography)
R, RMP
- Rifampicin
S, SM
- Streptomycin
t

1/2

- Thời gian bán thải của thuốc
Tmax
- Thời gian thuốc đạt nồng độ cao nhất trong huyết tơng kể từ khi
uống
WHO
- Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization)
Z, PZA
- Pyrazinamid
CA - Cinnamaldehyd
àg
- Microgam
àm
- Micromet
àl
- Microlit
MeCN - Acetonitril
MeOH - Methanol
TCA - acid tricloacetic
vi


BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU CẤP BỘ

I. THÔNG TIN CHUNG
1.
Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
định lượng nồng độ thuốc chống lao RHZ trong huyết tương bệnh nhân lao

2. Chủ nhiệm đề tài:
1. Họ và tên: Lê Thị Luyến
Ngày, tháng, năm sinh: 22/2/1967 Nam/ Nữ: Nữ
Học hàm, học vị: Tiến sĩ Y học
Chức vụ: chuyên viên chính
Điện thoại: Tổ chức: 62732249 Nhà riêng: 37846918 Mobile:
0913597423
Fax: 6 2732243 E-mail:
Tên tổ chức đang công tác: Vụ Khoa học và Đào t
ạo, Bộ Y tế
Địa chỉ cơ quan: 138A Giảng Võ, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: Số 21 Lô 4A Trung yên 10, Q. Cầu Giấy, Hà Nội
2. Họ và tên: Nguyễn Thị Liên Hương
Ngày, tháng, năm sinh: 06/7/1974 Nam/ Nữ: Nữ
Học hàm/học vị: Tiến sỹ Dược học
Chức vụ : Trưởng bộ môn Dược lâm sàng ĐH Dược Hà Nội
Điện thoại: (CQ)/ 04.9330771 (NR)/ 04.8586359 Mobile: 0904308406
Fax: E-mail:
Địa chỉ cơ quan: Trường Đại học Dược Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: Số 8 Ngõ 72 Chính Kinh, Nhân Chính, Thanh Xuân, Hà
Nội

3. Tổ chức chủ trì đề tài:
Tr−êng §¹i häc D−îc Hµ Néi
§iÖn tho¹i: 04 8255437 Fax: 04 9332332
E-mail:
§Þa chØ: 13 Lª Th¸nh T«ng – Hµ Néi
vii

II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài:
- Theo quyết định phê duyệt: từ tháng 12/2007 đến tháng 7/2010
- Thực tế thực hiện: từ tháng 3/2008 đến tháng 12/2010
- Được gia hạn
- Lần 1 từ tháng 8/ 2010 đến tháng 1/2011
- Lần 2 ….
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 460 tr.đ, trong đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 460 tr.đ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: 0 .tr.đ.
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Theo kế hoạch Thực t
ế đạt được
Số
TT
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Ghi chú
(Số đề nghị
quyết toán)
1 2007 100 2007 100 100
2 2008 200 2008 200 200
3 2009 160 2009 160 160

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng SNKH Nguồn
khác
Tổng SNKH Nguồn
khác
1 Trả công lao động
(khoa học, phổ
thông)
207.5 207.5
0
207.5 207.5
0
2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
160.2 160.2
0
160.2 160.2
0
3 Thiết bị, máy móc
0 0
0
0 0
0

4 Xây dựng, sửa
chữa nhỏ
0 0
0
0 0
0
5 Chi khác
92.3 92.3
0
92.3 92.3
0

Tổng cộng
viii


3. Cỏc vn bn hnh chớnh trong quỏ trỡnh thc hin ti/d ỏn:
(Lit kờ cỏc quyt nh, vn bn ca c quan qun lý t cụng on xỏc nh nhim v, xột chn,
phờ duyt kinh phớ, hp ng, iu chnh (thi gian, ni dung, kinh phớ thc hin nu cú); vn
bn ca t chc ch trỡ ti, d ỏn (n, kin ngh iu chnh nu cú)
S
TT
S, thi gian ban
hnh vn bn
Tờn vn bn Ghi chỳ
1 5316/Q-BYT
ngy 25/12/2007
Quyt nh phờ duyt
2 8833/BYT-K2T
ngy 22/02/2010

Cụng vn gia hn thi gian
thc hin ti
Gia hn thc hin
n thỏng 1/2011

4. T chc phi hp thc hin ti, d ỏn:
S
TT
Tờn t chc
ng ký
theo Thuyt
minh
Tờn t chc
ó tham gia
thc hin
Ni dung
tham gia ch yu
Ghi chỳ*
1
Đại học
Dợc Hà
Nội
Đại học
Dợc Hà
Nội
- Xây dựng phơng
pháp định lợng các
thuốc trong huyết
tơng.
- Triển khai định lợng

nồng độ thuốc trong
huyết tơng
- Nhp v phõn tớch d
liu
- Vit bỏo cỏo tng kt

2
BV Lao và
bệnh phổi
TƯ
BV Lao và
bệnh phổi
TƯ

3
BV Lao và
BP Hải
Phòng
BV Lao và
BP Hải
Phòng

4
BV Lao và
BP Thái
Nguyên
BV Lao và
BP Thái
Nguyên
- Lựa chọn bệnh nhân

nghiên cứu
- Lấy mẫu máu định
lợng
- Thu thập các dữ liệu
lâm sàng, cận lâm
sàng
- Theo dõi bệnh nhân
nghiên cứu.
- Xét nghiệm vi khuẩn
lao


ix

5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:
Số
TT
Tên cá nhân
đăng ký theo
Thuyết minh
Tên cá
nhân đã
tham gia
thực hiện
Nội dung tham gia
chính
Sản phẩm chủ
yếu đạt được
1 TS Lê Thị Luyến
2 TS Nguyễn Thị Liên Hương

3 TS Nguyễn Thị Kiều Anh
4 ThS Vò §×nh Hoµ
5 ThS Ph¹m T. Thuý V©n
6 ThS Phan Quúnh Lan
7 DS NguyÔn Tø S¬n
8 Bs Ph¹m ThÞ HiÓn* DS TrÞnh
Trung HiÕu
Xây dựng phương pháp
định lượng
Bảo quản mẫu
Định lượng nồng độ
thuốc
Phân tích và xử lý dữ
liệu
Viết báo cáo tổng kết
- Phưong pháp định
lượng PZA và
RMP đồng thời
- Phương pháp định
lượng INH
- Định lượng nồng
độ thuốc dựa trên
phương pháp xây
dựng được
- Mẫu bảo quản
đúng điều kiện quy
định
- Phân tích dữ liệu
- Báo cáo tổng kết
9 BS Hoµng ThÞ Ph−îng

10 BS Chu ThÞ Minh**
11 BS Ph¹m ThÞ Ph−¬ng Nam**
12
DS CK1 Bµnh §øc L©m***
Lựa chọn bệnh nhân
nghiên cứu
Lấy mẫu và vận chuyển
huyết tương
Theo dõi diễn biến điều
trị
Thu thập dữ liệu trên
lâm sàng
**Thực hiện luận văn
cao học
***Thực hiện luận văn
chuyên khoa 2
- Thu thập đủ số
bệnh nhân nghiên
cứu
- Lấy đủ số mẫu và
vận chuyển theo
đúng điề
u kiện quy
định
- Thu thập các dưc
liệu của bệnh nhân
trên lâm sàng theo
quy định
- 2 luận văn thạc sĩ
Y học

- 1 luận văn Dược
sĩ chuyên khoa cấp
2
13 TS NguyÔn V¨n H−ng
Xét nghiệm VK lao - Xét nghiệm VK
lao các mẫu bệnh
phẩm bn nghiên
cứu
- Lý do thay đổi (nếu có): * nghỉ hưu trong quá trình đề tài đang triển khai

6. Tình hình hợp tác quốc tế: Không

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Không

x

8. Túm tt cỏc ni dung, cụng vic ch yu:
(Nờu ti mc 15 ca thuyt minh, khụng bao gm: Hi tho khoa hc, iu tra kho sỏt trong nc v nc
ngoi)

Thi gian
(Bt u, kt thỳc
- thỏng nm)
S
TT
Cỏc ni dung, cụng vic
ch yu
(Cỏc mc ỏnh giỏ ch yu)
Theo k
hoch

Thc t t
c
Ngi,
c quan
thc hin
1
Xây dựng đề cơng nghiên cứu
Thiết kế biểu mẫu Khảo sát
nồng độ thuốc và theo dõi bệnh
nhân
7/2007
12/2007
7/2007
12/2007
Lê Thị Luyến
Nguyễn Liên Hơng


Tập huấn cho các nghiên cứu
viên

12/2007 12/2007
Lê Thị Luyến
Nguyễn Liên Hơng

2
Xây dựng và thẩm định quy
trình định lợng INH và PZA
trong huyết tơng

12/2007
5/2009
12/2007
5/2009
Nguyễn Liên Hơng
Nguyễn T. Kiều Anh
Vũ Đình Hoà
Nguyễn Tứ Sơn
Trịnh Trung Hiu

3
Lựa chọn bệnh nhân nghiên cứu
Thu thập mẫu máu, Xử lý mẫu
5/2008
5/2009
5/2008
5/2009
4
- Theo dõi bệnh nhân, ghi chép
dữ liệu bệnh nhân nghiên cứu
- Chỉ định xét nghiệm đờm
- Xột nghim vi khun lao

05/2008
07/2009
05/2008
07/2009
Chu Thị Minh
Bành Đức Lâm
Phạm T. Phơng

Nam
Hoàng Thị Phợng
Nguyễn Văn Hng

5
- Bảo quản mẫu huyết tơng
- Định lợng INH, PZA, RMP
huyết tơng
05/2008
07/2009
05/2008
05/2010
6
Nhập dữ liệu, xử lý dữ liệu,
phân tích

7/2009
5/2010 -
10/2010
Nguyễn Liên Hơng
Nguyễn T. Kiều Anh
Vũ Đình Hoà
Nguyễn Tứ Sơn
Lờ T. Luyn
Phan Qunh Lan
Nguyn Thỳy Võn
Trịnh Trung Hiu
7 Vit Bỏo cỏo tng kt
8/2009
10/2009

10/2010
12/2010
Lê Thị Luyến
Nguyễn Liên Hơng



III. SN PHM KH&CN CA TI
1. Sn phm KH&CN ó to ra:
a) Sn phm Dng I: Không đăng ký
xi

S
TT
Tờn sn phm v
ch tiờu cht lng
ch yu
n
v o
S lng
Theo k
hoch
Thc t
t c
1

b) Sn phm Dng II:
Yờu cu khoa hc
cn t

S
TT
Tờn sn phm

Theo k hoch Thc t
t c
Ghi chỳ

1
Phơng pháp định
lợng INH trong huyết
tơng

2
Phơng pháp định
lợng PZA trong
huyết tơng
Phơng pháp đơn
giản, dễ thực
hiện, khả thi tại
Việt Nam. Đợc
thẩm định đầy đủ
về tiêu chuẩn theo
quy định của
FDA
Phơng pháp đơn
giản, dễ thực
hiện, khả thi tại
Việt Nam. Đợc
thẩm định đầy đủ

về tiêu chuẩn theo
quy định của
FDA
Định lợng
đồng thời PZA
và RMP trong
huyết tơng

c) Sn phm Dng III:
Yờu cu khoa hc
cn t

S
TT
Tờn sn phm

Theo
k hoch
Thc t
t c
S lng, ni
cụng b
(Tp chớ, nh
xut bn)
1
Bảng số liệu
khảo sát nồng
độ INH, PZA,
RMP huyết
tơng bệnh nhân

lao
Số liệu chính xác,
khoa học, mô tả đợc
thực trạng nồng độ
RMP, INH và PZA
trong huyết tơng
Số liệu chính xác,
khoa học, mô tả
đợc thực trạng
nồng độ RMP, INH
và PZA trong huyết
tơng

2
Báo cáo phân
tích
Phân tích về mối liên
quan của nồng độ
thuốc với các yếu tố
và liều điều trị
Phân tích về mối liên
quan của nồng độ
thuốc với các yếu tố
và liều điều trị
01Bỏo cỏo
tng hp
3
Bài đăng báo từ
kết quả nghiên
cứu

03 05
YH thực hành
YH Việt Nam
Proceedings of
Indochina
conference on
pharmaceutical
science
4
Đào tạo
02 05
Đã bảo vệ
d) Kt qu o to:
xii

Số lượng
Số
TT
Cấp đào tạo, Chuyên
ngành đào tạo
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1 Thạc sỹ
01 04
2008/2009
2 Tiến sỹ
0

3 BS Nội trú
0

4 DS CKII
0 01
2010

2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
1. Phương pháp HPLC là phương pháp hiện đại được các nhà khoa học trên
thế giới khuyến cáo sử dụng trong định lượng nồng độ thuốc chống lao trong
huyết tương tại hầu hết các phòng nghiên cứu về dược động học và sinh khả
dụng của thuốc. Phương pháp định lượng chúng tôi xây dựng được trên cơ
sở
tham khảo các nghiên cứu khác trên thế giới đã công bố và nghiên cứu áp
dụng có thay đổi cho phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt Nam.
2. Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời RMP và PZA trong
huyết tương bằng phương pháp HPLC: phương pháp chiết đơn giản, phương
pháp phân tích hiệu quả, dễ áp dụng, định lượng được đồng thời RMP và PZA
trong cùng một pha động. Phương pháp định l
ượng đã được thẩm định đầy đủ
về các tiêu chuẩn theo yêu cầu của FDA về phương pháp định lượng thuốc
trong dịch sinh học.
3. Xây dựng được và thẩm định phương pháp định lượng INH trong dịch sinh
học. Thẩm định đầy đủ các tiêu chuẩn theo quy định của FDA về phương
pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học. Phương pháp định lượng đơn
giản, dễ thự
c hiện tại Việt Nam.
4. Ứng dụng kỹ thuật định lượng thuốc trong dịch sinh học bằng HPLC đã
xây dựng được để khảo sát nồng độ thuốc trong huyết tương 285 bệnh nhân

lao đang điều trị tại Việt Nam.
xiii

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
Phương pháp định lượng nồng độ RMP, INH, PZA trong huyết tương có giá
trị ứng dụng trong các phòng nghiên cứu về dược động ứng dụng trong điều
trị, sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc. Đặc biệt có thể ứng
dụng phương pháp này trong đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học
các thuốc chống lao khi lựa chọn đấ
u thầu thuốc của Chương trình chống lao
quốc gia Việt Nam, nhằm lựa chọn được thuốc chống lao có chất lượng điều
trị bệnh nhân.
Các kết quả của nghiên cứu về nồng độ thuốc trong huyết tương giúp ích cho
các chuyên gia về bệnh lao thấy được nồng độ thuốc đạt được trong huyết
tương thấp hơn phạm vi điều trị, góp phần đư
a ra bằng chứng về nguyên nhân
gia tăng bệnh lao và tình trạng kháng thuốc lao. Ngoài ra, phân tích về ảnh
hưởng của những yếu tố cá thể đến nồng độ thuốc trong huyết tương bệnh
nhân, từ đó ứng dụng việc tối ưu hoá điều trị dựa trên nồng độ thuốc, cũng
như đưa ra những vấn đề cần nghiên cứu sâu hơn nhằm tìm ra các giải pháp
đi
ều trị, kiểm soát bệnh lao thành công.
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:
Số
TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính,

người chủ trì…)
I Báo cáo định kỳ
Lần 1 2008 Thực hiện đúng theo tiến độ
II Kiểm tra định kỳ Thực hiện đúng theo tiến độ
Lần 1 2008
III Nghiệm thu cơ sở 2010

Chủ nhiệm đề tài




TS Lê Thị Luyến TS Nguyễn T.Liên Hương
Thủ trưởng tổ chức chủ trì

xiv

BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ
Về tình hình thực hiện và những đóng góp mới của đề tài KHCN cấp Bộ


1. Tên đề tài:
Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
định lượng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tương bệnh nhân lao
2. Chủ nhiệm đề tài:
TS BS Lê Thị Luyến – TS DS Nguyễn Thị Liên Hương
3. Cơ quan chủ trì đề tài: Trường Đại học Dược Hà Nội
4. Thời gian thực hiện: 12/2007 – 12/2010
5. Tổng kinh phí thực hiện Đề tài: 460 triệu đồng
Trong đó, kinh phí từ NSNN: 460 triệu đồng

6. Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương:
6.1. Mức độ hoàn thành khối lượng công việc:
Hoàn thành đầy đủ số lượng, chủng loại sản phẩm theo như đề cương đã
đăng ký. Thực hiện được đầy đủ các mục tiêu của đề tài:
- Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng RMP, INH, PZA
trong huyết tương bằ
ng phương pháp HPLC
- Khảo sát nồng độ RMP, INH, PZA trong huyết tương bệnh nhân lao
Các nội dung nghiên cứu và kết quả đạt được phù hợp với mục tiêu nghiên
cứu đã được phê duyệt.
Vượt mức sản phẩm về đào tạo và công bố kết quả nghiên cứu so với đề
cương đã được phê duyệt.
xv

6.2. Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN
1. Xây dựng được phương pháp định lượng đồng thời RMP và PZA trong
huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao: phương
pháp chiết đơn giản, phương pháp phân tích hiệu quả, dễ áp dụng, định
lượng được đồng thời PZA và RMP trong cùng một pha động. Phương
pháp định lượng đã được thẩm
định đầy đủ về các tiêu chuẩn theo yêu
cầu của FDA về phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học.
2. Xây dựng được và thẩm định phương pháp định lượng INH trong dịch
sinh học. Thẩm định đầy đủ các tiêu chuẩn theo quy định của FDA về
phương pháp định lượng thuốc trong dịch sinh học. Phương pháp định
lượng đơn giản, dễ thực hiện tại Việt Nam.
3. Các số liệu về nồng độ RMP, INH, PZA trong huyết tương bệnh nhân
lao phổi và màng phổi tại Việt Nam: mô tả được thực trạng nồng độ
thuốc trong huyết tương so với nồng độ phạm vi điều trị cần đạt. Nồng
độ INH và RMP thấp hơn phạm vi điều trị chiếm tỷ lệ cao (RMP

76,3%, INH 49,4%, PZA 18,1%). Ngoài ra có một số bệnh nhân có
nồng độ thuố
c trong huyết tương cao hơn phạm vi điều trị (INH 10,8%,
PZA 13,8%).
4. Phân tích về mối liên quan giữa nồng độ thuốc trong huyết tương với
một số yếu tố liên quan về tình trạng bệnh tật và liều điều trị:
Bằng phương pháp phân tích tương quan đơn biến và phân tích
tương quan đa biến đa cho thấy nồng độ các thuốc chống lao có tương
quan thuận với liều
điều trị. Ngoài ra, yếu tố tuổi tương quan thuận với
nồng độ RMP, thể lao có tương quan thuận với nồng độ INH, đặc biệt ở
nhóm bệnh nhân lao màng phổi có nồng độ INH cao hơn so với nhóm
bệnh nhân lao phổi. Bệnh nhân nữ có nồng độ PZA cao hơn so với
nhóm bệnh nhân nam.
xvi

6.3. Công bố các kết qủa nghiên cứu trên các tạp chí khoa học y dược và
Hội nghị quốc tế:
- Đăng tải 05 bài báo trên Tạp chí Y học thực hành, Y học Việt Nam,
Báo cáo toàn văn đăng tải trên Proceeding của Hội nghị Dược Đông
Dương lần thứ 6 (2009)
- Báo cáo và đăng tải tóm tắt kết quả nghiên cứu tại các Hội nghị quốc
tế:
- Hội thảo quốc tế
về tối ưu hóa trị liệu bệnh lao tại Ấn Độ tháng 11
năm 2009 (International Symposium on optimization of inhaled
tuberculosis therapies and implications for Host - Pathogen
Interaction, New Dehli, India 3 - 5 November 2009)
- Hội nghị toàn cầu về bệnh lao và bệnh phổi lần thứ 41 tại Berlin
(Đức) tháng 11 năm 2010 (41

st
World Conference on Lung Health
of the Union Againts Tuberculosis and Lung Diseases, Berlin,
Germany 11- 15 November 2010)
- Hội nghị Dược Đông dương lần thứ 6 (The sixth Indochina
conference on pharmaceutical science, Hue 2009)
6.4. Đóng góp về đào tạo:
- Đào tạo 2 thạc sĩ Y học (đã bảo vệ vệ thành công năm 2008)
- Đào tạo 2 thạc sĩ Dược học học (đã bảo vệ vệ thành công năm 2008,
2009)
- Đào tạo 01 dược sĩ chuyên khoa cấp 2 (đã bảo vệ
thành công năm
2010)
- Góp phần đào tạo về định lượng thuốc trong dịch sinh học, ứng dụng
trong nghiên cứu dược động học/ dược lâm sàng cho các giảng viên của
Bộ môn Dược lâm sàng.
6.5. Về tiến độ thực hiện:
xvii

Đã được gia hạn thời gian thực hiện đề tài 06 tháng (đến hết 1/2011).
Hoàn thành đề tài đúng thời hạn đã được gia hạn.
7. Về những đóng góp mới của đề tài:
Đề tài có những điểm mới sau đây:
7.1. Về giải pháp khoa học - công nghệ: Phương pháp HPLC là phương pháp
hiện đại được khuyến cáo sử dụng trong định lượng nồng độ thuốc chống lao
trong huyết tươ
ng trong hầu hết các phòng nghiên cứu về dược động học và
sinh khả dụng của thuốc. Phương pháp xây dựng được có áp dụng trên cơ sở
của các nghiên cứu khác trên thế giới đã công bố và có thay đổi cho phù hợp
với điều kiện phòng thí nghiệm của Việt nam. Phương pháp phân tích đơn

giản, khả thi. Ứng dụng kỹ thuật định lượng thuốc trong dịch sinh học bằng
HPLC đã xây dự
ng được để khảo sát nồng độ thuốc trong huyết tương 285
bệnh nhân lao đang điều trị tại Việt Nam.
7.2. Về phương pháp nghiên cứu: Ngoài những nghiên cứu về nồng độ RMP
huyết tương chúng tôi thực hiện năm 2005, đây là nghiên cứu đầu tiên tại Việt
Nam về nồng độ cả 3 thuốc chống lao thiết yếu RMP, INH, PZA trong huyết
tương bệnh nhân lao.
7.3. Những đóng góp mớ
i khác:
Đóng góp trong đào tạo: các bác sĩ chuyên ngành lao, dược sĩ chuyên
ngành dược lâm sàng có hiểu biết sâu hơn về ứng dụng dược động học trong
điều trị.
Các kết quả của nghiên cứu này cũng giúp ích cho các chuyên gia về
bệnh lao thấy được nồng độ thuốc đạt được trong huyết tương thấp hơn phạm
vi điều trị, góp phần đưa ra bằng chứng về nguyên nhân gia tăng bệ
nh lao và
tình trạng kháng thuốc lao. Ngoài ra, phân tích về ảnh hưởng của những yếu
tố cá thể đến nồng độ thuốc trong huyết tương bệnh nhân, từ đó ứng dụng
việc tối ưu hoá điều trị dựa trên nồng độ thuốc, cũng như đưa ra những vấn đề
xviii

cần nghiên cứu sâu hơn nhằm tìm ra các giải pháp điều trị, kiểm soát bệnh lao
thành công.


Hà Nội, ngày 10 tháng 12 năm 2010
CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

TS Lê Thị Luyến TS Nguyễn Thị Liên Hương



1
Đặt vấn đề

Hóa trị liệu là phơng pháp quan trọng nhất để đảm bảo bệnh nhân lao
đợc điều trị khỏi bệnh và cắt nguồn lây trong cộng đồng. Điểm đặc biệt của
hoá trị liệu bệnh lao là thời gian điều trị kéo dài và đa trị liệu, vì vậy việc tuân
thủ đúng liệu trình điều trị gặp nhiều khó khăn. Số loại thuốc chống lao không
nhiều, trong khi đó các thuốc chống lao mới ra đời vẫn còn rất ít và còn đang
trong giai đoạn thử nghiệm lâm sàng, khó tiếp cận trong điều kiện Việt Nam.
Các thuốc điều trị bệnh lao hiện đã và đang sử dụng tuy không mới nhng
vẫn là vũ khí quan trọng nhất để điều trị bệnh lao.
Thực tế điều trị bệnh lao cho thấy đa số bệnh nhân lao đáp ứng tốt với
phác đồ điều trị chuẩn và thực hiện điều trị có giám sát trực tiếp, nhng có
một số bệnh nhân đáp ứng kém mặc dù phác đồ đúng và tuân thủ điều trị. Một
số nghiên cứu gần đây cho thấy sự khác biệt giữa các cá thể về nồng độ thuốc
lao đạt đợc trong huyết tơng mặc dù đợc uống cùng liều nh nhau.
Isoniazid (INH), Rifampicin (RMP), Pyrazinamid (PZA) là những thuốc
chống lao thiết yếu đợc sử dụng rộng rãi tại Việt Nam. Các thuốc này có tác
dụng diệt khuẩn và tiệt khuẩn trong tổn thơng lao, đợc sử dụng kết hợp
trong giai đoạn tấn công của các phác đồ điều trị. Để điều trị có hiệu quả,
nồng độ thuốc trong máu/huyết tơng phải đạt nồng độ trong phạm vi điều trị.
Nồng độ các thuốc chống lao trong máu thấp có thể là một trong các nguyên
nhân gây ra nguy cơ đáp ứng điều trị kém, kháng thuốc và tăng khả năng tái
phát bệnh lao.

Nghiên cứu năm 2005 tại Việt Nam về nồng độ RMP trong huyết tơng
đã đa ra phơng pháp định lợng RMP huyết tơng, các thông tin về đánh
giá chất lợng RMP trong viên hỗn hợp có định liều và thực trạng nồng độ
RMP trong huyết tơng bệnh nhân[5],[6]. Trong khi đó điều trị bệnh lao
thờng phối hợp nhiều thuốc, nhất là các thuốc uống nh
RMP, PZA, INH là


2
các thuốc chống lao thiết yếu, có mặt trong các phác đồ điều trị bệnh lao. Do
đó nghiên cứu về nồng độ thuốc chống lao trong huyết tơng bệnh nhân cần
có dữ liệu nồng độ cả RMP, PZA, INH.
Định lợng nồng độ thuốc trong huyết tơng đòi hỏi các phơng tiện kỹ
thuật và phơng pháp phân tích phù hợp. Có nhiều phơng pháp định lợng
thuốc chống lao trong huyết tơng, nhng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC) là phơng pháp phổ biến hơn cả do có độ chính xác cao, khoảng
thời gian phân tích hợp lý và chi phí chấp nhận đợc. Trong điều kiện Việt
Nam hiện nay, máy HPLC tơng đối phổ biến, trong khi đó việc định lợng
nồng độ các thuốc chống lao RMP đã đợc chúng tôi xây dựng trong các
nghiên cứu trớc đây. Cùng với RMP, INH v PZA l các thuốc chống lao
thiết yếu dùng đồng thời trong phác đồ điều trị bệnh lao, cho đến thời điểm
chúng tôi tiến hành nghiên cứu này, cha có phơng pháp định lợng nồng độ
INH, PZA trong huyết tơng phù hợp với điều kiện hiện nay tại Việt Nam.
Những vấn đề đợc đề cập trên đây chính là lý do chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài: Nghiên cứu ứng dụng phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng
cao định lợng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tơng bệnh nhân lao.
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng rifampicin, isoniazid,
pyrazinamid trong huyết tơng bằng HPLC.
2. Khảo sát nồng độ rifampicin, isoniazid, pyrazinamid trong huyết tơng

bệnh nhân lao.


3
Phn 1
Tổng quan

1.1. Phơng pháp định lợng RMP, PZA, INH trong huyết
tơng bằng HPLC
Định lợng nồng độ thuốc trong máu (hoặc huyết tơng/huyết thanh)
không phải là xét nghiệm thờng quy mà đợc sử dụng trong một số trờng
hợp sau:


Giám sát nồng độ điều trị (Therapeutic Drug Monitoring) những thuốc
có phạm vi điều trị hẹp, bệnh nhân nghi ngờ khả năng hấp thu kém, có
rối loạn chức năng gan thận, hoặc để theo dõi sự tuân thủ điều trị của
bệnh nhân.
Nghiên cứu dợc động học của thuốc
Đánh giá sinh khả dụng (bioavailability) và tơng đơng sinh học
(bioequivalence) của thuốc.
Để định lợng đợc nồng độ RMP, INH, PZA huyết tơng trong đánh
giá sinh khả dụng của thuốc cũng nh giám sát nồng độ điều trị, cần xây dựng
đợc phơng pháp định lợng RMP, INH, PZA trong huyết tơng. Trớc đây
nồng độ thuốc chống lao trong huyết tơng đợc định lợng bằng phơng
pháp đo quang hoặc phơng pháp vi khuẩn học (sử dụng Staphylococcus
aureus, Sarcina lutea hoặc Bacillus subtilis). Gần đây, một số phơng pháp
khác nh: phơng pháp miễn dịch phóng xạ (radioimmunoassay), miễn dịch
huỳnh quang phân cực (fluorescence polarization immunoassay), sắc ký lỏng
hiệu năng cao (high performance liquid chromatography) đợc sử dụng để

định lợng nồng độ thuốc chống lao trong huyết tơng cho độ chính xác cao
hơn.


4
Định lợng thuốc chống lao trong huyết tơng bằng HPLC đợc Tổ
chức Y tế thế giới (WHO) và Hiệp hội bài lao và bệnh phổi quốc tế (IUATLD)
khuyến cáo sử dụng trong đánh giá sinh khả dụng của RMP, INH, PZA, EMB
trong chế phẩm thuốc chống lao hỗn hợp chứa RMP [75]. Ngoài ra, một số tác
giả trên thế giới [37],[40],[77]

đã xây dựng phơng pháp định lợng thuốc
chống lao trong huyết tơng và dịch sinh học khác nhằm nghiên cứu dợc
động học, sinh khả dụng và theo dõi điều trị.

Nhìn chung các phơng pháp
định lợng RMP, INH, PZA trong dịch sinh học đợc áp dụng gần đây hầu
hết là sử dụng phơng pháp HPLC vì đây là loại máy tơng đối phổ biến ở các
phòng nghiên cứu, phơng pháp có độ chính xác cao, khoảng thời gian phân
tích hợp lý và chi phí chấp nhận đợc.
1.1.1. Phơng pháp chiết RMP, INH, PZA từ huyết tơng
Để chiết hoạt chất từ huyết tơng phục vụ cho định lợng thuốc trong
huyết tơng bằng HPCL thờng sử dụng các phơng pháp sau:
- Phơng pháp chiết lỏng - lỏng: bằng dung môi hoặc hỗn hợp dung môi.
Một số hỗn hợp dung môi đã đợc nghiên cứu để chiết RMP, INH, PZA
bao gồm dichloromethan - diethylether, tỉ lệ 2:3 (v/v) [77], diethylether:
diclomethane, tỉ lệ 2:1(v/v), acid tricloacetic 5% [72].
- Phơng pháp chiết lỏng - rắn: dùng cột chiết xuất pha rắn để chiết hoạt
chất. Mẫu đợc bơm vào cột chiết xuất pha rắn sau đó đợc rửa giải bằng
hệ dung môi thích hợp để tách hoạt chất. P.J. Smith, J. van Dyk, A.

Fredericks [64] dùng cột C18 Bondelut, đợc hoạt hóa lần lợt bằng
methanol, nớc, đệm phosphat pH 4,5 trớc khi bơm mẫu. 0,5 ml huyết
tơng đợc bơm vào cột, giữ trong 5 phút và cho chảy từ từ qua cột. Sau
thời gian này, các thành phần không liên kết đợc loại bỏ. Cột chiết xuất
đợc rửa giải với 0,5 ml acetonitril, 0,5 ml methanol. Tuy nhiên phơng
pháp này đắt tiền hơn vì phải chi phí cho sử dụng cột chiết xuất pha rắn.
- Tủa protein huyết tơng: là phơng pháp đơn giản hơn cả. Một số dung
môi để tủa protein huyết t
ơng đã đợc nghiên cứu bao gồm acetonitril


5
[27], (tỉ lệ huyết tơng: acetonitril = 1:1,5 hoặc 1:1); methanol [45], acid
tricloacetic 5% [72].
1.1.2. Chơng trình sắc ký
Qui trình chiết và phơng pháp định lợng hoạt chất trong chế phẩm
bào chế thờng đơn giản hơn định lợng trong huyết tơng do tạp (các tá
dợc) ít hơn và hàm lợng trong thuốc thờng đã đợc dự đoán trớc. Đối với
việc định lợng các hoạt chất trong huyết tơng thờng phức tạp hơn do hàm
lợng thuốc trong huyết tơng thấp, trong huyết tơng có rất nhiều thành phần
và có thêm chất chuyển hóa của các hoạt chất. Tại Việt Nam, năm 2005 chúng
tôi đã xây dựng và thẩm định phơng pháp định lợng rifampicin trong huyết
tơng [5],[9].
Trên thế giới, có nhiều chơng trình sắc ký đợc sử dụng để định lợng
rifampicin trong huyết tơng nh trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số chơng trình HPLC định lợng RMP, INH, PZA trong
huyết tơng
Tài
liệu
TK

Ct Pha ng Detector Thi
gian lu
(phỳt)
Cht
nh
lng
[64]
àBondapak C 18
(30 cm x 3,9 mm,
10 àm)
Methanol 0,05 M
ammonium formate
(65:35)
254 7
RMP
[26] Spherisorb C 8
(250 x 4,6 mm
I.D., 5 àm, )
Tiền cột: C8
Acetonitrile- 0,1% acid
trifluoroacetic (80:20)
270 3,9
RMP
[45]
Nova Pack C18
(250 mm x 4 mm,
4 àm)
Methanol- dung dịch
0,01 M Natri phosphat
pH 5,2 (65:35)

UV
(254nm)
6,4 RMP
[45]

C
18
MeOH-m
p
hosphate (pH 5.2) =
65:35
UV
(254nm)
RMP: 17 RMP v
dn
cht,
Rifapen
tin (cú
mt
PZA)
[17,
24]
Gradient: m acetat,
nc, ACN
LC
MS/MS
RMP: 2-
3 phỳt
RMP v
cỏc cht