0131 nghiên cứu xây dựng qui trình định lượng đồng thời dư lượng một số kháng sinh nhóm phenicol quinolon có trong nước bằng phương pháp lc m

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN NGỌC KHÁNH THƯ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG MỘT SỐ
KHÁNG SINH NHÓM PHENICOL, QUINOLON CÓ
TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC

CẦN THƠ - 2018


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ

NGUYỄN NGỌC KHÁNH THƯ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH
LƯỢNG ĐỒNG THỜI DƯ LƯỢNG MỘT SỐ
KHÁNG SINH NHÓM PHENICOL, QUINOLON CÓ
TRONG NƯỚC BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC-MS/MS

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ ĐẠI HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. ĐỖ CHÂU MINH VĨNH THỌ
ThS. DƯƠNG THỊ TRÚC LY

Cần Thơ - 2018


LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian nghiên cứu thực hiện luận văn dưới sự hướng dẫn khoa học của
Thầy TS. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ và cô ThS. Dương Thị Trúc Ly em xin gửi
lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến:
TS. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ và cô ThS. Dương Thị Trúc Ly đã ln tận
tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ và cho em những ý kiến bổ ích trong suốt q
trình thực hiện luận văn.
Các thầy cơ trong Liên bộ mơn Hóa phân tích - Kiểm nghiệm - Độc chất, thầy
Nguyễn Mạnh Quân đã cho những lời khuyên hữu ích và giúp đỡ, tạo điều kiện cho
em có đầy đủ dụng cụ, trang thiết bị, máy móc để thực hiện đề tài này.
Xin gởi lời cám ơn chân thành đến Ths. Huỳnh Thị Ngọc Liên và Ths. Nguyễn
Văn Luy (Trung tâm chất lượng nông lâm thủy sản vùng 6, NAFI 6) đã giúp đỡ
hỗ trợ về chất chuẩn, hóa chất, kinh nghiệm phân tích mẫu để em hoàn thành tốt
luận văn.
Cảm ơn các anh chị Dược K38, anh Huỳnh Huỳnh Anh Thi và các bạn bè
Dược K39 đã giúp đỡ, động viên em trong suốt quãng thời gian vừa qua.
Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân đã ln
ủng hộ, đồng hành cùng con.


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự

hướng dẫn của TS. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ và ThS. Dương Thị Trúc Ly.
Các số liệu, kết quả thực nghiệm nêu trong luận văn là trung thực, chưa từng
được công bố trong bất kỳ tài liệu nào khác.
Cần Thơ, ngày 11 tháng 06 năm 2018

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Ngọc Khánh Thư


MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG VIẾT TẮT ................................................................................... i
DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. ii
DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................... iv
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
1.1. Tổng quan về nhóm kháng sinh phenicol ........................................................... 3
1.1.1. Tổng quan cloramphenicol ...................................................................... 3
1.1.2. Tổng quan florfenicol ............................................................................... 4
1.1.3. Tổng quan thiamphenicol ........................................................................ 5
1.2. Tổng quan về nhóm quinolon ............................................................................. 6
1.2.1. Tổng quan ofloxacin................................................................................ 6
1.2.2. Tổng quan ciprofloxacin.......................................................................... 7
1.2.3. Tổng quan enrofloxacin........................................................................... 8
1.3. Các nghiên cứu liên quan đến đến phương pháp định lượng cloramphenicol,
florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước
thải bằng phương pháp sắc ký lỏng ........................................................................... 9
1.3.1. Nghiên cứu trong nước ............................................................................. 9
1.3.2. Nghiên cứu trên thế giới: ........................................................................ 10
1.3.3. Nhận xét các cơng trình nghiên cứu ....................................................... 11

1.4. Tổng quan về phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu nước thải .................... 11
1.4.1. Phương pháp lấy mẫu nước thải ............................................................. 11
1.4.2. Xử lí mẫu ................................................................................................ 12
1.5. Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ ........................................ 16
1.5.1. Sắc ký lỏng ............................................................................................. 16
1.5.2. Đầu dò khối phổ ba lần tứ cực............................................................... 16
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 19
2.1. Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 19


2.2. Địa điểm, thời gian nghiên cứu ........................................................................ 19
2.3. Phương tiện nghiên cứu .................................................................................... 19
2.3.1. Hóa chất, thuốc thử................................................................................. 19
2.3.2 Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn .......................................................... 20
2.3.3. Thiết bị, dụng cụ..................................................................................... 20
2.4. Phương pháp nghiên cứu: ................................................................................. 21
2.4.1. Chuẩn bị mẫu ......................................................................................... 21
2.4.2. Xây dựng quy trình định lượng cloramphenicol, florfenicol,
thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước thải bằng
phương pháp LC-MS/MS ........................................................................................ 22
2.4.3. Thẩm định quy trình định lượng đồng thời cloramphenicol,
florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin trong nước thải
bằng phương pháp LC-MS/MS................................................................................ 27
2.4.4. Ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định phân tích dư lượng
cloramphenicol,

florfenicol,

thiamphenicol,

ofloxacin,

ciprofloxacin,

enrofloxacin có trong mẫu nước thải thu thập ở vùng nuôi trồng thủy sản các tỉnh
Bạc liêu, Sóc trăng, Trà Vinh................................................................................... 30
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ ............................................................................................. 31
3.1. Khảo sát xây dựng quy trình định lượng .......................................................... 31
3.1.1 Khảo sát sự lựa chọn nội chuẩn ............................................................... 31
3.1.2 Khảo sát điều kiện khối phổ .................................................................... 32
3.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp ....................................................... 35
3.1.4. Quy trình xử lý mẫu thích hợp ............................................................... 36
3.1.5. Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích ........................................................ 37
3.1.6. Đánh giá ảnh hưởng nhiễu nền lên chất phân tích .................................. 38
3.2. Thẩm định quy trình phân tích ......................................................................... 38
3.2.1. Tính tương thích hệ thống ...................................................................... 38
3.2.2. Tính đặc hiệu- chọn lọc .......................................................................... 40
3.2.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ........................................................ 43


3.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ............................................. 44
3.2.5. Độ đúng và độ chính xác ........................................................................ 46
3.3. Áp dụng quy trình đã thẩm định để phân tích dư lượng kháng sinh nhóm
phenicol và quinolon trong mẫu nước thải vùng nuôi trồng thủy sản thu thập tại
các tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Trà Vinh ...................................................................... 49
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ........................................................................................... 50
4.1. Xây dựng quy trình định lượng ........................................................................ 50
4.1.1. Khảo sát nội chuẩn ................................................................................. 50
4.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ tối ưu ......................................................... 50
4.1.3. Khảo sát điều kiện sắc ký thích hợp ....................................................... 54

4.1.4. Khảo sát quy trình xử lý mẫu thích hợp ................................................. 56
4.1.5. Khảo sát sự ổn định mẫu phân tích......................................................... 58
4.1.6. Khảo sát ảnh hưởng của nhiễu nền lên chất phân tích ............................ 58
4.2. Thẩm định quy trình định lượng ....................................................................... 58
4.2.1. Tính tương thích hệ thống ...................................................................... 58
4.2.3. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn ........................................................ 60
4.2.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ............................................. 60
4.2.5. Độ đúng và độ chính xác ........................................................................ 60
4.3. Ứng dụng quy trình định lượng đã thẩm định .................................................. 61
KẾT LUẬN .................................................................................................................. 62
KIẾN NGHỊ ................................................................................................................. 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


i

DANH MỤC BẢNG VIẾT TẮT
Chữ tắt, ký hiệu
AOAC

Chữ nguyên
Association of Official
Analytical Chemists

ADR

Adverse Drug Reaction

CB

CLOR
CLOR-d5
CIP
EC
ERF
ESI
FLOR

Conduction band
Cloramphenicol
Cloramphenicol-d5
Ciprofloxacin
European Commission
Enrofloxacin
Electrospray ion
Florfenicol
High Performance Liquid
Chromatography
Internal Standard
Liquid Chromatography
Liquid ChromatographyMass Spectrometry
Limit Of Detection
Limit Of Quantification

HPLC
IS
LC
LC-MS
LOD
LOQ

m/z
MRL
MRM
MS
MTBE
NOR
OFL
PAD
RSD
S/N
SIM
SPE
THI

Maximum Residue Limit
Multiple Reaction
Monitoring
Mass Spectrometry
Methyl terbuthyl ether
Norfloxacin
Ofloxacin
Photodiode Array Detector
Relative Standard Deviation
Signal/Noise
Selected Ion Mornitoring
Solid Phase Extraction
Thiamphenicol

Ý nghĩa
Hiệp hội hóa học phân tích

quốc tế
Tác dụng khơng mong muốn
của thuốc
Vùng dẫn năng lượng cao
Cloramphenicol
Đồng vị của Cloramphenicol
Ciprofloxacin
Hội đồng Châu Âu
Enrofloxacin
Ion hoá phun điện tử
Florfenicol
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Chuẩn nội
Sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng ghép khối phổ
Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng
Khối lượng/điện tích
Giới hạn dư lượng tối đa
Chế độ chọn lọc nhiều lần
Khối phổ
Methyl terbuthyl ether
Norfloxacin
Ofloxacin
Đầu dị dãy diod quang
Độ lệch chuẩn tương đối
Tín hiệu/Nhiễu
Chế độ quét chọn lọc ion
Chiết pha rắn
Thiamphenicol

ii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của cloramphenicol .......................................................... 3
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của florfenicol .................................................................. 4
Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của thiamphenicol ............................................................ 5
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của ofloxacin .................................................................... 6
Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của ciprofloxacin .............................................................. 7
Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của enrofloxacin ............................................................... 8
Hình 1.7. Tóm tắt quy trình chiết pha rắn (SPE) ......................................................... 15
Hình 1.8. Cấu tạo bộ phận khối phổ 3 lần tứ cực ......................................................... 18
Hình 2.1. Hệ thống UPLC-MS/MS Xevo-TQD của Waters ........................................ 21
Hình 2.2. Quy trình xử lý mẫu 1 .................................................................................. 24
Hình 2.3. Quy trình xử lý mẫu 2 .................................................................................. 25
Hình 2.4. Quy trình xử lý mẫu 3 .................................................................................. 25
Hình 3.1. Kết quả năng lượng phân mảnh tối ưu tín hiệu cho nội chuẩn.................... 31
Hình 3.2. Kết quả autotune và manual-tune của chất chuẩn OFL ............................... 33
Hình 3.3. Kết quả autotune và manual-tune của chất chuẩn CLOR ............................ 34
Hình 3.4. SKĐ phân tích đồng thời CLOR, FLOR, THI, CIP, OFL, ERF .................. 36
Hình 3.5. Độ thu hồi các chất phân tích qua các quy trình xử lý mẫu. ........................ 37
Hình 3.6. Sắc ký đồ overlay 6 lần tiêm liên tiếp của Cloramphenicol ......................... 40
Hình 3.7. Sắc ký đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu trắng
thêm chuẩn lần 2 của chất cloramphenicol ................................................................... 41
Hình 3.8. Phổ đồ MS fullscan ES+ của mẫu trắng thêm chuẩn ................................. 421
Hình 3.9. Phổ đồ Phổ đồ Daughter Scan của Ciprofloxacin ..................................... 422
Hình 3.10. Đường tuyến tính của CIP và CLOR được truy xuất từ phần mềm
Masslynx 4.1 ................................................................................................................. 44
Hình 3.11. S/N xác định LOD của CIP và CLO .......................................................... 46

Hình 3.12. Độ thu hồi trong ngày và liên ngày của CIP, OFL, ERF, CLOR, THI,
FLOR ở nồng độ 10 ppb ............................................................................................... 48
Hình 3.13. Độ chính xác trong ngày và liên ngày của CIP, OFL, ERF, CLOR, THI,
FLOR ở nồng độ 10 ppb ............................................................................................... 48


iii

Hình 4.1. Phân mảnh con trong đặc trưng cho phân tích định lượng CLOR,
THIAM, FLOR, CIP, OFL, ERF và nội chuẩn NOR bằng kỹ thuật LC-MS/MS so
với Thư viện Phổ chuẩn (European Massbank) ............................................................ 53
Hình 4.2. Sắc ký đồ minh họa hệ pha động ACN-nước acid formic pH 2,99 ............. 55
Hình 4.3. Sắc ký đồ các mẫu nước có dư lượng kháng sinh ........................................ 61


iv

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Nghiên cứu trong nước................................................................................... 9
Bảng 1.2. Nghiên cứu trên thế giới ............................................................................... 10
Bảng 2.1. Chất chuẩn đối chiếu và nội chuẩn được dùng trong nghiên cứu ................ 20
Bảng 2.2. Thông tin về các chất chuẩn đối chiếu sử dụng trong nghiên cứu ............... 20
Bảng 2.3. Giới hạn sai lệch cho phép tối đa của tỉ lệ ion ............................................. 28
Bảng 3.1. Thông tin khảo sát nội chuẩn ....................................................................... 31
Bảng 3.2. Điều kiện khối phổ tối ưu các kháng sinh phân tích .................................... 32
Bảng 3.3. Chương trình gradient pha động thích hợp phân tích đồng thời CLOR,
FLOR, THI, CIP, OFL, ERF. ........................................................................................ 35
Bảng 3.4. Kết quả khảo sát quy trình xử lý mẫu .......................................................... 37
Bảng 3.5. Độ ổn định sau 24 giờ .................................................................................. 38
Bảng 3.6. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu lên chất phân tích ...................... 38

Bảng 3.7. Kết quả tính tương thích hệ thống ................................................................ 39
Bảng 3.8. Tỉ lệ ion định tính và định lượng các kháng sinh phân tích ......................... 42
Bảng 3.9. Độ lệch chuẩn thời gian lưu cho các chất phân tích..................................... 43
Bảng 3.10. Khoảng tuyến tính, phương trình hồi quy và hệ số tương quan ................. 44
Bảng 3.11. LOD, LOQ của các chất cần phân tích ...................................................... 46
Bảng 3.12. Độ đúng, độ chính xác trong ngày và liên ngày của các chất .................... 47
Bảng 3.13. Kết quả phân tích 15 mẫu nước thải vùng nuôi trồng thủy sản ................. 49
Bảng 4.1. So sánh kết quả khảo sát pha tĩnh tìm điều kiện sắc ký tối ưu..................... 54


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng sinh đóng vai trị quan trọng trong chăm sóc sức khỏe nhân dân,
phịng và điều trị bệnh trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản. Tuy nhiên, việc sử
dụng kháng sinh không hợp lý trong khám chữa bệnh, phòng bệnh đã gây hiện
tượng đề kháng và tồn dư các kháng sinh trong nước thải, trong vật nuôi, ảnh hưởng
xấu đến hiệu quả điều trị bệnh, sức khỏe cộng đồng và môi trường nghiêm trọng
[1], [4]. Trong khi các cơ sở khám chữa bệnh, đặc biệt khu vực ni trồng thủ sản
và chăn ni hầu như chưa có hệ thống xử lý nước thải chứa dư lượng các kháng
sinh, chất sát khuẩn.
Hiện nay, trên thị trường các loại thuốc kháng sinh phịng và trị bệnh ni
trồng thủy sản, chăn nuôi rất phong phú và đa dạng về số lượng và chủng loại với tên
thương mại rất khác nhau. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã ra
Quyết định ban hành danh mục hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng trong nuôi trồng
thủy sản và các quy định về việc cấm mua bán và sử dụng thuốc, hoá chất
không rõ nguồn gốc cho nuôi trồng thủy sản [10]. Nhưng trong thực tế tình
trạng mua bán và sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh cấm sử dụng hoặc không
rõ nguồn gốc vẫn diễn ra thường xuyên và phổ biến.
Qua phân tích tình hình phân phối và sử dụng thuốc trong ni trồng

thuỷ sản tại các tỉnh Sóc Trăng, Bạc Liêu và Cà Mau (Nguyễn Thị Phương
Nga, 2014) thì có đến 136 loại kháng sinh đang được sử dụng trong ni
trồng thủy sản, trong đó có 40 loại thuốc có chứa kháng sinh thuộc danh mục hạn
chế sử dụng. Kháng

sinh

được

sử

dụng

nhiều

nhất

thuộc

nhóm

Fluoroquinolone (enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin và oxolinic
acid) và nhóm Phenicol (cloramphenicol, flofencicol). Do có phổ kháng khuẩn rộng
và khả năng phân bố tốt vào các mô trong cơ thể nên kháng sinh nhóm phenicol và
nhóm quinolon được dùng phổ biến [15].
Khi vấn đề sử dụng thuốc có tính chất lạm dụng thuốc, dùng không
đúng liều lượng, dùng một cách tràn lan, sử dụng tăng lên dẫn đến dư lượng kháng
sinh còn tồn dư trong các sản phẩm thủy sản, nước thải với hàm lượng đáng kể, đây

2

là một vấn đề hết sức báo động vì dẫn đến tình trạng đề kháng kháng sinh ngày
càng gia tăng trên diện rộng ở nước ta, làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc chăm
sóc sức khỏe con người, vật ni và bảo vệ mơi trường sống. Do đó,việc phát triển
phương pháp phân tích với độ đặc hiệu, nhạy và chính xác caonhằm xác định dư
lượng các kháng sinh có trong nước thải từ các cơ sở khám chữa bệnh, cơ sở nuôi
trồng thủy hải sản, chăn nuôi một vấn đề cấp thiết.
Hiện nay, đã có một vài cơng trình nghiên cứu phân tích dư lượng kháng sinh
nhóm quinolon trong nước thải bệnh viện bằng phương pháp LC-FD, hay phương
pháp LC-MS/MS phân tích quinolon [13] hoặc beta-lactam [21] trong mẫu nước
thải của nhà máy sản xuất Dược phẩm, trong mẫu nước bề mặt [24]. Hầu như chưa
có cơng trình nghiên cứu phân tích đồng thời dư lượng kháng sinh nhóm quinolon
và cloramphenicol có trong trong mẫu nước thải ni trồng thủy sản bằng phương
pháp LC-MS/MS.
Xuất phát từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình định
lượng đồng thời dư lượng một số kháng sinh nhóm phenicol, quinolon có trong
nước bằng phương pháp LC-MS/MS”được thực hiện với các mục tiêu:
1. Xây dựng và thẩm định qui trình định lượng đồng thời dư lượng
chloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol; ofloxacin, ciprofloxacin, enrofloxacin,
có trong mẫu nước thải nuôi trồng thủy sản bằng phương pháp LC-MS/MS theo
hướng dẫn của EC/657-2002.
2. Ứng dụng qui trình đã thẩm định để xác định dư lượng các kháng sinh
nhóm phenicol và quinolon có trong mẫu nước thải vùng nuôi trồng thủy sản, sông,
rạch thu thập tại các tỉnh Bạc Liêu, Cà Mau, Trà Vinh.


3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về nhóm kháng sinh phenicol
1.1.1. Tổng quan cloramphenicol [2], [3], [36]
1.1.1.1. Cấu trúc, tên hóa học
Tên khoa học: 2,2-dicloro-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-2-(4nitrophenyl) ethyl] acetamid.
Cơng thức phân tử: C11H12Cl2N2O5.
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.1. Cơng thức cấu tạo của cloramphenicol
Phân tử lượng: 323,132 g/mol.
1.1.1.2. Tính chất
Bột kết tinh màu trắng, trắng xám hoặc trắng vàng hay tinh thể hình kim hoặc
phiến dài, khó tan trong nước, dễ tan trong ethanol 96% và trong propylen glycol.
Dung dịch trong ethanol thì hữu tuyền, trong ethyl acetat thì tả tuyền.
1.1.1.3. Định tính
Có thể chọn một trong hai nhóm phép thử định tính sau:
Nhóm 1: A, B
Nhóm 2: B, C, D, E
A. Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
cloramphenicol chuẩn (ĐC).
B. Điểm chảy từ 149 oC đến 153 oC.
C. Trong phần thử tạp chất liên quan, vết chính trên sắc ký đồ của 1 µl dung
dịch thử phải tương đương với vết chính của dung dịch đối chiếu (1) về vị trí và
kích thước.
D. Hoà tan khoảng 10 mg chế phẩm trong 1 mL ethanol 50% (TT), thêm 3 mL
dung dịch calci clorid 1% (TT) và 50 mg bột kẽm (TT), đun nóng trên cách thủy 10


4

phút. Lọc dung dịch nóng và để nguội. Thêm 0,1 mL benzoyl clorid (TT) và lắc 1

phút. Thêm 0,5 mL dung dịch sắt (III) clorid 10,5% (TT) và 2 mL cloroform (TT),
lắc. Lớp nước có màu đỏ tím nhạt đến đỏ tía.
E. Lấy 50 mg chế phẩm vào chén sứ, thêm 0,5 g natri carbonat khan (TT), đốt
trên ngọn lửa trong 10 phút, để nguội. Hoà tan cắn bằng 5 mL dung dịch acid nitric
2 M (TT) và lọc. Lấy 1 mL dịch lọc, thêm 1 mL nước, dung dịch này phải cho phản
ứng A của ion clorid.
1.1.1.4. Định lượng
Hòa lỗng một thể tích chế phẩm có chứa 20 mg cloramphenicol với nước
thành 200 mL. Lấy 10 mL dung dịch này cho vào bình định mức 100 mL, thêm
nước vừa đủ đến vạch. Lắc kỹ và đo độ hấp thu của dung dịch thu được ở bước
sóng cực đại 278 nm, cốc đo dày 1 cm, dùng nước làm mẫu trắng. Tính hàm lượng
của cloramphenicol, C11H12Cl2N2O5, theo A (1%, 1 cm). Lấy 297 là giá trị A (1%, 1
cm) ở cực đại 278 nm.
1.1.2. Tổng quan florfenicol [11], [38]
1.1.2.1. Cấu trúc, tên hóa học
Tên khoa học:
2,2-dicloro-N-[(1R,2S)-3-floro-1-hydroxy-1-(4-methanesulfonylphenyl)
propan-2-yl] acetamid.
Cơng thức phân tử: C12H14Cl2FNO4S.
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của florfenicol
Phân tử lượng: 358,21 g/mol.
1.1.2.2. Tính chất


5

Chất rắn, dạng bột, màu trắng, không mùi, vị đắng, khó tan trong nước, tan
nhiều trong lipid và dung mơi hữu cơ.

1.1.2.3. Định tính
Chưa có qui trình định tính florfenicol trong Dược điển Việt Nam IV, BP
2016, USP 31.
1.1.2.4. Định lượng
Chưa có qui trình định lượng florfenicol trong Dược điển Việt Nam IV, BP
2016, USP 31.
1.1.3. Tổng quan thiamphenicol [11], [38], [36]
1.1.3.1. Cấu trúc, tên hóa học
Tên khoa học: 2,2-dicloro-N-{(1R,2R)-2-hydroxy-1-(hydroxymethyl)-2-[4(methylsulfonyl) phenyl] ethyl} acetamid.
Tên khác: Thiophenicol, dextrosulphenidol.
Công thức phân tử:C12H15Cl2NO5S.
Công thức cấu tạo:

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của thiamphenicol
Phân tử lượng: 356,223 g/mol.
1.1.3.2. Tính chất
Bột kết tinh rắn, màu trắng, ít tan trong nước, tan trong methanol, tan tốt trong
acetonitril và dimethyl formamid, tan rất tốt trong dimethyl acetamid.
1.1.3.3. Định tính
Chưa có qui trình định lượng thiamphenicol trong Dược điển Việt Nam IV,
BP 2016, USP 31.
1.1.3.4. Định lượng


6

Chưa có qui trình định lượng thiamphenicol trong Dược điển Việt Nam IV,
BP 2016, USP 31.
1.2. Tổng quan về nhóm quinolon
1.2.1. Tổng quan ofloxacin [2], [3], [36]

1.2.1.1. Cấu trúc, tên hóa học
Tên khoa học: acid (RS)-9-fluoro-3-methyl-10-(4-methylpiperazin-1-yl)-7oxo-2,3-dihydro-7H-pyrido[1,2,3-de]-1,4-benzoxazin-6-carboxylic [1],[19],[44].
Cơng thức phân tử: C18H20FN3O4.
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của ofloxacin
Phân tử lượng: 361,368 g/mol.
1.2.1.2. Tính chất
Bột kết tinh màu vàng nhạt hoặc vàng sáng, ít tan trong nước và methanol, tan
trong acid acetic băng, ít tan đến tan trong dicloromethan.
1.2.1.3. Định tính
Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của ofloxacin
chuẩn (ĐC).
1.2.1.4. Định lượng
Phương pháp chuẩn độ thể tích.
Hịa tan 0,300 g chế phẩm trong 100 mL acid acetic băng (TT). Chuẩn độ
bằng dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ), xác định điểm tương đương bằng phương
pháp chuẩn độ đo điện thế. 1 mL dung dịch acid percloric 0,1 N (CĐ) tương đương
với 36,14 mg C18H20FN3O4.


7

1.2.2. Tổng quan ciprofloxacin [2],[36], [38]
1.2.2.1. Cấu trúc, tên hóa học
Tên khoa học: Acid 1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-7-(piperazin-1-yl)-1,4dihydroquinolin-3-carboxylic.
Công thức phân tử: C17H18FN3O3.HCl.
Công thức cấu tạo:

Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của ciprofloxacin

Phân tử lượng: 331,346 g/mol.
1.2.2.2. Tính chất
Bột kết tinh màu vàng nhạt, hút ẩm nhẹ, tan trong nước, khó tan trong
methanol, rất khó tan trong ethanol, thực tế khơng tan trong aceton, ethyl acetat và
methylen clorid.
1.2.2.3. Định tính
A. Phổ hồng ngoại của chế phẩm phải phù hợp với phổ hồng ngoại của
ciprofloxacin hydroclorid chuẩn (ĐC).
B. Chế phẩm cho phản ứng định tính (B) của ion clorid.
1.2.2.4. Định lượng
Trong Dược điển Việt Nam IV, ciprofloxacin được định lượng theo phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Điều kiện sắc ký:
- Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi pha tĩnh C (5 m).
- Nhiệt độ cột: 40 0C.
- Đầu dò quang phổ tử ngoại đặt tại bước sóng 278 nm.
- Tốc độ dịng: 1,5 mL/phút.
- Thể tích tiêm mẫu: 10 µl.


8

Dung dịch thử: hòa tan 25,0 mg chế phẩm trong pha động và pha loãng thành
50,0 mL với cùng dung mơi.
Dung dịch đối chiếu: hịa tan 25,0 mg ciprofloxacin hydroclorid chuẩn (ĐC)
trong pha động và pha loãng thành 50,0 mL với cùng dung môi.
Tiến hành sắc ký dung dịch thử và dung dịch đối chiếu. Tính hàm lượng
C17H18FN3O3.HCl dựa vào diện tích pic.
1.2.3. Tổng quan enrofloxacin [13], [16], [38]
1.2.3.1. Cấu trúc, tên hóa học

Tên khoa học: 1-cyclopropyl-7-(4-ethylpiperazin-1-yl)-6-floro-4-oxo-1,4dihydroquinolin-3-carboxylic acid.
Cơng thức phân tử: C19H22FN3O3.
Cơng thức cấu tạo:

Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của enrofloxacin
Phân tử lượng: 359,4 g/mol.
1.2.3.2. Tính chất
Bột kết tinh màu trắng hoặc vàng nhạt, ít tan trong nước, tan trong ethanol, tan
tốt trong acetonitril.
1.2.3.3. Định tính
Chưa có qui trình định tính enrofloxacin trong Dược điển Việt Nam IV, BP
2016, USP 31.
1.2.3.4. Định lượng
Chưa có qui trình định lượng enrofloxacin trong Dược điển Việt Nam IV, BP
2016, USP 31.


9

1.3. Các nghiên cứu liên quan đến đến phương pháp định lượng
cloramphenicol,

florfenicol,

thiamphenicol,

ofloxacin,

ciprofloxacin,

enrofloxacin trong nước thải bằng phương pháp sắc ký lỏng
1.3.1. Nghiên cứu trong nước
Bảng 1.1. Nghiên cứu trong nước
Tác giả
Dương Hồng
Anh và cộng
sự (2007) [13,
tr.14]

Nguyễn Thị
Hạnh (2015)
[13]

Chất phân tích

Phương pháp xử lý
mẫu và phân tích
Kháng
sinh
họ Chiết tách và làm
floquinolon
giàu bằng phương
(ofloxacin,
pháp chiết pha rắn
ciprofloxacin,
(SPE)
norfloxacin)
trong sử dụng cột chiết
nước thải bệnh viện cation hỗn hợp.
Định tính, định lượng

bằng HPLC
với
detectơ huỳnh quang
moxifloxacin,
Sử dụng SPE để xử lý
ofloxacin,
mẫu giúp loại bỏ
ciprofloxacin,
được nhiều tạp chất
norfloxacin trong
xác
định
dư
nước thải công
l ư ợ n g bằng LCnghiệp Dược
MS/MS

Nguyễn Văn cephalexin,
Thuận (2015) cefuroxim, cefixim
[20]
trong nước thải nhà
máy dược phẩm

Tiến hành xử lý mẫu
bằng phương pháp
SPE, phát hiện và
định lượng
bằng
phương
pháp

LC/MS-MS.

Kết quả
Quy trình có hiệu suất
thu hồi cao (trung bình
84 - 101%), LOQ từ
0,5 - 1 μg/L.

Phương pháp có độ
đúng, độ chính xác
từ 72,08% - 114,78%,
LOD từ 0,03 - 0,2
ppb và LOQ từ 0,10,66 ppb,
hiệu suất thu hồi của
các kháng sinh cao
(77,75-114,93%),
Độ lặp lại cao RSD <
8% với n = 6,độ
nhạy cao với giá trị
LOD và LOQ thấp
(LOD từ 0,58 ng/mL1,22 ng/mL), Độ thu
hồi của các kháng
sinh
nằm
trong
khoảng 40 – 80%
(RSD < 8%)


10

1.3.2. Nghiên cứu trên thế giới:
Bảng 1.2. Nghiên cứu trên thế giới
Tác giả

Chất phân tích

Marco Antonio
F.
Locatelli,
Fernando
F.
Sodre
và
Wilson
F.
Jardim (2010)
[23]

amoxicillin,
ampicillin, cefalexin
(CEF), ciprofloxacin
(CIP), norfloxacin
(NOR),
sulfamethoxazole,
tetracycline (TET)
và trimethoprim
Qiang Xue & 35 chất kháng sinh
Yanjie Qi & bao gồm sulfonamid
Fei Liu, (2015) (SAs),

quinolone
[37]
(QLs) , tetracyclines
(TCs),
macrolides
(MALs), lincomycin
(LIN),
và
cloramphenicol
(CAP)

Ocsana Opris
ba
penicillin
và cộng sự (amoxicillin,
(2013) [34]
ampicillin, penicillin
G),hai cephalosporin
(ceftazidim,
ceftriaxone) và hai
tetracycline
(tetracycline,
doxycycline).

Phương pháp xử lý
mẫu
Xử lý mẫu bằng SPE
trao đổi anion, đinh
tính định lượng bằng
sắc ký lỏng kết hợp

khối phổ (LC-MS /
MS)

SPE kết hợp sắc ký
lỏng siêu hiệu năng
(UPLC-MS / MS)
Pha động được bổ
sung 0,1% axit formic
giúp hình thành [M +
H] + và tăng cường
tín hiệu phát hiện.
Khoảng pH tối ưu cho
SPE là 4,5 ~5.0 với 6
mL
dung
dịch
amoniac/methanol
(5/95, v / v).
Xử lý mẫu bằng SPE,
định tính, định lượng
bằng HPLC đầu dị,
diode quang và phổ
khối trong chế độ ion
dương. Kháng sinh
được chiết xuất bằng
cột
hydrophilic-lipophilic.
Sự thu hồi tốt nhất thu
được ở pH 3 và 7
tương ứng

Kết quả
Giới hạn phát hiện
(LOD) thay đổi từ
0.13 ng/L cho CIP và
NOR đến 0,76 ng/ L
cho TET

Độ thu hồi chất trong
mẫu nước siêu sâu và
nước ngầm lần lượt
là 67,13%- 93,00%
và 68,91% -92,67%.
Ưu điểm thời gian
phát hiện ngắn (< 10
phút), lượng mẫu
nhỏ, hiệu suất thu hồi
và độ nhạy cao
LOD phương pháp
(MDL) là 0,29-4,03
ng/L.
LOD
và
LOQ
khoảng 0,07-0,92 μg
mL-1 và 0,21-2,77
μg mL-1 tương ứng.


11

1.3.3. Nhận xét các cơng trình nghiên cứu
Qua các cơng trình nghiên cứu đã cơng bố, nhận thấy:
- Mẫu nghiên cứu thường là mẫu nước thải sinh hoạt, nước bề mặt sơng, rất ít
nghiên cứu trên mẫu nước ni trồng thủy, hải sản.
- Kháng sinh nghiên cứu thường là nhóm quinolon, nhóm phenicol chỉ tập
trung vào cloramphenicol; florfenicol, thiamphenicol rất ít được quan tâm trong các
nghiên cứu về nước thải.
- Kỹ thuật sắc ký thường dùng là LC-MS/MS
- Phương pháp xử lý mẫu thường dùng là phương pháp chiết pha rắn SPE.
- Giới hạn phát hiện (LOD) trong khoảng 0,02-0,92 ppb, giới hạn định lượng
(LOQ) từ 0,2-2,77 ppb.
Như vậy, các nghiên cứu trên đã chỉ ra nhiều phương pháp phân tích kháng
sinh trong nước. Tuy nhiên, hiện chưa có nghiên cứu nào xác định đồng thời dư
lượng cloramphenicol, florfenicol, thiamphenicol, ofloxacin, ciprofloxacin,
enrofloxacin trong nước thải, nước nuôi trroong thủy sản bằng phương pháp LCMS/MS.
Phương pháp nghiên cứu thành công sẽ rút ngắn thời gian và chi phí xử lý
mẫu, đồng thời mở rộng nền mẫu có thể áp dụng phương pháp.
1.4. Tổng quan về phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu nước thải
1.4.1. Phương pháp lấy mẫu nước thải
1.4.1.1. Địa điểm lấy mẫu
Trước tiên phải nghiên cứu kỹ hệ thống cống trên bản vẽ. Sau đó kiểm tra thực
địa, chọn các địa điểm lấy mẫu đại diện [6].
Cần quan tâm đến cả lưu lượng dịng chảy tại vị trí then chốt, lấy ở nơi có
xốy cuộn, vì chất lỏng được trộn đều [6].
1.4.1.2. Thời gian lấy mẫu và phân tích mẫu
Dựa trên các mẫu lấy ở những khoảng thời gian đều đặn trong một chu kỳ.
Nếu bản chất và độ lớn của tải lượng cực đại là quan trọng, cần lấy mẫu ở thời điểm
tải lượng cực đại xuất hiện [7].

12

1.4.1.3. Thể tích lấy mẫu
Khi lấy mẫu tổ hợp, thể tích mỗi mẫu đơn phải lớn hơn 50 mL. Nên lấy mẫu
đơn từ 200 mL đến 300 mL để có được các mẫu đại diện [6].
1.4.1.4. Phương pháp lấy mẫu
Thông thường cần phân biệt hai loại mẫu: mẫu đơn và mẫu tổ hợp. Trong
nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp lấy mẫu đơn [6].
Mẫu đơn: Trong một mẫu đơn, tồn bộ thể tích mẫu được lấy ở một thời điểm.
Các mẫu đơn thường được dùng để xác định thành phần nước thải ở một thời điểm
nhất định. Trong những trường hợp dịng nước thải ít thay đổi về thể tích và thành
phần, một mẫu đơn có thể đại diện cho thành phần dòng nước thải trong thời
gian dài.
Cách lấy mẫu: Việc lấy mẫu được thực hiện bằng cách sử dụng chai thủy tinh
màu vàng 1 lít đã được làm sạch trong phịng thí nghiệm và rửa bằng nước mẫu tại
chỗ. Chai được gói bằng giấy nhơm, đặt trong thùng đá và được vận chuyển tới
phịng thí nghiệm. Tất cả các mẫu được chuyển ngay đến giai đoạn chiết và làm
sạch [24].
1.4.2. Xử lí mẫu
1.4.2.1. Phương pháp xử lý và bảo quản mẫu
Quy trình xử lý mẫu:
Mẫu 1 lít được lọc qua bộ lọc sợi thủy tinh (Schleicher & Schuell, Dassel,
Đức) và các màng cellulose acetate 0,45 µm (Sartorius, Geottingen, Ger-) trước khi
chiết pha rắn (SPE). Mỗi mẫu nước sau đó được axit hóa với HCl đến pH 2,4 và
thêm vào 0,2g Na2EDTA [24].
Bảo quản, vận chuyển và lưu giữ mẫu:
Bảo quản mẫu sau khi lấy ở 2- 8oC nếu phân tích ngay trong 24 giờ hoặc bảo
quản ở tủ lạnh sâu –30oC trong vòng 1 tháng.
1.4.2.2. Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký

Các mẫu sinh học, mẫu mơi trường thường có thành phần rất phức tạp,
hàm lượng chất cần phân tích khá thấp nên khơng tương thích cho việc phân tích


13

trực tiếp trên hệ sắc ký. Do vậy, trước khi phân tích mẫu chúng ta cần phải tách,
làm giàu các thành phần của mẫu cần phân tích. Có rất nhiều phương pháp xử lý
mẫu như : lọc, bay hơi, làm khô, ly tâm, chiết lỏng- lỏng, sắc ký cột, chiết
Soxhlet, chiết pha rắn (Solid Phase Extraction– SPE).... nhưng tất cả các phương
pháp này đều phải đáp ứng được các tiêu chí:
- Làm sạch mẫu một cách chọn lọc.
- Cơ đặc mẫu
- Lượng mẫu không cần nhiều.
- Lượng dung môi tiêu thụ ít.
- Độ thu hồi cao, khơng gây nhiễu.
- Đơn giản, nhanh.
Dựa trên các mối liên hệ giữa đặc tính chất phân tích, nồng độ, nền mẫu mà
chúng tơi chọn phương pháp SPE để xử lý mẫu.
Có 6 bước chính trong quá trình chiết pha rắn: [13]
Bước 1. Chuẩn bị dịch mẫu: Mẫu phải ở dạng dung dịch và tương tác được
với chất hấp phụ. Dịch mẫu khi cần thiết phải được lọc hoặc ly tâm trước khi cho
vào cột SPE để tránh làm tắc cột.
Bước 2. Hoạt hóa cột: làm ướt pha rắn, tạo mơi trường thích hợp cho việc hấp
thu chất phân tích. Thể tích dung mơi cần sử dụng khoảng 1mL/100mg chất hấp
phụ. Nếu thể tích dung mơi sử dụng ít hơn thể tích quy định này sẽ làm tăng
nguy cơ pha rắn khơng được solvat hóa hoàn toàn, kết quả độ thu hồi của mẫu thấp.
Bước 3. Cân bằng cột: Trước khi cho mẫu vào, cột phải có điều kiện tương
đương với điều kiện chạy của mẫu (ví dụ: pH) bằng cách cho thêm dung mơi có
điều kiện tương đương dung mơi chứa mẫu.

Bước 4. Nạp mẫu: mẫu được cho qua cột SPE. Tốc độ dòng chảy của mẫu qua
cột khoảng 0,5 – 1 mL/phút.
Bước 5. Rửa pha rắn: dùng dung mơi thích hợp để loại các tạp chất ra khỏi cột
nhưng vẫn giữ lại được chất cần phân tích.


14

Bước 6. Rửa giải: sử dụng dung mơi thích hợp để tách chất cần phân tích ra
khỏi cột, tốc độ dịng chảy khi rửa giải khơng được q nhanh. Tốc độ này phụ thuộc
vào đường kính cột và khối lượng chất hấp phụ, người ta thường rửa với tốc độ
khoảng 1mL/phút.
1.4.2.3. Một số quy trình chiết pha rắn đã được sử dụng để tách chiết kháng sinh
trong nước thải trong các nghiên cứu
Chiết pha rắn trao đổi ion [24]
Sự chiết kháng sinh được thực hiện bằng cách sử dụng hai cột chứa pha tĩnh
SPE, trong một hệ thống chiết xuất do phịng thí nghiệm thực hiện .
Cột pha tĩnh trao đổi anion chứa 500 mg Strata SAX (Phenomenex, Torrance,
CA) dùng để loại bỏ các chất humic. Cột polyme 500mg Oasis HLB (Waters,
Milford, CT) dùng để giữ các hợp chất đích.
Các cột được thiết lập theo chuỗi và được hoạt hóa với 6 mL methanol, 6mL
nước cất và dung dịch HCl 6 mL ở pH 2,4. Các mẫu được nạp ở tốc độ dòng chảy 5
mL/min.
Sau khi nạp, gỡ bỏ cột SAX, và cột HLB được rửa sạch bằng 6mL nước khử
ion. Cột này được làm khơ bằng dịng Nitơ liên tục trong 20 phút.
Bước tẩy rửa được thực hiện bằng cách sử dụng một ống thủy tinh Prep Sepet
12 cổng (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) với ống thủy tinh đã làm sạch trước đó.
Kháng sinh đã được rửa bằng 6 mL methanol.
Cơ cạn bằng khí trơ N2, và các chất đích đạt thể tích cuối cùng là 1.0 mL
trong dung dịch axit formic 0.1% trong tỉ lệ nước : methanol (90:10) (v / v).được

nạp ở tốc độ dòng chảy 5 mL/phút.