nghiên cứu xây dựng qui trình định lượng đồng thời chất ngọt tổng hợp aspatam và acesulpam trong một số sản phẩm thực phẩm băng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong cuộc sống hằng ngày của chúng ta, thường xuyên dùng đến đồ ngọt như
các loại: hoa quả, khoai củ, chè, nước ngọt, bánh kẹo Ngoài thịt ngọt có bản chất là
protein và các axit amin thì đa phần các vị ngọt khác đều là các loại đường tạo ra.
Đường sinh học để dùng cho chuyển hóa tế bào là glucose nhưng trong thực tế
cuộc sống chúng ta thường đưa vào cơ thể các dạng đường đơn, đường đa như fructose,
mantose, saccharose, tinh bột lấy từ các loại hoa, củ, quả, thân cây mía, củ cải, mật
ong vốn có sẵn trong tự nhiên. Còn các loại đường hóa học chỉ tạo vị ngọt chứ không
chuyển hóa được, để dùng trong việc điều trị cho những người bệnh thừa cân hay đái
tháo đường. Các đường tổng hợp như: saccharin, manitol, acesulfam K, aspartam,
isomalt, sorbitol, sucraloza được phép sử dụng trong chế biến thực phẩm với giới hạn
tối đa và có quy định của Bộ Y tế.[ ]
Đường hóa học (hay là chất ngọt tổng hợp) là chất không có trong tự nhiên,
thường có vị ngọt rất cao so với đường kính saccharose và tuyệt nhiên không hề có một
giá trị dinh dưỡng nào khác. Do đó, nhiều cơ sở sản xuất vì mục đích lợi nhuận nên
thường sử dụng các chất ngọt này để thay thế cho đường mía (saccharose), mặc dù biết
rõ những điều có hại cho người tiêu dùng khi sử dụng quá mức qui định.
Acesulfame K là một acid hữu cơ sinh ra từ acid Acetic.[ ] Chất này không bị
cơ thể phân hủy và được ống tiêu hóa bài xuất ra nguyên trạng. và được sử dụng nhiều
trong thực phẩm chế biến
Aspartam là một este methyl cấu tạo từ 2 acid amin là aspartic acid và
phenylalanine, có độ ngọt cao khoảng 180 đến 200 lần ngọt hơn đường mía, và có năng
lượng khoảng 4 Kcal/g. Tuy nhiên, một số người nhạy cảm cho rằng đường này để lại
trên lưỡi một hậu vị không ngon. Vì vậy, để thể khắc phục thông thường người ta trộn
aspartam với các loại đường khác như acesulfame K.
Hiện nay, trên thị trường xuất hiện khá nhiều sản phẩm như: nước giải khát,
bánh kẹo, nước ngọt, chè, sâm lạnh, sữa đậu nành…và được sử dụng hai hay nhiều các
hoạt chất này, do đó gây không ít khó khăn cho việc kiểm tra chất lượng các sản phẩm
thực hiện đang lưu thông trên thi trường Thừa Thiên Huế.
Để phân tích hàm lượng các thành phần này , theo TCVN chỉ định lượng được
hai thành phần này riêng lẻ trong các nguyên liệu bằng phương pháp chuẩn độ trong

môi trường khan, hoặc một số phòng kiểm nghiệm thực phẩm trong nước thường dùng
các phương pháp chiết với axit axetic băng, sau đó xác định bằng phương pháp chuẩn
độ điện thế. Phương pháp này không ổn định, mất thời gian, tốn kém hóa chất, cho độ
nhạy kém, hơn nữa nếu trong sản phẩm chứa hai hay nhiều thành phần, thì phường
pháp này tỏ ra không hữu hiệu. Chính vì những lý do này mà hiện nay phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao đang được áp dụng thay dần phương pháp nói trên.
1
Từ những yêu cầu thực tế của công tác quản lý vệ sinh an toàn thực phẩm trên
thị trường Thừa Thiên Huế, chúng tôi thường xuyên phải phân tích các sản phẩm loại
này, đồng thời để có qui trình phân tích đạt yêu cầu về độ chính xác và độ đúng, do đó
cần phải tiến hành xây dựng, tối ưu hóa và đánh giá qui trình phân tích đồng thời hai
hoạt chất trên trong cùng sản phẩm thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
nâng cao pha đảo.
Để thực hiện vấn đề này chúng tôi tiến hành triển khai đề tài: “Nghiên cứu xây
dựng qui trình định lượng đồng thời chất ngọt tổng hợp aspatam và acesulpam trong
một số sản phẩm thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao” nhằm giải quyết
các mục tiêu sau:
- Xây dựng, tối ưu hóa và đánh giá qui trình phân tích đồng thời hai hoạt chất
trên phương pháp sắc lỏng hiệu nâng cao.
- Nghiên cứu phương pháp xử lý mẫu
- Áp dụng quy trình xây dựng được để định lượng một số sản phẩm được gửi tới trung
tâm kiểm nghiệm Thuốc - mỹ phẩm - Thực phẩm - Thừa Thiên
2
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về aspartame và acesulfame-K
1.1.1 Aspartame [1];[9];[7]; [13];[10]
- Tên khác và ký hiệu của aspartame:
- Tên: Aspartyl phenylamin metyl ester

Ký hiệu: APM
Tên hóa học : 3-Amino-N-(α carbomethoxy-phenyletyl)-acid succinamic
Hay: N-L-α-aspartyl-L-phenyllamin-1-metyl ester
- Công thức : C14H18N2O5


- Khối lượng phân tử: 294,31
- Ngoại quan: Tinh thể màu trắng, không mùi có vị ngọt mạnh
- Chức năng: chất tạo ngọt
- Góc quay cực riêng: [α]20D +14,5o- 16,5o
- Tính tan: ít tan trong nước và ethanol
- Độ pH: 4,5-6,0
* Tính chất ASPARTAME (E951)[10]
- Aspartame là một chất tạo ngọt vốn được sử dụng phổ biến trong các loại nước
uống và thực phẩm dành cho người bị bệnh tiểu đường và người muốn ăn kiêng với
mục đích giảm lượng đường và năng lượng tiêu thụ. Tuy nhiên, có những lo ngại về tác
dụng phụ của nó như có khả năng gây ung thư, gây bệnh động kinh, gây u não….
- Aspartame (tên khác là L-aspartyl-L-phenylalanine methyl ester) là một este
methyl cấu tạo từ 2 acid amin là aspartic acid và phenylalanine. Trong tự nhiên,
aspartic acid và phenylalanine được tìm thấy trong thực phẩm có chứa protein, như thịt,
ngũ cốc và các sản phẩm từ sữa. Este methyl cũng được tìm thấy trong hoa quả và rau.
- Aspartame có độ ngọt cao, khoảng 180 đến 200 lần ngọt hơn đường mía. Vị
ngọt của aspartame khá giống đường. Vị ngọt này được cảm nhận chậm hơn và kéo dài
lâu hơn so với đường.
- Aspartame có năng lượng khoảng 4 Kcal/g (17 KJ/g). Tuy nhiên, chỉ cần một
lượng rất nhỏ aspartame đã tạo ra độ ngọt cần thiết. Do đó năng lượng chúng ta đưa vào
cơ thể khi dùng thực phẩm tạo ngọt bằng aspartame sẽ không đáng kể.
- Đa số người tiêu dùng có nhận xét là aspartame không để lại dư vị khó chịu, tuy
nhiên một số người nhạy cảm cho rằng đường này để lại trên lưỡi một hậu vị không
ngon. Điều này có thể khắc phục bằng cách trộn aspartame với các loại đường khác

(như acesulfame K hay saccharine). Aspartame rất được ưa chuộng trong việc sử dụng
để thay thế đường trong các sản phẩm thực phẩm dành cho người ăn kiêng.
3
Khi vào cơ thể, bản thân aspartame không hấp thụ vào máu mà tan ra trong ruột thành
ba chất: aspartic acid (40%), phenylalanin (50%) và methanol (10%). Đây là cơ sở của
nhiều ý kiến về tác động bất lợi cho sức khỏe con người từ aspartame.
-Bản thân methanol là một chất có độc tính thấp. Sau khi được đưa vào cơ thể,
methanol được ôxy hóa tạo nên formaldehyde, chất này lại tiếp tục được ôxy hóa tạo
nên acid formic (hoặc formate, tùy theo độ pH). Acid formic có độc tính rất cao. Chính
acid formic là nguyên nhân gây nên tình trạng toan chuyển hóa (nhiễm acid) và mù lòa,
những tổn thương đặc trưng của nhiễm độc methanol.
- Lo ngại về lượng axit aspartic và phenylalanine khi ăn sản phẩm có chứa
aspartame:
- Phenylalanine cũng là một chất độc thần kinh. Quá nhiều phenylalanine gây
động kinh, thai gây chậm phát triển trí óc, mất ngủ… Chính phenylalanine tạo ra bệnh
phenylketonuria (PKU), là loại bệnh mà trong máu có quá nhiều axít amin
phenylalanine, làm chậm phát triển trí tuệ nghiêm trọng, và làm tổn hại đến hệ thần
kinh. Mặt khác, con người hấp thu các axít amin cần thiết từ thiên nhiên dưới dạng kết
hợp với nhiều chất khác chứ không phải chỉ riêng một chất cô lập.
- Nếu dư thừa, axit aspartic có thể gây ra rối loạn nội tiết (hormone) và các vấn đề
về thị lực. Aspartic acid là một chất kích thích thần kinh, ảnh hưởng đến hệ thống thần
kinh trung ương, gây nên các chứng: nhức đầu, buồn nôn, đau bụng, mệt mỏi, rối loạn
giấc ngủ, vấn đề về thị lực, trầm cảm, và bệnh suyễn, động kinh…
- Dù sao, quan điểm của nhiều tổ chức có uy tín hiện nay ủng hộ việc sử dụng
aspartame trong hạn mức cho phép, bao gồm Tổ chức Nông lương Quốc tế (FAO), Tổ
chức Y tế Thế giới (WHO), Ủy ban Quản lý Dược-Thực phẩm Mỹ (FDA)…. Liều dùng
cho phép của aspartame mỗi ngày (ADI) là nhỏ hơn hoặc bằng 40 mg/kg thể trọng. Đây
là một trong những hàm lượng cho phép sử dụng cao nhất trong số các phụ gia thực
phẩm. Tuy nhiên, tháng 4 năm 2009, FESA cũng tổ chức một hội nghị gồm các chuyên
gia có những kiến thức chuyên sâu về aspartame. Các chuyên gia này xem xét lại tất cả

những nghiên cứu và dữ liệu về aspartame và những ảnh hưởng đến sức khỏe (nếu có)
của nó. Dự kiến, đầu năm 2010, hội đồng này sẽ thông báo kết quả.
Tại Việt Nam, aspartame được phép sử dụng cho các sản phẩm như đồ uống, kẹo, bia,
rượu với mục đích làm tạo ngọt, điều vị với ADI cũng từ 0 – 40 mg/kg, giống như kiến
nghị của các tổ chức uy tín trên thế giới. Trên những sản phẩm có sử dụng aspartame sẽ
phải ghi tên “aspartame” hoặc “aspartame” hay ghi mã số “951”.
- Ở Việt Nam, theo Quyết định của Bộ trưởng Bộ Y Tế, Số 3742/2001/QĐ-BYT
về các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm. Được ghi trong bảng
sau:
Bảng: 1.1. Giới hạn tối đa chất phụ gia aspartame trong thực phẩm [5] SttNhóm thực
phẩmML
4
Stt Nhóm thực phẩm ML
1 Đồ uống có sữa, có hương liệu hoặc lên men (VD: sữa
sô cô la, sữa cacao, bia trứng, sữa chua uống, sữa đặc)
600
2 Quả thanh trùng pasteur đóng hộp hoặc đóng chai 1000
3 Mứt, mứt cô đặc, mứt hoa quả 1000
4 Hoa quả ngâm đường 2000
5 Rau thanh trùng pasteur đóng hộp, đóng chai hoặc
đóng túi
1000
6 Bột nhão từ cacao 3000
7 Kẹo cứng, kẹo mềm, kẹo nuga 10000
8 Kẹo cao su 10000
9 Sản phẩm dùng để trang trí thực phẩm 5000
10 Dầu trộn, gia vị (bao gồm các chất tương tự muối) 2000
11 Nước rau, quả ép 2000
12 Necta rau quả 2000
13 Bia và nước giải khát chế biến từ mạch nha 600

14 Rượu vang 600

1.1.2. Acesulfame-K [1]; [7]; [4];[8];[10]
- Tên hóa học:
Tên: Muối kali 6-metyl-1,2,,3-oxathiazin-4(3H)-một-2,2-dioxid
Muối kali 3,4-dihydro-6-metyl-1,2,3-oxathiazin-4-một-2,2-dioxid
- Tên khác:
- Công thức: C4H4KNO4S

- Khối lượng phân tử: 201,24
- Ngoại quan: Tinh thể màu trắng, không mùi, có vị ngọt mạnh
- Chức năng: chất tạo ngọt, chất điều vị
- Tính tan: tan nhiều trong nước, ít tan trong ethanol.
*Tính chất acesulfame-K (E950)
- Acesulfame-K được Clauss và Jensen (hãng Hoechst, Đức) tìm ra năm 1967;
được FDA kiểm nghiệm và cho đưa vào sử dụng từ năm 1988, với các tên thương mại
khác nhau như Sunette, Sweet one, Sweet'n safe Các sản phẩm có chứa acesulfame-K
chưa gây ra bất kỳ sự cố nào cần cảnh báo.
- Acsesulfame-K được sử dụng trong hơn 4000 sản phẩm trên khắp thế giới
Ngoài ra, thường được dùng kết hợp với aspartame hoặc các loại đường hóa học khác
vì nó có tác động hỗ trợ, tăng cường và duy trì vị ngọt của thức ăn và nước giải khát.
Tính chất:
- Có dạng tinh thể màu trắng với cấu trúc hóa học tương tự saccharin. Vị ngọt gấp 150 -
200 lần đường saccharose; ổn định hơn aspartame ở nhiệt độ cao và môi trường acid.
5
- Acesulfam-K không cung cấp năng lượng cho cơ thể vì nó không tham gia quá trình
trao đổi chất và được thải ra ngoài theo nước tiểu mà không có bất kì sự biến đổi hóa
học nào.
- Thêm ưu điểm là giá thành rẻ; song điều dở là có dư vị hơi đắng
- Ở Việt Nam, theo Quyết định của Bộ trưởng Bộ Y Tế, Số 3742/2001/QĐ-BYT về các

chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm. Được ghi trong bảng sau:
Bảng: 1.2. Giới hạn tối đa chất phụ gia aceslfame-K trong thực phẩm SttNhóm thực
phẩmML
Stt Nhóm thực phẩm ML
1 Đồ uống có sữa, có hương liệu hoặc lên men (VD: sữa
sô cô la, sữa cacao, bia trứng, sữa chua uống, sữa đặc)
500
2 Sữa lên men và sữa có chất rennet (nguyên chất)
không kể đồ uống từ sữa
GMP
3 Thức ăn tráng miệng có sữa (VD: kem, sữa lạnh, bánh
putđing, sữa chua hoa quả hoặc có hương liệu )
1000
4 Quả thanh trùng pasteur đóng hộp hoặc đóng chai 500
5 Mứt, mứt cô đặc, mứt hoa quả 1000
6 Hoa quả ngâm đường 500
7 Sản phẩm cacao, sô cô la (VD: sô cô la sữa, sô cô la
trắng)
1000
8 Kẹo cứng, kẹo mềm, kẹo nuga 350
9 Kẹo cao su 5000
10 Sản phẩm dùng để trang trí thực phẩm 500
11 Bánh nướng và các loại sản phẩm bánh nướng thông
thường
GMP
12 Bánh có sữa, trứng 350
13 Nước chấm dạng sữa (VD: nước sốt mayonne, nước
sốt salát
1000
14 Nước chấm không có sữa (VD: tương cà chua, tương

ớt, nước chấm có kem)
350
15 Nước quả thanh trùng pasteur đóng hộp hoặc đóng
chai
600
16 Nước rau ép thanh trùng pasteur đóng hộp hoặc đóng
chai
600
17 Nước giải khát có hương liệu, bao gồm nước uống
dành cho thể thao, nước uống có hàm lượng khoáng
cao và các loại nước uống khát
600
18 Cà phê, chè, nước uống có dược thảo và các loại đồ
uống từ ngũ cốc, không kể nước uống từ cacao.
GMP
19 Rượu vang 350

6
1.1.3 Tính chất của hỗn hợp aspartame và acesulfame-K
- Độ ngọt cao gấp 200 lần so với đường tự nhiên, do vậy, chỉ cần một lượng rất
nhỏ aspartame cũng cho độ ngọt tương đương như sử dụng đường bình thường. Vị
ngọt của aspartame chậm hơn lúc đầu, nhưng lại kéo dài lâu hơn - nên nên aspartame
thường được dùng kết hợp với acesulfame-K cho vị ngọt giống (và ngọt hơn) đường tự
nhiên. Không để lại dư vị hoá chất hoặc vị kim loại khó chịu như một số chất làm ngọt
khác, dễ bảo quản và sử dụng, giá thành rẻ hơn nhiều so với việc sử dụng đường tự
nhiên nên hiện nay aspartame được sử dụng rộng rãi tại hơn 125 quốc gia trên thế giới
và hiện diện trong khoảng 6.000 sản phẩm khác nhau - trong bánh kẹo, nước hoa quả,
trong các sản phẩm "không đường" hoặc sản phẩm "light", "diet" , kẹo cao su, sữa
chua, đường cho người ăn kiêng và ngay cả trong một số thuốc, vitamin, thực phẩm bổ
sung

- Aspartame được thương mại hoá dưới một số tên như Canderel, Equal,
NutraSweet, Sanecta, Tri-Sweet, Aminosweet, Spoonful, Sino sweet
- Acesulfame-K - còn được gọi là Sunette, Sweet One, Sweet 'n an toàn
Acesulfame-K đã được phát hiện vào năm 1967 và là 150-200 lần ngọt hơn đường.
Acesulfame-K là một rất ổn định, kết tinh chất ngọt với một cấu trúc hóa học tương tự
như saccharin.
- Acesulfame-K thường được sử dụng kết hợp với aspartame hoặc chất ngọt khác
vì nó có một tác dụng hiệp đồng để tăng cường và duy trì vị ngọt của thực phẩm và đồ
uống. Đó là nhiệt ổn định để nó có thể được sử dụng trong các sản phẩm nướng. Nó
không cung cấp calo vì cơ thể không chuyển hóa nó và nó được bài tiết trong nước tiểu
mà không bị thay đổi.
- Acesulfame-K được tìm thấy trong
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
(1). Lựa chọn các điều kiện sắc ký để tách đồng thời hai chất acesulfame-K và
aspartame trong các mẫu nước giải khát bao gồm:
- Qui trình chiết mẫu nước giải khát: loại màu, thể tích dung môi chiết….
7
- Các điều kiện tiến hành sắc ký: dung môi pha động, tỷ lệ pha động, tốc độ
dòng, nồng độ pH….
(1). Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích qua các đại lượng như độ
lặp lại, độ đúng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng.
(3). Áp dụng thực tế: áp dụng phương pháp lựa chọn để phân tích một số mẫu
có chứa acesulfame-K và aspartame trong các nước giải khát hiện đang lưu hành trên
thị trường Thừa Thiên Huế
2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.2.1. Thiết và dụng cụ
- Cân phân tích AUW220D (±0,1 mg) của hãng Shimadzu Nhật Bản.
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Series 20A của hãng Shimadzu Nhật Bản.

- Các thiết bị khác như: Tủ sấy, máy lắc, máy cất nước hai lần, thiết bị lọc nước
siêu sạch.
- Các dụng cụ thủy tinh như: Bình định mức các loại, pipet vạch và pipet bầu
các loại, cốc
- Micropipet các loại: 0,5-10μL; 10-100μL; 100-1000μL
- Màng lọc 0,45μm
- Cột sắc ký pha đảo C18, 150x5mm, 4,5μm
- Bộ lọc hút chân không
2.2.2. Hóa chất
- Nước cất hai lần lọc qua màng lọc 0,45μm.
- Chất chuẩn acesulfame- K
- Chất chuẩn aspartame và các hóa chất khác loại PA
- KH
2
PO
4
Merck
- Acetonitril (ACN) Merck
- Etylacetat của PA
- NaCl của PA
- NaHCO
3
của PA
- H
3
PO
4
2.2.3. Các dung dịch gốc:
- Dung dịch gốc 5000ppm: cân mỗi loại 0,5g, lắc cho tan hoàn toàn và định
mức đến 100mL.

- Từ dung dịch gốc, pha các dung dịch chuẩn làm việc: 1ppm; 5ppm; 10ppm;
20ppm; 50ppm; 100ppm; 200ppm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Xử lý mẫu:
8
+ Các sản phẩm chất lỏng trong (đối với nước chanh, nước cola, các loại đồ uống)
Pha loãng mẫu với nước đựng trong bình định mức 100ml. Lọc dung dịch qua
bộ lọc cỡ lỗ 0,45 µm trước khi bơm.
+ Các sản phẩm dạng đục(nước đồ quả, đồ uống từ sữa có hương vị)
Pha loãng 20ml mẫu đã đồng hóa với 50ml nước cất, định mức vừa đủ 100ml.
Lọc qua giấy lọc gấp nếp, loại bỏ 10ml dịch lọc đầu tiên. Cho phần dịch lọc qua bộ lọc
màng cỡ lỗ 0,45µm trước khi bơm.
Để tính đến thể tích chất kết tủa,nếu chất hòa tan không chứa chất béocó trong
mẫu (trường hợp này là 20ml) vượt quá 3g, thì li tâm hỗn hợp mẫu đã làm trong 10
phút với tốc độ 5000 vòng/phút, trước khi lọc sang bình định mức 100ml. Rữa phần
chất lắng hai lần với nước cất và cho li tâm lại, thu lấy phần nỗi phía trên sang bình
định mức 100 ml rồi pha loãng dung dịch bằng nước cất đến vạch. Nếu lượng chất
không hòa tan nhỏ hơn 3 g thì cũng có thể thực hiện qui trình này.
2.3.2. Phương pháp phân tích
* Điều kiện tiến hành thí nghiệm
Các thí nghiệm được tiến hành trên hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao của
SHIMAZDU, detectơr diotarray có bước sóng từ 190 đến 800 nm, cột tách pha đảo RP
C18:
- Pha tỉnh và chiều dài cột: hạt hình cầu 3µm đối với cột dài 100mm, đến 10µm
đối với cột dài 300 mm
- Đường kính trong: 4,0mm
- Tốc độ dòng : từ 0,8 ml/min đến 1ml/min
- Thể tích tiêm: 10µl đến 20µl
- Phát hiện ở bước sóng: λ = 217nm đối với aspartame; λ = 227nm đối với
acesulfame-K; hoặc λ = 220 nm đối với cả hai chất.

- Tỷ lệ pha động:
+ dung dịch đệm phosphat + axetonitril [80: 20] (v/v)
+ dung dịch đệm phosphat + axetonitril [85: 15] (v/v)
+ dung dịch đệm phosphat + axetonitril [90: 10] (v/v)
+ dung dịch đệm phosphat + axetonitril [95: 5] (v/v)
* Định tính và định lượng
- Định tính: Dựa trên việc so sánh thời gian lưu của các chất có trong mẫu phân
tích với thời gian lưu của các chất chuẩn khi tiến hành trong cùng điều kiện sắc ký.
9
- Định lượng:
+ Xác định theo phương pháp ngoại chuẩn: tính tích phân các diện tích
píc/chiều cao và so sánh các kết quả với giá trị tương ứng của các chất chuẩn.
+ Phương pháp đường chuẩn: bơm một lượng thích hợp các các dung dịch
chuẩn có các nồng độ thích hợp. Vẽ diện tích pic/chiều cao của dung dịch chuẩn tương
ứng với nồng độ mg/l . Kiểm tra độ tuyến tính của đường chuẩn.
* Tính kết quả:
+ Phương pháp ngoại chuẩn: Hàm lượng các chất tạo ngọt (w), có trong dung
dịch thử được tính mg/l, theo công thức sau:
1000
%
)/(
22
11
×
×
×××
=
VA
FCVA
lmgw

(1)
Trong đó:
A
1
: diện tích pic của chất tạo ngọt thu được ở dung dịch mẫu thử
A
2
: diện tích pic của chất tạo ngọt thu được ở dung dịch chuẩn
V
1
: thể tích của dung dịch mẫu, tính bằng mililit (ml)
V
2
: thể tích của dung dịch mẫu, tính bằng mililit (ml)
C%: nồng độ phần trăm của chất tạo ngọt trong dung dịch chuẩn
+ Phương pháp đường chuẩn:
Hàm lượng các chất tạo ngọt (w), có trong dung dịch thử được tính mg/l, theo
công thức sau:
0
1
)/(
m
FCV
lmgw
××
=
(2)
Trong đó:
C : hàm lượng chất tạo ngọt có liên quan trong dung dịch thử, đọc được
từ đường chuẩn, tính bằng mg/l.

F,V
1
, m
0
xem trong công thức (1)
2.3.3. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
2.3.3.1 Độ lặp lại
Đánh giá độ lặp lại trên cơ sở xác định độ lệch chuẩn và sai số tương đối RSD%
của 5 phép thử song song trên mỗi đối tượng nghiên cứu.
100.(%)
tb
X
S
RSD =
10
Trong đó: S : độ lệch chuẩn

tb
X
: giá trị trung bình
2.3.3.2. Độ đúng
ĐỘ đúng của phương pháp phân tích được đánh giá qua độ thu hồi (Rev) khi
phân tích mẫu thực tế có them chuẩn (spiked sample)
100.(%)Re
1
02
x
xx
v
−

=
Trong đó:
x
0 :
là nồng độ chất

phân tích trong mẫu
x
1
: là nồng độ chất phân tích them chuẩn vào mẫu
X
2
: là nồng độ chất phân tích xác định được trong mẫu them chuẩn
2.3.3.2.Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
LOD xác định bằng cách phân tích lập lại từ 8 – 10 lần mẫu trắng hoặc mẫu
chuẩn. Từ kết quả phân tích lặp lại, tính độ lẹch chuẩn S, LOD và LOQ tính theo công
thức sau:
LOD = t * S
LOQ = 10* S
Trong đó: t là giá trị chuẩn student với bậc tự do f (f = n-1, n là số lần đo lặp
lại), P = 0,99
S : là độ lệch chuẩn
2.3.3.3. Phương pháp xử lý số liệu thí nghiệm
Các số liệu thực nnghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê ( sử dụng các
phần mềm Excel và Origin 8.0)
2.3.3.4. Đánh giá khả năng ứng dụng thực tiễn của phương pháp định lượng đã nghiên cứu
Sử dụng phương pháp định lượng đã nghiên cứu vào việc định lượng
acesulfame-K và aspartame có trong các sản phẩm nước giải khát có trên thị trường
Thừa Thiên Huế.

11
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1.Lựa chọn các điều kiện tiến hành sắc ký để phân tích đồng thời hai hoạt chất
acesulfame-K và aspartame trên hệ thống HPLC
Để lựa chọn các điều kiện phân tích đồng thời aspartame và acesulfame-K,
chúng tôi tiến hành bơm vào hệ thống HPLC hỗn hợp aspartame và acesulfame-K có
nồng độ 20 mg/l cho mỗi chất theo các điều kiện khảo sát khác nhau (bảng 3.1). Sau đó
dựa trên sự phân giải các pic, tín hiệu và thời gian hoàn thành phép phân tích để lựa
12
chọn điều kiện phân tích phù hợp. kết quả được trình bày ở bảng 3.2. Sắc ký đồ của hỗn
hợp theo các điều kiện khác nhau được trình bày ở hinh 3.1. và các phụ lục ….
Bảng 3.1. Các điều kiện phân tích hỗn hợp trên hệ thống HPLC
Ký hiệu Tốc độ dòng
(ml/phút)
Tỷ lệ pha động
(Phosphat + axetonitril)
1a
0,8
80 : 20
1b
0,8
90 : 10
2a 1,0 80 : 20
2b
1,0
90 : 10
3a 1,2 80 : 20
3b 1,2 90 : 10
4a 1,5 80 : 20

4b 1,5 90 : 10
Với các điều kiện phân tích trên, sắc ký đồ thu được có sự phân tách tương đối
tốt, không có hiện tượng chồng píc. Tuy nhiên, theo điều kiện phân tích (2b) sắc ký đồ
thu được có độ phân giải tốt, nhưng tín hiệu (chiều cao píc) của aspatam bé hơn so với
các điều kiện khác, hơn nữa hê số đối xứng của píc ra sau (S
b2
= 1,33 > 1,000) có thể
ảnh hưởng tới việc xác định cường độ tín hiệu (diện tích) Khi phân tích điều kiện
(3b), mặc dù thời gian phân tích ngắn dễ bị nhiễu các tạp chất, độ phân giải giữa hai
píc không được tốt sẽ gây khó khăn khi tiến hành mẫu thật đặc biệt các mẫu nước giải
khát có màu tổng hợp, chất bảo quản và lipid….
Theo điều kiện (4a), độ phân giải của hai pic tốt hơn so với (3b), có tín hiệu pic
cao, thời gian phân tích không quá dài ( khoảng 5 phút). Như vậy, với mục tiêu lựa
chọn các điều kiện tiến hành sắc ký sao cho tăng độ nhạy của phương pháp, giảm thời
gian phân tích (giảm chi phí)….vẫn cho kết quả phân tích tin cậy. Do đó, chúng tôi
chọn điều kiện (4a) để tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
13
Hình 3.1. sắc đồ hỗn hợp chuẩn ở điều kiện 2b
14
Hình 3.2. sắc đồ hỗn hợp chuẩn ở điều kiện 3b
Hình 3.3. sắc đồ hỗn hợp chuẩn ở điều kiện 4a
15
Tóm lai, các điều kiện phân tích dung dịch hỗn hợp chuẩn: aspartame và
acesulfame-K trên hệ thống HPLC như sau:
- Cột pha đảo : RP C18 (5µm,150 mm; 4,0 mm)
- Tốc độ dòng : 1,5 ml/min
- Thể tích tiêm: 20µl
- Phát hiện ở bước sóng: λ = 220 nm đối với cả hai chất.
- Tỷ lệ pha động:
+ (dung dịch đệm phosphat + axetonitril) - [80:20] (v/v)

Bảng 3.2. Thời gian lưu (t
R
), diện tích (S), độ phân giải (R), và
tổng thời gian phân tích(T) theo điều kiện 4a với nồng độ 20 mg/l
Điêù kiện
4a
t
R
S R T
Acesunfan
3,3 1334798
11,98 3,67
Aspatam
7,2 1372789
3.2. Khảo sát và chọn lựa quy trình xử lý mẫu
Thực tế, một số mẫu nước giải khát có nền mẫu phức tạp, muốn phân tích chính
xác đòi hỏi phải có quy trình xử lý mẫu thích hợp để không mất chất cần phân tích, do
đó cần phải loại tạp chất trước khi định lượng. Trong qui trình chuẩn bị mẫu phân tích
aspartame và acesulfame trong nước giải khát, giai đoạn ảnh hưởng lớn nhất là giai
đoạn chiết chất phân tích ra khỏi mẫu ban đầu (loại các chất cản trở như: chất bảo quản,
phẩm màu tổng hợp, chất tạo hương hoặc một số nước sữa giải khát có lipid và các chất
hữu cơ kém phân cực, các vitamin….) Theo kết quả tổng hợp các tài liệu đã công bố về
phương pháp chuẩn bị mẫu phân tích aspatam và acesulfame-k trong nước giải khát
[….]; [ ], chúng tôi nhận xét rằng:
- Giai đoạn làm sạch mẫu (elean-up): để làm sạch người ta dùng kỹ thuật chiết
pha rắn (SPE: Soil Phase Extraction) với pha rắn thường dùng là florisil.Trong trường
hợp này, thêm 2ml dịch lọc đã làm trong vào cột, trước đó đã hoạt hóa 3 ml methanol
và 20 ml nước. Chất phân tích được rửa giải bằng 20 ml dung dịch pha động, sau đó
dịch lọc đi qua bộ lọc màng có kích thước lỗ 0,45µm trước khi bơm vào hệ thống
HPLC. Tuy nhiên, cũng có tác giả chỉ làm sạch dịch chiết bằng thuốc thử carrez I, II,

sau đó tách trên cột sắc ký pha đảo của HPLC […]….
16
Rõ ràng, có nhiều phương pháp xử lý mẫu khác nhau cho mỗi giai đoạn của quá
trình xử lý mẫu. Với mục đích xây dựng qui trình xử lý mẫu đơn giản, chi phí thấp, phù
hợp với điều kiện hiện tại phòng thí nghiệm của teung tâm, nhưng vẫn đảm bảo độ
chính xác của kết quả phân tích. Do đó, chúng tôi đề xuất 2 quy trình xử lý mẫu phân
tích đồng thời aspartame và acesulfame-K trong một số nước giải khát theo sơ đồ hình
3.4; 3.5.
17
Hình 3.4. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu, chiết soxhlet bằng dung môi thích hợp
+20ml NaCl bão hào
+ H
3
PO
4
; pH= 1-2ml
Chiết Asp+Ace
bằng 2×75ml
ethylacetat
+30ml NaCl bão hào
+ Lắc kỹ
Dịch chiết ethyacetat
được chiết 2 ×20ml
natrihydrogen
carbonat
Loại
Nước
Cô quay đuổi
hết dung môi
ethyacetat

Thêm 2ml TBA-Br 0,1M,
định mức
HPLC
Mẫu nước giải
khát (10-40ml)
18
Hình 3.5. Sơ đồ tách tạp chất dùng cột chiết pha rắn và rửa giải bằng pha động
CỘT SPE
(Đã đýợc hoạt hóa với 3ml
metanol và 20 ml nước)
Dịch lọc
Lọc qua màng
0,45µm
HPLC
10ml -20 ml mẫu,
pha loãng nước cât
vừa đủ 100 ml
+ rửa giải bằng
20 ml pha động
19
3.2.1. Lựa chọn biện pháp chiết mẫu
Như ta đề cập ở trên 2 hình 3.2 ; .3.3 chúng tôi thực hiện 2 biện pháp chiết mẫu
khác nhau:
1/ Mẫu được chiết qua dung môi ethylacetat và chiết ethylacetat bằng dung môi
natrihydrogen carbonat , sau loại nước và cô quay chân không đến còn 2ml, thêm 2ml
TBA-Br 0,1M, định mức, lọc qua màng 0,45µm rồi bơm vào HPLC
2/ Mẫu được làm sạch qua cột chiết pha rắn, được rửa giải pha động, và lọc qua
màng 0,45µm sau đó bơm vào HPLC
Hiệu suất của việc chiết chất phân tích ra khỏi mẫu ban đầu phụ thuộc vào nhiều
yếu tố khác nhau như kỹ thuật chiết mẫu, dung môi sử dụng, các điều kiện tiến hành thí

nghiệm…. Khi các điều kiện đó được kiểm soát, thì thành phần của mẫu lại là yếu tố
quyết định đến sự thành công của quá trình chiết (hay là hiệu suất chiết). Do vậy, trong
nghiên cứu này để lựa chọn biện pháp chiết phù hợp,chúng tôi tiến hành thí nghiệm
trên mẫu thực tế mhu sau: Với mỗi biện pháp chiết mẫu, chúng tôi tiến hành song song
trên cùng một mẫu:
+ 1 thí nghiệm trên mẫu không thêm chuẩn
+ 1 thí nghiệm trên mẫu có thêm hỗn hợp aspatam và acesunfan (thêm vào mẫu
nước giải khát 1ml chuẩn hỗn hợp aspatam và acesunfan 100mg/l , mỗi chất)
Sau đó tính toán độ thu hồi cho từng biện pháp xử lý mẫu. Độ thu hồi là cơ sở
để chúng tôi lựa chọn biện pháp chiết mẫu thích hợp.
Do điều kiện bị giới hạn, chúng tôi chỉ tiến hành thí nghiệm thêm chuẩn ở mức
100 % . Tuy nhiên, các thí nghiệm được tiến hành cẩn thận nên kết qủa thu được có độ
đảm bảo tin cậy.
Dưới đây mô tả cụ thể 02 biện pháp chiết mẫu:
Biện pháp 1:
- Lấy khoảng 10- 20 ml cho vào ống ly tâm hoặc phẽu chiết.
- Thêm vào 20ml dung dịch NaCl bão hoà, thêm H
3
PO
4
để có pH=1-2
- Chiết bằng 2x 75ml ethylacetat.
- Thêm 30ml muối bão hoà vào toàn bộ dịch chiết ethylacetat thu được.
- Lắc kỹ bỏ lớp nước
- Chiết lớp ethylacetat bằng 2 x 20ml natrihydrogen carbonat
- Cất quay đuổi hết dung môi ethylacetat
- Thêm vào 2ml TBA-Br 0,1M
- Định mức tới vạch và chạy HPLC.
Biện pháp 2:
20

- Lấy khoảng 10 – 20 ml mẫu đã đồng hóa kỹ, cho vào bình định mức 100ml,
pha loãng nước cất vừa đủ, lọc. Lấy 4 ml dịch lọc đã được làm trong vào cột chiết pha
rắn đã được hoạt hóa với 3 ml methanol và 20 ml nước và rửa giải với 20 ml pha động.
Cho phần dịch lọc màng có kích thước lỗ 0,45 µm và bơm trực tiếp vào mẫy HPLC.
Kết quả định lượng trên máy HPLC sẽ dùng để tính toán độ thu hồi các chất
phân tích cho từng biện pháp xử lý mẫu. Sau đó dựa trên độ thu hồi tính toán được để
lựa chọn biện pháp xử lý mẫu.
Kết quả tính độ thu hồi với 2 biện pháp xử lý mẫu khác nhau được trình bày ở
bảng 3.3.
Bảng 3.3. Độ thu hồi aspatam và acesulpam với hai biện pháp chiết mẫu khác nhau
Kết quả thu được cho thấy: Biện pháp biện pháp 2 cho độ thu hồi các chất phân
tích cao ( từ 89 đến 105 %), sắc ký đồ có đường nền thấp. Còn biện pháp 1 hiệu suất
thu hồi kém: aspatam < 70%. Như vậy, biện pháp xử lý mẫu được lựa chọn là làm sạch
mẫu qua cột chiết pha rắn và rửa giải bằng pha động.
3.3.Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
Độ thu hồi %
Tên chất
Biện pháp 1 Biện pháp 2

Acesulpam
Aspatam
105
65 98
21
3.3.1. lp li
Tin hnh o lp li 3 ln hn hp dung dch chun 2
Mẫu đợc chiết bằng dung môi ethylacetat trong môi trờng acid phosphoric (pH =1-2 ).
Sau đó đờng saccarin và acesulpham K lại đợc chiết bằng dung dịch natri hydrogen
carbonat. Dịch chiết đợc cất quay đuổi hết ethylacetat và thêm vào đó 2ml dung dịch
TBA-Br, định mức và bơm vào hệ thống HPLC xác định bởi detector PDA ở bớc sóng

210 và 230nm.
Phạm vi áp dụng: Phơng pháp này áp dụng cho các sản phẩm nớc giải khát, ô mai, bánh
mứt kẹo
Đối với mẫu ở trạng thái rắn đợc xay, nghiền nhỏ và đồng nhất kỹ
- Mẫu trạng thái lỏng phải trộn đều
- Cân khoảng 10- 40 g cho vào ống ly tâm hoặc phẽu chiết.
- Thêm vào 20ml dung dịch NaCl bão hoà, thêm H
3
PO
4
để có pH=1-2
- Chiết bằng 2x 75ml ethylacetat.
- Thêm 30ml muối bão hoà vào toàn bộ dịch chiết ethylacetat thu đợc.
- Lắc kỹ bỏ lớp nớc
- Chiết lớp ethylacetat bằng 2 x 20ml natrihydrogen carbonat
- Cất quay đuổi hết dung môi ethylacetat
- Thêm vào 2ml TBA-Br 0,1M
- Định mức tới vạch và chạy HPLC.
Da vo trng lng phõn t, cu trỳc húa hc, tớnh cht hũa tan, tớnh phõn
cc ca aspartame v acesulfame-K, kt hp vi vic tham kho tng quan ti liu ca
hai cht aspartame v acesulfame-K: aspartame v acesulfame-K u l cht phõn cc
v cựng cú liờn kt nờn cú hp th t ngoi vựng 200nm-300nm (aspartame hp th
bc súng cc i max=214nm nm v acesulfame-K hp th bc súng cc i
22
ở λmax =237 nm). Do đó chúng tôi sử dụng kỹ thuật sắc ký pha đảo cột C18 và
detector dioaray để phân tích đồng thời hai hoạt chất này.
Bước sóng phát cũng được lựa chọn trên cơ sở ưu tiên tại bước sóng cực đại của chất
có nồng độ bé (210nm). Pha động được khảo sát và lựa chọn trong các dung môi và
hỗn hợp theo tỉ lệ của các dung môi: Methanol; nước; ACN; dung dịch đệm.
Cột: Sử dụng cột Lichrosorb RP 18 (150x4,6mm; 3μm). Cột đạt yêu cầu sử

dụng của hãng sản xuất.
Detector: Chọn bước sóng phát hiện sao cho tạp chất và các chất phụ không
gây cản trở, cường độ của peak phải phù hợp với phép phân tích đồng thời cả hai chất
aspartame và acesulfame-K trong nước giải khát. Các bước sóng đã thử ?, ưu tiên chọn
bước sóng cực đại của chất có hàm lượng bé hơn là bước sóng 210nm.
Dung môi pha mẫu: Dung môi pha mẫu là dung môi hòa tan tốt chất cần phân
tích nhưng hạn chế tan các tạp chất khác có trong mẫu, đồng thời cũng phải có thành
phành tương tự với thành phần pha động để giảm hiện tượng gây nhiểu đường nền
trong quá trình sắc ký.
Thể tích bơm mẫu: 20μL (buồng tiêm cố định của máy) vì vậy cần phải đưa
ra nồng độ chất phân tích thích hợp. Qua một số lần bơm mẫu thăm dò, chúng tôi thấy
nồng độ các chất phân tích được pha dưới đây cho kết quả chấp nhận được (diện tích
peak nằm trong khoảng đo của máy, peak cân đối, tách rõ ràng).
-Nồng độ dung dịch chuẩn aspartame: cân chính xác 0,050g aspartame vào
bình định mức 100mL, thêm dung dịch NaHCO
3
0,1M lắc cho tan rồi định mức đến
vạch bằng dung dịch NaHCO
3
0,1M, lắc đều (dung dịch A). Lấy 20mL dung dịch A
cho vào bình định mức 100mL, thêm dung dịch NaHCO
3
0,1M cho đến vạch rồi lọc
qua màng lọc milipor 0,45μm (dung dịch A').
Dung dịch chuẩn acesulfame-K: Cân chính xác 0,050g acesulfame-K vào
bình định mức 100mL, thêm dung dịch NaHCO3 0,1M lắc cho tan rồi định mức đến
vạch bằng dung dịch NaHCO3 0,1M, lắc đều (dung dịch B). Lấy 20mL dung dịch B
cho vào bình định mức 100mL, thêm dung dịch NaHCO3 0,1M cho đến vạch rồi lọc
qua màng lọc milipor 0,45μm (dung dịch B').
-Dung dịch mẫu thử: Lấy chính xác 50,0mL chế phẩm vào bình tam giác,

acid hóa bằng acid phosphoric cho đến pH khoảng 2÷3. Đun nóng trên bếp cách thủy
khoảng 15 phút, chiết hai lần bằng dung môi ethylacetat (mỗi lần là 25mL). Rửa chiết
hai lần bằng dung dịch NaHCO3 0,1M (mỗi lần 25mL). Đun trên bếp cách thủy để đuổi
dung môi hữu cơ, chuyển hết vào bình định mức 100mL dùng dung dịch NaHCO3 định
mức đến vạch, lọc qua màng lọc milipre 0,45μm
3.1.1. Khảo sát lựa chọn dung môi pha động
Khảo sát các hệ dung môi phân cực khác nhau: MeOH- nước; MeOH- đệm;
ACN- đệm. Tốc độ duy trì là 1mL/phút. Kiểm tra sự ổn định của máy sau mỗi lần thay
đổi pha động, tiến hành bơm 20μL vào cột. Sắc ký đồ thu được ứng với mỗi hệ dung
môi ở hình 3.1; 3.2; 3.3 Và bảng 3.1
23
Nhận xét:
Kết quả cho thấy khi thay đổi hệ dung môi pha động thì thời gian lưu, độ
phân giải và hệ số đối xứng của peak thay đổi theo
Với hệ dung môi pha động là MeOH-nước, chúng tôi thấy chương trình sắc ký đang
khảo sát không cho phép xác định aspartame và acesulfame-K vì cả hai peak đã bị doãn
và không tách rời nhau.
Với hệ dung môi pha động là MeOH-đệm, chúng tôi thấy chương trình sắc ký đang
khảo sát không cho phép xác định aspartame và acesulfame-K vì peak đã bị chèn bởi
một peak của chất khác.
Với hệ dung môi ACN- đệm (tỉ lệ 10:90), chúng tôi thấy chương trình sắc ký
đang khảo sát đã cho phép tách hỗn hợp aspartame và acesulfame-K hoàn toàn riêng lẽ
(R=6,734). Tuy nhiên hệ số đối xứng Sa1= 3,959; Sa2=3,275 đều lớn hơn hai.
Qua quá trình khảo sát để lựa chọn dung môi pha động chúng tôi quyết định
chọn hệ dung môi ACN- đệm. Để được hệ số đối xứng tốt chúng tôi tiếp tục khảo sát tỉ
lệ giữa hai thành phần ACN và đệm.
3.1.2. Khảo sát lựa chọn tỉ lệ dung môi pha động
Khi đã xác định được hệ dung môi pha động là ACN- đệm, chúng tôi tiến hành khảo sát
hệ dung môi ACN- đệm theo các tỉ lệ 5:95; 10:90; 15:85; 20:82, trong các điều kiện:
-Sử dụng cột RP18 (150x4,6mm; 3μm)

-Thể tích bơm mẫu 20μL
-Tốc độ dòng: 1mL/phút
-Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
-Detector: UV bước sóng 210nm
Sắc ký đồ thu được ứng với mỗi tỉ lệ của ACN- đệm ở hình 3.4; 3.5; 3.6; 3.7
và bảng 3.2.
Nhận xét:
Kết quả cho thấy khi thay đổi tỉ lệ dung môi pha động thì thời gian lưu, độ
phân giải và hệ số đối xứng của peak cũng thay đổi theo.
Khi tỉ lệ ACN thay đổi từ 5% đến 20%, tR2 giảm xuống 2,22 lần. Điều này
phù hợp với lý thuyết vì đây là quá trình sắc ký pha đảo, dung môi càng ít phân cực khả
năng rửa giải càng mạnh. Độ phân cực của pha động làm giảm thời gian phân tích.
Khi tỉ lệ ACN là 5%, dung môi pha động phân cực mạnh, thời gian lưu quá
lớn do đó thời gian phân tích tăng.
Khi tỉ lệ ACN là 20%, dung môi ít phân cực, sự rửa giải xảy ra quá nhanh
dẫn đến hiện tượng các peak bị chập và peak thứ 2 bị doãn.
Khi tỉ lệ ACN là 10%, hai peak tách nhau hoàn toàn nhưng hệ số đối xứng
lớn Sa1= 3,959; Sa2= 3,275, nên không phù hợp với quá trình phân tích.
Khi tỉ lệ ACN là 15%, hai peak tách nhau hoàn toàn, các hệ số đối xứng
(Sa1=1,561; Sa2= 1,095) đều thỏa mãn cho quá trình phân tích. Thời gian lưu
24
tR2=7,271là thời gian ngắn do đó ít tốn kém dung môi. Với kết quả trên, chúng tôi
chọn tỉ lệ ACN là 15% là thích hợp cho quá trình phân tích.
Bảng 3.2. Giá trị trung bình các thông số cơ bản của quá trình tách hỗn hợp
aspartame và acesulfame-K ở các tỉ lệ dung môi pha động khác nhau (n= 5)
Tỉ lệ ACN:đệm
Các thông số
5:95 10:90 15:85 20:80
Thời gian lưu tR1
Thời gian lưu tR2

Hệ số đối xứng Sa1
Hệ số đối xứng Sa2
Độ phân giải R
5,067
13,295
2.574
1,948
12,325
3,608
6,865
3,959
3,275
6,734
3,493
7,271
1,561
1,095
13,452
5,284
5,981
1,700
2,174
2,247
3.1.3. Khảo sát tốc độ dòng
Sau khi khảo sát thành phần và tỉ lệ dung môi pha động chúng tôi nhận thấy
rằng với hệ dung môi ACN-đệm theo tỉ lệ 15:85 là thích hợp cho chương trình tách sắc
ký, chúng tôi tiếp tục khảo sát sự ảnh hưởng của tốc độ dòng ở các tốc độ 0,8mL/phút;
1mL/phút; và 2mL/phút. Dung môi pha động là ACN: đệm là 15:85. Kiểm tra sự ổn
định của máy sau mỗi lần thay đổi tốc độ dòng, tiến hành bơm 20μL vào cột. Sắc ký đồ
thu được ứng với mỗi tốc độ dòng ở hình3.8; 3.9; 3.10 Và bàng 3.3

Từ kết quả thu được chúng tôi nhận thấy tốc độ dòng có ảnh hưởng đáng kể
đến thời gian lưu. Khi tốc độ dòng tăng, thời gian lưu giảm (tốc độ dòng tăng từ
0,8mL/phút đến 2mL/phút, thời gian lưu giảm 1,87 lần) do đó làm giảm thời gian phân
tích.
Sự thay đổi tốc độ dòng có ảnh hưởng hạn chế đến độ phân giải, khi tốc độ dòng tăng
từ 1mL/phút đến 2mL/phút thì độ phân giải giảm từ giá trị 13,452 đến 4,510.
Tốc độ dòng tăng làm cho tốc độ di chuyển của các phân tử qua cột sắc ký
tăng, sắc ký đồ của các peak gọn và cân đối hơn (hệ số đối xứng giảm).
-Với tốc độ dòng là 0,8mL/phút thì cả hai hệ số đối xứng đều lớn hơn 2
(Sa1=3,968; Sa2=3,278), cả hai peak đều bị doãn.
-Với tốc độ dòng là 1mL/phút, có độ phân giải lớn (R=13,452). Các yếu tố:
tR1=3,493; tR2=7,271 là khoảng thời gian ngắn nên ít tốn kém dung môi; hệ số đối
xứng (Sa1=1,561; Sa2=1,095) đều nhỏ hơn 2, rất thích hợp cho quá trình sắc ký mà
chúng tôi đang khảo sát.
-Với tốc độ dòng là 2mL/phút, sự rửa giải xảy ra quá nhanh dẫn đến hiện
tượng xuất hiện peak tạp và hiện tượng chập peak. Hệ số đối xứng (Sa2=2,04) lớn hơn
2 nên không phù hợp cho quá trình sắc ký vì peak này bị doãn, ngoài ra, hệ số phân giải
(R=4,510) là bé nhất trong ba hệ số phân giải của các tốc độ dòng này.
- Với kết quả khảo sát chúng tôi chọn tốc độ duy trì hợp lý là 1mL/phút.
Bảng 3.3 Giá trị trung bình các thông số cơ bản của quá trình tách hỗn hợp
aspartame và acesulfame-K ở các tốc độ dòng khác nhau (n= 5)
25