0137 tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase tự nhiên và tạo cellulase tái tổ hợp từ nấm sợi tại việt nam luận văn tốt nghiệp

BỘGIÁODỤCVÀĐÀOTẠO
ĐẠIHỌCTHÁINGUN

TRỊNHĐÌNHKHÁ

TINH SẠCH VÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH
CỦACELLULASE TỰ NHIÊN VÀ TẠO CELLULASE
TÁITỔHỢPTỪNẤMSỢI TẠI VIỆTNAM
Chun ngành: Hóa sinh
họcMãsố:62.42.01.16

TĨMTẮTLUẬN ÁNTIẾNSĨSINHHỌC

THÁINGUN-2015


Cơngtrìnhđược hồnthànhtại:
TRƢỜNGĐẠIHỌCKHOAHỌC-ĐẠIHỌCTHÁINGUNVIỆN
CƠNGNGHỆSINHHỌC-VIỆNHÀNLÂM
KHOAHỌCVÀCƠNGNGHỆVIỆTNAM

Ngƣờihƣớngdẫnkhoahọc: 1.PGS.TS.QuyềnĐìnhThi
2.PGS.TS. Nghiêm NgọcMinh

Ngƣờiphảnbiện1:……………………………………
……………………………………..
Ngƣờiphảnbiện2:……………………………………
……………………………………..
Ngƣờiphảnbiện3:……………………………………
……………………………………..

LuậnánsẽđƣợcbảovệtrƣớcHộiđồngchấmluậnáncấpĐạihọcHọptại:TR
ƢỜNGĐẠIHỌCKHOAHỌC-ĐẠIHỌCTHÁINGUN

Vào hồi

giờ

ngày

tháng

năm2015

Có thể tìm hiểu luận án
tại:ThƣviệnQuốcgia
Trung tâm học liệu Đại học Thái
NguyênThƣviệnTrƣờngĐạihọcKhoahọcTháiNguyê
n


DANHMỤCCÁCCƠNGTRÌNHCĨLIÊNQUANĐẾNĐỀTÀI
1. Dinh Kha Trinh, Dinh Thi Quyen, Thi Tuyen Do, Thi Thu
HuongNguyen,NgocMinh
Nghiem
(2013),“Optimization
ofcultureconditions and medium components for Carboxymethyl
Cellulase(CMCase) production by a novel basidiomycete
strainPeniophorasp.NDVN01”,IranianJournalofBiotechnolo
gy,11(4),pp.251259.(SCI-E)
2. Dinh Kha Trinh, Dinh Thi Quyen, Thi Tuyen Do, Ngoc

MinhNghiem(2013),“Purificationandcharacterizationofanoveldet
ergentand
organic
solvent-resistant
endo-beta-1,4glucanasefrom a newly isolated basidiomycetePeniophorasp.
NDVN01”,TurkJ Biol, 37, pp. 377-384.(SCI-E)
3. Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nghiêm Ngọc Minh
(2012),“Nhân dịng và phân tích trình tự gene 28S rRNA của
chủng nấmđảm sinh tổng hợp cellulase”,Tạp chí Khoa học và
Cơng nghệ -Đại học TháiNguyên,Tập96, Số 8, pp.115-118.
4. Trinh Dinh Kha, Quyen Dinh Thi, Nghiem Ngoc Minh
(2012),“OptimizationofcarboxymethylcellulaseproductionbyBasi
diomycetePeniophorasp.NDVN01undersolidstatefermentation”,
Proceedings The Second Academic conference onNatural Science
for Master and PhD Students from Cambodia -Laos - Malaysia –
Vietnam, Publishing House for Science andTechnology,pp. 445450.
5. Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nghiêm Ngọc Minh
(2011),“Tối ưu sinh tổng hợp carboxymethyl cellulase từ chủng
nấm đảmPeniophorasp. NDVN01 ở các điều kiện lên men rắn”,Tạp
chíCơngnghệ Sinhhọc,Tập 9,Số 4, pp. 845-852.
6. Trìnhtự gen đăngkýtrênGenBank:mã sốJF925333


1
MỞĐẦU
Cellulaseđượcứngdụngtrongcôngnghiệpthựcphẩm,sảnxuấtthức ăn chăn
nuôi,sảnxuấtbia,bộtgiấy,ngànhcôngnghiệpchấttẩyrửa, ngành công nghiệp dệt may,
nhiên liệu và hóa chất, quản lý chấtthảivàxửlýơnhiễmmơitrường.
Việc khai thác ứng dụng cellulase từ nguồn tự nhiên gặp
nhiềuhạn chế do năng lực sinh tổng hợp của chủng giống, khơng chủ

động,khó can thiệp thay đổi tính chất về động học enzyme, độ bền nhiệt
độvàpH,khảnănghoạtđộngtrongnhữngđiềukiệnnồngđộcaochấttẩyrửavàdung
mơihữucơ.
Trênthếgiới,đãcónhiềuphươngphápđượcđưarađểnângcaonăngsuấtcel
lulasenhưlàtuyểnchọncácchủngcókhảnăngsinhtổnghợp cellulase cao, tối ưu hóa các
điều kiện lên men nhằm thu đượclượng lớn enzyme này. Đặc biệt với sự phát
triển của cơng nghệ, mộtsố gen mã hóa cellulase của vi sinh vật và
thực vật đã được tách dòngvàđưavàobiểuhiệnmứcđộlớnởcáchệbiểuhiệnkhácnhau
(biểuhiện trong E. coli, trong nấm men, trong nấm mốc). Ở Việt Nam,
việcnghiên cứu cellulase chủ yếu dừng ở việc phân lập tuyển chọn
cácchủngvisinhvậtsảnxuấtenzymecaovàđánhgiámộtsốtínhchấtcủaenzyme để
ứng

dụng

trong

cơng

nghệ

sinh

học

và

xử

lý

mơi

trường.Việcnghiêncứutạochếphẩmcellulasetáitổhợpvàứngdụngcácchếphẩmnà
ycịnhạnchế.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tơi tiến hành thực hiện
đềtài luận án:“Tinh sạch và nghiên cứu đặc tính của cellulase
tựnhiênvàtạocellulasetáitổhợptừnấmsợitạiViệtNam”.
2. Mụctiêunghiêncứu
(i) Tinhsạchvàđánhgiáđượcđặctínhcủacellulasetựnhiêntừchủngnấmt
uyểnchọnlàmcơsởứngdụngvàtạocellulasetáitổhợp.


(ii) Tạo được endoglucanase tái tổ hợp khơng chứa peptide
tínhiệu từ nguồn gen đã được phân lập từ chủng nấm sợi tuyển
chọntạiViệt Nam.
3. Nộidungnghiêncứu
3.1. Nghiên cứu tuyển chọn chủng nấm có khả năng sinh tổng
hợpcellulasemạnh trongbộ sưutậptừ nhiều nguồn khácnhau;
3.2. Nghiên

cứu

tốiưu

thành

phầnmơitrường,điềukiện

lênm e n quym ơ p h ị n g t h í n g h i ệ m p hù h ợ p v ớ i c h ủ n g n ấ m t uy ể n

c h ọ n l à m cơsởsảnxuấtcellulasetựnhiên;
3.3. Tinh sạch và phân tích tính chất lý hóa của cellulase tinh sạch
từchủngnấmchọn lọctạiViệtNam;
3.4. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa endoglucanase khơng
chứapeptide tín hiệu từ chủng nấmAspergillus nigerVTCC-F021
trongPichia pastorisGS115 và tối ưu môi trường lên men phù hợp để
sảnxuấtendoglucanase táitổ hợp khơngchứapeptidetínhiệu;
3.5. Tinh sạch và phân tích tính chất lý hóa của endoglucanase tái
tổhợp khơngchứa peptidetínhiệu.
4. Nhữngđónggópmớicủaluậnán
(i) EndoglucanasetừchủngnấmPeniophorasp.NDVN01tuyểnchọn
tạiViệtNamlầnđầutiênđượctinhsạchcókíchthướckhoảng 32 kDa. Endoglucanase có
độ bền cao trong khoảng nhiệt độ30-37°C và pH 4,0-7,0. Enzyme
này bền đối với dung môi acetone ởnồng độ 1-20%; ethanol và
butanol-1 ở nồng độ 1-5%; isopropanol ởnồng độ 1-15% và độ bền
cao đối với chất tẩy rửa Tween 20, Tween80,TritonX-100vàtritonX114.
(ii) Gen mã hóa endoglucanase A khơng chứa peptide tín
hiệu(meglA)từc h ủ n g A.nigerVTCCF021đãđư ợ cbiểuhiệnthànhcôngtrongP.pastorisGS115.Endoglucan
aseAtáitổhợp(rmEglA) tinh


sạch có kích thước khoảng 32 kDa. Enzyme hoạt động tối ưu ở
nhiệtđộ 50°C, pH 3,5, bền ở 30-37°C và rất bền trong khoảng pH
3,0-8,0.Enzyme độ bền cao đối với chất tẩy rửa Tween 20, Tween
80, TritonX-100vàtritonX-114.
5. Ýnghĩakhoahọcthựctiễncủaluậnán
5.1. Ýnghĩakhoahọc
Kếtquảnghiêncứugópphầnlàmsángtỏđặcđiểmhóasinhcủaendoglucanase
có

nguồn

gốc

từ

nấm

thuộc

chiPeniophoravà

gópphầnlàmsángtỏảnhhưởngcủapeptidetínhiệuđếntínhchấtendoglucanase
củachủngA. nigerVTCC-F021 biểu hiện trong nấmmenPichiapastoris.
Kết quả tạo endoglucanase tái tổ hợp khơng chứa peptide
tínhiệuđãcủngcốthêmcơsởkhoahọctronghướngcảibiếnhoạttínhvàtínhchấte
nzymetáitổhợpbằngcáchcắtbỏđoạnpeptidetínhiệu.
Các bài báo khoa học cơng bố trên tạp chí khoa học
chuyênngành quốc tế và trong nước cùng với trình tự gen cơng bố
trên cơ sởdữ liệu Ngân hàng gen Quốc tế là những tài liệu có giá trị
tham khảotrongnghiêncứuvàgiảngdạy.
5.2. Ýnghĩathựctiễn
EndoglucanasetừchủngnấmPeniophorasp.NDVN01vàendogluc
anasetáitổhợpkhơngchứapeptidetínhiệucótínhchấtphùhợpvớihướngứngd
ụngsảnxuấtchếphẩmbổ
sungvàothứcănchănniđểchuyểnhóahợpchấtglucannângcaohiệuquảsửdụng
thứcănvàtăngtrọngvậtni.Đồngthời,haienzymenàycóthểsửdụngtrongchuyểnh
óasinhhọcngunliệu,chấtthảinơngnghiệpgiàucellulosethànhđườngsửdụn
gtrongcơngnghiệplênmen.
Thànhphầnmơitrườngvàđiềukiệnlênmentốiưuđốivớichủng

Peniophorasp.NDVN01vàchủngP.pastoristáitổhợpcóthểđượcsử


dụngđểlênmenlượnglớn,phùhợpđểsảnxuấtchếphẩmendoglucanasetựnhiê
nvàtáitổhợptrongđiềukiệnthựctiễntạiViệtNam.
*BốcụccủaLuậnán
Luậnángồm126trang(khơngkểphụlục),mởđầu4trang,tổngquantàiliệu27
trang;vậtliệuvàphươngphápnghiêncứu13trang;kết quả 46 trang; thảo luận 11 trang;
kết

luận

và

đề

nghị

2

trang.

Luậnáncó18bảngthểhiệnkếtquảnghiêncứu,31hìnhảnhminhhọa,189tài liệu
thamkhảo,trongđócó24tàiliệutiếngViệtvà161tàiliệutiếngAnhvà04địachỉtrangweb.
Chƣơng1.TỔNGQUANTÀILIỆU
Luận án đã tham khảo 24 tài liệu tiếng Việt và 161 tài liệu
tiếngAnhvà04địachỉtrangwebchuyênngànhđểtổngkếtcácnộidungcóliên quan
baogồm:(1)Cellulase;(2)Ứngdụngcủacellulase;(3)Nghiên cứu tạo cellulase tái tổ hợp;
(4) Nấm sợiPeniophorasp.,Aspergillusniger.
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối

liênkết-1,4-Oglycosidetrongphântửcellulose,oligosaccharide,disaccharide và một
số cơ chất tương tự khác (Saranraj và đtg, 2012).Cáccellulaseđượcứngdụng
rộngrãitrongnhiềungànhcôngnghiệpnhư: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp
sản xuất thức ăn gia súc,công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ, sản
xuất chất tẩy rửa, côngnghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt trong cơng
nghệ xử lý rác thải sảnxuất phânbónvisinh(Kuhadvà đtg,2011;
Sharada vàđtg,2013).
Cho đến nay, trên thế giới đã có khá nhiều tác giả nghiên cứu
vềbiểuhiện

cellulase

trong

nhiều

hệthống

biểuhiện.

Yang

vàđtg(2010)đãnhândòngvàbiểuhiệncellulasebềnnhiệttừchủngBacillu
s subtilis15 trongE. coliB L 2 1

(DE3).

Năm

2011,

P e n g v à đtgđãbiểuhiệnthànhcơnggenmãhóacellulasebềnnhiệttừ


Clostridium thermocellumtrongE. coli.Năm 2001, Hong và đtg
đãphân lập gen mã hóa β-glucanase từA. nigerIF031125 và biểu
hiệntrong nấm men. Zhao và đtg đã sử dụng phương pháp tối ưu
hóacodon geneng1từA. nigerIFO31125 thu được gensyn-eglbị
thayđổi1 93 n u c l e o t i d e , thà nh phầnG + C giảmtừ5 4% x uố ng 44
%.S a u đóđượcchènvàovectorpPIC9K,đặttronghệbiểuhiệnP. pastorisGS115. Rashid
và CS (2008) đã biểu hiện F1-CMCase (24 kDa, 221aa) từA.
aculeatustrongA. oryzaeniaD300. Hoạt tính enzyme tái tổhợp đạt cao
nhất (18,3 U/ml) sau 120 giờ biểu hiện trong môi trườngchứa
nguồntinhbột.
Ở Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu mới chỉ quan tâm đếnglucanase tự nhiên, có ít các nghiên cứu đề cập đến-glucanase tái
tổhợp.Năm2010,Nguyenvàđtgđãnhândịnggenmãhóa-glucosidase
từA. nigerPBC và biể u hiệ n thà nh công trong P.pastorisSMD1168
vớ i hệvectorbiể u hiệ n làpPIC 9. Trần Đình Mấnvà đtg (2010) dựa trên
kỹ thuật megaprimer, đã gắn thành cơng đoạngen mã hóa
exoglucanase (1450 bp) từCellulomonas fimiATCC484và promoter
(180 bp) từB. subtilisvà biểu hiện trongE. colicó hoạttính 0,25 U/ml.
Năm 2011, Phạm Thị Hòa và đtg đã nhân dòng vàbiểu hiện thành
cơng gen eglA mã hóa endoglucanase thuộc họ 12 từchủngA.
nigerVTCC-F021 trong nấm menP. pastorisGS115. Tuynhiên, năng
suất biểu hiện của chủng tái tổ hợp thấp và tính chất chưaphùhợpđịnh
hướngứngdụngtrongchăn ni.
Chƣơng2.VẬTLIỆUVÀPHƢƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU
2.1. Vậtliệu,hóachấtvàđịađiểmnghiêncứu
2.1.1. Vậtliệu
Bộsưutập42chủngnấmdophịngCơngnghệsinhhọcenzyme

-Việncơngnghệsinhhọc-ViệnHànlâmKhoahọcvàCơngnghệ


Việt Nam, phịng thí nghiệm sinh học - Khoa Khoa học Sự sống TrườngĐạihọcKhoahọc-ĐạihọcTháiNguncungcấp.
2.1.2. Hóachất
Hóachấtsửdụngtrongthí
nghiệmđều
ởdạngtinhkhiếtdocáchãnguytínchuncungcấphóachấtphântíchcủaMỹ,Đức
,TâyBanNhacungcấp.
2.1.3. Địađiểmnghiêncứu
Các thí nghiệm được thực hiện từ tháng 7 năm 2009 tại
PhịngCơng nghệ sinh học enzyme và Phịng thí nghiệm trọng điểm
Cơngnghệ gen thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa
họcvàCôngnghệ ViệtNam.
Công trình được hồn thành tại Khoa Khoa học Sự sống TrườngĐạihọcKhoa học -ĐạihọcTháiNguyên
2.2. Thiếtbịthínghiệm
Các thiết bị được sử dụng làm thí nghiệm đều mới, hiện đại
vàcó độ chính xác cao thuộc phịng Cơng nghệ sinh học Enzyme
vàPhịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ
sinhhọc,ViệnKhoahọcvàCôngnghệViệtNam.
2.3. Phƣơngphápnghiêncứu
2.3.1. Cácphươngphápvisinhvật
Nuôi cấy hoạt hóa nấm mốc; Ni cấy nấm thu enzyme;
NicấyE.coli;NibiểuhiệnChủngP.pastoristáitổhợp.
2.3.2. Cácphươngphápsinhhọcphântử
2.3.2.1. TáchchiếtDNAtổngsốcủanấmmốc
2.3.2.2. TáchchiếtDNAtổngsốnấmmen
2.3.2.3. TáchDNAplasmidtheoSambrookvàRusel
2.3.2.4. Cắtplasmidbằngenzymegiớihạn
2.3.2.5. TinhsạchphânđoạnDNA

2.3.2.6. NhânbảngenbằngPCR


2.3.2.7. Phảnứngnốighépgen
2.3.2.8. Biếnnạpbằngsốcnhiệt
2.3.2.9. Biếnnạpbằngxungđiện
2.3.2.10. Giảitrìnhtựnucleotidetheophươngphápgiảitrìnhtựtựđộng
2.3.3. Cácphươngpháphóasinh
2.3.3.1. Xácđịnhhoạttínhcellulasetheođườngkínhthủyphântrênđ
ĩathạch
2.3.3.2. XácđịnhhoạtđộcellulasetheophươngphápcủaMiller1959
2.3.3.3. Tinhsạchcellulasetựnhiênbằngsắckýlọcgel
2.3.3.4. Tinhsạchproteintáitổhợpbằngsắckýáilực
2.3.3.5. Điệndigelpolyacrylamide(SDS-PAGE)theoLemmli1970
2.3.3.6. ĐiệndiSDS-PAGEnhuộmhoạttính
2.3.3.7. XácđịnhhàmlượngproteintổngsốtheoBradford1976
2.3.3.8. Nghiêncứuảnhhưởngcủamộtsốyếutốlýhóalênhoạttínhvàđộbề
ncủacellulasetựnhiênvàtáitổhợp
ĐộnghọccủaphảnứngenzymeNhiệ
tđộvàpHtốiưu
ĐộbềnnhiệtvàđộbềnpH
Ảnhhưởngcủaionkimloại,chấttẩyrửavàdungmơihữucơ.
2.3.3.9. XácđịnhsảnphẩmthủyphânbằngkỹthuậtTLC
2.4. Xửlýsốliệu
Phần mềm Microsoft Excel sử dụng để xử lý số liệu thu
đượctrong quá trình thực nghiệm và tính giá trị của các tham số
thống kêsinh học (Chu Văn Mẫn 2001). Chương trình Blast,
DNAstar đượcdùng để phân tích, so sánh trình tự nucleotide và xây
dựng cây phânloại chủng nấm nghiên cứu. Chương trình SignalP 4.1
Server

dùng
đểphântíchsignalpeptide,NetOGlyc4.0ServerdùngđểphântíchđiểmOglycosylhóa,NetNGlyc1.0ServerdùngđểphântíchđiểmN-glycosylhóa.


Chƣơng3.KẾTQUẢVÀTHẢOLUẬN
3.1. Tinhs ạc h v à n g h i ê n c ứ u đ ặ c t í n h c ủ a c e l l u l a s e t ự n h i ê n
t ừ nấmsợitạiViệtNam
3.1.1. Tuyểnchọnvàphânloạichủngnấmsợisinhtổnghợpcellulase
Đãt u y ể n c h ọ n đ ư ợ c c h ủ n g N D V N 0 1 c ó h o ạ t t í n h m ạ n h n h
ấ t (1,47U/ml)trongsố37chủngnấmTrichodremavà5chủngnấmđảm.

Hình 3.1. Hoạt tính cellulase của một số chủng nấm
sợi(T1-T31: một số chủng nấm Trichoderma; 1:
Peniophora sp.NDVN01;2:Pleurotussajor-caju;3:Pleurotusostreatus;
4:Ganodermalucidum; 5:Flammulinavelutipes)
Đã nhân dịng và xác định trình tự nucleotide của gene mã
hóarRNAgồmmộtphầngen18S;tồnbộtrìnhtựITS1,gen5,8SvàtrìnhtựITS2;
mộtphầngen28ScủachủngNDVN01cóchiềudài1255bp.
1

bp

M

M

2

3

ĐC

4

M

bp

1500
1000

3000
1500
1000

1200bp

A

B

C

D

Hình3.2.HìnhảnhđiệndinhângenmãhóarRNA
DNA tổng số (A-1); Sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA
từkhn DNA tách chiết từ chủng NDVN01 (B-2); Plasmid tái tổ hợp(C-3);Sảnphẩmcắt
plasmidtáitổhợp/XbaIvà XhoI(D-4);Marker
1kb(M);pJET1.2(C-ĐC)

So sánh trình tự có độ tương đồng cao (>99%) với một số
lồithuộcchiPeniophora.TrìnhtựgenmãhóarRNAcủachủngNDVN01đã
được đăng ký trong GenBank với mã số JF925333 và chủng
đãđượcđặttênlàPeniophorasp.NDVN01.
P42
P61
B19
P61
P85
P85
P42
P62
P61
P33
P61
P65
D42
V48
R72

9.1
8

6
4
2
NucleotideSubstitutio ns (x100)

0

Hoạttínhcellulase(U/ml)

Hình3.3.CâyphânloạichủngNDVN01dựavàotrìnhtựgenmãhóarRNA
P333:Peniophorasp.NDVN01(JF925333); P611:Peniophorasp.
M104-3B(HM595611);P651:Peniophorapini(EU118651)
3.1.2. Tốiưuđiềukiệnmơitrườngnicấysinhtổnghợpcellulase
ChủngPeniophora sp.NDVN01 đã được tối ưu các điều
kiện:thời gian lên men, pH ban đầu của môi trường, nhiệt độ lên
men, cơchất cảm ứng, nồng độ dịch chiết khoai tây, nguồn carbon,
nguồnnitrogenvàmộtsốnguồnkhống.
30
25

24,65

20
15
10
5

2,87

0
STU

Mơitrường

TTU

Hình 3.9. Năng suất sinh tổng hợp cellulase của
chủngPeniophorasp.NDVN01trongmôitrƣờngtốiƣuvàchƣatốiƣu
STU:sautốiưu; TTU:trước tốiưu


Kết quả tối ưu cho thấy, năng suất sinh tổng hợp cellulase
đạt24,65U/ml,caohơn8,6lầnsovớimơitrườngcơbảnbanđầuchưatốiưu.Nhưvậy,
thành phần mơi trường tối ưu có chứa 80% (v/v) củatruyền khoai tây, 0,6% rơm lúa;
0,2% (w/v) (NH4)2HPO4và 0,5%(w/v) bột giấy làm cơ chất cảm ứng.
Điều

kiện

lên

men

thích

hợp

ở28°C,pHbanđầucủamơitrườngbằng7,0,thờigianlênmen120giờ.
3.1.3. TinhsạchvàđánhgiátínhchấtcellulasecủachủngPeniophoras
p.NDVN01
3.1.3.1. Tinhsạchcellulase

Hình 3.10. Sắc ký đồtinh sạch cellulase trên cột Biogel-P100 (A)
vàhìnhảnhđiệndiproteinsảnphẩmtinhsạch(B),điệndihoạttính(C)
M: marker protein (Fermentas); 1: phổ điện di dịch enzyme thô;

2:phổ điện di dịch enzyme qua cột Sephadex-G75; 3: phổ điện di
dịchenzymequacộtBiogel-P100(dịchtinhsạch);4:Phổđiệndinhuộmhoạttínhđặc hiệu
Tinh sạch bằng tủa ammonium sulfate, qua cột sắc ký lọc
gelSephadexG75vàcộtBiogelP100thuđượcmộtbăngproteinduynhấtcókhốilượngphântửkhoảng32kDa.Kết
quảđiệndihoạttínhkhẳngđịnhbăngtinhsạchthuđượclàmộtcellulase(hình3.10).
Cellulasecóđộsạch2,34lầnsovớidịchenzymethơbanđầu,hoạttínhriê
ngđạt146,42U/mgnhưnghiệusuấtthuhồithấpchỉđạt4,33%.


3.1.3.2. Độnghọccơchấtcủacellulase
Động học đối với cơ chất β-glucan lúa mạch của cellulase
từchủngPeniophorasp. NDVN01 có Km thấp hơn, K catvà Kcat/
Kmcaohơn so với cơ chất CMC. Vận tốc cực đại của phản ứng do
cellulasexúc tác đối với cơ chất CMC đạt 1825 U/mg, còn đối với cơ
chất β-glucanlúamạchđạt9804U/mg.
3.1.3.3. Đặchiệucơchấtcủacellulase
Kết quả cho thấy, cellulase có tính đặc hiệu cao đối với cơ
chấtβ-glucanlúamạchvàCMC,trongđómạnhnhấtđốivới β-glucanlúamạch với hoạt tính
tương đối đạt 456% so với cơ chất CMC. Đối vớicơ chất xylan, LBG
và
avicel,
cellulase
của
chủngPeniophorasp.NDVN01khơngcótácdụngthủyphân.
3.1.3.4. Sảnphẩmthủyphâncơchấtcủacellulase
Kết quả cho thấy, sản phẩm thủy phân chủ yếu của CMC
làcellobiose (G2) và cellotriose (G3), tiếp theo là cellotetrose (G4)
vàcác oligomer lớn hơn G4. Glucose (G1) là sản phẩm thu được ít
nhất(hình 3.12). Như vậy, kết hợp với kết quả phân tích động học cơ
chất,đặc hiệu cơ chất có thể khẳng định cellulase tinh sạch

từPeniophorasp.NDVN01làmộtendo1,4-glucanase.
Hình3.12. Hìnhảnhphổchạysắc ký TLCsảnphẩm
thủyphâncơchấtCMCcủa
cellulasetinhsạchtừchủngPeniophorasp.NDVN0
1
G1

1: Phổ chạy chất chuẩn; 2: phổ chạy

G2
G3
G4

dịchcellulasetinhsạch;3:phổchạydịchthủyphân;4:p
hổchạycơchấtCMC;G1:glucose:G2:cellobiose;
G3:cellotriose, G4:cellotetrose
1234

3.1.3.5. Nhiệtđ ộ p h ả n ứ n g t ố i ư u v à đ ộ b ề n n h i ệ t
đ ộ c ủ a
endoglucanase
Kết quả cho thấy hoạt tính endoglucanase tăng dần từ 32%
ởnhiệtđộ30°Clêncựcđạiở60°C(100%).Sauđókhităngnhiệtđộthìhoạttínhcủ
aenzymegiảmdầnchỉcịn51%ở85°C(hình3.13A).


Hình3.13.Đồthịảnhhƣởngcủanhiệtđộphảnứng(A)vàđộbềnnhiệtđộ (B)
của endoglucanase từ chủngPeniophorasp.
NDVN01Endoglucanasec ủ a c h ủ n g P e n i o p h o r a s p . N D V N
01vẫngiữ

đượchoạttínhởnhiệtđộ45°C,hoạttínhtươngđốicịnlạitrongkhoảng62-76%
sau 24 giờ xử lý tại 30-45°C. Tuy nhiên, khi xử lý ở nhiệt độcao5055°Cthìhoạttínhcủaenzymegiảmmạnh(hình3.13B).
3.1.3.6. pHphảnứngtốiưuvàđộbềnpHcủaendoglucnanase
pHphảnứngtốiưucủaendoglucanasecủachủngPeniophorasp.NDVN01
trongkhoảng4,5-5,0.EndoglucanasetừPeniophorasp.NDVN01 có độ bền cao trong
khoảng
pH
từ
4,0-5,5
với
hoạt
tínhtươngđốicịnlạitrên90%sau24hủtrongđệmởnhiệtđộ37°C.

Hình3.14.ĐồthịảnhhƣởngcủapHphảnứng(A)vàđộbềnpHcủaendog
lucanasetừchủngPeniophorasp. NDVN01
3.1.3.7. Ảnhhưởngcủaionkimloạiđếnhoạttínhendoglucanase


Bảng3.4.Ảnhhƣởngcủaionkimloạivàmộtsốthuốcthửđếnhoạttínhendo
glucanasecủachủngPeniophorasp.NDVN01
Ionkimloạivà một
sốthuốcthử(mM)
+

2mM

Hoạttínhtươngđối(%)
4mM
6mM
8mM

10mM

K
Na+

91,53,0

93,82,6

92,83,1

93,73,3

91,53,0

86,45,8

85,51,8

80,83,5

94,22,8

97,43,0

Ag+

71,82,0

0 0

00

Fe2+
Ni2+

69,92,8

76,93,2

91,82,4

93,32,6

101,32,5

168,51,6

147,31,4

108,53,1

105,33,1

104,32,6

Mn2+

65,13,2

84,42,4

95,52,6

94,83,2

97,03,2

2+

102,32,3

100,42,9

98,82,0

91,72,4

86,32,8

Zn2+

105,92,8

97,42,5

99,22,9

98,81,8

98,71,2

97,64,8

115,41,4

93,43,5

91,93,2

90,62,1

52,82,2

0 0

Ca

2+

Ba
Cu2+
Mg

2+

EDTA
2-Mercaptoethanol

0 0

00

00

0 0

00

78,62,8

73,93,4

78,52,3

80,12,5

78,73,1

61,31,1

64,62,4

65,83,0

71,02,2

67,13,1

114,62,6

108,13,2

103,12,3

100,22,5

93,71,2

Đốichứng

1006,9

Kết quả cho thấy rằng hoạt tính của enzyme đã được tăng
cườngvới sự hiện diện của Ni2+trong khoảng 2-10 mM, Ca2+ở nồng độ
2mM,Zn2+ởnồngđộ2mM,Ba2+ởnồngđộ4mMvàmercaptoethanoltrongkhoảng
nồngđộ2-6mM.Trongđó,ionNi2+tăng cường mạnhmẽ hoạt động của enzyme,
làm tăng hoạt tính tương đối lên 168% ởnồng độ 2 mM. Tuy nhiên,
hoạt

tính

cellulase

đã

hồn

tồn

bị

ức

chếbởiviệcbổsungcácionAg+vàCu2+ởnồngđộ4-10mM.
3.1.3.8. Ảnhhưởngcủadungmơihữucơvàchấttẩyrửađếnhoạttínhendoglucanas
e
Việc bổ sung dung môi methanol (1% v/v), ethanol (15%),isopropanol(1-10%),butanol-1(1-5%)vàacetone(115%)tăngcườngh o ạ t đ ộ n g c ủ a e n z y m e , n h ư n g k h i ở n ồ n g đ ộ c a
odungmôi


methanol(5-20%),ethanol(10-20%),isopropanol(15-20%)vàbutanol-1
(10-20%) ức chế hoạt động của enzyme. Trong đó, dungmơi acetone
ở nồng độ 15% (v/v) làm tăng hoạt tính cellulase mạnhnhất với hoạt
tính tương đối đạt 121% so với đối chứng không bổsung dung môi.
Dung

môi

butanol-1

với

nồng

độ

từ

10-20%

(v/v)

ứcchếm ạ nh h o ạ t t ính e n z y m e , h o ạ t t í n h tư ơngđối c ị n l ại 3941% s o vớiđốichứng(hình 3.15A).

Hình3.15.Biểuđồsosánhảnhhƣởngcủadungmơihữucơ(A)vàchấttẩyrửa(B)
đếnhoạttínhendoglucanasecủachủngPeniophorasp. NDVN01
Met: Methanol; Eth: Ethanol; Ipro: Isopropanol; n-But:nButanol;Ace:Acetone;T20:Tween20;T80:Tween80;TX-100:TritonX100;TX-114:TritonX-114;ĐC:Đốichứng
Bổ sung các Triton X-114 tại nồng độ 1% (v/v) tăng
cườngmạnhnhấthoạtđộngcủaenzyme,nhưngởnồngđột ừ 1 0 2 0 % TritonX-114ứcchếhoạtđộngenzyme.SDSứcchếhồntồnhoạttínhcủaenzyme.
3.2. Nhândịngvàbiểuhiện genmeglAtừchủngAspergillusniger
VTCC-F021trongPichiapastoris
3.2.1. NhândịnggenmeglA
34

bp

bp

M5

3000
3.2.1.1.
750
500

A

720

750

672bp

B

C

672


Hình 3.17. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân
genmeglA(A),plasmidtáitổhợppJmeglA(B) và sản phẩm cắt
pJmeglAbằngEcoRI/XbaI(C)
dc: sản phẩm PCR đối chứng âm (khơng có khn DNA); 2:
sảnphẩmPCRnhângeneglA(đốichứngdương);3:sảnphẩmPCRnhângenmeglA;3:plasmid
pJmeglA;4:plasmidpJET1.2(đốichứng);5:sản phẩmcắtpJmeglAbằng
EcoRI/XbaI
TrìnhtựgenmeglAđượcnhândịngvàgiảitrìnhtựvớichiềudài672n
ucleotide.
cagacaatgtgctctcagtatgacagtgcctcgagccccccatactcagtgaaccagaac
QTMCSQYDSASSPPYSVNQN
ctctggggcgagtaccaaggcaccggcagccagtgtgcatatgtcgacaaactctccagc
LWGEYQGTGSQCAYVDKLSS
agtggtgcatcctggcacaccgaatggacctggagcggtggtgagggaacagtgaaaagc
SGASWHTEWTWSGGEGTVKS
tactctaactctggcgttacatttaacaagaagctcgtgagtgatgtatcaagcatcccc
YSNSGVTFNKKLVSDVSSIP
acctcggtggaatggaagcaggacaacaccaacgtcaacgccgatgtcgcgtatgatctt

TSVEWKQDNTNVNADVAYDL
ttcaccgcggcgaatgtggaccatgccacttctagcggcgactatgaactgatgatttgg
FTAANVDHATSSGDYELMIW
cttgcccgctacggcaacatccagcccattggcaagcaaattgccacggccacagtggga
LARYGNIQPIGKQIATATVG
ggcaagtcctgggaggtgtggtatggcagcaccacccaggccggtgcggagcagaggaca
GKSWEVWYGSTTQAGAEQRT
tacagctttgtgtcggaaagccctatcaactcatacagtggggacatcaatgcatttttc
YSFVSESPINSYSGDINAFF
agctatctcactcagaaccaaggctttcccgccagctctcagtacttgatcaatctgcag
SYLTQNQGFPASSQYLINLQ
tttggaactgaggcgttcaccgggggcccggcaaccttcacggttgacaactggaccgcc
FGTEAFTGGPATFTVDNWT *A
agtgtcaactag
SVN-

Hình 3.18. Trình tự genmeglAvà trình tự amino acid suy
diễncủamEglAtừchủngA. nigerVTCC-F021
T*:vịtríThreoninecóthểxảyraglycosylhóa

60
20
120
40
180
60
240
80
300
100

360
120
420
140
480
160
540
180
600
200
660
220
672
223


Phân tích bằng phần mềm DNAstar cho thấy trình tự amino
axít suy diễn của rmEglA dài 223 amino acid. Trong đó có 9
aminoacid mang tính ba zơ mạnh (K, R), 19 amino acid mang tính a
xítmạnh (D, E), 68 amino a xít kỵ nước (A, I, L, F, W, V) và 96
amino axít phân cực (N, C, Q, S, T,Y). Enzyme rmEglA có khối lượng tínhtốntheolý
thuyếtkhoảng 24,24kDavớipI bằng4,24.S o v ớ i rEglA, thành phần
amino acid thay đổi: giảm 1 amino a xít có tính bazơ mạnh (K, R),
giảm 9 amino a xít kỵ nước (A, I, L, F, W, V) vàgiảm 3 amino a xít
phân cực (N, C, Q, S, T,Y). Enzyme rmEglA cókhối lượng
giảmkhoảng 1,5 kDa và pI giảm 0,129 so với rEglA. Sửdụng phần
mềm
trực
tuyến
NetOGlyc

4.0
Server
phân
tích
điểmglycosylhóa( />được trên chuỗipolypeptide củamrEglA cóthể xảy raO g l y c o s y l hóa tại vị trí của amino a xít Threonine-219 (T *) (hình
3.18). Tuynhiên, khi phân tích băng phần mềm trực tuyến NetNGlyc
1.0 Server( khơng phát
hiện được vịtrí cóthể xảyra qtrình N-glycosylhóa.
3.2.2. ThiếtkếvectorbiểuhiệnmeglA
Plasmid pJmeglAmang genmeglAvà vector pPICZA
cùngđược cắt bằng EcoRI và XbaI. Sau đó, được nối với nhau bằng
T4ligase tạo plasmid tái tổ hợp pPmeglA. Plasmid có đoạn chèn có
kíchthước lớn hơn, nên nằm cao hơn so với vector không có đoạn
chèn(hình3.19A).
Plasmidtái tổ hợp pPmeglAtinh sạch được cắt bằngEcoRI
vàXbaIchohaibănglàpPICZαA(A(3,6kb)genmeglA(672bp)(hình3.19B).
pPmeglAđược đọc trình tự để kiểm tra cấu trúc biểu hiện
trướckhibiếnnạpvàbiểuhiệnởP.pastorisGS115.Cấutrúcbiểuhiệnđúngkhungđọc
,meglAđượcchènvàođúngvịtrímongmuốn,đủđiềukiệnđểđưavàobiểuhiệntro
ngP.pastorisGS115.
bp12Mbp

3

4

bp56Mbp

bpM
6000

3000

3600

672

3000

750

7
4272bp


3600

A

3000

C
1000

672
750

D

Hình 3.19. Hình ảnh điện di sản phẩm thơi gel (A),
plasmidpPmeglA(B), sản phẩm cắt pPmeglAbằngEcoRI vàXbaI

(C),sảnphẩmcắtpPmeglAbằngSacI(D)
1:pPICZAmởvòng;2:genmeglA;3:pPmeglA;4:pPICZA(đối
chứng);5:pPmeglAcắt
bằngEcoRIvàXbaI;6:pPICZAbằngEcoRIvà XbaI(đốichứng);7:
pPmeglAcắtbằngSacI
3.2.3. BiểuhiệnrmEglAtrongP.pastorisGS115
3.2.3.1. XâydựnghệthốngbiểuhiệnP.pastorisGS115/pPmeglA
10
kDa9M* 1112116
66

kb1 M2 3 4567 8kb
3,0
2,2
1,0
0,6

2,2

45

1,2

35
25
18

A

B

13
kDaM * 11
6
66

rmEglA

45

32kDa

25

35

rmEgllA

18
14

C

Hình 3.21. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu3´5´AOX1(A);điệndiproteintổngsốdịchlênmenchủngP.pastorisGS115/pPmeglA(B);
điện di nhuộm hoạt tính dịch lênmenchủngP.
pastorisGS115/pPmeglA(C)
1: PCR genome P. pastoris GS115/pPicZα (đối chứng); 2-8:
PCRgenome P. pastoris GS115/pPmeglA; 9: dịch lên men dịng
P.pastoris GS115/pPICzA (đối chứng); 10-12: dịch lên men một
sốdịngP.pastorisGS115/pPmeglA;13:nhuộmhoạttínhrmEglA

ĐểbiểuhiệngenmeglA,plasmidtáitổhợppPmeglAđượccắtmởv
ị n g b ằ n g S a c I( h ì n h 3 . 1 9 D ) v à đ ư ợ c b i ế n n ạ p v à o t ế b à o P .