nghiên cứu sử dụng các tác nhân vi sinh vật trong đấu tranh sinh học để phòng trừ bệnh nấm hại rễ (phytophthora spp.) ở cây trồng có múi

Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
1
Lớp 0601


MỞ ĐẦU

Hàng năm trên thế giới các bệnh thực vật như bệnh đạo ôn, bệnh xì mủ,
thối cổ rễ gây ra những tổn thất nặng nề cho sản xuất nông nghiệp. Khoảng
hơn 8000 loài nấm có khả năng gây bệnh cho cây trồng và một vài loài nấm
có thể gây hại trên nhiều loại cây trồng[5]. Trong đó các bệnh do nấm
Phytophthora spp. gây ra được xem rất nguy hiểm ở nhiều loại cây như sầu
riêng, cam, quýt, nhãn Ở Mỹ, nấm Phytophthora spp. gây thiệt hại cho cây
trồng gây thất thu hàng tỉ đô la mỗi năm. Chỉ ở bang Ohio của Mỹ, nấm
Phytophthora spp. gây bệnh thối rễ trên cây đậu nành làm thiệt hại trên 50
triệu đô la mỗi năm. Ở Việt Nam từ năm 1998 đến nay, bệnh này đã phát triển
và gây hại ở một số tỉnh phía Nam. Bệnh do nấm Phytophthora spp. gây ra là
bệnh rất nguy hiểm trên cây ăn quả, bởi chúng tấn công và gây hại cho cây từ
giai đoạn cây con đến giai đoạn trưởng thành, thậm chí đến giai đoạn sau thu
hoạch. Trong điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa, trồng trọt quanh năm, sự
lan truyền của các tác nhân gây bệnh trong nước tưới, hệ thống thoát nước
kém, cây giống không sạch bệnh là những yếu tố tạo điều kiện thuận lợi cho
sự phát triển của bệnh này.
Trên thế giới, hàng loạt các biện pháp phòng trừ nấm bệnh đã được các
nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu và được áp dụng[1, 8]. Việc sử
dụng thuốc hoá học trừ nấm bệnh thường rất độc và rất tốn kém, có khả năng
tồn dư trong đất, nước, nông sản sẽ gây ảnh hưởng tới sức khoẻ con người,
gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái. Mặt khác việc sử dụng

thuốc hoá học nhiều làm cho nhiều loài vi khuẩn và nấm bệnh hại có khả năng
kháng lại thuốc nên hiệu quả diệt trừ không cao. Chính vì vậy, Hội nghị tư
vấn Khu vực Thái Bình Dương của FAO năm 1992 đã khẳng định: đấu tranh
sinh học là nền tảng của chương trình IPM (quản lí dịch hại tổng hợp) với 3
chiến lược cơ bản chính [23]:
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
2
Lớp 0601


1. Sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể kí
sinh. Hướng dẫn áp dụng với các loại vi sinh vật đối kháng, các chất sinh học
diệt khuẩn vào các vùng sinh thái khác nhau của cây trồng.
2. Làm tăng các vi sinh vật có ích, đấu tranh chống các vi sinh vật ký sinh cho
cây ở trong đất.
3. Thúc đẩy khả năng sinh trưởng cây trồng, làm tăng sức chống chịu của cây.
Hiện nay biện pháp phòng chống nấm bệnh cây trồng bằng chế phẩm
sinh học, đang được sử dụng rộng rãi bởi tính bền vững, an toàn với môi
trường sinh thái, an toàn với sức khỏe con người và tính hiệu quả của chúng.
Trên thế giới đã có nhiều thí nghiệm và thực nghiệm về việc sử dụng các vi
sinh vật đối kháng như: vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm … trong phòng chống bệnh
hại cây trồng, đặc biệt là nhóm bệnh hại có nguồn gốc trong đất (nấm, vi
khuẩn…). Tại Việt Nam, việc tìm kiếm các vi sinh vật có khả năng đối kháng,
tiêu diệt nấm bệnh đã và đang được nhiều nhà khoa học tiến hành. Các chế
phẩm từ vi sinh có khả năng kháng nấm bước đầu đã được thử nghiệm ở
nhiều quy mô khác nhau [3, 4, 5, 8].
Xuất phát từ những yêu cầu, thực trạng đó, cùng với xu hướng nghiên cứu

trên thế giới hiện nay, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài:"Nghiên cứu sử
dụng các tác nhân vi sinh vật trong đấu tranh sinh học để phòng trừ bệnh
nấm hại rễ (Phytopthora spp.) ở cây trồng có múi”.









Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
3
Lớp 0601


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. ĐẤU TRANH SINH HỌC (Biological control)
1.1.1. Khái niệm
Đấu tranh sinh học là việc giảm các quần thể phá hoại bằng các đối thủ
tự nhiên và thông thường có sự tham gia tích cực của con người. Các đối thủ
tự nhiên của các loài phá hoại, còn được gọi là các tác nhân đấu tranh sinh
học bao gồm những loài ăn mồi, các loài kí sinh và các mầm bệnh. Các tác
nhân đấu tranh sinh học đối với các bệnh ở thực vật thường được đề cập là
các loài đối kháng (antagonist). Các tác nhân đấu tranh sinh học của cỏ dại

bao gồm các loài ăn cỏ và các mầm bệnh ở thực vật. Các loài ăn mồi như bọ
cánh cứng (lady beetle) và lacewing, là các loài sống tự do mà sử dụng số lớn
con mồi trong đời sống của nó. Các loài kí sinh (Parasitoids) là những loài mà
giai đoạn chưa trưởng thành của nó phát triển trên hoặc trong một cơ thể chủ
duy nhất và cuối cùng tiêu diệt cơ thể chủ. Hầu hết có một dãy vật chủ rất
hẹp. Nhiều loài côn trùng và một số loài ruồi là những sinh vật kí sinh. Các vi
sinh vật gây bệnh được coi như là mầm bệnh bao gồm vi khuẩn, nấm và virut,
chúng tiêu diệt hoặc làm suy yếu cơ thể chủ và khá đặc hiệu với một số nhóm
côn trùng nhất định [25].
1.1.2. Đấu tranh sinh học các bệnh thực vật
Đấu tranh sinh học (kiểm soát sinh học) đối với các loài gây hại và
mầm bệnh ở thực vật tiếp tục thu hút nhiều nghiên cứu và phát triển ở nhiều
lĩnh vực. Theo nghĩa hẹp, đấu tranh sinh học là quá trình ức chế các sinh vật
gây hại bằng các sinh vật khác [11,36]. Tuy nhiên, mối quan hệ tương tác lẫn
nhau của các môi trường có thể tạo ra nhiều tương tác giữa các sinh vật và
môi trường của chúng, nhiều trong số đó có thể góp phần tạo nên quá trình
đấu tranh sinh học hiệu quả. Hơn nữa, các sản phẩm tự nhiên và các chất hoá
học đã được phát hiện như là kết quả của nghiên cứu về cơ chế phân tử của
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
4
Lớp 0601


quá trình phát sinh bệnh và đấu tranh sinh học đã dẫn đến sự phát triển của
các chất diệt loài gây hại dựa trên nguyên lý sinh học [25,35].
Trải qua hàng trăm năm, các nghiên cứu liên tục chỉ ra rằng các vi sinh
vật có thể hoạt động như các tác nhân đối kháng với nhiều mầm bệnh khác

nhau ở thực vật. Các tương tác giữa vi sinh vật và cơ thể thực vật chủ có thể
là rất phức tạp, những tương tác dẫn tới quá trình kiểm soát sinh học bao gồm:
kháng sinh, cạnh tranh, cảm ứng sự kháng của vật chủ và tiêu diệt. Khi kiểm
tra các chủng vi khuẩn và nấm được phân lập từ môi trường về hoạt tính đấu
tranh sinh học thì có ít nhất từ 1 đến 10% khả năng ức chế sự sinh trưởng của
các mầm bệnh. Tuy nhiên, một vài dòng có thể ức chế các bệnh ở thực vật
dưới các điều kiện sinh trưởng khác nhau và một vài loài có phổ tác dụng
rộng chống lại nhiều loài mầm bệnh. Chính vì vậy, việc sàng lọc kỹ càng sẽ
tạo ra nhiều vi sinh vật trong việc phát triển các chế phẩm thương mại. Một
vài dòng vi sinh vật đã được thương mại hoá thành công và hiện tại được
phân phối như là các chất diệt loài gây hại sinh học ở Mỹ, bao gồm các vi
khuẩn thuộc về các chi Agrobacterium, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces
và nấm thuộc về các chi Ampelomyces, Candida, Coniothyrium, Trichoderma.
Sàng lọc là một bước quan trọng trong việc phát triển các tác nhân đấu tranh
sinh học. Thành công của các giai đoạn sau đó sẽ phụ thuộc vào phương pháp
sàng lọc để xác định một loài thích hợp. Nhiều tác nhân đấu tranh sinh học
hữu dụng đã được phát hiện bằng cách quan sát các vùng ức chế trên đĩa
thạch. Đối với sự cạnh tranh, các phương pháp sàng lọc bao gồm việc tìm
kiếm các vi sinh vật mà nhanh chóng tạo được khuẩn lạc trong đất vô trùng và
có khả năng loại bỏ các sinh vật khác lây nhiễm vào đó, tìm kiếm các vi sinh
vật mà tạo khuẩn lạc bảo vệ đối với quá trình lây nhiễm. Việc sàng lọc cơ bản
đối với các vi sinh vật đấu tranh sinh học mới vẫn còn được sử dụng và dường
như sẽ tiếp tục cần để làm đa dạng các ứng dụng của kiểm soát sinh học cũng
như thay thế các sản phẩm đấu tranh sinh học đang được sử dụng mà có thể sẽ
dẫn tới sự kháng [36].
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
5

Lớp 0601


1.2. TÁC NHÂN VI SINH VẬT TRONG ĐẤU TRANH SINH HỌC
CHỐNG LẠI CÁC BỆNH THỰC VẬT (Biological control agents-BCAs).

Các tác nhân đấu tranh sinh học có thể là một phương pháp thay thế các
chất hoá học trong việc quản lý các bệnh mùa màng do nấm. Nhiều tác nhân
đấu tranh sinh học hiện nay đã có sẵn trên thị trường. Cạnh tranh không gian
và dinh dưỡng đối với các mầm bệnh cũng như sản sinh các hợp chất chống
nấm là các cơ chế đấu tranh sinh học quan trọng nhất. Điều này sẽ phụ thuộc
vào khả năng tồn tại một lượng lớn các tác nhân đấu tranh sinh học ở vị trí
đích. Ức chế cạnh tranh và gây độc đối với các vi sinh vật khác thường xảy ra
trong tự nhiên là hai vấn đề đã được xác định là những ảnh hưởng bất lợi đến
việc sử dụng các tác nhân đấu tranh sinh học
1.2.1 Vi khuẩn
Nhiều tác nhân vi khuẩn đã được sử dụng rộng rãi để ức chế mầm bệnh
ở thực vật. Chẳng hạn chế phẩm của B. subtilis đã được thương mại hoá với
thương hiệu Quantum-4000, Kodiak và Epic, sử dụng để xử lý hạt quả đậu,
rau, bông để kiểm soát bệnh do Rhizoctonia và Fusarium gây ra. Một tác
nhân diệt nấm chống lại bệnh mốc xám dựa trên B. subtilis gần đây đã được
chấp nhận cho thương mại hoá bởi EPA của Mỹ. Ở Trung quốc, Bacillus sp
đã được sử dụng để tăng năng suất của lúa gạo, lúa mì, ngô, củ cải đường, cải
bắp và hạt cải dầu [36]. Nhiều sản phẩm khác từ B. subtilis cũng đang được
phát triển bởi các tổ chức thương mại trên khắp thế giới [33].
Việc phối trộn sẽ cung cấp một môi trường bảo vệ cho các vi khuẩn đưa
vào, do đó làm tăng khả năng sống sót của nó và cho quá trình hình thành
khuẩn lạc thành công. Trong khi các sinh vật dựa trên Bacillus có thể ổn định
hơn về mặt di truyền thì một số loài vi khuẩn Gram âm như Pseudomonas cần
phải có những hệ thống bảo vệ đặc biệt. Vidhyazakara và Muthamilan đã

phát triển một chế phẩm dựa trên bột đá tan, than bùn, chất khoáng bón cây,
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
6
Lớp 0601


cao nilit, mùn cưa và phân bón sân trại mà trong đó các chủng P. fluorescens
có thể sống sót tới 240 ngày dự trữ. Một chủng P. fluorescece được tạo ra trên
methylcellulose: đá tan có khả năng sống sót trong 10 tháng ở 4
o
C và làm
giảm tới 68,5% bệnh ở lúa gạo. Những chế phẩm vi sinh khác được sử dụng
để kiểm soát bệnh tật bao gồm Agrobacterium radiobacter, hiện nay đã được
thương mại hoá ở Úc, New Zealand và Mỹ dùng để kiểm soát các bệnh mụn
cây (crown gall) dưới dạng lỏng, dưới dạng bột than, bùn ẩm [36]. Những chế
phẩm này được hoà tan trong nước trước khi xử lý hạt và đào những rãnh nhỏ,
phun hoặc nhúng. Streptomyces griseoviridis được sử dụng chống lại nhiều
nấm gây bệnh và có sẵn ở nhiều nước trên thế giới dưới dạng bột có thể làm
ẩm, được sử dụng để kiểm soát các bệnh ở rễ gây ra bởi Pythium, Fusarium,
Phytophthora và Phomopsis. Các chế phẩn dạng than bùn hoặc lỏng của
Burkholderia cepacia cũng đang được sử dụng để kiểm soát các nấm gây
bệnh như Phytophthora, Pythium và Fusarium.
Ngày nay, các CKS trong bảo vệ thực vật sử dụng có hiệu quả thường
được dùng dưới dạng các chế phẩm như là: thuốc chống nấm blastixidin,
kasugamyxin…; thuốc chống vi khuẩn streptomyxin, oxytetracylin…; thuốc
trừ sâu avermectin – B, milbemctins…; thuốc diệt cỏ bilanafos và các chất
điều hòa sinh trưởng của cây như là gibberellins. Ở Nhật Bản, người ta đã có

những chế phẩm chống đạo ôn và khô vằn rất có hiệu quả như: blastixidin S
chiết từ S.griseochromogenes, kasugamixin từ S.kaysugaensis, validamixin từ
S. hygroscopicus. Ở Ấn Độ, sử dụng aureofulvin chống bệnh thối cổ rễ. Ở
Anh và một số nước Châu Âu cũng đã sử dụng griseofulvin trong nông
nghiệp để chống các bệnh ở cây trồng [17]. Tại Việt Nam, hiện nay có sử
dụng nhiều loại thuốc như: validamycin chống bệnh khô vằn, polyoxin
complex chống bệnh đen lá, streptomycin chống bệnh bạc lá hại lúa.
Năm 1954 Trung Quốc đã phân lập được Streptomyces spp 5406 có khả
năng sinh ra chất kháng sinh phòng chống bệnh thối rễ cây và đã áp dụng trên
6 triệu ha trồng bông và đã thu hoạch được những kết quả rất khả quan. Ngoài
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
7
Lớp 0601


ra, Trung quốc còn ứng dụng chế phẩm YIB (yield increasing bacteria) trên
6,7 triệu ha ở 30 tỉnh khác nhau. Chế phẩm này không những phòng chống
bệnh do vi khuẩn gây ra mà còn chứa các hormon thực vật như IAA, giberilin
làm tăng năng suất cây trồng. Sau đó cũng tại Trung Quốc, jingangmycin,
một chất kháng sinh được tách chiết từ một loài Streptomyces hygroscopicus,
ứng dụng rất thành công trong phòng bệnh thối rễ [34].Vi khuẩn cũng có khả
năng ảnh hưởng đến chu trình sống của giun tròn trong đất do chúng bắm chặt
vào vùng rễ. Nhiều vi khuẩn ở rễ được biết là có tác dụng làm giảm quần thể
giun tròn và các chi quan trọng bao gồm Agro-bacterium, Alcanigenes,
Bacillus, Clostridium, Desulfovibrio, pseudomonas, Ser-ratia, and
Streptomyces [39]. Các loài nấm kí sinh bắt buộc vào vi khuẩn như Pasteuria
penetrans thường không được sản xuất ở mức thương mại vào thời điểm này,

có thể giảm quần thể giun tròn bằng khả năng kí sinh của chúng, trong khi các
loài vi khuẩn trong rễ không kí sinh có thể làm giảm quần thể giun tròn bằng
cách tạo khuẩn lạc ưu tiên trên thực vật chủ hoặc tạo ra các chất trao đổi độc
với giun tròn [37]. Các chế phẩm thương mại của B.cepacia đã được điều chế
dưới dạng bột ẩm, hạt khuếch tán trong nước hoặc dưới dạng huyền phù đang
được đánh giá để kiển soát các loại giun tròn.
Trước khi một tác nhân đấu tranh sinh học vi khuẩn có thể được thương mại
hoá thì một đánh giá mức độ nguy hiểm cũng phải được hoàn thành. Đối với
một tác nhân đấu tranh sinh học được đăng kí như là các chất diệt loài gây hại
thì những quy định hiện hành đòi hỏi nhà sản xuất phải cung cấp các dữ liệu
về sự phân tán của tác nhân đấu tranh sinh học và các tác động đến các vi
khuẩn khác trong môi trường mà tác nhân này được sử dụng.
1.2.2 Nấm
Các loài nấm chủ yếu sử dụng trong đấu tranh sinh học là Trichoderma
spp, Gliocladium viens, Tilletiopsis pallescens, and Pseudozyma flocculose
[19]. Nhiều nấm gây bệnh ở lá và rễ như Rhizoctonia, Pythium, Phytophthora,
Botrytis có khả năng được kiểm soát bởi những loài nấm này [19, 30, 36].
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
8
Lớp 0601


Có nhiều phương pháp khác nhau dùng để phát triển các chế phẩm
nấm, bao gồm làm khô sợi nấm đã phân đoạn, chứa một viên hệ sợi nấm [12],
viên nang bào tử hoặc hệ sợi nấm trong tinh bột hoặc alginate và bao bọc các
bao tử khô lên hạt cám, một số bào tử nấm sinh sôi nhanh chóng trong nước.
Tương tự, các chế phẩm dạng nước thường dễ bị nhiễm do đó mà việc sử dụng

các chế phẩm dưới dạng này không được ưa thích, các chế phẩm dạng bột ẩm
hoặc dạng mùn thường được sử dụng hơn. Trichoderma harzianum có biểu
hiện sinh trưởng tốt hơn và đa dạng hơn khi được sản xuất dưới dạng đất
diamomit có bổ sung 10% mật đường để kiểm soát Sclerotium rolfsii trong lạc [15].
Ở Ấn Độ, đã ứng dụng chế phẩm từ một loại nấm là Trichoderma
viridae và dùng aureofulvin để phòng chống một số nấm bệnh ở rễ như
Rhizoctonia spp., Fusarium spp., Pythium, Phytophthora spp. Một công thức
đã đuợc tập trung vào Trichoderma và Gliocladium như là các tác nhân đấu
tranh sinh học chống lại các nấm khác do dễ phân lập, nuôi cấy và lên men
[31, 32]. Các chế phẩm sinh học của T.harzianum đã được điều chế bằng
cách trộn sinh khối nấm trong môi trường đất.
Các loài nấm Trichoderma đã được biết là có hoạt tính đối kháng
chống lại nhiều vi sinh vật, nhiều chủng. Công thức chế phẩm của những
loài này đã được sử dụng để bảo vệ thực vật. Các quần thể Trichoderma có
thể được thiết lập một cách dễ dàng trong các loại đất khác nhau. Những quần
thể này trở nên nhỏ hơn theo thời gian nhưng có thể tiếp tục duy trì ở mức có
thể phát hiện được sau nhiều tuần hoặc thậm chí nhiều tháng. Điều này được
xem như là một ưu điểm đối với BCA bởi vì một trong số những khó khăn
trong việc sử dụng các BCA để chống lại nấm gây hại là khó khăn trong việc
tạo dựng một mật độ quần thể cần thiết ở vị trí đích với việc giảm khả năng
kiểm soát mầm bệnh tương ứng với việc giảm kích thước quần thể BCA.
1.3. CƠ CHẾ ĐỐI KHÁNG VỚI NẤM GÂY BỆNH CÂY TRỒNG CỦA
CÁC TÁC NHÂN VI SINH VẬT TRONG ĐẤU TRANH SINH HỌC
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
9
Lớp 0601

Ở đâu có vi sinh vật tồn tại thì sẽ có những vi sinh vật cạnh tranh, đối
kháng với nó, đó là quy luật cạnh tranh sinh tồn của sinh vật nói chung trong
hệ sinh thái. Vi sinh vật trong đất cũng vậy, bao gồm cả vi sinh vật hữu ích và
vi sinh vật gây bệnh. Ở vùng rễ, vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng nguy hiểm
và đáng quan tâm là nấm gây bệnh. Những vi sinh vật hữu ích trong vùng rễ
là các vi khuẩn kiểm soát sinh học, xạ khuẩn, nấm chúng là hàng rào phòng
thủ đầu tiên chống lại các nấm gây bệnh cho cây trồng. Sự có mặt của các vi
sinh vật đối kháng với nấm bệnh ngăn chặn bệnh và giảm tác động gây bệnh
của nấm với cây trồng [4].
Các vi sinh vật đối kháng với nấm, cho đến nay đã được biết là nhờ các cơ
chế như cạnh tranh dinh dưỡng, tiêu diệt mầm bệnh (các sản phẩm trao đổi
chất của các sinh vật kiểm soát sinh học có tính kháng, có tính độc đối với tế
bào nấm), ký sinh đối với nấm (vi sinh vật sinh ra các emzym có khả năng
phân huỷ thành tế bào nấm bệnh làm nguồn cơ chất và nguồn cacbon cho
mình) và đề kháng cảm ứng của cây trồng với nấm bệnh. Các cơ chế này cho
đến nay vẫn chưa được hiểu một cách đầy đủ, nhưng các nhà khoa học cho
rằng nấm bị tiêu diệt bởi các vi sinh vật đối kháng không chỉ đơn thuần từ
một cơ chế nào đó mà có sự kết hợp bởi các cơ chế nói trên [4, 35].
1.4. ĐẤU TRANH SINH HỌC - CƠ HỘI VÀ THÁCH THỨC
Có nhiều cơ hội và thách thức của việc sử dụng biện pháp đấu tranh
sinh học bao gồm việc phát hiện và sử dụng các vi sinh vật làm tác nhân đấu
tranh sinh vật. Chúng bao gồm các thách thức về khoa học và công nghệ và
các quá trình điều tiết ở các nước khác nhau mà đòi hỏi những xem xét và
kiểm tra trước.
Ở nhiều nước cũng như cộng đồng Châu Âu, các tác nhân sinh học
được xử lý với tầm quan trọng tương đuơng với các thuốc trừ sâu hoặc các
thuốc diệt nấm thương mại. Đánh giá dữ liệu độc học và an toàn sinh học phải
thu được và cung cấp bởi các cơ quan luật pháp dẫn đến một thời gian chờ đợi dài
trước khi được đăng kí, hơn nữa giá thành lại cao để có thể phát triển sản phẩm.

Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
13
Lớp 0601


giới tính khác nhau. Phần lớn các loài Phytophthora gây bệnh phổ biến ở Việt
Nam là dị tản, như P. capsici, P. palmivora, P. nicotianae, P. cinnamomi và
P. colocasiae
Trong điều kiện có đầy đủ nguồn dinh dưỡng, noãn bào tử và bào tử
Chlamydo trong mô rễ sẽ phát triển thành sợi nấm làm cho rễ bị thối rữa và
dẫn đến cây bị hoại sinh. Sau cây khi bị hoại sinh, chúng không còn thức ăn,
lúc này nếu gặp điều kiện thuận lợi về thức ăn chúng sẽ lại phát triển thành
sợi nấm, còn nếu trong điều kiện môi trường có lượng dinh dưỡng thấp chúng
sẽ kết lại trong túi bào tử và sống tự do trong môi trường nước cho đến khi nó
bám được vật chủ là rễ cây và gây hại, nếu không gặp được vật chủ và sống
trong điều kiện nghèo chất dinh dưỡng thì chúng kết thành bào xác, khi gặp
điều kiện thuận lợi về dinh dưỡng thì chúng lại phát triển thành tiểu bào tử.
Nếu được cung cấp thêm chất dinh dưỡng thì chúng phát triển thành sợi nấm,
trong điều kiện hàm lượng dinh dưỡng thấp thì chúng lại sống trôi nổi trong
môi trường nước.
1.5.3 Ký chủ của nấm Phytophthora spp
Nấm Phytophthora spp có kí chủ rất rộng, chúng tấn công trên nhiều
loại cây trồng khác nhau như: cam quýt, sầu riêng, cây dừa, ca cao, bơ, đu đủ,
dứa, xoài… Ngoài ra nấm còn gây hiện tượng thối trái trên cây ổi, nhãn, táo,
cây tiêu, cao su…
1.5.4 Đặc điểm phát sinh và phát triển của nấm Phytophthora spp.
Nấm Phytophthora phát triển mạnh trong khoảng nhiệt độ từ 16 đến

32
o
C, độ ẩm không khí từ 80 đến 95%, nhất là trong mùa mưa,tuy nhiên ở
nhiệt độ dưới 10
O
C hay trên 35
o
C nấm ngừng phát triển.
1.5.5 Nguồn bệnh và lây lan
Nấm Phytophthora ưa thích và cần độ ẩm để sinh sản, phát triển. Vì thế
ở các tỉnh Nam bộ, bệnh thường xuất hiện và gây hại nhiều trong mùa mưa,
nhất là ở những vườn sau khi bị ngập lũ, những vườn trồng dầy, tán lá bít
bùng, không thông thoáng khô ráo. Từ nguồn bệnh ban đầu, khi gặp điều kiện
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
14
Lớp 0601


thích hợp như mưa nhiều thì bào tử vách dày có khả năng sinh sản động bào
tử và chúng có thể bơi lội trong nước tự do đến vị trí rễ và lông hút để gây hại
nhờ 2 lông roi. Từ các vết bệnh ban đầu các sợi nấm sẽ sinh sản rất nhiều bào
tử và lây lan rất nhanh trong điều kiện có gió, mưa hay lũ lụt. Nguồn nước
tưới trong vườn cũng là yếu tố làm cho nấm phát tán, lây lan rất nhanh trong
vườn và trong cùng khu vực.
1.5.6 Sự thiệt hại do nấm Phytophthora spp. gây ra
Thiệt hại do nấm Phytophthora trên cây trồng ở Mỹ làm thất thu hàng
tỷ đô la mỗi năm và nếu tính trên cả thế giới thì còn gấp hơn nhiều lần so với

con số này. Chỉ riêng Bang Ohio của nước Mỹ, nấm Phytophthora gây bệnh
thối rễ trên cây đậu nành làm thiệt hại trên 50 triệu đô la mỗi năm (Mc Blain
và ctv. , 1991a, 1991b). Theo báo cáo của Whiteside về các tác nhân có liên
quan đến việc dịch mục nâu đã được hạn chế trong suốt thời gian từ tháng
chín đến tháng mười năm 1968 và 1969, bị gây ra bởi loài Phytophthora có
khả năng trải rộng cao (>1m) trong cây vòm và tạo ra một số lượng lớn các
các bào tử rất nhanh từ đó làm cho cây ăn quả bị hại. Nguyên nhân của các
bệnh do nấm gây ra ở một số vườn cây ăn quả được xác định là do
P.citrophthora (R.E.Smith & E.H. Smith) Leonian.
Vào năm 1994 và 1995, sự bùng phát dịch Phytophthora spp. cũng
tương tự với P.palmivora (Butler) Butler được báo cáo ở một số khu vực dọc
theo các vùng duyên hải và trung tâm phía nam của Florida [32]. Trong
trường hợp, theo kết quả của Hurricane Gordon thì hàng trăm hecta bị ảnh
hưởng với thiệt hại lên đến 90%. P.palmivora được tìm thấy từ trong đất ở
Florida thuộc hai vùng đông duyên hải, và Phytophthora được báo cáo là một
mầm bệnh ở cam quýt xảy ra trên diện rộng ở những vùng nhiệt đới ẩm. Khi
tiến hành nghiên cứu trong nhà kính và in vitro, Zitko và Timmer đã chứng
minh được rằng P. palmivora tấn công và cạnh tranh gây ra mầm bệnh ở rễ,
thân, và quả ở cam quýt cao hơn so với P. nicotianae
.
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
15
Lớp 0601


Trên cây ca cao nấm Phytophthora spp gây bệnh thối trái làm thất thu
khoảng 1500 triệu bảng Anh hằng năm, khoảng 10-30% sản lượng trên thế

giới (Evans và Prior, 1987). Năm 1994 do ảnh hưởng của lũ lụt nên hầu hêt
diện tích sầu riêng ở Thái Lan đã bị nhiễm nấm Phytophthora spp và bệnh
bộc phát rất nhanh gây thiệt hại nghiêm trọng, có khoảng 40% số cây bị chết
do thối gốc chảy nhựa.
Ở Việt Nam từ năm 1998 đến nay bệnh này đã phát triển và gây hại
nặng ở một số tỉnh phía Nam. Bệnh do Phytophthora spp gây ra là bệnh rất
nguy hiểm trên cây ăn quả, do chúng tấn công và gây hại nghiêm trọng trên
nhiều loại cây trồng từ giai đoạn cây con đến giai đoạn trưởng thành thậm chí
đến giai đoạn sau khi thu hoạch. Trong mùa lũ, phần lớn cây trồng đều bị tổn
thương, nhất là bộ rễ, vì thế nấm bệnh dễ dàng tấn công, đôi khi làm cho vườn
cây chết hàng loạt, hơn cả thiệt hại khi ngập. Như vậy, vấn đề phòng chống
nấm bệnh cây trồng là vô cùng quan trọng và cần thiết.
Biện pháp sử dụng hoá chất diệt nấm bệnh nhanh nhưng để lại nhiều
hậu quả như: làm cho nấm bệnh quen và dẫn đến kháng thuốc, ngoài ra nhiều
loài vi sinh vật có ích trong đất cũng bị tiêu diệt từ đó làm mất cân bằng môi
trường sinh thái vùng rễ. Bên cạnh đó hoá chất còn dư đọng trong đất sẽ ảnh
hưởng đến chất lượng sản phẩm cũng như xâm nhiễm vào thức ăn làm ảnh
hưởng đến sức khoẻ con người.
Vì vậy biện pháp phòng trừ bệnh nấm hại rễ bằng chế phẩm sinh học rất
cần thiết bởi tính bền vững, an toàn với sức khỏe con người, môi trường sinh
thái và hiệu quả kinh tế cao.
1.6. Một số bệnh liên quan do nấm Phytophthora spp. gây ra trên cây có múi
Do giá trị kinh tế cao nên diện tích cây ăn trái ngày càng gia tăng ở
Việt Nam, từ 346.000 ha năm 1995, diện tích cây ăn trái đã gia tăng đến
500.000 ha vào năm 2000. Trong các loại cây ăn trái được trồng phổ biến thì
nhóm cây có múi Citrus (cam, quýt, chanh, bưởi) chiếm một diện tích rất lớn.
Chỉ riêng trong khu vực miền Nam Việt Nam trong năm 2000, diện tích của
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

Trần Thị Nguyệt
16
Lớp 0601


nhóm cây có múi đã chiếm đến 40.000 ha [14]. Tuy nhiên từ 1998 đến nay, bệnh
do Phytophthora trên cây có múi ngày càng phát triển và gây hại nặng [25].
• Bệnh thối gốc, chảy nhựa ở cây có múi
Triệu chứng:
Bệnh thường xuất hiện và tấn công trên các vườn cam quýt trồng trên
nền đất thấp, kém thoát nước nhất là vào mùa mưa. Một số nấm Phytophthora
trong đất thông qua việc nhiễm trên bộ rễ mềm, khi gặp điều kiện nhiệt độ và
độ ẩm cao thích hợp, những nang bào tử sẽ phóng thích bào tử động có hai
roi. Bào tử này thường bị hấp dẫn từ những chất tiết ra từ những rễ non.
Chúng nhiễm vào chóp rễ, nhiễm dần vào vỏ rễ và từ từ sẽ nhiễm toàn bộ.
Triệu chứng lúc đầu là vỏ của thân cây bị sũng nước ở xung quanh gốc sau đó
vỏ cây bị thối có màu nâu hợp thành những vùng bất dạng, kèm theo là ứ
nhựa ra màu nâu đen và có mùi hôi. Bệnh có thể phát triển nhanh vòng quanh
thân, hoặc rễ chính làm cho các lá bị vàng, nhất là gân lá, sau đó lá rụng đi,
bệnh nặng làm lá trên cành rụng gần hết, cành khô chết đi, sau đó trên thân
mọc nhiều nhánh non nhưng chết sớm [14, 16].
Tác nhân gây bệnh
Loài P. nicotianae (P. parasitica) phổ biến trong điều kiện Á Nhiệt đới,
gây bệnh thối gốc, chảy nhựa và thối rễ, nhưng ít gây hại trên phần thân cây.
Loài P. citrophthora gây hiện tượng chảy nhựa thân và thối rễ, loài này
có thể gây hại trên phần thân cây phía trên.
Loài P. palmivora thường gây hại trên phần trên mặt đất của thân.
Ngoài ra, còn một số loài khác như: P. citricola; P. hibernalis; P. Sygingae
• Bệnh vàng và rụng lá (thối rễ, vàng lá chết nhanh)
Triệu chứng:

Bệnh thường gây hại trên quít, cam sành. Trong năm, bệnh thường gây
hại trong mùa mưa lũ hoặc sau khi tưới nước ra hoa. Cây bị bệnh lá vẫn lớn
bình thường nhưng gân lá có màu vàng trắng, phiến lá ngả màu vàng xanh, và
sau đó rụng đi, nhất là khi có gió hoặc khi ta lắc nhẹ cây. Các lá già rụng
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
17
Lớp 0601


trước sau đó dẫn đến các lá trên. Lúc đầu chỉ có một vài nhánh biểu hiện vàng
lá, rụng lá nhưng sau đó toàn cây sẽ rụng lá. Cây có nhiều chồi gắn lá nhỏ,
nhiều hoa, trái, trái chua và cuối cùng cây chết hẳn. Đào rễ lên thấy phía cành
bị rụng lá, rễ bị thối, vỏ rễ tuột khỏi phần gỗ, gỗ bị sọc nâu lan dần vào rễ lớn.
Bệnh nặng thì tất cả các rễ đều bị thối và cây chết [14, 16, 18].
Tác nhân:
Do nấm Fusarium solani, Phytophthora spp., Pythium tấn công vào
chóp rễ và làm thối rễ. Nếu rễ cây bị ngập úng làm rễ suy yếu hoặc do tuyến
trùng chích hút tạo vết thương và từ đó nấm tấn công gây hại làm cây bị bệnh
trầm trọng và chết nhanh hơn. Ngoài ra nấm còn kích thích cây tạo ra ethylen
làm lá vàng nhanh, rụng sớm. Thường vào mùa nắng hoặc do nước siết kích
thích ra hoa làm cho rễ suy yếu và một số rễ ăn sâu xuống để tìm nước hoặc
đến mùa mưa, bón phân cây ra nhiều rễ non, đất thoát nước không kịp, mực
thủy cấp dâng cao, rễ bị ngập úng, ngộp và thiếu oxy, làm rễ suy yếu đồng
thời qua tác đông trung gian của tuyến trùng (vết chích hút) tạo điều kiện
thuận lợi cho nấm tấn công nhanh hơn và bệnh nặng hơn.
• Bệnh lở cổ rễ, chết cây con
Là bệnh rất quan trọng và phổ biến ở hầu hết các vườn ươm cây giống.

Bệnh được gây ra bởi nhiều loại nấm hại trong đất. Điều kiện độ ẩm cao của
đất là yếu tố thích hợp cho bệnh phát triển. Bệnh này xảy ra trên hầu hết các
loại cây ăn trái khác nhau trong vườn ươm.
Triệu chứng của bệnh:
Bệnh có thể xảy ra ở hai giai đoạn:
Giai đoạn trước khi cây mọc mầm, lúc mà các tử diệp của cây chưa nhô
ra khỏi vỏ hạt thì đã bị nấm tấn công.
Giai đoạn sau khi cây mọc mầm, lúc tử diệp xuất hiện sau khi cây được
vài đôi lá. Tuy nhiên phổ biến nhất là cây có đôi lá đầu tiên đến khi cây có đôi
lá thứ 3. Đôi khi cây cũng có thể bị tấn công ở giai đoạn muộn hơn. Ngoài ra,
trong vài tháng sau khi ra ngôi cây cũng có thể bị nhiễm bệnh. Vết bệnh
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
18
Lớp 0601


thường xuất hiện ở phần gốc gần mặt đất. Phần mô bị bệnh ban đầu chuyển
màu hơi sậm hơn sau hóa màu đen và hơi lõm vào làm cho phần vỏ thân dễ
bị tuột ra. Kích thước vết bệnh phát triển rất nhanh khi gặp điều kiện độ ẩm
cao. Khi vết bệnh lan rộng, cây con thường bị ngã rạp, bộ rễ của cây bị thối
đen. Trên líp ươm, bệnh thường xuất hiện thành từng cụm sau đó lan rất
nhanh. Đối với những cây trồng trong bầu, những bầu bị ứ nước thì cây dễ bị
thối toàn bộ rễ của cây, phần vỏ rễ bị lở ra làm cho cây bị héo và chết rất
nhanh [14, 16, 25].
Tác nhân gây ra bệnh:
Bệnh có thể do các loại nấm trong đất gây hại như: Phytophthora,
Fusarium hay Pythium, ngoài ra còn có thể do các nấm Rhizoctonia và

Sclerotium gây ra. Nếu do nấm Sclerotium gây hại thì trên mắt đất gần gốc
cây bệnh có thể nhìn thấy các hạch nấm tròn màu nâu. Trong khi nấm
Rhizoctonia tạo nên các hạch nấm tròn dẹt và bề mặt hạch nấm sần sùi. Đây là
các loại nấm có khả năng lưu tồn trong đất. Chúng phát triển và lây lan mạnh
trong điều kiện đất có độ ẩm cao, những lúc mưa kéo dài, luống ươm hay bầu
đất bị ứ đọng nước, thiếu ánh nắng như ở vườn ươm. Ngoài ra, nếu phần cổ rễ
của cây con (nơi tiếp xúc với đất) bị sây xước mà trong đất có chứa sắn mầm
bệnh thì vi sinh vật gây bệnh sẽ dễ dàng tiếp xúc và xâm nhiễm vào cây hơn.
• Chết cây con
Triệu chứng
Bệnh thường tấn công vào cây con một năm tuổi trở lại, ở thân cây
ngang mặt đất, cây nảy mầm làm cây gãy gục. Cây cũng có thể bị tấn công
muộn hơn (cây cao 5 – 10 cm), làm vỏ thân ngang mặt đất bị hư và cây bị
chết nhưng cây vẫn còn đứng không ngã rạp như lúc nhỏ [14, 16].
Tác nhân
Do nấm Phytophthora palmivora; Fusarium spp; Rhizoctonia solani;
Sclerotium rolfsii
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
19
Lớp 0601


Ở mặt đất, nơi gốc cây bệnh có thể quan sát thấy hạch nấm, nếu hạch
nấm nhỏ màu vàng nâu đến nâu và bóng láng thì đó là nấm S. rolfsii, nếu hạch
nấm to, sần sùi, hơi dẹt là nấm R. solani, nếu ở gốc cây có tơ nấm trắng dày
đặc là Fusarium spp, nếu chỉ thấy tơ nấm rất ít vào sáng sớm như mạng nhện
là do P. palmivora.

Bệnh còn tấn công trên cây ghép trong vườn ươm, khi có độ ẩm không
khí cao bệnh gây hại trên tất cả các giai đoạn phát triển của lá, vết bệnh xuất
hiện ở bất cứ vị trí nào trên lá, lúc đầu vết bệnh tròn nhỏ, có màu xanh đậm,
nhũn nước, sau đó vết bệnh lan dần nhưng vẫn giữ hình tròn, đôi khi bất dạng,
có màu xám nâu, đôi khi nâu đen làm rụng lá. Nếu độ ẩm cao, tơ nấm màu
trắng bám trên vết bệnh vào buổi sáng hoặc trong bóng râm. Bệnh còn gây hại
trên đọt non, làm thối đen đọt và chết, đôi khi bệnh tấn công vào mắt tháp,
làm toàn bộ cành tháp héo đột ngột và chết rất nhanh.
• Bệnh thối nhũn trái
Bệnh gây hại trong mùa mưa lũ, có độ ẩm cao, hoặc vườn bị ngập trong
mùa lũ. Bệnh gây hại trên trái già và những trái trong, tán cây, gây hại nặng
trên quýt đường, cam mật. Bệnh làm cho trái bị mất màu từ rốn trái lan dần lên
trên, lúc đầu vết bệnh như bị úng nước, sau đó có màu xám đen. Vào sáng sớm
hoặc những ngày có độ ẩm cao và trời âm u, phần trái bị bệnh có phần tơ màu
trắng phủ trên vết bệnh. Khi vết bệnh lan chiếm 1/3 đến 1/2 diện tích, trái sẽ
rụng.
.CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU
2.1.1. Vi sinh vật
- Các chủng vi sinh vật phân lập từ các mẫu đất, nước biển ở Nha
Trang, Qui Nhơn, Bình Dương, Daclak, KonTum, Khu hệ sinh thái Cần Giờ.
- Bộ vi khuẩn kiểm định: Shigella flexneri, P. enteridis, Pseudomonas
aeruginosa, Bacillus subtilis, Sarcina lutea, Klebsiella sp, E. coli, Candida
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
20
Lớp 0601

albicans, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Salmonella typhi. . . do
Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật - Trung tâm Công nghệ Sinh học- Đại học
Quốc gia Hà Nội cung cấp.
- Các loại nấm, vi khuẩn gây bệnh thực vật: Phytophthora spp,
Fusarium moniliform, Fusarium oxysporum.
2.1.2. Hoá chất
Hóa chất: Các hóa chất làm môi trường: pepton, tinh bột tan, thạch, cao
men, các loại đường chuẩn: glucoza, fructoza, inositol, mannitol, arabinoza,
raffinoza
Các loại dung môi: n- butanol, etanol, ethyl acetate, iso propanol,
methanol, aceton (Trung quốc).
Các hóa chất dùng trong phân loại và nghiên cứu: agaroza, Tris-HCl,
EDTA, SDS, isoamyl alcohol, ethilium bromide, Tris-HCl, EDTA, SDS
(Merck).
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ
Cân điện 0,001 (Thụy Điển), kính hiển vi quang học OLYMPUS (Nhật
Bản), máy lắc ổn nhiệt (Nhật), nồi lên men (Nhật), máy đo pH (Mỹ), máy li
tâm, máy đo OD, máy GeneAmp PCR System, máy đọc trình tự ABI PRISM
3100 Avant Genetic Analyzer (Mỹ), máy ly tâm lạnh (Sigma, Đức), máy soi
gel (Mỹ); máy đo quang phổ UV3000, máy chạy điện di.
2.1.4. Môi trường
• Môi trường khoai tây (PDA) (g/L):

Khoai tây miếng: 200g
Đường gluco: 20g
Thạch : 16g
Nước : 1 lit
• Môi trường Czapeck:

Đường saccaroza : 20g
NaNO
3
: 2g
KH
2
PO
4.
: 1g
KCl : O,5g
FeSO
4
: 0,01g
Thạch : 16g
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
21
Lớp 0601


MgSO
4
.7H
2
O : 0,5g Nước : 1lit
• Môi trường Khoai tây – Cà rốt (PCA)
Khoai tây : 200g
Cà rốt : 100g

Đường gluco: 20g
Thạch : 16g
Nước : 1l

• Môi trường ISP
4
• Môi trường Gause I:
Tinh bột tan: 20g
K
2
HP0
4
: 0,5g
MgSO
4
.7H
2
O: 0,5g
NaCl: 0,5g
(NH
4
)
2
SO
4
: 2g
KNO
3
: 0,5g
FeSO

4
: 0,01g
Thạch: 16g
Nước: 1lit
pH: 7
• Môi trường A4
Glucoza; 10g
Bột đậu tương: 10g
NaCl: 5g
CaCO
3
: 1g
Nước: 1lit
pH 7
• Môi trường A4H:
Glucoza; 15g
Bột đậu tương: 15g
NaCl: 5g
CaCO
3
: 1g
Nước: 1lit
pH 7

Tinh bột tan : 10g
K
2
HP0
4
: 1g

MgSO
4
.7H
2
O: 1g
NaCl : 1g
(NH
4
)
2
SO
4
: 2g
CaCO
3
: 2g
Dịch khoáng: 1ml
Thạch : 16g
Nước : 1lit
pH : 7
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
22
Lớp 0601


2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi sinh vật

2.2.1.1. Phân lập vi sinh vật
Cân 10 g mẫu đất cho vào bình tam giác dung tích 250 ml chứa 90 ml
nước vô trùng, lắc đều 30 phút trên máy lắc. Pha loãng mẫu với nồng độ giảm
dần theo cơ số 10. Hút 0,05 ml dịch đã pha loãng ở từ 10
3
-10
6
cấy gạt đều trên
môi trường khoai tây, ISP4 ở 37
o
C. Sau 3-5 ngày cấy xạ khuẩn, nấm đã mọc
dùng môi trường thạch ISP4, Czapeck để giữ giống. Đối với các chủng vi
khuẩn, phân lập trên môi trường thạch thường, ủ ở 30
0
C trong 48 giờ.
2.2.1.2 Bảo quản giống
Các chủng vi sinh vật đã lựa chọn được cấy trên môi trường thạch
nghiêng ở các điều kiện thích hợp, sau đó các ống giống được bảo quản trong
tủ lạnh ở 4-6
o
C, sau 2-3 tháng cấy chuyền lại một lần.
2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzym và hoạt tính kháng sinh
* Phương pháp đặt thỏi thạch
Vi sinh vật được nuôi trong môi trường ở nhiệt độ thích hợp trong các
đĩa petri. Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào môi trường đã
cấy VSV kiểm định. Để trong tủ lạnh từ 4-8 giờ cho CKS khuếch tán vào môi
trường, rồi đặt vào tủ ấm (30
o
C). Đọc kết quả sau một ngày đối với vi sinh vật
kiểm định là vi khuẩn, 3 ngày đối với nấm.

Hoạt tính enzym/hoạt tính kháng sinh (HTE/HTKS) xác định theo công thức:
HTE/HTKS = D – d (mm).
D: Đường kính vòng phân giải/vòng vô khuẩn + đường kính thỏi thạch.
d: Đường kính thỏi thạch.
* Phương pháp nhỏ dịch
Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy vi sinh
vật kiểm định trong đĩa petri, nhỏ dịch lọc sau nuôi cấy. Các bước tiếp theo
tiến hành như phương pháp thỏi thạch.
2.2.2. Đặc điểm hình thái
a. Quan sát hình dạng cuống sinh bào tử:
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
23
Lớp 0601


Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP4 cắm lamen nghiêng. Sau 6-7
ngày lấy lamen ra quan sát hình dạng cuống sinh bào tử và đếm số lượng bào
tử trên kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay lượn
sóng kí hiệu là RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn
toàn kí hiệu là RA (Ratinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira).
b. Bề mặt bào tử
Quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử
Bào tử có dạng: tròn, ovan, elip, hình que.
Bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng: nhẵn kí hiệu là Sm (Smooth), dạng
mụn cóc Wa (Warty), dạng gai Sp (Spiny) và dạng tóc là Ha (Hairy).
2.2.3 Phân loại theo sinh học phân tử
 Phương pháp tách ADN vi khuẩn, nấm

Vi khuẩn
- Lấy 2 vòng que cấy vi khuẩn hoà vào 200 µl TE trong ống Eppendoff
- Thêm lyzozym vào, trộn đều, sau đó ủ ở 37
o
C trong 30 phút
- Thêm 100 µl SDS 10%, ủ ở 37
o
C trong 30 phút
- Thêm 300 µl PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol) vào, trộn đều trong đá
lạnh, sau đó ly tâm với vận tốc 15.000 vòng/phút, sau ly tâm, lấy dịch trên.
(Bước này được lặp lại 2 lần)
- Dùng etanol lạnh với thể tích gấp 2 lần thể tích mẫu để tủa ADN.
- Rửa tủa bằng etanol 70%.
- Làm khô ADN bằng máy làm khô chân không.
- Thêm 30-50 µl nước, bảo quản để dùng dần.
Nấm
- Lấy sinh khối nấm cho vào 100µl đệm phá tế bào (100mM Tris- HCl;
30mM EDTA và 0,5 % SDS (pH8)
- Trộn đều sau đó đun ở 100
0
C trong vòng 15 phút
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
24
Lớp 0601


- Thêm 100 µl axetat kali, trộn đều và đặt trên đá 1giờ, ly tâm lạnh 4

0
C ở
15.000 vòng/ phút trong 5 phút, lấy phần nổi phía trên.
- Thêm 200 µl CHCl
3
-Izoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000v/phút trong 2
phút. (Bước này được lặp lại 2 lần)
- Thêm 200 µl 2-propanol (Izo-propanol) và đặt trong tủ đá 20 phút. Ly tâm
15.000v/ph trong 15 phút và lấy kết tủa.
- Rửa sạch kết tủa bằng etanol 70%. Ly tâm 15.000 v/ph trong vòng 10 phút
và lấy tủa.
- Làm khô thiết bị ly tâm trong 10 phút. Hòa tan tủa trong TE (30-50 µl), giữ
trong tủ lạnh 4
0
C trong 1 ngày. Giữ ở -20
0
C trước khi sử dụng.
 Điện di trên gel agaroza
- Đây là kỹ thuật quan trọng vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn
axit nucleic hiển thị trực tiếp. Phương pháp này dựa trên một đặc tính của axit
nucleic là ở pH trung tính mang điện tích âm nhờ các nhóm photphat nằm trên
khung photphodieste của các sợi axit nucleic. Điều đó có nghĩa là các phân tử
sẽ chạy về cực dương khi đặt trong điện trường. Kỹ thuật này được tiến hành
trên một đệm gel có tác dụng phân tách các axit nucleic theo kích thước.
- Tiến hành: Đun tan 1% agaroza trong dung dịch đệm TAE 1x đổ vào
khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml
dung dịch 1X TAE. Trộn đều 2µl dung dịch loading buffer 6x với 5µl mẫu,
nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V,
cường độ dòng điện 80mA trong 30 phút, bỏ ra ngâm trong dung dịch EtBr
(nồng độ 0,5 µl/ml) 20 phút vớt ra. Quan sát vạch ADN trên máy soi gel.

 Phản ứng khuếch đại ADN
Vi khuẩn Nấm
Thành phần Thể tích (%) Thành phần Thể tích
10 X buffer 10 10 X buffer 10
dNTP 1,25 mM 16 dNTP 1,25 mM 16
Mồi xuôi
1 (10 pmol/µl)
Mồi xuôi
1 (10 pmol/µl)
Mồi ngược
1 (10 pmol/µl)
Mồi ngược
1 (10 pmol/µl)
Khóa luận tốt nghiệp Chuyên ngành Công nghệ Sinh học


Trần Thị Nguyệt
25
Lớp 0601


Taq polymeraza 1,2
Takara Ex Taq
Tm
(5 unit/ µl)
0,5
Mẫu 2 Mẫu 0,5
Nước đủ 100 Nước đủ 100
Mồi cho phản ứng PCR
 Vi khuẩn

Mồi xuôi: 5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3' tương ứng với vị trí
nucleotit 27 đến 47
Mồi ngược: 5'- AAAGGAGGTGATCCAGCC -3' tương ứng với vị trí
nucleotit 1525 đến 1507
 Nấm
Mồi xuôi 18F: 5'- CACCAGGTTGATTCTGCC-3'
Mồi ngược 18R: 5′-GTGCACGGTCTACGAGACCTC-3′
- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR







Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di: Tiến hành tương tự như
đối với điện di genom.
 Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự
Sử dụng bộ kít Cycle sequencing với hỗn hợp phản ứng như sau:
Terminator Ready Reaction Mix
8 µl
Mồi
1 µl
Mẫu
1µl
Nước cất
đủ đến 20µl

- Chu trình nhiệt
Bước tiến hành Nhiệt độ (

o
C) Thời gian
1 96 1 phút
Bước tiến hành Nhiệt độ (
0
C) Thời gian
1 94 1 phút
2 lặp lại 30 lần chu kỳ sau
94 30 giây
55 45 giây
72 2 phút 30 giây
3 72 7 phút
4 4 -