nghiên cứu xây dựng qui trình nhân nhanh in vitro giống lan hồ điệp nhập nội (phalaenopsis)

Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 1

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển trong đời sống vật chất, đời sống tinh thần và
nhu cầu thưởng thức cái đẹp của con người cũng không ngừng tăng lên.
Trong cuộc sống, hoa là một trong những vẻ đẹp đến từ thiên nhiên mà con
người dễ dàng thưởng thức nhất, luôn là tâm điểm của mọi sự chú ý, nhất là
vào những dịp lễ Tết và các hoạt động văn hoá. Ngày nay, việc trồng hoa
không chỉ mang ý nghĩa xã hội mà còn mang ý nghĩa lớn về mặt kinh tế, nhất
là xuất khẩu. Vì vậy ngành sản xuất hoa đã và đang đóng vai trò quan trọng
trong các ngành sản xuất nông nghiệp nói riêng và trong nền kinh tế nói
chung. Hoa mang lại lợi nhuận lớn cho những người tham gia sản xuất và
kinh doanh. Hoa góp phần mang lại vẻ đẹp cho cảnh quan, hệ sinh thái và môi
trường sống của con người.
Trong vườn hoa muôn màu muôn vẻ của thế giới tự nhiên, có lẽ hiếm
có loài hoa nào lại phong phú, tập hợp trong mình nhiều họ, nhiều chủng loại,
màu sắc, dáng nét và giàu sức quyến rũ, mê hoặc con người một cách kỳ lạ
cho bằng hoa Lan. Hoa Lan không chỉ mang vẻ đẹp đài các, sang trọng nhưng
ấm áp, gần gũi mà nó còn chất chứa trong mình những giá trị tiềm ẩn, luôn
mới lạ, luôn hấp dẫn và mời gọi lòng say mê, khám phá của những ai trót
nặng lòng với loài hoa vương giả này. Trong số những loài hoa Lan được nuôi
trồng chủ yếu ở nước ta, bên cạnh những loại hoa tương đối dễ chăm sóc như
Mokara, Dendro, Lan vũ nữ… thì vẫn có những loài hoa Lan chỉ thích hợp
với một số khu vực địa lý nhất định mà cụ thể nhất là địa Lan, loài hoa chỉ có
thể nuôi trồng trong điều kiện lí tưởng của Đà Lạt… Không quá kén chọn và
hạn chế nơi trồng như địa Lan song Lan Hồ điệp cũng là một trong những
giống Lan quý mà qui trình chăm sóc, thuần dưỡng cũng đòi hỏi lắm công
phu, tâm huyết của người trồng.

Lan Hồ Điệp là một loài Lan rất khó nhân giống, thường cho hệ số
nhân thấp trong điều kiện vườn ươm. Để có được số lượng lớn cây giống,
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 2

đồng đều, ổn định về mặt di truyền đáp ứng nhu cầu thị trường thật nan giải.
Trong những năm gần đây, công nghệ lai giống kết hợp gieo hạt trong ống
nghiệm cho tỷ lệ nẩy mầm cao, chất lượng cây con tương đối ổn định. Tuy
nhiên nhân giống bằng phương pháp gieo hạt mang tính ngẫu nhiên không
đảm bảo thu được cây có tính trạng như mong muốn.
Do đó, việc nâng cao chất lượng giống và nhân giống chủ động bằng
cách áp dụng công nghệ sinh học mới trong sản xuất đang là vấn đề quan
trọng cho phát triển ngành sản xuất hoa Lan ở nước ta. Từ thực tế trên, chúng
tôi đã tiến hành thực hiện đề tài :
“ Nghiên cứu xây dựng qui trình nhân nhanh in vitro giống Lan Hồ
Điệp nhập nội (Phalaenopsis)”
Với mục tiêu cụ thể là: Nghiên cứu quy trình nhân giống bằng phương pháp
in vitro nhằm cung cấp nhanh giống đã được tuyển chọn cho sản xuất, đồng
thời chủ động khâu giống cây vốn lâu nay phụ thuộc nguồn ngoại nhập.
- Xây dựng qui trình kỹ thuật nhân giống Lan Hồ Điệp bằng in vitro.
- Duy trì và nhân nhanh giống Lan Hồ Điệp để cung cấp giống tốt,
khoẻ, sạch bệnh, cho sản xuất.


Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 3

PHẦN 2. TỔNG QUAN

2.1. Giá trị kinh tế của hoa Lan
2.1.1. Trên thế giới
Hoa Lan là một loài hoa rất đa dạng về kích thước, hình dáng, màu sắc,
cấu trúc, số lượng và hương thơm. Trong số các loại hoa thương phẩm lớn
hiện nay, hoa Lan là một loài có triển vọng kinh tế hết sức cao. Ngay từ năm
1957, James Shoemaker đã cho rằng “Nuôi trồng Lan sẽ không chỉ là một sở
thích mà còn hướng tới trở thành một ngành công nghiệp”. Và quả vậy, ngành
trồng Lan đang ngày càng phát triển mạnh mẽ.
Từ thời xưa cho đến nay, hoa Lan luôn được con người ngưỡng mộ và
được xem như là nữ hoàng của các loài hoa, loài hoa vương giả hay vua của
những loài cỏ cây có hoa. Do có vẻ đẹp rực rỡ, quý phái, ngào ngạt hương
thơm, thanh nhã cao sang và trước đây hoa Lan được xem là loài quý hiếm,
nên thời gian trước thú chơi hoa Lan thường chỉ dành cho giới vua chúa,
thượng lưu. Ngày nay, thú chơi hoa Lan đã được nâng lên thành nghệ thuật,
nghề trồng Lan đã được phát triển thành ngành công nghiệp có lợi nhuận cao
ở một số nước như Thái Lan, Đài Loan,… Hơn nữa, nhờ quá trình sưu tầm
các loài hoa Lan đẹp, lạ mắt và các kỹ thuật lai tạo ra các hoa Lan mới tuyệt
đẹp, nên số loài hoa Lan hiện nay trên thế giới có thể đã lên đến 100000 loài.
Vì thế trong thời gian gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam ta, thú chơi
hoa Lan đã trở thành thông dụng và có điều kiện hơn, không phân biệt địa vị,
tuổi tác, hoàn cảnh kinh tế nữa, số người chơi và yêu chuộng hoa Lan ngày
càng tăng nhanh, hay nói cách khác nhu cầu sử dụng các chủng loại hoa Lan
đã và đang tăng. Hoa Lan hiện đang được trồng và kinh doanh với 03 kiểu
dáng phổ biến trên thị trường: hoa cắt cành, cây đã thành thục trong chậu treo
hay bám trên giá thể và cây Lan con từ 10-15cm
(
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 4

Khu vực Đông Nam Á ngày nay hoa kiểng cũng phát triển rất mạnh;
Singapore năm 1991 xuất khẩu đạt 13 triệu USD, nay đã đạt trên 20 triệu
USD; Thái Lan năm 1991 đạt 80 triệu USD thì nay đã đưa doanh số xuất khẩu
lên 200 triệu USD/năm. Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu về Lan, Thái
Lan có hơn 1.000 giống hoa Lan, thậm chí Lan đã trở thành biểu tượng của
vương quốc. Tại Malaysia, chính phủ đã quy hoạch 300 ha ở bang Zohor và
giao cho Hiệp hội hoa Lan tổ chức ở đây thành khu Trung tâm sản xuất Hoa
kiểng xuất khẩu. Ngành trồng hoa của Đài Loan cũng đang tăng nhanh tốc độ
15 – 20%. Hiện nay, Đài Loan đã có diện tích trồng hoa là 10.172ha, đạt
doanh thu hàng năm 293 triệu USD
( />news_id=1847)
2.1.2. Ở Việt Nam
Theo các chuyên gia về hoa của trường Đại học Nông nghiệp 1, với
khoảng 755 loài hoa Lan hiện có, khí hậu thích hợp và nhiều nguyên liệu làm
giá thể tốt cho cây sinh trưởng, Việt Nam có thể trở thành một nước sản xuất
hoa Lan lớn trong khu vực. Tuy nhiên hàng năm Việt Nam ta vẫn phải nhập
một lượng lớn cây giống và cả lan cắt cành từ Thái Lan về để phục vụ nhu
cầu trong nước.
Hiện nay, mới chỉ có một số công ty lớn, trong đó có những công ty
nước ngoài trồng hoa Lan tại Đà Lạt, TP Hồ Chí Minh, Đồng Nai với diện
tích khoảng 50-60 ha/một doanh nghiệp. Một vài địa phương khác hoa Lan
chỉ mới trồng ở quy mô gia đình, trên diện tích từ vài m
2
đến vài nghìn m
2
, cá
biệt mới có vài hộ trồng trên 1-2 ha. Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam
bước đầu cũng đã có những thành công trong việc nuôi cấy mô tạo giống
phong lan theo công nghệ được chuyển giao từ Thái Lan. Một số địa phương

Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 5

khác như Sa Pa, Phú Yên bước đầu đã khảo sát và nghiên cứu phương pháp
nhân giống, hoàn thiện quy trình sản xuất hoa Lan.
Theo tính toán của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, nếu trồng
hoa Lan cắt cành là loài Dendrobium và Mokara, mỗi ha đất trồng có thể cho
thu nhập 500 triệu đến 1 tỷ đồng/năm, cao hơn nhiều lần so với trồng lúa và
một số hoa màu khác. Hiện nay, mỗi năm Việt Nam vẫn phải chi hàng tỷ
đồng để nhập hoa Lan từ các nước láng giềng cho nhu cầu nội địa. Chỉ tính
riêng tại thành phố Hồ Chí Minh, năm 2003 doanh số kinh doanh hoa Lan và
cây cảnh mới đạt 200 - 300 tỷ đồng, nhưng chỉ trong quý I năm 2006, doanh
số này đã đạt 400 tỷ đồng; các cơ sở kinh doanh hoa Lan, cây cảnh tăng
nhanh từ 264 cơ sở năm 2003 lên trên 1.000 cơ sở. Riêng hoa Lan mỗi năm ở
thành phố này lượng tiêu thụ cũng đã lên đến hàng triệu cây

(
2.1.3. Tầm quan trọng đối với việc duy trì và bảo vệ nguồn giống
Khí hậu ở Việt Nam nóng ẩm rất phù hợp với sự sinh trưởng và phát
triển của các loài lan. Theo giáo sư Phạm Hoàng Hộ, hoa Lan Việt Nam rất đa
dạng và phong phú với số lượng lên tới 755 loài (Phạm Hoàng Hộ, 2000).
Theo nguồn tài liệu ngiên cứu mới nhất về hoa Lan ở Việt Nam năm 2003, đã
biết được 897 loài thuộc 152 chi của họ Lan (Trần Duy Quý, 2005).
Hoa Lan là một loại cây cảnh rất được ưa chuộng trên thị trường. Tuy
nhiên, do các mục đích kinh tế, con người đã không quan tâm tới sự bảo tồn
thiên nhiên nói chung cũng như bảo vệ các nguồn giống quý nói riêng. Lan
được khai thác từ rừng và vận chuyển tới các thành phố lớn trong nước và
nước ngoài, đặc biết những giống đặc hữu và quý hiếm. Nguồn tài nguyên
này đang ngày càng cạn kiệt () mà không có cách gì

bù đắp.
Hiện nay, ở nước ta nuôi cấy mô tế bào đã được ứng dụng rộng rãi
trong việc nhân nhanh nhiều giống cây cảnh, cây lâm nghiệp, cây lương thực
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 6

thực phẩm… và đã thu được những thành công nhất định. Không chỉ vậy,
nuôi cấy mô tế bào cũng được áp dụng trong việc bảo tồn nguồn gen của các
giống cây quý.
Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu và ứng dụng so với yêu cầu thực tiễn
còn một khoảng cách khá lớn và đòi hỏi sự nỗ lực và quyết tâm của các nhà
khoa học cũng như các chuyên gia kinh tế trong lĩnh vực này.

2.2. Giới thiệu về giống lan Hồ Điệp Phalanopsis
2.2.1. Giới thiệu chung về họ Lan
Về phân loại học, họ Lan Orchidaceae là họ lớn nhất trong giới thực vật
một lá mầm, với khoảng 800 chi và 25000-35000 loài (Arrditti, 1979; Garay,
1960). Đặc tính khác thường về khả năng thụ phấn và lai xa tự nhiên của họ
thực vật này đã khiến chúng trở nên phong phú về loài và phân bố rộng rãi.
Bên cạnh đó, người ta tiến hành lai tạo và đạt được nhiều thành công càng
làm tăng nhanh số giống mới. Hiện nay có hơn 9000 giống Lan lai mới đã
được đăng ký bản quyền tại Royal Horticulture Society, Anh (Phạm Hoàng
Hộ, 2000).
Cây Lan thường sống ở những nơi hoang dã, tại các địa hình rất khác
nhau với các điều kiện môi trường đa dạng. Chính cấu trúc đặc biệt của Lan
đã tạo cho chúng khả năng thích nghi phong phú trong các môi trường hoàn
toàn trái ngược.

2.2.2. Giới thiệu về giống Lan Hồ Điệp Phalanopsis

2.2.2.1. Tên và nguồn gốc
Lan Hồ Điệp có tên khoa học là Phalaenopsis là loài có hoa lớn, bền,
đẹp. Có tên từ chữ grec Phalaina nghĩa là bướm và opsis có nghĩa là sự giống
nhau. Lan Hồ Điệp là loài Lan có hoa giống bươm bướm phất phơ rất đẹp.
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 7

Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius
đặt tên là Angraecum album. Năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum.
Năm 1825 nhà thực vật Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis.


Chi Phalaenopsis
Họ Orchidendrodeae
Bộ Asparagales
Lớp Liliopsida
Ngành Magnoliophyta
Giới Thực vật



Hình 2.1. Phalaenopsis amabilis
Lan Hồ Điệp phân bố chủ yếu ở: Malaysia, Indonexia, Philipin, phía
đông Ấn Độ và Úc. Ở Việt nam cũng có một số loài vì có hoa nhỏ nên được
gọi là tiểu Hồ Điệp (phalaenopsis manni, gibbosa, lobbi, fuscata, cornucervi).
Lan Hồ Điệp có thể mọc ở khí hậu nhiệt đới và đồi núi cao 2000m nên vừa
chịu được khí nóng ẩm vừa chịu được khí hậu mát.
Lan Hồ Điệp có chừng 44 loại nguyên giống, cây có thể mọc ở xứ nhiệt
đới và đồi núi cao 2000 mét nên vừa chịu khí hậu nóng ẩm lại vừa chịu khí

hậu mát, nhiệt độ trung bình từ 20
0
C đến 30
0
C. Việt Nam có chừng 7-8 giống.
Vào năm 1750 G.E. Rumphius đã tìm ra cây Lan Hồ Điệp nhưng lầm tưởng là
một loại Angraecum và sau này Carl Blume mới tìm ra cây Phalaenopsis
amabilis vào năm 1825. Lan Hồ điệp là một loại Lan thân đơn, ngắn, lá to và
cứng, rễ dài. Những cây nguyên giống thường nở hoa vào mùa đông xuân, các
cây lai giống hoa nở quanh năm. Nếu nuôi đúng cách Lan Hồ điệp có thể sống
rất lâu.

Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 8

2.2.2.2. Đặc điểm
Lan Hồ Điệp là loài Lan đơn thân, mập, ngắn lá to, dày mọc sát vào
nhau. Đây là giống gồm các loài có hoa lớn, đẹp. Phát hoa mọc từ nách lá,
dài, đơn hay phân nhánh, cánh hoa phẳng, trải rộng, hoa nở từng cái, 3 đài to
tròn, 2 cánh xòa rộng kín. Môi cong, dẹp có 2 râu dài. Trụ có hình bán nguyệt
với 2 phần khối u nên chứa đầy phấn hoa. Ngày nay, Lan Hồ Điệp được lai
tạo với nhiều màu sắc và kích thướt đa dạng: trắng, tím, đỏ, vàng, hồng.

Hình 2.2. Một số loài Lan Hồ Điệp
Cách trồng
- Nhiệt độ: Lan Hồ Điệp là một loại Lan không chịu được quá nóng hay
quá lạnh, lại không cần nhiều ánh sáng cho nên thích hợp trồng trong nhà hay
trong nhà kính. Nhiệt độ thích hợp nhất là từ 22 – 27
0
C. Khi cây đang ra nụ,
nhiệt độ hay độ ẩm thay đổi bất thường sẽ làm cho nụ hoa héo rụng.
- Ánh sáng: Trong nhà kính phải dùng lưới che bớt ánh sáng vì hoa Lan
chỉ cần từ 1000 cho đến 1500 ánh nến. Nuôi trong nhà, cần để lan ở gần cửa
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 9

sổ có ánh nắng hoặc không cũng được. Có thể dùng 4 chiếc đèn ống 40W và
2 bóng đèn thường, cách ngọn cây Lan khoảng 6-10" từ 12-16 giờ mỗi ngày:
12 giờ cho cây lớn và 16 giờ cho cây nhỏ.
- Tưới nước: Không bao giờ để Lan quá khô, mùa hè nên tưới thật đẫm
2 lần một tuần. Mùa đông 10 ngày tưới một lần. Nên tưới vào buổi sáng để lá
cây sẽ khô trước khi đêm xuống. Nếu để nước đọng vào ngọn, lá non dễ bị
thối và cây sẽ chết.
- Độ ẩm: Hoa Lan cần độ ẩm từ 50-80%. Để chậu Lan trên khay nước
có xếp đá sỏi cho có đủ độ ẩm cần thiết.

- Phân bón: Khi cây đang mọc bón phân 30-10-10 mỗi tuần một lần, chỉ
nên bón 1/4 hay ½ thìa cà phê gạt cho 1 gallon nước. Khi cây sắp ra nụ bón
phân 10-30-20 hoặc dùng một thứ 15-15-15. Mùa đông bớt bón phân 2 tuần 1
lần, khi cây không mọc nên ngưng bón.
- Thay chậu: Thời gian thay chậu tốt nhất là vào muà xuân hay khi hoa
vừa tàn, tối thiểu 3 năm một lần. Nếu vỏ cây bị mục nát sẽ làm thối rễ. Vỏ cây
nuôi Lan Hồ điệp cần phải thoáng và dóc nước, thông thường dùng vỏ cây cỡ
½" trộn với 1/10 perlite hoặc vỏ cây cở 1/8-1/4" và perlite cho những cây lan
còn nhỏ. Khi trồng lại, cắt bỏ các rễ thối, giữ cho cuống rễ gần ngang miệng
chậu rồi bỏ vỏ cây vào. Dùng ngón tay ấn quanh miệng chậu cho chặt. Tưới
bằng 1 thìa súp B1 pha với 1 gallon nước.
Khi hoa tàn, cắt bỏ dò hoa chừa lại 3 đốt cuối, cây Lan sẽ tiếp tục ra
hoa. Nếu cây không được khỏe, lá mềm rũ xuống nên cắt bỏ hẳn dò hoa để
cho cây được mạnh. Đôi khi Lan cũng mọc cây con (keiki) ở gốc hoặc trên
các đốt trên dò hoa, trường hợp này đợi cây non ra rễ sẽ tách ra trồng lại. Có
những loại thuốc có chất hormone để tạo ra những cây con ở các đốt hoa.
Thuốc này có bán tại các nhà trồng Lan.
Những cây lai giống từ các cây kể trên phần đông đều có hương thơm
di truyền từ cây cha hoặc cây mẹ.

Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 16

+ Sử dụng KOH, NaOH và HCl để điều chỉnh pH
+ Trong quá trình nuôi cấy pH giảm dần làm môi trường chua hoá
c. Các bước nuôi cấy mô
- Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị
Chuẩn bị cây mẹ: chăm sóc phòng trừ bệnh, nếu cần thiết cách ly, bao
bọc toàn cây hay bộ phận cần thiết để chống nhiễm các vi khuẩn, nấm và

virus.
- Giai đoạn 2: Giai đoạn nuôi khởi động
Tạo mẫu vô trùng trong ống nghiệm. Đây là giai đoạn cực kì quan
trọng trong quy trình nuôi nhân giống nào, yêu cầu tạo được mẫu vô trùng và
phát triển trong ống nghiệm. Chọn loại mô thích hợp để đưa vào ống nghiệm
là mô trẻ, mô dễ tái sinh, ưu tiên mẫu không cần qua khử trùng hoặc dễ khử
trùng như đỉnh sinh trưởng.
Khử trùng mẫu thường dùng các chất như cồn H
2
O
2
, HgCl
2
… Yêu cầu
làm tiệt trùng mẫu mà không làm tổn hại đến mẫu, duy trì được khả năng tái
sinh của mẫu.
Trình tự khử trùng:
Dùng cồn 70 độ khử trùng lớp sáp bên ngoài. Chú ý chọn nồng độ thích
hợp và thời gian khử trùng phù hợp.
Sau khi khử trùng loại bỏ chất khử trùng bằng tráng nước vô trùng
nhiều lần, cắt bỏ phần mô tiếp xúc với chất khử trùng. Sau đó cấy vào môi
trường.
- Giai đoạn 3: Nhân nhanh
Có ý nghĩa quyết định đến hiệu quả của toàn bộ quy trình. Các yếu tố
ảnh hưởng đến quá trình như: Loại môi trường, các chất điều hoà sinh trưởng,
vi lượng, nồng độ, tương tác giữa các chất, các muối khoáng đa lượng, vi
lượng, các vitamin, phụ gia hữu cơ, chế độ chiếu sáng, nhiệt độ, chế độ cấy
chuyển,…
- Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học

Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 17

+ Kéo dài thân: Nếu thân chưa đủ dài thì phải kéo dài thân. Môi trường
giảm cytokinin, tăng hoặc giữ nguyên auxin.
+ Ra rễ cho cây: Loại bỏ cytokinin, bổ sung auxin vào môi trường hoặc
chuyển sang môi trường không có chất điều hoà sinh trưởng.
- Giai đoạn 5: Đưa cây ra ngoài ống nghiệm
Chuẩn bị cây trước khi đưa ra ngoài ống nghiệm: giảm độ ẩm bằng
cách mở nút, hay bằng nút giấy. Tăng nhiệt độ, tăng cường độ ánh sáng.
Chuẩn bị điều kiện để đưa cây ra: giá thể - khử trùng, tơi xốp, thoát
nước, giữ độ ẩm cần thiết, cung cấp thêm chất dinh dưỡng (Phạm Hoàng Hộ,
2000).
+ Các nghiên cứu về NCM hoa Lan
Hoa Lan là một trong những loại cây trồng thành công nhất trong nhân
giống vô tính bằng phương pháp NCM ở mức độ thương mại. NCM đã được
thí nghiệm từ thế kỷ 17 nhưng chỉ thành công sau những sưu tầm về môi
trường nuôi cấy của White và Gautheret đã áp dụng phương pháp NCM hoa
Lan năm 1956. Morel (1960) đã tạo được cây Cymbidium sạch virus từ cây bị
bệnh bằng nuôi cấy chồi nách trên môi trường Knudson C. Bằng phương pháp
NCM có thể dễ dàng đạt được 4 triệu cây/năm từ một chồi ban đầu (Morel,
1964). Với kỹ thuật nhân giống này đã tạo ra cường độ cực kỳ mạnh mẽ trong
phát triển nghề trồng hoa Lan có tính chất công nghiệp. Một số nhà vườn
hàng đầu thế giới đã chấp nhận kỹ thuật NCM như một thông lệ trong những
điều kiện của họ Murashige (1974) đã liệt kê có 22 giống được nhân bằng
phương pháp NCM, Aritti (1977) liệt kê được 35 giống. Có rất nhiều những
thành công đạt được với rất nhiều giống bao gồm cả những giống được tạo ra
do quá trình lai tạo như Aranthera (Irawati, Harjadi, Suseno and Idris, 1977),
Ascocenda (Fu, 1979, Holttumara Teo and Wong, 1978) và Renantanda (Goh
and Tan, 1979).

Cho tới nay thì hầu hết các loài hoa Lan đã được nhân nhanh bằng cách
sử dụng phương pháp NCM tế bào đã có rất nhiều những cuộc hội thảo về hoa
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 18

Lan được tổ chức trên thế giới đặc biệt là các nước thuộc khu vực Châu Á.
Những nghiên cứu chi tiết cho từng loại, từng giống ở từng khu vực đã và
đang được các nhà khoa học nghiên cứu đưa ra những quy trình những cải
tiến ngày một hoàn chỉnh hơn.
+ Các phương pháp nhân giống in vitro hoa Lan
a. Nuôi cấy in vitro hoa Lan bằng cách sử dụng chồi đỉnh
Kết quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng phụ thuộc rất nhiều vào mẫu nuôi
cấy, nguồn gốc và kích thước của mẫu. Tốt nhất là chúng ta lấy mẫu từ chồi
đỉnh đang ở thời kì sinh trưởng mạnh (Gup et al, 1981). Đỉnh sinh trưởng của
những cây non tốt hơn cây già. Điều kiện sinh trưởng, thời vụ lấy mẫu cũng
có ảnh hưởng rất lớn đến kết quả tái sinh của mẫu nuôi cấy.
Những công việc của Morel 1960 về nuôi hoa Lan hầu hết là sử dụng
chồi đỉnh. Mored (1960, 1964) đã sử dụng những chồi đỉnh có kích thước rất
nhỏ (0,1 mm) để lấy meristem.
Những cộng sự của ông và các nhà khoa học khác sau đó sử dụng
những chồi đỉnh có kích thước lớn hơn (khoảng 3-5cm). Theo cách này thì có
thể sẽ không làm sạch được virus nếu như cây mẹ đã nhiễm bệnh. Vì vậy mà
người ta đã tách ra như sau:
Nếu cây mẹ sử dụng để lấy mẫu đã được xác định là hoàn toàn sạch
virus thì có thể sử dụng những chồi đỉnh có kích thước từ 3-5mm để đưa vào
nuôi cấy. Với những kích thước mẫu nuôi cấy này thì sẽ giảm thiểu đáng kể
đến sự chết của mẫu và tăng cao khả năng tái sinh. Nếu cây mẹ bị nhiễm virus
thì phải lấy chồi đỉnh có kích thước 0,1-0,2mm với 1-2 lớp lá bao đưa vào
nuôi cấy thì sẽ tránh được nhiễm virus.

Phương pháp sử dụng chồi đỉnh đã được thực hiện trên rất nhiều đối
tượng: Aranda (Goh, 1973; Goh, Lonhard), Dendrobium (Singh, 1976),
Rhychotylis (Vajrabhaya, 1970), Vanda (Goh, 1970) và rất nhiều loài khác.


Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 19

b. Nuôi cấy chồi nách
Phương pháp này dùng cho nuôi cấy các giống Vanda, Aranda,
Dendrobium, Mokara và Oncidium.
Trong thực tế một số kết quả thu được cho thấy việc sản xuất các chồi
nách làm nguồn mẫu cuôi cấy chúng có thể phản ứng như việc sử dụng chồi
đỉnh, thậm chí còn cho kết quả tốt hơn so với việc sử dụng chồi đỉnh đối với
một số giống Arandarai (Goh, 1973; Goh and Loh 1975). Tuy nhiên khả năng
đẻ của mẫu sẽ giảm khi sử dụng những chồi nách ở xa với đỉnh ngọn (Loh,
Goh, and Rao,1978). Điều này nhận thấy rõ trên đối tượng Dendrobium (Kim
et al, 1970; Singh, 1976). Chính vì vậy mà trong quá trình lấy mẫu và nuôi
cấy người ta chỉ nên chọn các chồi có kích thước từ 3-4cm là tốt nhất.
Đối với một số giống Lan đặc biệt là những loài thuộc nhóm Lan đa thân
thì việc sử dụng chồi nách để nuôi cấy vừa có hiệu quả cao vừa có thể bảo
toàn được cây mẹ ban đầu vì vào mùa sinh trưởng thì khả năng phát triển của
chồi nách rất lớn.
c. Nuôi cấy cuống hoa
Việc sử dụng cuống hoa đem vào nuôi cấy chủ yếu áp dụng cho loài hoa
Phalaenopis. Bởi vì đối với Phalaenopsis, nó không giống như các loại hoa
Lan khác như Cymoidium, Dendrobium và Cattleya, hầu hết những giống
Phalaenopsis được trồng trọt có tính thương mại chúng được nhân giống từ
hạt và như vậy thì sẽ cho thế hệ cây non không đồng nhất. Và phương pháp vi

nhân giống không có khả năng làm giảm được bất lợi trong kỹ thuật này. Do
sự không đồng nhất đó một số vấn đề lớn phải giải quyết đó là sự thay đổi
trong sinh trưởng, thời gian ra hoa và những đặc tính của hoa. Những thay đổi
đã làm tăng giá thành sản xuất, giảm lợi nhuận (Ken Tokuhara and Masahiro
mii, 1993). Hơn nữa việc nhân giống bằng chồi nách của Phalaenopsis là rất
hãn hữu do khả năng đẻ chồi của nó rất hiếm.
Một số phương pháp vi nhân giống như Phalaenopsis được đưa ra bao
gồm nuôi cấy cuống hoa cùng chồi nách (Intwong et at, 1972, Reiginger et at,
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 20

1976), chồi đỉnh của những chồi từ cuống hoa (Zimmer and Pieper 1978,
Ichihashi 1992) những đoạn của cuống hoa (Homma and Asahira 1895, Lin
1986). Ở phương pháp này người ta sử dụng những phát hoa của cây đang ở
thời kì hình thành nụ nhỏ, cắt mỗi đoạn phát hoa có mang một mắt chồi, loại
bỏ lớp áo bao phía ngoài rồi thực hiện các bước khử trùng. Sau đó tách bỏ 2-3
lớp lá từ chồi. Phần chồi đỉnh đạt được kích thước rộng 1mm, cao 0,5mm và
có 1-2 lá bao được cắt ra từ đoạn cuống của phát hoa.
d. Nuôi cấy mô lá
Sử dụng mô lá làm nguồn vật liệu cho nuôi cấy được thực hiện khá thành
công trên một số đối tượng như: hoa cúc, thuốc lá… đối với hoa Lan việc sử
dụng mô lá để làm nguồn mẫu ban đầu lại càng có ý nghĩa hơn bởi việc sử
dụng chồi đỉnh sẽ dễ dàng làm hy sinh luôn cả cây đó. Hoặc khi sử dụng chồi
nách một phần của cây sẽ bị phá huỷ, cả hai phương pháp này đều làm ảnh
hưởng tới sinh trưởng của toàn bộ cây mẹ hoặc nó bị ức chế tới các chức năng
khác. Trong khi việc sử dụng phát hoa, lá, rễ cũng gây hại cho cây nhân giống
đầu tiên.
Phương pháp sử dụng mô lá được thực hiện trên một số đối tượng như
Cattleya, EpiDendrobium và Laelio Cattleya. Nguồn mẫu lấy từ lá non của

cây in vitro hoặc phần chóp lá của những cây trưởng thành (Champagnat and
Morel, 1969; Churchill et at, 1971,1973).
Riêng đối với cây Phalaenpsis hướng nhân giống từ mô lá đã được
thực hiện bởi M.Tanaka và cộng sự tại trường đại học Osaka, Nhật Bản.
Những cuộc thử nghiệm ban đầu đã cho thấy việc nuôi cấy mô lá của những
cây trưởng thành đã không hình thành thể Protocorm-PLB (protocorm like
body). PLB chỉ hình thành khi nuôi cấy mô lá của những cây rất non. Quá
trình tạo PLB bị hạn chế cùng với sự tăng của tuổi cây.
Lá từ những cây non của một số giống hoa Lan Aranda là nguồn mẫu
tuyệt vời cho quá trình nhân giống in vitro (Loh et al, 1975; Loh, 1977; Fu,
1979). Thậm chí những lá non đang phát triển từ những cây trưởng thành của
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 21

Ascocenda và Renantanda có thể sử dụng để nuôi cấy tạo vật liệu cho việc
nhân giống hàng loạt (Fu, 1979; Goh and Tan 1979).
+ Môi trường nuôi cấy
Hầu hết môi trường sử dụng cho sự nảy mầm của hạt hoa Lan cũng như
cho nuôi cấy mô là giống nhau như cho nuôi cấy mô của những loại cây khác
(Witthner, 1959; Arditti, 1967). Qua nhiều thử nghiệm nghiên cứu người ta
nhận thấy đa số các loài hoa Lan tỏ ra thích hợp với môi trường Vacin and
Went (VW). Bên cạnh đó môi trường Murashige and Skoogs và Knudson C
cũng hay được sử dụng.
Ngoài thành phần khoáng đa lượng, vi lượng, vitamin của môi trường
cơ bản ban đầu thì nước dừa (ND) thông thường được bổ sung để tăng cường
sự hình thành callus (Goh, 1970; Goh, Loh and Rao, 1975), với phạm vi sử
dụng từ 10-25%. Với mẫu đưa vào nuôi cấy ban đầu có thể dùng 20% và sau
khi xảy ra sự phân hoá cấy chuyển có thể giảm xuống còn 10% (Loh, Goh
and Rao 1978).

Một trong những nhân tố quan trọng nữa là cytokinin (Letham 1974,
Van Standen and Drewes, 1975). Tuy nhiên tuỳ theo đối tượng mẫu, phát hoa,
mô lá hay tính trạng của mẫu (đã cấy chuyển nhiều lần hay chưa) mà ta sử
dụng chủng loại, nồng độ cho thích hợp với từng loại mẫu, từng thời kì. Vì đa
số các loài hoa Lan là tương đối nhạy cảm với sự có mặt của các chất điều tiết
sinh trưởng bổ sung vào trong môi trường đặc biệt với mẫu đã qua một số lần
cấy chuyển.
Việc bổ sung các chất phụ gia khác (dịch chiết của một số loại như:
khoai tây, chuối, đu đủ, cà rốt…) là hết sức có ý nghĩa đối với quá trình nhân
giống in vitro hoa Lan.


Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 22

PHẦN 3 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu
Đối tượng nghiên cứu là giống Lan Hồ Điệp hoa trắng tuyền
(Phalaenopsis amabilis)
Nguyên liệu được sử dụng trong nghiên cứu giống Lan Hồ Điệp: ngồng
hoa và nụ hoa non.

3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Để xây dựng qui trình nhân nhanh giống Lan Hồ Điệp, chúng tôi đã
tiến hành các thí nghiệm in vitro. Qui trình nhân giống gồm 5 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
- Giai đoạn 2: Tạo thể nhân nhanh in vitro
- Giai đoạn 3: Nhân nhanh in vitro
- Giai đoạn 4: Tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh

- Giai đoạn 5: Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm

























2

4

5

3

1

Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 23

Các thí nghiệm này được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm,
Viện Di Truyền Nông Nghiệp. Nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Nghiên cứu hiệu quả khử trùng của HgCl
2
và H
2
O
2
ở các thời gian,
nồng độ khác nhau.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến khả
năng sinh trưởng và phát triển chồi của các mẫu nuôi cấy.
- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm và đưa cây ra
vườn ươm.
Các thí nghiệm nghiên cứu được thực hiện:

3.2.1. Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ và thời gian khử trùng đối với
ngồng hoa Lan Hồ Điệp
Mẫu ban đầu được lau qua cồn 70

0
rồi bỏ vào bình sạch đã được khử
trùng(đối với những mẫu bám bụi bẩn, phải đem rửa bằng xà phòng trước).
Sau đó cho 50-100ml cồn 70
0
lắc nhẹ trong thời gian 1 phút, rồi tráng nước vô
trùng 1 lần và bắt đầu tiến hành thí nghiệm với các hoá chất khử trùng là
H
2
O
2
nồng độ: 10%, 20%, 30% trong thời gian 10 phút và HgCl
2
0,1% trong
thời gian: 5 phút, 10 phút, 15 phút. Các mẫu được lắc đều trong 100-150ml
hoá chất ở các nồng độ và thời gian đã nêu. Sau đó đem tráng nước vô trùng
nhiều lần (4-5lần) cho đến khi mẫu sạch.

3.2.2. Giai đoạn tạo thể nhân nhanh in vitro
Các mẫu đã được khử trùng đưa vào nuôi cấy trong các công thức môi
trường khác nhau tùy theo mục tiêu của thí nghiệm. Các công thức môi
trường được liệt kê dưới đây.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP từ (0- 2,5) mg/l đến khả năng
tạo chồi từ mắt ngủ của Lan Hồ Điệp
B1: MS + 0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu
ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 24

B2: MS + 0,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar

B3: MS + 1,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
B4: MS + 1,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
B6: MS + 2,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
B5: MS + 2,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của 2,4D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với
0,1mg/l IAA lên quá trình phát sinh mô sẹo ở nụ hoa (tính theo tỷ lệ %)
TD1: MS + 0 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD2: MS + 0,1 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD3: MS + 0,2 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD4: MS + 0,3 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD5: MS + 0,4 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD6: MS + 0,5 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
TD7: MS + 0,6 mg/l 2,4D + 0,1 mg/l IAA + 30g/l đường + 6g/l Agar
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của chất bổ sung vào môi trường đến biểu hiện
phân hoá mô sẹo của Lan Hồ Điệp
Bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất: 1000 mg/l casein hydrolysate,
1000 mg/l malt extract, 60 g/l maltose và sucrose, 60 g/l glutose và sucrose,
60 g/l sucrose.

3.2.3. Giai đoạn nhân nhanh in vitro
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và nồng độ BAP = 1,0 mg/l
đến khả năng tạo chồi của Lan Hồ Điệp
N1: MS + 1,0 mg/l BAP + 0 mg/l NAA + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
N2: MS + 1,0 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
N3: MS + 1,0 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
N4: MS + 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
N5: MS + 1,0 mg/l BAP + 1,5 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
N6: MS + 1,0 mg/l BAP + 2,0 mg/l NAA+ 30 g/l đường + 6 g/l Agar
Viện Đại Học Mở Hà Nội Khoa Công nghệ Sinh Học
Hoàng Thu Thu

ỷ Lớp: KS.CNSH 0601 25

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của BAP đến quá trình nhân nhanh chồi của
Lan Hồ Điệp
B1: Vacin + 0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
B2: Vacin + 0,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
B3: Vacin + 1,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
B4: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
B5: Vacin + 2,0 mg/l BAP + 30 g/l đường + 6 g/l Agar
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của nước Dừa đến quá trình nhân nhanh chồi
của Lan Hồ Điệp
CW1: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 0 ml/l nước Dừa + 30 g/l đường + 6 g/l
Agar
CW2: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 50 ml/l nước Dừa + 30 g/l đường + 6 g/l
Agar
CW3: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 100 ml/l nước Dừa + 30 g/l đường + 6 g/l
Agar
CW4: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước Dừa + 30 g/l đường + 6 g/l
Agar
CW5: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 200 ml/l nước Dừa + 30 g/l đường + 6 g/l
Agar
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của chuối xanh đến quá trình nhân nhanh chồi
của Lan Hồ Điệp
C1: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 0 g/l chuối xanh + 30 g/l
đường + 6 g/l Agar
C2: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 10 g/l chuối xanh + 30
g/l đường + 6 g/l Agar
C3: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 20 g/l chuối xanh + 30
g/l đường + 6 g/l Agar
C4: Vacin + 1,5 mg/l BAP + 150 ml/l nước dừa + 30 g/l chuối xanh + 30

g/l đường + 6 g/l Agar