Báo cáo: Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất chế phẩm vi sinh phòng trừ bệnh héo lạc và vừng ppt

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI
SINH PHÒNG TRỪ BỆNH HÉO LẠC VÀ VỪNG
Lê Th Thanh Thy, Lê Như Kiu, Nguyn Văn Huân,
Trn Th La, Trn Quang Minh
SUMMARY
Study on the construction of process for production of microbial preparation
to control of wilt disease of groundnut and sesame
Isolation, selection, assessment of biological activities and the ability to against bacterial wilt
disease caused by Ralstonia solanacearum and Fusarium oxysporum of bacterial strains have
been done. 2 groups of microorganisms used to make microbial preparation for groundnut (PS1,
TS6, Pb8, Ba51, T15) and sesame (HS10, CRT, HS8, M, CX1) were selected. In the mixed
condition, all of selected bacterial strains can be existed well together and had positive effects to
growth, development and inhibition of disease caused by R. solanacearum and F. oxysporum.
These selected bacterial strains have potential to produce microbial preparation to control of wilt
disease of groundnut and sesame. We constructed of process for production of microbial
preparation VSV1 used for groundnut and VSV2 used for sesame. Both of microbial preparations
contained multi- antagonistic strains have density of microorganism is about 10
9
cfu/g. Quality of
microbial preparation was insured in 3 months keeping time in room temperature.
Keywords: Disease of groundnut, disease of sesame, bacterial wilt, R. solanacearum, F. oxysporum,
antagonistic bacteria.
I. M U
 nưc ta, cây lc và cây vng là
nhng cây có giá tr kinh t cao trên mt
ơn v din tích gieo trng. Do vy phát
trin trng lc và vng không ch thúc Ny
chuyn dch cơ cu cây trng trong nông
nghip mà còn nâng cao thu nhp cho
ngưi nông dân. Tuy nhiên, thc t trng
lc và vng  các nưc trên th gii nói

chung và  Vit Nam nói riêng gp rt
nhiu khó khăn, c bit là bnh héo xanh
do vi khuNn R. solanacearum gây ra trên lc
và vng [3].  nưc ta bnh héo xanh do vi
khuNn ã phát sinh  hu ht các a phương
có trng các cây như: cà chua, vng, lc,
thuc lá, khoai tây,  rt nhiu tnh thành
như: Hà Ni, Vĩnh Phúc, Bc Ninh, Thái
Nguyên, Thanh Hoá, Ngh An có nơi, có
lúc bnh ã gây thit hi nng ti mc gây
cht 100% cây trng. Cho ti nay nhng
nghiên cu v bnh héo xanh vi khuNn  lc
và vng ch yu ch gii hn trong phm vi
xác nh mc  thit hi, s phân b ca
bnh và bưc u xác nh ngun gen kháng
trong tp oàn các ging lc và vng hin có.
Tuy nhiên do kh năng có th bin i tính
c ca các chng vi khuNn R. solanacearum
gây bnh và hn ch ca thuc bo v thc
vt i vi loi vi khuNn này, nên các bin
pháp phòng tr sinh hc bnh héo xanh vi
khuNn bng các vi sinh vt i kháng ã cho
thy nhiu ha hn kh quan và là bin pháp
rt cn thit  thay th các loi thuc hóa
hc bo v thc vt [1, 3]. Bài báo này s
ưa ra nhng kt qu trong nghiên cu xây
dng qui trình sn xut ch phNm vi sinh
phòng tr bnh héo lc và vng.
II. VT LIU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CU

1. Vật liệu
- Vi khuNn R.solanacearum và nm
F.oxysporum gây bnh héo ưc phân lp
t các cây lc và vng có biu hin triu
chng nhim bnh in hình [5]  mt s
tnh như: Hà Ni, Thanh Hoá, Ngh An và
Vĩnh Phúc. Các mu t trng cây h cà
(t, cà chua), cây lc và vng.
2. Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp Koch s dng  xác
nh mt  vi sinh vt: Mt  vi sinh vt
ưc xác nh da trên phương pháp nuôi
cy trên môi trưng thch ĩa, tính s lưng
vi sinh vt trên mililit hoc trên gam mu
thông qua s khuNn lc phát trin trong các
ĩa môi trưng.
- Phương pháp xác nh hot tính i
kháng vi khuNn, nm gây bnh: ưc xác
nh bng cách o ưng kính vòng c ch;
ó là vòng tròn trong sut bao quanh khuNn
lc (i vi trưng hp cy im) hoc l
thch (i vi trưng hp khoan l thch),
nơi mà vi sinh vt gây bnh không sinh
trưng ưc [4].
- Phương pháp Salkowsky ci tin
(Misra và cs., 1989) s dng  xác nh
kh năng sinh tng hp IAA thô: Các chng
vi sinh vt ưc nuôi cy trong môi trưng
có b sung 0,1% Triptophan. Sau thi gian
nuôi cy, ly tâm, thu ưc dch trong. Cho

2 ml dch trong vào ng nghim cha 8 ml
thuc th Salkowsky ci tin. Lc u, 
yên trong 20 phút, sau ó so màu trên máy
vi bưc sóng 530 nm. Hàm lưng IAA to
ra trong môi trưng ưc tính toán trên cơ
s  th IAA chuNn. Thuc th Salkowsky
ci tin: FeCl
3
0,5M 15 ml; H
2
SO
4
98%
300 ml; nưc ct 500 ml.
- Phương pháp ánh giá tính c ca các
chng vi khuNn s dng theo 10TCN: 216-
1995 (216-2003) [2]. Thí nghim chia thành
6 công thc: CT1: Công thc i chng là
t không nhim sinh khi vi khuNn; CT2:
t nhim R. solanacearum (10
4
-10
5
cfu/g);
CT3: t nhim F. oxysporum (10
4
-10
5
bt/g);
CT4: t nhim hn hp các chng vi

khuNn; CT5: Là CT2+hn hp vi khuNn;
CT6: Là CT3+hn hp vi khuNn.
III. KT QU VÀ THO LUN
1. Tuyển chọn các chủng vi sinh vật đối
kháng để sản xuất chế phm vi sinh
T các mu t, mu thân cây vng và
cây lc khe  các tnh Vĩnh Phúc, Hà
Tĩnh, Hà Ni và Thanh Hóa ã phân lp
ưc 24 chng vi khuNn i kháng, ây là
ngun nguyên liu quý cho vic tuyn chn
chng có tim năng cao trong sn xut ch
phNm vi sinh phòng tr bnh héo xanh lc,
vng. Tiêu chuNn chn la các chng vi
khuNn i kháng là phi có hot lc i
kháng mnh, tác dng trên nhiu chng vi
sinh vt gây bnh, n nh lâu dài trong ch
phNm và không gây bnh cho ng vt máu
nóng. T 24 chng vi khuNn i kháng trên
chúng tôi la chn ưc 2 t hp, bao gm
10 chng vi khuNn in hình làm vt liu
trong nghiên cu sn xut ch phNm vi sinh
s dng trong phòng tr bnh héo xanh lc
và vng. Trong ó có 8 chng i kháng c
R. solanacearum và F. oxysporum vi kích
thưc vòng c ch t 10-20 mm.
Bảng 1. Tổ hợp các chủng vi khun sử dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phm vi sinh
phòng trừ bệnh héo xanh lạc và vừng (tháng 10-2008, tại Viện Thổ nhưỡng ông hóa)
Chế
phẩm

Chủng vi khuẩn
Ký hiệu
chủng
Hoạt tính sinh học Đơn vi đo hoạt lực Hoạt lực

Cây
lạc
Pseudomonas
fluorescens
Pseudomonas sp.
Bacillus sp.
Bacillus subtilis
Bacillus megaterium
Ps1
TS6
Pb8


Ba5.1


T15

ĐKVK & N héo xanh
ĐKVK & N héo xanh
ĐKVK & N héo xanh
ĐKVK & N héo xanh,
KTSTTV,
PG kitin
ĐKVK héo xanh

Đường kính VƯC (mm)
Đường kính VƯC (mm)
Đường kính VƯC (mm)
Đường kính VƯC (mm)
IAA: µg/ml
Đường kính VPGKT (mm)
Đường kính VƯC (mm)
12; 12
12; 10
16; 16
15; 15,5
182
32
20
Cây
vừng
Pseudomonas sp.
Pseudomonas putida
Bacillus sp.
Bacillus velezensis
Bacillus polyfermenticus
HS10

CRT

HS8


M

CX1
ĐKVK & N héo xanh
ĐKVK héo xanh
ĐKVK & N héo xanh,

ĐKVK & N héo xanh,
KTSTTV
PG kitin
ĐKVK & N héo xanh
Đường kính VƯC (mm)
Đường kính VƯC (mm)
Đường kính VƯC (mm)
Đường kính VƯC (mm)
IAA: µg/ml
Đường kính VPGKT (mm)
Đường kính VƯC (mm)
16; 16
20
12; 12
15; 15,5
160
37
15; 15
KVK & N: i kháng vi khuNn và nm. IAA: Indol Acetic Acid.
VƯC: Vòng c ch vi khuNn/nm gây bnh. KTSTTV: Kích thích sinh trưng thc vt.
PG: Phân gii. VPGKT: Vòng phân gii kitin.
Các chng vi khuNn la chn thuc các
chi Pseudomonas và Bacillus u có hot tính
i kháng cao vi vi khuNn R. solanacearum

và nm F. oxysporum gây héo lc, vng và
n nh hot tính trong nhiu ln thí nghim.
Kt qu minh ha trên hình 1.
Tin hành xác nh nh tính tác ng
tương h gia các chng bng phương pháp
cy vch tip xúc gia các chng vi khuNn
trên môi trưng thch. Kt qu cho thy,
các chng vi khuNn tuyn chn u phát
trin tt trên cùng mt môi trưng dinh
dưng, không có biu hin kìm hãm sinh
trưng gia các chng nghiên cu. Kt qu
minh ha trên hình 2.


Hình 1. ánh giá hot lc i kháng vi khuNn
R. solanacearum và nm F. oxysporum gây
héo xanh lc và vng
Hình 2. N uôi cy vch các chng vi khuNn
tuyn chn trên cùng môi trưng dinh dưng

Bảng 2. Ảnh hưởng của hỗn hợp vi khun đối kháng đến sinh trưởng, phát triển và khả năng
hạn chế bệnh héo xanh giống lạc MD7 (thí nghiệm nhà lưới, Viện Thổ nhưỡng ông hóa 2008)
Công thức
Cao
cây
(cm)
Trọng
lượng khô
thân lá (g)

Tỷ lệ cây chết (%) do
R. solanacearum

F. oxysporum

CT1: Đối chứng 20,8 1,41 - -
CT2: Nhiễm R. solanacearum 19,3 1,46 87,5 -
CT3: Nhiễm F. oxysporum 17,8 1,39 - 75,0
CT4: Nhiễm hỗn hợp vi khuẩn 21,7 1,53 - -
CT5: Nhiễm R. solanacearum + hỗn hợp vi khuẩn

21,0 1,55 25,0 -
CT6: Nhiễm F. oxysporum + hỗn hợp vi khuẩn 20,1 1,58 - 37,5
LSD (0,05) 4,03 4,80
CV (%) 7,50 3,90

Kt qu bng 2 cho thy khi nhim
bnh nhân to t l cây cht héo do
R. solanacearum là 87,5%, do F. oxysporum
là 75%. Nhim ng thi t hp các chng
vi khuNn i kháng và vi khuNn
R. solanacearum t l cây cht ch còn
25%, t hp các chng vi khuNn i kháng
và nm F. oxysporum t l cây cht ch còn
37,5%. Trong khi ó công thc nhim hn
hp vi khuNn, cây lc sinh trưng, phát trin
bình thưng, cây không b cht héo.
Bảng 3. Ảnh hưởng của hỗn hợp vi khun đối kháng đến sinh trưởng, phát triển và khả năng hạn
chế bệnh héo xanh giống vừng V6 (thí nghiệm nhà lưới, Viện Thổ nhưỡng ông hóa, 2008)
Công thức

Cao
cây
(cm)
Khối
lượng khô
thân lá (g)
Tỷ lệ cây chết (%) do
R. solanacearum

F. oxysporum

CT1: Đối chứng 50,76 105,84 - -
CT2: Nhiễm R. solanacearum 48,12 98,28 80,0 -
CT3: Nhiễm F. oxysporum 46,67 95,76 - 72,0
CT4: Nhiễm hỗn hợp vi khuẩn 56,16 123,48 - -
CT5: Nhiễm R. solanacearum + hỗn hợp vi khuẩn 55,06 120,96 25,0 -
CT6: Nhiễm F. oxysporum + hỗn hợp vi khuẩn 58,15 119,07 - 40,5
LSD (0,05) 3,05 5,35
CV (%) 5,10 3,10

i vi vng khi nhim bnh nhân to t
l cây cht héo xanh do R. solanacearum là
80%. Nhim ng thi t hp các chng vi
khuNn i kháng và vi khuNn R. solanacearum
t l cây cht ch còn 25%, t l cây cht ch
còn 40,5%  t hp các chng vi khuNn i
kháng và nm F. oxysporum. Công thc
nhim hn hp chng vi khuNn i kháng,
cây vng sinh trưng, phát trin tt, cây
không b cht héo, minh ha  bng 3. N hư

vy, các chng vi khuNn i kháng nghiên
cu có  iu kin  sn xut ch phNm vi
sinh s dng trong phòng chng bnh héo
lc và vng.
2. ghiên cứu qui trình sản xuất chế
phm vi sinh vật đối kháng bệnh héo cây
lạc và vừng trong phòng thí nghiệm
Thí nghim s dng các ngun dinh
dưng tng hp và ngun dinh dưng t
nhiên d kim, r tin trong nuôi cy nhân
sinh khi các chng vi khuNn. Kt qu so
sánh mt  các chng vi khuNn và hot
tính ca chúng trên các môi trưng có thành
phn dinh dưng khác nhau ưc th hin
trong các bng 4 và 5.
Bảng 4. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến sự phát triển của các chủng vi khun
TT
Kí hiệu
chủng
Mật độ tế bào (cfu/ml) của các chủng vi khuẩn tuyển chọn trong môi trường
King B Pseu SX1 SX2 SX3 SX4
1 Ps1 2,2 x 10
8
1,6 x10
9

2,4 x 10
8
2,9 x 10
8

4,2 x 10
9
9,8 x 10
7

2 TS6 3,1 x10
8

1,3 x10
9
2,0 x 10
8
5,2 x 10
8
3,4 x 10
9
7,8 x 10
7

3 Pb8 4,4 x 10
8
2,5 x 10
8
1,2 x 10
7
2,6 x 10
7
6,0 x 10
8
4,0 x 10

7

4 Ba5.1 6,0 x10
8

1,1 x10
8

1,8 x10
8

8,3 x10
8

6,9 x10
8

1,1 x10
8

5 T15 2,1 x 10
9
1,4 x10
8
8,5 x10
7
4,2 x10
9
3,8 x10
9

1,4 x10
8

6 HS10 2,5 x 10
8
2,5 x 10
9
2,5 x10
9
2,6 x10
9
4,6 x10
9
2,9 x10
8

7 CRT 2,0 x10
8

1,5 x10
9
1,4 x10
8
2,0 x10
8
1,4 x10
9
2,7 x10
8

8 HS8 3,4 x10
8

2,5 x10
8
1,3 x10
8
4,5 x10
8
3,2 x10
8
2,5 x10
8

9 M 5,6 x 10
8
2,0 x10
8
4,6 x10
8
5,4 x10
8
5,0 x10
8
1,8 x10
8

10 CX1 2,6 x 10
8
1,2 x10

8
1,0 x 10
7
2,4 x 10
7
4,6 x 10
8
5,0 x 10
7

Chú thích: * SX1, SX2, SX3, SX4: Là các môi trưng cha g ưng mía, dch nưc chit u, có b sung
mt s cht dinh dưng và khoáng cht. * KingB, Pseu: Là hai môi trưng c hiu cho nuôi cy
các chng thuc chi Bacillus và Pseudomonas.
Bảng 5. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng đến hoạt tính đối kháng của các chủng vi khun
TT

Kí hiệu chủng
Đường kính vòng ức chế vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh cây lạc,
vừng (D-d)(mm)
King B Pseu SX1 SX2 SX3 SX4
1 Ps1 11 12 11 11 12 10
2 TS6 12 12 11 12 12 10
3 Pb8 16 14 14 14 16 14
4 Ba5.1 15 14 15 15 15 14
5 T15 18 20 18 18 19 18
6 HS10 16 16 16 16 16 16
7 CRT 18 20 18 19 20 18
8 HS8 12 10 11 11 11 10
9 M 15 14 14 14 14 14
10

CX1 15 14 13 14 15 13

Kt qu bng 4 và 5 cho thy, các
chng vi khuNn nghiên cu u phát trin
tt trong môi trưng c hiu có ngun gc
t nhiên (nưc chit u, g ưng) cho
tng chng trên các môi trưng. Trên môi
trưng sn xut SX3 tt c các chng u
có mt  t bào cao hoc tương ương khi
nuôi cy trên môi trưng c hiu. Kt qu
tương t khi so sánh hot tính sinh hc ca
các chng vi khuNn nghiên cu trên các môi
trưng nuôi cy khác nhau. Như vy có th
la chn môi trưng SX3 cho nhân sinh
khi các chng vi khuNn la chn  sn
xut ch phNm cho cây lc vng, vì môi
trưng này va m bo mt  t bào cao
(t 10
8
-10
9
/ml), va m bo hot tính i
kháng cao nht (kích thưc vòng phân gii
t 15-20 mm) so vi các môi trưng khác.
Cht mang là giá th mà  ó vi sinh vt
trú ng, m bo t mt  theo yêu cu
trong quá trình t khi sn xut n lúc s
dng. ã tin hành nghiên cu so sánh kh
năng tn ti ca các chng vi khuNn tuyn

chn trên các nn cht mang khác nhau như
than bùn, than bùn b sung xơ da, phân
giun, phân compost, mai cua, t x him.
Trên cơ s ó ã la chn loi cht mang
phù hp cho nghiên cu sn xut ch phNm
vi sinh cho cây lc, vng là cht mang than
bùn b sung g ưng và t x him.
Cht mang s dng làm ch phNm ưc
x lý vi các công on:
Nghin nh → Trung hòa pH → Phi
trn g ưng, t x him → iu chnh
 Nm → óng gói → Kh trùng
Trên cơ s tng hp các kt qu nghiên
cu v công ngh sn xut ch phNm vi sinh
như: Tuyn chn b chng ging vi sinh vt
s dng cho sn xut ch phNm, la chn
môi trưng nhân sinh khi VSV, xác nh
iu kin lên men nhân sinh khi, la chn,
x lý cht mang. Kt qu ã xây dng ưc
2 quy trình công ngh sn xut ch phNm vi
sinh vt phòng tr bnh héo cây lc và
vng và ưc tóm tt trong sơ  1 và 2.

SƠ ĐỒ 1. QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV
ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÂY LẠC
SƠ ĐỒ 2. QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VSV
ĐỐI KHÁNG BỆNH HÉO XANH CÂY VỪNG

Ch phNm VSV1 s dng cho cây lc;
Ch phNm VSV2 s dng cho cây vng,
là sn phNm lên men cp hai nhân sinh
khi vi sinh vt và phi trn vi cht
mang. Mt  t bào mi loi vi khuNn t
10
9
cfu/g và ưc bo qun  iu kin
nhit  phòng trong iu kin râm mát,
sch s, không  gn nơi cha cht c
hóa hc, thuc tr sâu. S dng tt trong
vòng 3 tháng.
IV. KT LUN
Phân lp, tuyn chn, nghiên cu và ánh
giá hot tính sinh hc, kh năng i kháng

bnh héo xanh vi khuNn do R. solanacearum
và bnh héo do nm F. oxysporum. Trong iu
kin t hp các chng vi khuNn cho thy, hn
hp các chng vi khuNn s dng sn xut ch
phNm vi sinh cho lc (PS1, TS6, Pb8, Ba51,
T15) và ch phNm cho vng (HS10, CRT,
HS8, M, CX1) u có th tn ti tt cùng nhau
Chất mang
Trung hòa pH

Trộn gỉ đường,
đ
ất xạ hiếm, phụ
gia
Kiểm tra tạp
nhiễm
Đóng gói, khử
trùng
Xử lý thô
(nghiền, sàng,
loại bỏ tạp chất)


Bảo quản sử dụng

Chủng giống VSV


Lên men cấp 1
Lên men cấp 2

Thu sinh khối
Phối trộn
Chế phẩm VSV1

Ki
ểm tra mật độ
t
ế
bào VSV, tạp nhiễm

Chất mang
Trung hòa pH
Trộn gỉ đường,
đ
ất xạ hiếm, phụ
gia
Kiểm tra tạp
nhiễm
Đóng gói, khử
trùng
Xử lý thô
(nghiền, sàng,
loại bỏ tạp chất)

Bảo quản sử dụng

Chủng giống VSV


Lên men cấp 1

Lên men cấp 2
Thu sinh khối
Phối trộn
Chế phẩm VSV2

Kiểm tra mật độ tế
bào VSV, t
ạp nhiễm

và có th s dng trong sn xut ch phNm vi
sinh cho cây lc và vng.
Xây dng ưc qui trình sn xut ch phNm
VSV1 i kháng s dng cho cây lc và VSV2
i kháng s dng cho cây vng. Các ch phNm
vi sinh cha hn hp chng VSV i kháng
bnh do R. solanacearum và F. oxysporum có
mt  t bào mi chng t 10
9
cfu/g, thi gian
bo qun 3 tháng  nhit  phòng.
TÀI LIU THAM KHO
1 Lê hư Kiểu, Phạm Công Minh, Trần
Quang Minh và guyễn gọc Cường,
2005. Quy trình sn xut ch phNm vi
khuNn i kháng VK58 phòng chng
bnh héo xanh cà chua, Tp chí Khoa
hc và Công ngh, tp 43, s 5, tr. 47-54.
2 10TCN: 216-1995 (216-2003): Kho
nghim hiu lc phân bón trên ng
rung i vi cây trng.

3 guyễn Văn Viết và cs., 2003. Kt qu
nghiên cu phòng tr bnh héo xanh vi
khuNn hi lc bng ging kháng bnh 
vùng t cn và t dc, 2001-2002.
Tuyn tp các Công trình Khoa hc K
thut Nông nghip, Nhà xut bn Nông
nghip, 74-79.
4 10TCN 714-2006: Phương pháp ánh
giá hot tính i kháng ca vi sinh vt
có kh năng i kháng vi khuNn
Ralstonia solanacearum gây bnh héo
xanh cây trng cn.
5 Black L.L., Green S.K., Hartman G.L.,
Poulos J.M., 1991. Pepper Diseases: A
Field Guide. Asian Vegetable Research
& Development Center, AVRDC
Publication No.31-347, 98pp.
gười phản biện: guyễn Văn Viết
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam
8