Bài giảng xu hướng phát triển thực phẩm các kỹ thuật gen sử dụng trong tạo sinh vật biến đổi gen

Các kỹ thuật gen sử
dụng trong tạo sinh
vật biến đổi gen
THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN
Nguyễn Tiến Thành - HUST


Làm thế nào tạo ra GMO

Gen

Tế bào sinh vật
Tế
bàgen
o sinh
vật
mang
chuyển
bình thường
(GMO)


Các bước chính tạo GMO
Lựa chọn gen
và sinh vật cho
gen

tách gen từ sinh
vật cho gen,
“tách dòng”

kháng sâu đục thân cry
từ Bacillus

cry

Sàng lọc tế bào
đạt yêu cầu

Chuyển gen vào
tế bào đích

Chọn cá thể ngô có
đặc điểm khán g sâu

Sún g bắn gen vào
ngô

Thiết kế cấu trúc
biểu hiện gen
Promoter-cry-Terminator

Đưa gen lên các
phương tiên
chuyển
hạt vàn g


Các kỹ thuật cơ bản
u

Tách chiết, tinh sạch DNA hệ gen

u

Khuếch đại DNA

u

Cắt và ghép nối DNA

u

Chuyển (Biến nạp) DNA vào tế bào vật chủ

u

Các phương pháp đánh giá kết quả chuyển gen


Chọn gen mục tiêu và sinh vật cho
gen
u

u

Thường là các gen tạo cho sinh vật nhận các đặc tính mới :
u

Kháng sâu đục thân: cry từ Bacillus thurigensis

u

Kháng thuốc trừ cỏ: bar từ Streptomyces, espsp từ
Agrobacterium…

u

Hormon sinh trưởng: từ cá hồi Chinok

u

Etc..

Cần rõ trình
̀ tự DNA, đặc biệt là vùng mã hóa cho protein
tương ứng


Tách gen từ sinh vật cho
u

Phương pháp chủ đạo là ”câu” và nhân gen (khuếch đại
gen) từ DNA hệ gen của sinh vật cho gen:
u

Tách chiết DNA hệ gen từ sinh vật cho gen. Trường hợp sinh
vật cho gen là virus thì cần tạo cDNA từ RNA của virus

u

Nhân gen từ DNA hệ gen đã tách chiết được

Phương pháp tách chiết DNA hệ
gen từ sinh vật cho gen

Phương pháp nhân gen


Phương pháp tách/tinh sạch DNA
hệ gen
u

Mục đích: thu DNA nguyên vẹn (không bị cắt đoạn, gẫy),
không lẫn các thành phần khác (protein…), hiệu suất thu hồi
cao

u

Nguyên tắc chính:
u

Phá màng tế bào, màng nhân, giải phóng DNA

u

Tách DNA ra khỏi các thành phần khác

u

Thu nhận DNA

Phương pháp tách chiết/tinh
sạch DNA
u

u

u

Phá màng tế bào, màng nhân: kết hợp 2 phương pháp
u

Cơ học: nghiền trong Ni tơ lỏng, siêu âm, rung lắc với bi thuỷ
tinh

u

Hoá học: lyzozyme (enzyme phân giải màng peptidoglycan), SDS
(giãn mạch protein), proteinase (thuỷ phân protein, tách DNA
khỏi protein), Rnase (phân giải RNA)

Tách DNA khỏi thành phần khác: 1 trong 2 phương pháp
u

Trích ly bằng phenol – chloroform để thu protein, DNA trong pha
nước

u

Sử dụng cột silica, bám đặc hiệu DNA

Thu nhận DNA
u

Kết tủa bằng isopropanol, ly tâm thu kết tủa

u

Rửa giải DNA trên màng silica thu DNA



Tách chiết DNA



Phương pháp nhân gen
u

PCR: polymerase chain reaction: phản ứng chuỗi trùng hợp,
dựa trên đặc tính của DNA và khả năng tổng hợp chuỗi của DNA
polymerase trên chuỗi khuôn từ các mồi bổ sung ban đầu (xem
tái bản gen)

u

Cần có:

u

u

Đoạn DNA gốc cần nhân lên

u

Các nucleotide A, T, G, C tự do

u

Enzyme DNA polymerase

u

Các mồi: 2 mồi: xuôi và ngược ứng với 2 mạch đơn DNA

u

Thiết bị luân nhiệt

Kết quả: từ 1 đoạn DNA kép gốc tạo ra số lượng vô cùng lớn các
đoạn DNA kép giống với DNA gốc


Phương pháp nhân gen
Nguyên tắc phản ứng PCR
Đoạn DNA
ban đầu

Mồi
Các
nucleotide

Biến tính tại 94 –96oC
Bắt cặp tại 55 - 65oC
Kéo dài tại 72oC


Phương pháp nhân gen PCR
u

u

Thiết kế mồi:
u

Mồi quyết định sản phẩm PCR

u

Để thu đúng sản phẩm, mồi cần được thiết kế dựa trên
đoạn gen cần ”câu” và nhân lên từ DNA à cần trình tự của
đoạn gen cần “câu” ra

u

Mồi cần có chiều dài đủ để sự bắt cặp mồi với DNA đích
đúng: 20 -25 nt

u

Tỷ lệ GC tốt nhất là 50%.

Tổng hợp mồi: cơng ty bên ngồi thực hiện


Phương pháp nhân gen PCR
u

Thực hiện trong các thiết bị luân nhiệt: ở các nhiệt
độ khác nhau (95oC, 60oC, 72oC), trong thời gian khác
nhau, lặp lại chu trình nhiều lần


Phương pháp nhân gen PCR
u

Kiểm tra sản phẩm nhân gen: sử dụng điện di trên agarose

u

Sản phẩm nhân gen được đưa vào agarose, đặt trong điện trường,
DNA sẽ di chuyển tùy thuộc và kích thước của nó (nhỏ thì nhanh,
lớn thì chậm) à nếu là hỗn hợp nhiều DNA kích thước khác nhau,
sau một thời gian sẽ phân tách được chúng.

u

Quan sát sự phân bố các sản phẩm DNA dưới tia UV với sự hỗ trợ

của ethidium bromide (EtBr)


Kiểm tra sản phẩm nhân gen bằng
điện di trên agarose
Điện trường
Điện tích âm

DNA từ
phản
ứng
nhân
gen
Đưa vào các đường
chạy trên Agarose,
có kèm DNA chuẩn
biết kích thước

DNA
phân
tách
theo
kích
thước

Chất
hiện
màu

Điện tích dương

Hiện sản phẩm
dưới UV
So
sánh
kích
thước


“Tách dòng” gen
u

“Tách dòng”: Là thuật ngữ thể hiện công việc sau khi đã thu
được gen đích, chuyển vào một “phương tiện” để giữ gen, đồng
thời có thể tạo ra số lượng gen lớn khi cần

u

“phương tiện” giữ gen thường là các vec tơ trong các vi sinh
vật trung gian giữ vector đó, loại vector phổ biến nhất là các
plasmid
u

Plasmid giữ gen thường có kích thước nhỏ, có thể tồn tại ở số
lượng lớn (vài trăm plasmid) trong 1 tế bào giữ plasmid.

u

u

Plasmid cần tương thích (không bị đào thải) với tế bào giữ plasmid

“Phương tiện” phổ biến: thường là vi khuẩn E.coli, nấm men…
và các plasmid tương ứng với nó


“Tách dòng” gen
u

Cấu trúc chung của plasmid dùng để “tách dòng”:

•

Gen chọn lọc: gen kháng kháng sinh

•

Tín hiệu khởi đầu tái bản: cần phù hợp với tế bào mang plasmid (cho phép
plasmid có thể nhân lên trong tế bào) và quyết định sớ lượng bản sao
plasmid trong tế bào

•

Vùng MCS: cho phép có thể mở vòng plasmid để gắn thêm gen đích vào

Gen
chọn
lọc

khung

Gen chọn
lọc

Vùng MCS
Vùng MCS

Gen đích

Tín hiệu
khởi đầu tái
bản

Tín hiệu khởi đầu tái
bản


Plasmid tách dòng pJET (E.coli)


Cắt hạn chế DNA (restricted
digestion)
u

DNA có thể bị phân giải toàn bộ = enzyme DNAse (cắt thành
các nucleotit đơn)
u

u

Đôi khi cần chú ý không bị nhiễm tạp từ ngoài vào

DNA có thể bị cắt “hạn chế” = enzyme RE (restriction enzyme)
tại một số vị trí đặc biệt
u

Các enzyme RE có các điểm nhận biết đặc hiệu trên trình tự DNA,
có thể cắt tại ví trí nhận biết (loại II), hoặc cách xa vài nucleotit
(loại III) hoặc 1000 – 2000 nucleotit (loại I)

u

Loại II được sử dụng rộng rãi cho kỹ thuật gen, loại III sử dụng ít.


RE cắt DNA
u

Cách gọi tên: EcoRI: chữ cái đầu Tên giống - tên loài – chủng số thứ tư la mạ̃của enzyme tìm ra từ loài vi sinh vật này: từ
E.coli chủng H thứ I

u

Đặc điểm vị trí nhận biết của các RE: đối xứng nghịch đảo

u

Cách cắt: tạo đầu bằng (blunt end) hoặc đầu dính (sticky end)

u

Điều kiện hoạt động phụ thuộc RE, thông thường là 37oC, pH
trung tính, có mặt ion kim loại


Vector tách dòng pJET
u

Có mấy điểm cắt SalI, BamHI trên plasmid bên?

u

Nếu cắt plasmid bên bằng các enzyme này thì sản phẩm
có mấy đoạn DNA?


Ghép nối DNA (ligation)
u

Sử dụng enzyme có tên là ligase: tạo liên kết este giữa đầu 5’ P
và đầu 3’ OH

u

Có thể ghép nối đầu 2 đầu bằng hoặc đầu lệch

u

Phổ biến là enzyme T4 DNA ligase: từ thực khuẩn thể T4.
Thường có sản phẩm thương mại

u

Điều kiện cho phản ứng ghép nối: nhiệt độ phòng (25oC), thời
gian ngắn (5 -10 phút), hoặc nhiệt độ thấp 4oC, thời gian dài
(qua đêm)