Nghiên cứu nhân giống các dòng tràm trà a32 23 và a26 218 (melaleuca alternifolia) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Ƣ

Ọ
Ọ
--------

KHÓA LUẬN TỐT NGHI P
Đề tài:
Ố
A26.218 (MELALEUCA ALTERNIFOLIA

Ậ

Ấ IN VITRO

Gi

: TS. Khuất

: 1953071185
: K64-CNSH

t

H i Ninh


L I CẢ

Ơ

Khóa luận tốt nghiệp đƣợc hồn thành tại Viện Công nghệ sinh học
Lâm nghiệp, trƣờng đại học Lâm nghiệp. Có đƣợc kết quả này khơng chỉ sự
nỗ lực của cá nhân em mà còn là sự giúp đỡ tận tình của các thầy cơ tại Viện
Cơng nghệ sinh học. Nhân dịp này, em xin chân thành cám ơn về sự quan tâm
và giúp đỡ quý báu đó.
Em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và kính trọng tới TS. Khuất Thị Hải
Ninh đã tận tình hƣớng dẫn chỉ bảo em trong q trình thực hiện khóa luận.
Đồng thời, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trong Viện Cơng nghệ sinh
học Lâm nghiệp đã tận tình giảng dạy, trang bị cho em những kiến thức quý
báu trong 4 năm vừa qua.
Em xin chân thành cảm ơn ông bà, bố mẹ đã luôn động viên ủng hộ vật
chất lẫn tinh thần trong suốt thời gian qua. Em xin cảm ơn sự quan tâm giúp
đỡ và ủng hộ của các anh chị, bạn bè trong quá trình thực hiện đề tài.
Mặc dù đã cố gắng hồn thành khóa luận trong phạm vi và khả năng
cho phép nhƣng chắc chắn sẽ khơng tránh khỏi những thiếu sót. Em rất mong
nhận đƣợc sự thơng cảm, góp ý và tận tình chỉ bảo của quý thầy cô và các bạn.
Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2023
Sinh viên th c hi n

Nguyễn Hoàng Anh

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
MỤC LỤC ......................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG ........................................................................................ iv
DANH MỤC HÌNH .......................................................................................... v
BẢNG KÍ TỰ VIẾT TẮT ................................................................................ vi

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU.................................... 3
1.1 Đặc điểm sinh vật học và sinh thái học của Tràm trà ................................. 3
1.1.1 Đặc điểm sinh vật học .............................................................................. 3
1.1.2 Đặc điểm sinh thái học ............................................................................. 4
1.2 Tác dụng và giá trị kinh tế của tinh dầu Tràm trà ....................................... 4
1.2.1 Tác dụng sinh học củ tinh dầu Tràm trà ................................................. 4
1.2.2 Giá trị kinh tế của tinh dầu Tràm trà ........................................................ 6
1.3 Các nghiên cứu về cây Tràm trà trên thế giới ............................................. 7
1.3.1 Nghiên cứu về chọn giống ....................................................................... 7
1.3.2 Nghiên cứu về nhân giống ....................................................................... 8
1.4 . Các nghiên cứu về cây Tràm trà ở Việt Nam.......................................... 11
1.4.1 Nghiên cứu về chọn giống ..................................................................... 11
1.4.2 Nghiên cứu về nhân giống ..................................................................... 12
1.5 Một số nhận định chính ............................................................................. 13
CHƢƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, Đ I TƢ NG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ................................................................................................ 14
2.1 Mục tiêu nghiên cứu.................................................................................. 14
2.2 Nội dung nghiên cứu ................................................................................. 14
2.3 Đối tƣợng, vật liệu và đị điểm nghiên cứu .............................................. 14
2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu........................................................................... 15
2.4.1 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm............................................................... 15
2.4.2 Phƣơng pháp xử lý số liệu...................................................................... 19
ii


CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ......................... 20
3.1 Nghiên cứu ảnh thời gian khử trùng bằng J vel 5% đến khả năng tạo mẫu
sạch. ................................................................................................................. 20
3.2 Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hò sinh trƣởng và ánh sáng đến khả

năng nhân nh nh chồi...................................................................................... 21
3.2.1 Ảnh hƣởng của chất điều hò sinh trƣởng đến khả năng tạo cụm chồi . 21
3.2.2 Ảnh hƣởng của Kinetin đến khả năng kích thích tăng trƣởng chồi ....... 23

3.2.3 Ảnh hƣởng củ cƣờng độ ánh sáng đến khả năng kích thích tăng trƣởng
chồi .................................................................................................................. 25
3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng củ IBA đến khả năng tạo rễ. .............................. 26
3.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng của loại giá thể đến khả năng sinh trƣởng của cây
mô gi i đoạn vƣờn ƣơm .................................................................................. 28
KẾT LUẬN TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 33
PHẦN PHỤ BIỂU........................................................................................... 38

iii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng mẫu bằng J vel 5% đến khả năng
tạo mẫu sạch dòng A32.23 và A26.218 Tràm trà s u 3 tuần nuôi cấy ........... 20
Bảng 3.2 Khả năng tạo cụm chồi ở A32.23 và A.26.218 trong môi trƣờng
MS* bổ sung 0,2mg/l Kinetin + 0,1mg/l NAA + (0,2-1,5 mg/l BAP) sau 4
tuần ni cấy ................................................................................................... 22
Bảng 3.3 Kết quả kích thích tăng trƣởng chồi ở A32.23 và A.26.218 trong
mơi trƣờng MS* có bổ sung 1 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA + (0,1-0,5 mg/l)
Kinetin sau 4 tuần nuôi cấy ............................................................................. 24
Bảng 3.4 Kết quả ảnh hƣởng củ ánh sáng đến khả năng tăng trƣởng chồi các
dòng A32.23 và A.26.218 (sau 4 tuần nuôi cấy) ............................................ 25
Bảng 3.5 Ảnh hƣởng củ IBA đến khả năng r rễ của chồi in vitro sau 3 tuần
nuôi cấy ........................................................................................................... 27
Bảng 3.6 Ảnh hƣởng của giá thể đến khả năng sống và sinh trƣởng của cây in

vitro các dòng Tràm trà ở vƣờn ƣơm s u 3 tháng r ngôi .............................. 28

iv


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây Tràm trà tại Australia .................................................................. 3
Hình 1.2 Hoa Tràm trà. ..................................................................................... 4
Hình 1.3 Một số sản phẩm từ tinh dầu Tràm trà sản xuất tại Australia ............ 6
Hình 1.4 Dự báo thị trƣờng tinh dầu Tràm trà tồn cầu gi i đoạn 2019-2030. 7
Hình 3.1 Mẫu sạch các dòng Tràm trà khi khử trùng Javel 5% trong thời gian
10 phút ............................................................................................................. 21
Hình 3.2 Cụm chồi ở 2 dịng A32.23 và A.26.218 trong mơi trƣờng MS* bổ
sung 0,2mg/l Kinetin + 0,1mg/l NAA + 1,0 mg/l BAP) sau 4 tuần ni cấy. 23
Hình 3.3 Chồi 2 dịng A32.23 và A26.218 trong mơi trƣờng kích thích tăng
trƣởng chồi MS* có bổ sung 0,5mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA + 1,0 mg/l
BAP ................................................................................................................. 25
Hình 3.4 Cụm chồi 2 dịng A.32.23 và A26.218 trong điều kiện chiếu sáng
tối ƣu................................................................................................................ 26
Bảng 3.5 Ảnh hƣởng củ IBA đến khả năng r rễ của chồi in vitro sau 3 tuần
ni cấy ........................................................................................................... 27
Hình 3.5 Rễ Tràm trà dịng A32.23 và A26.218 ............................................. 28
Hình 3.6 Tràm trà trồng trên các loại giá thể khác nhau sau 3 tháng trồng .... 30

v


BẢNG KÍ TỰ VIẾT TẮT
ê đầy đủ

STT

Ký hiệu

1

BAP

Benzyl aninopurine

2

ĐHST

Điều hồ sinh trƣởng

3

LV

Môi trƣờng cơ bản của Litvay, 1985

4

MS

Murashige and Skoog (một loại môi trƣờng nuôi cấy mô)

5

MS*

Môi trƣờng Murashige and Skoog cải tiến

6

NAA

Naphthalene acetic acid

7

IBA

Indole butiric acid

8

IAA

3-Indole acetic acid

9

BA

6-benzyladenine

10

STT

Số thứ tự

11

TB

Trung bình

12

WPM

Woody plant medium ( mơi trƣờng trong ni cấy mô cây
thân gỗ)

vi


ẶT VẤ

Ề

Tràm (Melaleuca) là chi thực vật có đến 290 loài, đ số các loài tràm là
cây đ tác dụng, có thể để lấy gỗ, tinh dầu, ni ong, làm cây bảo vê đất nông
nghiệp, cây đƣờng phố và cây trong công viên Brophy J.J và cs., 2013 .
Một trong những giá trị lớn nhất củ các loài tràm là sản xuất tinh dầu ứng
dụng trong y học và m phẩm. Tinh dầu tràm là tên gọi chung cho các loại

tinh dầu đƣợc chƣng cất từ lá tràm, gồm nhiều hợp chất thiên nhiên có giá trị
nhƣ 1,8-cineole, terpinen-4-ol, nerolidol và lin lool v.v..., trong đó 1,8cineole, terpinen-4-ol là những loại tinh dầu đƣợc tiêu thụ nhiều nhất, tiếp đến
là nerolidol và linalool có giá trị dƣợc liệu và hƣơng liệu c o đƣợc dùng trong
sản xuất nƣớc hoa và m phẩm Khuất Thị Hải Ninh, 2016 .
Tràm trà (Melaleuca alternifolia Maiden & E. Betche ex Cheel) chủ
yếu đƣợc trồng để sản xuất tinh dầu giàu terpinen-4-ol. Hiện nay loài cây này
đƣợc trồng phổ biến ở nhiều nơi trong đó có Việt Nam.
Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn đã gi o cho Viện Cải thiện
giống và Phát triển lâm sản chủ trì đề tài Nghiên cứu chọn giống, k thuật
trồng và chế biến tràm có năng suất tinh dầu c o đƣợc thực hiện trong 10
năm, gồm 2 gi i đoạn: gi i đoạn 1 2008-2012 , gi i đoạn 2 2013- 2017 do
GS.TS. Lê Đình Khả làm chủ nhiệm. Đề tài đã chọn và công nhận giống đƣợc
28 giống, trong đó 2 giống Tràm trà (A26.218 và A32.23) là những dịng vơ
tính có hàm lƣợng và chất lƣợng tinh dầu cao. Các giống tràm này đã đƣợc
Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là giống tiến bộ k thuật
theo quyết định số 3229/QĐ-BNN-TCLN ngày 01 tháng 8 năm 2017.
Để phát triển các giống Tràm trà này vào sản xuất Bộ Nông Nghiệp &
PTNT tiếp tục giao cho Viện Cải thiện giống và Phát triển lâm sản chủ trì dự
án

ả

Tràm trà (A36.217, A32.23, A26.218) mớ được công nhận tại một số tỉnh
miền Bắc và miề

” thực hiện trong gi i đoạn 2019 -2023.

1

Vì vậy, tiếp tục nghiên cứu và hồn thiện k thuật nhân giống in vitro cho
các giống Tràm trà có triển vọng là hết sức cần thiết. Trong giới hạn củ đề
tài tốt nghiệp đại học, tôi lựa chọn 2 dòng Tràm trà A32.23 và A26.218 để
thực hiện

ê

u

(Melaleuca alternifolia

r
t u t u

2

tr

ấy in vitro”.

v


ƢƠ
Ề NGHIÊN C U

TỔNG QUAN VẤ

1.1 ặ đ ểm sinh v t học và sinh thái học của Tràm trà
1.1.1 Đặ đ ểm sinh vật h c

Tràm trà (tên khoa học: Melaleuca alternifolia) là một lồi thực vật có
hoa trong Họ Đào kim nƣơng Myrt ce e , đƣợc miêu tả khoa học lần đầu
tiên năm 1924 Cheel., 1924 .
Trong tự nhiên, chỉ gặp cây Tràm trà mọc ho ng ở những nơi thấp vùng
duyên hải từ D rling Downs Queensl nd tới Hunter River vùng đầm lầy
New South W les thuộc Austr li

Nguyễn Văn Minh

, 2004).

Tràm trà là cây gỗ nhỏ có thể c o tới 7m. Thân th ng, vỏ trắng có thể
bóc thành nhiều lớp mỏng. Tán cây rậm rạp. Cành thƣờng r

Wilson, 2018).

Hình 1.1 Cây Tràm trà tại Australia
(Nguồn: Photo S. Goodwin 8 Nov 1999 ©The Royal Botanic Gardens
& Domain Trust)

Lá đơn mọc sole, hình ngọn giáo dài, đầu và đuôi lá nhọn dần, dài 1035mm, rộng 1mm; phiến lá mềm, nh n, màu lục sẫm, chứ nhiều tinh dầu
thơm. Hàm lƣợng tinh dầu c o nhất trong những tháng có nhiệt độ ấm hơn
(Orwa và cs., 2009).

3


Hoa mọc thành chùm có gai màu trắng hoặc màu kem dài 3–5 cm. Loài
này r hoa trong một thời gian ngắn, thƣờng từ tháng 2-3 và tạo cho v ngồi
củ cây nhƣ có lớp lơng tơ b o phủ Wilson, 2018 . Mù quả tháng 4-5. Quả

n ng, hình trụ, đƣờng kính 2–3 mm nằm rải rác dọc theo cành.

Hình 1.2 Hoa Tràm trà.
(Nguồn: Photo.J. Plaza 1990-The Royal Botanic Garden & Domain Trust)

1.1.2 Đặ đ ểm sinh thái học
Tràm trà là loài cây ƣ sáng và sống đƣợc ở nơi có nhiệt độ trung bình
tháng nóng nhất 27-31oC, tháng lạnh nhất 6-7oC, lƣợng mƣ trung bình năm
từ 1000-1600mm. Lồi này mọc đƣợc trên nhiều loại đất và nhạy cảm với
sƣơng giá (Orwa và cs., 2009).
1.2 Tác dụng và giá trị kinh tế của tinh dầu Tràm trà
1.2.1
Tinh dầu tràm trà te tree oil đƣợc chia thành 3 nhóm là: Nhóm 1 có
1,8-cineole thấp (3%) và terpinen-4-ol cao (45,4%), nhóm 2 có 1,8-cineole

4


trung bình (30,3%) và terpinen-4-ol trung bình (18%), nhóm 3 có 1,8-cineole
cao (64,1%) và terpinen-4-ol thấp (1,7%) (Wiliams and Home, 1989).
Một số tác dụng sinh học tinh dầu Tràm trà (giàu terpinen-4-ol) là:
- Tác dụng kháng khuẩn và kháng n m
Giống nhƣ tinh dầu tràm cajuput, tác dụng kháng khuẩn là tác dụng
đáng chú ý nhất của tinh dầu tràm trà. Một số thành phần hóa học trong tinh
dầu nhƣ lin lool, terpinen-4-ol, α-terpineol, α-terpinene, terpinolene và 1,8cineole c ng có tác dụng ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật nhƣ
Candida albicans, Escherichia coli và Staphylococcus aureus (MIC 0,060,50%) (Carson và cs.,1995).
Tinh dầu tràm trà đƣợc chứng minh là có tác dụng ngăn chặn sự phát
triển của nấm và ức chế quá trình hình thành bào tử. Theo đó tinh dầu tràm trà
có tác dụng kháng Candida albicans, các men, nấm trên da.
Do có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm mạnh và không hại da nên

tinh dầu Tràm trà đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực đời sống nhƣ nƣớc súc
miệng, m phẩm bôi d , nƣớc hoa, dầu gội đầu, xà phòng thơm, kem đánh
răng, v.v. Brophy và cs., 2013). Ngoài ra, tinh dầu tràm trà sử dụng trực tiếp
để trị mụn cóc, nám da do nấm, v.v.
- Tác dụng kháng virus và chống viêm
Tinh dầu tràm trà có khả năng chống lại virus khảm thuốc lá, virus
Herpes simplex (HSV). Ảnh hƣởng của tinh dầu tràm trên virus Herpes
simplex đã đƣợc Schnitzler và cs., (2001) nghiên cứu bằng cách ủ virus với
các nồng độ tinh dầu khác nh u và dùng các virus đã đƣợc xử lý này để gây
nhiễm tế bào. Ngoài ra, tinh dầu tràm trà c ng thể hiện có hoạt tính kháng
virus mạnh nhất trên virus tự do, ức chế hoàn toàn sự hình thành mảng bám
với 1% tinh dầu và làm giảm hình thành mảng bám khoảng 10% với 0,1%
tinh dầu (Minami và cs., 2003).

5


- Tác dụng chữa trị một số b nh ngoài da
Tinh dầu tràm trà là loại thuốc chữa các bệnh ngồi d thơng thƣờng rất
có hiệu quả nhƣ mụn trứng cá, mụn nhọt, eczema; nhiễm trùng d nhƣ mụn
rộp, vết thƣơng, mụn cóc, bỏng, cơn trùng cắn và bệnh nấm móng tay, bệnh
nấm da bàn chân, mồ hơi chân, nhọt, nấm onychia (onychomycosis) (Carson
và cs., 1994; Tong và cs., 1992).

Hình 1.3 M t s sản phẩm từ tinh dầu Tràm trà sản xuất tại Australia
(Nguồn: Google)

Tác dụng sinh học của tinh dầu tràm trà rất đ dạng, ngoài việc sử dụng
nhƣ một loại dƣợc liệu đ tác dụng, một số tinh dầu tràm còn chứa các chất
thơm nhƣ nerolidol, lin lool, v.v., nên tinh dầu tràm còn đƣợc dùng nhƣ một

thành phần của nhiều loại m phẩm và dầu tắm, dầu gội đầu, đặc biệt đƣợc
dùng trong các spa ở nhiều nƣớc trên thế giới.
1.2.2 Giá tr kinh tế c a tinh d u Tràm trà
Theo báo cáo củ Emergen Rese rch 2022 , thị trƣờng tinh dầu tràm
trà toàn cầu đạt 53,0 triệu đô l M năm 2021, dự đoán tốc độ tăng trƣởng kép
hàng năm là 5,9% gi i đoạn 2022-2030. Trong đó, thị trƣờng Bắc M chiếm
t trọng do nh thu lớn nhất 43,2% tổng do nh thu toàn cầu năm 2021, tiếp
6


theo là khu vực Châu Á-Thái Bình Dƣơng và Châu

u. Dự báo đến năm

2030, thị trƣờng tinh dầu tràm trà tồn cầu đạt 88,5 triệu đơ l M .

Hình 1.4 Dự báo thị trƣờng tinh dầu Tràm trà toàn cầu

a đoạn 2019-2030.

(Nguồn: Emergen Research)

1.3 Các nghiên c u về cây Tràm trà trên thế giới
Giống Tràm trà chất lƣợng c o là giống có t lệ terpinen-4-ol c o, t lệ
limonene và 1,8-cineole thấp khi đánh giá hàm lƣợng các thành phần có trong
tinh dầu. Theo Tiêu chuẩn tinh dầu Tràm trà giàu terpinen-4- ol ISO4730:2017 (ATTIA, 2017) thì t lệ terpinen-4-ol là 35-48%, limonene là 0,51,5%, 1,8-cineole là <10% (Lê Đình Khả và cs., 2018).
1.3.1 Nghiên cứu về ch n giống
Australi đã thực hiện dự án chọn lọc và cải thiện giống Tràm trà từ
năm 1993. S u gi i đoạn 1 (1993-1996), nhờ trồng các xuất xứ đƣợc chọn mà
sản lƣợng tinh dầu Tràm trà củ Austr li đã tăng lên 20%, trong lúc vẫn giữ

đƣợc t lệ 1,8-cineole thấp ở mức 2-3% theo yêu cầu thị trƣờng lúc đó. Gi i
đoạn 2 của dự án đƣợc tiếp tục trong các năm 1996-2001 và đã góp phần nâng
tăng thu di truyền đáng kể.
Cây đƣợc coi là lý tƣởng để trồng tràm lấy tinh dầu là có sinh khối lớn,
hàm lƣợng tinh dầu c o, đạt chất lƣợng tinh dầu theo u cầu thị trƣờng, có
13 khả năng thích ứng với các điều kiện sinh thái và có khả năng chống sâu
bệnh (Doran và cs., 2002).
7


Năm 1994, các khảo nghiệm hậu thế Tràm trà đã đƣợc xây dựng tại
Wyrallah và Teven ở New South Wales (Australia). Kết quả nghiên cứu tại 2
khảo nghiệm ở Wyrallah (khảo nghiệm cây chồi 19 tháng tuổi và vƣờn giống
hữu tính thế hệ một 25 tháng tuổi) cho thấy hàm lƣợng tinh dầu trung bình
tính theo khối lƣợng lá khơ đạt 4,52% tƣơng đƣơng 1,68% tính theo khối
lƣợng lá tƣơi , t lệ 1,8-cineole 4,3%, terpinen-4-ol 35,6%. Trong đó 2 xuất
xứ vƣợt trội cả về hàm lƣợng và chất lƣợng tinh dầu là C ndole hàm lƣợng
14 tinh dầu theo khối lƣợng lá khơ 5,11% - tƣơng đƣơng 1,9% tính theo khối
lƣợng lá tƣơi; t lệ 1,8-cineole 3,2%; terpinen-4-ol 36,7%) và Devils (có các
chỉ tiêu trên tƣơng ứng 5,2%; 2,2% và 36,3%). Hai xuất xứ này đều có t lệ
cây sống đạt 80%, chiều c o tƣơng ứng 1,76 m và 1,88 m (Doran và cs.,
2002).
S u 5 năm chọn lọc và nhân giống Williams (1997) đã chọn đƣợc siêu
dòng 88

supper clone "88") Tràm trà với t lệ terpinen-4-ol từ 42 - 44% và

t lệ 1,8-cineole từ 0,5 - 1%, vƣợt yêu cầu chất lƣợng tinh dầu Tràm trà trên
thị trƣờng lúc đó là terpinen-4-ol 35,5% và 1,8-cineole 5,5%) (Burfield và
H nger, 2000 . Năm 1998, siêu dòng 88 đã đƣợc đƣ vào sản xuất trên quy

mô thƣơng mại ở Artheton và Queensland.
Trung Quốc đã nhập giống Tràm trà từ Austr li đầu những năm 2000 để
nghiên cứu chọn giống. Viện Nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây đã chọn
đƣợc các dịng vơ tính Tràm trà có chất lƣợng tinh dầu c o. Đến năm 2005
Trung Quốc đã trồng 200 - 300 ha Tràm trà, sản lƣợng tinh dầu hàng năm đã
đạt 60-80 tấn, trong đó 40 - 50 tấn tinh dầu là có chất lƣợng cao với t lệ
terpinen-4-ol 40 - 50%, t lệ 1,8 cineole dƣới 3% (Chunmao, 2005), có khả
năng cạnh tranh với tinh dầu Tràm trà của Australia do giá thành thấp hơn.
1.3.2 Nghiên cứu về nhân giống
Thực tế, việc nhân giống bằng hạt các giống tràm bị hạn chế do t lệ
nảy mầm chỉ khoảng 10% , tỉ lệ nhân giống thấp, không thể giữ đƣợc đặc
tính tốt củ cây mẹ gây hạn chế trong việc tạo r tinh dầu có sản lƣợng và
8


chất lƣợng cao (Xiao Yufei và cs., 2017 . Vì vậy, ngƣời t thƣờng lự chọn
nhân giống sinh dƣỡng Tràm trà.
1.3.2.1 Nhân giống bằng hom
Nghiên cứu giâm hom Tràm trà ở Australia cho thấy sau 41 ngày hom
bắt đầu ra rễ và t lệ hom ra rễ tăng dần đến 69 ngày, hom đã đƣợc tr hố có
t lệ ra rễ đạt 26,1% c o hơn hom đƣợc lấy từ cây trƣởng thành (chỉ đạt
11,2%). Tr hoá cây mẹ lấy hom vào cuối mù đông và lấy hom vào giữa mùa
hè là thích hợp, hom đƣợc xử lý IBA ở nồng độ 3 g/l 3000 ppm để tạo rễ
(Mervyn Shepherd và cs., 2013).
Tại Br zil, Nghiên cứu Xử lí uxin và hó chất ph chất điều hị sinh
trƣởng trong nhân giống sinh dƣỡng Tràm trà cho thấy phƣơng pháp xử lý
hom bằng IBA

N OH 500 mg/l xit indolebutyric đƣợc pha loãng trong

dung dịch n tri hydroxit 0,5N là phƣơng pháp xử lý phù hợp nhất cho loài
này, cho kết quả t lệ r rễ đạt 16,66%, số lƣợng rễ trung bình là 2,50 rễ/cây
và chiều dài rễ trung bình là 3,44 M rcelo Pereir và cs., 2021).
1.3.2.2 Nhân giống bằng nuôi c y mô
Nghiên cứu nuôi cấy mô Tràm trà đƣợc thực hiện từ năm 1996, chồi
non (từ cây trƣởng thành đã đƣợc tr hoá đƣợc sử dụng để tạo mẫu sạch, với
độ dài 1,5 - 3 cm cấy vào môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP để nhân chồi
trong 12 tuần, s u đó cấy chuyển s ng mơi trƣờng tạo rễ MS bổ sung 0,15
mg/l IAA trong 8 tuần (List và cs., 1996).
Một nghiên cứu khác cho Tràm trà sử dụng 16 môi trƣờng MS và
WPM ở dạng rắn và lỏng, bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau (từ 0; 0,125;
0,25; 0,5; 0,75 và 1 mg/l để nghiên cứu khả năng nhân chồi. Công thức tốt
nhất cho nhân chồi là mơi trƣờng MS rắn có bổ sung 0,125 mg/l BAP hoặc
MS lỏng bổ sung 0,25 mg/l BAP với số chồi tạo r tƣơng ứng 5,6 và 11,8
chồi/mẫu cấy b n đầu. Trên môi trƣờng WPM rắn bổ sung 0,125 mg/l BAP
và môi trƣờng WPM lỏng bổ sung 0,125 mg/l BAP số chồi tạo r tƣơng ứng
là 5,5 và 4,7 chồi/mẫu cấy b n đầu. Ba loại chất điều hoà sinh trƣởng khác
9


nh u NAA, IAA và IBA đã đƣợc thử nghiệm ở nồng độ 0,1 mg/l và 0,5
mg/l trong gi i đoạn tạo rễ in vitro và công thức đối chứng là khơng sử dụng
chất điều hồ sinh trƣởng, kết quả là khi sử dụng chất điều hoà sinh trƣởng rễ
xuất hiện sau 8 ngày nuôi cấy, môi trƣờng không sử dụng chất điều hoà sinh
trƣởng rễ xuất hiện sau 12 ngày. Tuy nhiên tác giả c ng kết luận chất điều hồ
sinh trƣởng bổ sung vào mơi trƣờng ni cấy không cần thiết khi ra rễ in vitro.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ đƣờng sucrose (15; 30 và 45 g/l) và loại
mơi trƣờng ni cấy (MS; ½ MS; MS + than hoạt tính và ½ MS + than hoạt
tính đến khả năng tạo rễ cho thấy môi trƣờng MS + 30 g/l sucrose và khơng
có chất điều hồ sinh trƣởng cho t lệ chồi ra rễ đạt 100%, trung bình đạt 3

rễ/chồi, chiều dài rễ đạt 2,2 cm. Than hoạt tính đƣợc thêm vào mơi trƣờng
ni cấy làm giảm t lệ chồi ra rễ (Yohana de Oliveira và cs., 2010).
Nghiên cứu nuôi cấy mô Tràm trà từ chồi nách cây trƣởng thành, chồi
đƣợc cắt và rửa sạch dƣới vòi nƣớc chảy trong 15 phút một cách cẩn thận, sau
đó lắc cồn 70% trong 30 giây, rồi khử trùng bằng natri hypochlorite 10%
trong 10 phút, s u đó rửa nhiều lần bằng nƣớc cất vô trùng. Mẫu tiệt trùng
đƣợc thấm khô trên giấy lọc vô trùng trƣớc khi cấy trên mơi trƣờng MS có bổ
sung 0,5 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA với 77% mẫu đ chồi và 23 chồi/mẫu cấy.
Gi i đoạn tạo rễ in vitro sử dụng môi trƣờng MS bổ sung 1 mg/l IBA t lệ
chồi ra rễ 33,3% (Nadia Mohd Tasriba và cs., 2012).
Nghiên cứu nhân giống in vitro Tràm trà cho thấy, việc bổ sung
cytokinin làm tăng mạnh sự nhân chồi ở Tràm. Các chồi in vitro riêng l đƣợc
xử lý trƣớc đó bằng BA cho thấy sự phát triển ra rễ tốt hơn so với mơi trƣờng
ni cấy khơng có BA. Trong nghiên cứu này, các nồng độ khác nhau của 6benzyl denine BA

0, 0,55, 1,11 và 2. 22 µM đã đƣợc thử nghiệm trong

gi i đoạn nhân lên in vitro. Ngƣời ta quan sát thấy rằng ngay cả nồng độ BA
thấp nhất 0,55 µM c ng có thể làm tăng đáng kể t lệ nhân giống ở Tràm, so
với xử lý khơng có BA, do sự tăng sinh nhiều chồi. Ở gi i đoạn ra rễ, trong
mơi trƣờng ni cấy khơng có chất điều hòa thực vật, các chồi riêng l đƣợc
10


xử lý bằng BA trƣớc đó có t lệ ra rễ c o hơn 91–97% và tăng trƣởng chiều
c o đáng kể so với các chồi ở nghiệm thức đối chứng (khơng có BA) (66%)
(Carla Midori Iiyama, Jean Carlos Cardoso, 2021).
1.4 . Các nghiên c u về cây Tràm trà ở Việt Nam
1.4.1 Nghiên cứu về ch n giống
Tràm trà M. lternifoli

đƣợc nhập vào nƣớc ta lần đầu vào năm 1986

tại Trạm Dƣợc liệu Văn Điển, s u đó đƣợc trồng tại một số nơi ở miền Bắc và
miền Nam. Các lơ hạt đƣợc nhập bao gồm cả nhóm giàu 1,8-cineole (ở Văn
Điển, Ba Vì và một số nơi tại Đồng bằng Sơng Cửu Long) lẫn nhóm giàu
terpinen-4-ol (ở Phú Yên).
Nghiên cứu Tràm trà tại một số điểm ở miền Bắc nƣớc ta cho thấy sau
3 năm trồng hàm lƣợng tinh dầu có thể đạt 1,75 - 2,20% và th y đổi theo mùa,
t lệ terpinen-4-ol có thể đạt 33-43% (Nguyễn Văn Nghi, 2000 . Tuy vậy, kết
quả phân tích năm 2008 cho các mẫu tinh dầu chƣng cất từ lá Tràm trà trồng
tại Văn Điển, lại thấy t lệ terpinen-4-ol chỉ đạt 5,25%, trong khi t lệ 1,8cineole là 66,2% Lê Đình Khả, 2009). Phân tích mẫu thu từ khu trồng thử tại
Đồng bằng Sông Cửu Long c ng thấy t lệ 1,8-cineole là 40,73%, trong lúc t
lệ terpinen-4-ol chỉ đạt 11,85%. H i dòng Tràm trà đƣợc Phùng Cẩm Thạch
chọn tại Thạnh Hoá (từ quần thể chỉ 20 cây M. alternifolia lấy từ Phú Yên)
c ng thấy t lệ terpinen-4-ol dƣới 40% Lê Đình Khả, 2012).
Kết quả khảo nghiệm hậu thế Tràm trà (M. alternifolia) mới nhập từ
CSIRO củ Austr li

Lê Đình Khả và cs., 2018) cho thấy, các dịng vơ tính

Tràm trà (xuất xứ Candole NSW) có triển vọng tại Ba Vì là A26.218, A32.23,
A36.217, A38.39, A38.124 và A38.317. Đây là những dịng vơ tính có t lệ
sống c o >80% , hàm lƣợng tinh dầu 3,06 - 3,87%, c o hơn 13,3 - 48,3% so
với giống A26 và A38 hàm lƣợng 2,61% và 2,7%), rất có triển vọng tại đây,
đặc biệt dịng A36.217 có sinh trƣởng nhanh nhất, hàm lƣợng tinh dầu 3,15%
với t lệ terpinen-4-ol 43,25% (cao nhất trong các giống Tràm trà khảo
nghiệm tại B Vì . Riêng A38.124 đã ni cây mơ thành công. Các giống
11

Tràm trà A26, A32 và A38 tại Ba Vì đã đƣợc Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn công nhận là giống tiến bộ k thuật theo quyết định số 3229/QĐBNN-TCLN ngày 01 tháng 8 năm 2017.
1.4.2 Nghiên cứu về nhân giống
1.4.2.1 Nhân giống bằng hom
Xử lý hom Tràm trà bằng IAA và IBA (dạng nƣớc) nồng độ 500 ppm,
ABT nồng độ 1000 ppm vào mùa xuân sau 50 - 70 ngày có t lệ ra rễ 90 100% Nguyễn Văn Nghi, 2000 , hoặc hom lấy từ chồi vƣợt của cây mẹ 1
năm tuổi rồi xử lý IBA (dạng bột) nồng độ 0,25% và 0,75% c ng cho t lệ ra
rễ 90 - 93%, chiều dài rễ 7,6 - 7,7 cm (Hà Thị Kim Thoa, 2010).
1.4.2.2 Nhân giống bằng nuôi c y mô
Một số nghiên cứu nhân giống Tràm trà bằng ni cấy mơ đã đƣợc tiến
hành và có những kết quả nhất định.
Nghiên cứu nuôi cấy mô Tràm trà bƣớc đầu cho thấy thời kỳ vào mẫu
thích hợp từ tháng 4 – 9, chồi non (củ cây đã đƣợc tr hố đƣợc xử lý bằng
HgCl2 0,1% trong vịng 4 - 5 phút. Môi trƣờng nhân nh nh chồi Tràm trà MS
bổ sung 2 mg/l BAP + 1,5 mg/l GA3 + 2 g/l than hoạt tính Lê Sơn, 2011 .
Nghiên cứu khác đối với Tràm trà cho thấy sử dụng chồi đỉnh của cây 4
năm tuổi, mẫu đƣợc khử trùng với HgCl2 0,1% trong 10 phút, s u đó khử
trùng bằng dung dịch javel (75%) trong 15 phút cho t lệ mẫu sạch nảy chồi
70,59%. Mơi trƣờng thích hợp tái sinh chồi và nhân chồi là LV môi trƣờng
cơ bản của Litvay, 1985) có bổ sung 0,5 mg/l BAP (tạo 1,1 chồi/mẫu cấy
trong gi i đoạn tái sinh chồi, tạo 13,2 chồi/cụm trong gi i đoạn nhân nhanh
chồi . Trong mơi trƣờng LV có bổ sung 1 - 2 mg/l BAP mẫu cấy có xu hƣớng
tạo chồi song kìm hãm chồi phát triển chiều cao (thân lá nhỏ). Môi trƣờng LV
có bổ sung 2 mg/l NAA cho t lệ chồi ra rễ cao nhất đạt 60,42% M i Phƣơng
Ho và cs., 2013 .
Gi i đoạn 2 2013-2017) đề tài Nghiên cứu chọn giống tràm củ GS.TS
Lê Đình Khả đã nhân giống thành công bằng nuôi cấy mô một số dịng vơ
12

tính tràm trà có triển vọng nhƣ A38.124, A38.39 và A30.310. Khử trùng mẫu
bằng HgCl2 0,1% trong 5 phút chia thành 2 lần (3 phút + 2 phút) cho t lệ
mẫu sạch và mẫu sạch nảy chồi hữu hiệu cao nhất (t lệ mẫu sạch nảy chồi
67,8% . Môi trƣờng tái sinh chồi thích hơp nhất là MS bổ sung 1 mg/l BAP
+ 0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NAA (100% mẫu tạo cụm chồi; 6,41 chồi/cụm
và chiều cao chồi 0,9 cm . Mơi trƣờng tạo cụm chồi thích hợp là MS* + 7g/l
agar + 1 mg/l BAP + 0,2 mg/l Kinetin + 0,15 mg/l NAA, bổ sung 10g/l
glucose + 20 g/l sucrose. Ở mơi trƣờng này có t lệ mẫu tạo cụm chồi 100%
và 5,45 chồi/cụm. Mơi trƣờng kích thích tăng trƣởng chồi thích hợp là MS* +
0,3 mg/l Kinetin

0,1 mg/l BAP

0,1 mg/l NAA tăng trƣởng 2,2 cm sau 6

tuần ni cấy . Mơi trƣờng tạo cây con hồn chỉnh trong ống nghiệm phù hợp
nhất là MS* + 0,3 mg/l NAA (t lệ ra rễ 98,7%, rễ có chất lƣợng tốt).
1.5 M t s nh

định chính

Từ các nghiên cứu trên cho thấy, Tràm trà đƣợc trồng ở Việt Nam gồm
cả hai nhóm là giàu terpinen-4-ol và giàu 1,8-cineole. Vì thế có thể chọn giống
theo cả h i hƣớng là giàu 1,8-cineole lẫn giàu terpinen-4-ol. Những năm gần
đây, tinh dầu Tràm trà có thị trƣờng rộng lớn khắp các châu lục, giá thành cao,
dự báo ngành công nghiệp tinh dầu Tràm trà ngày càng phát triển mạnh mẽ.
Có thể thấy, Tràm trà mang lại giá trị rất lớn về kinh tế. Để có đƣợc những
cánh rừng Tràm trà có chất lƣợng về giống thì việc nhân các giống đã đƣợc Bộ
Nông nghiệp và Phát triển nông thôn công nhận là điều hết sức cần thiết.

Các nghiên cứu về nhân giống Tràm trà bằng biện pháp giâm hom cho
thấy khả năng r rễ củ hom thân kém. Bên cạnh đó, cây con phát triển từ hạt
thƣờng tạo r nhiều biến dị di truyền, trong đó có những biến dị khơng cịn
m ng những đặc điểm tốt củ cây mẹ. Ngƣợc lại, khi nhân giống lồi cây này
bằng k thuật ni cấy mô in vitro lại khá thành công về mặt chất lƣợng lẫn
số lƣợng. Vì vậy, trồng Tràm trà đƣợc ni cấy mơ đƣợc coi là một hƣớng đi
có triển vọng trong thời gian tới. Các nghiên cứu nhân giống in vitro Tràm trà
trên thế giới và Việt N m là cơ sở để đề tài tiến hành các nghiên cứu cho 2
dòng A32.23 và A26.218.
13


ƢƠ
Ố

MỤC TIÊU, NỘ

Ƣ

ƢƠ

VÀ
U

2.1 Mục tiêu nghiên c u
- M c tiêu chung: Hoàn thiện đƣợc k thuật nhân giống in vitro các dịng vơ
tính A32.23 và A26.218 Tràm trà.
- M c tiêu c thể:
+ Xác định đƣợc phƣơng pháp khử trùng thích hợp tạo mẫu sạch cho
ni cấy mơ các dịng vơ tính Tràm trà (A32.23, A26.218);

+ Xác định đƣợc chất điều hịa sinh trƣởng và ánh sáng thích hợp để
nhân nhanh chồi dịng vơ tính Tràm trà (A32.23, A26.218);
+ Xác định đƣợc môi trƣờng tạo rễ chồi in vitro dịng vơ tính Tràm trà
(A32.23, A26.218);
+ Xác định đƣợc loại giá thể phù hợp để r ngôi cây mô gi i đoạn vƣờn ƣơm.
2.2 N i dung nghiên c u
- Nghiên cứu ảnh thời gian khử trùng bằng Javel 5% đến khả năng tạo
mẫu sạch;
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hò sinh trƣởng và ánh sáng đến
khả năng nhân nhanh chồi;
- Nghiên cứu ảnh hƣởng củ IBA đến khả năng tạo rễ;
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của loại giá thể đến khả năng sinh trƣởng của
cây mô gi i đoạn vƣờn ƣơm.
2.3

tƣợng, v t liệu và địa đ ểm nghiên c u
- Đối tƣợng nghiên cứu: Dịng vơ tính Tràm trà A32.23, A26.218 do

Viện Cải thiện giống và Phát triển lâm sản cung cấp.
- Vật liệu nghiên cứu: Chồi non mọc từ cây mẹ đã tiến hành tr hóa
trƣớc thời điểm lấy mẫu 1-1,5 tháng
- Đị điểm nghiên cứu: Tiến hành nghiên cứu ở phịng thí nghiệm Viện
Cơng nghệ sinh học – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp.
14


ƣơ

2.4

p

p

ê

u

Nghiên cứu đƣợc tiến hành theo các bƣớc tạo mẫu sạch, tạo cụm chồi,
kích thích tăng trƣởng chồi, tạo cây con hồn chỉnh và trồng cây mơ r vƣờn
ƣơm. Mỗi cơng thức thí nghiệm đƣợc bố trí 3 lần lặp, mỗi lần lặp 30 mẫu.
Nhiệt độ phịng ni 25 ± 20C.
đ

ứ

ấ

tuyể
do V

trà

ọ

v t

Cả

ố

r
P á

tr
l

a

l

ớ

đề

ả

p

á

v
o

á đị

á đị

t
ư

ồ

â

2.4.1 P

ể l

u ấy

tạo ụ
á đị

tr

t

trƣở

á

á

độ

ờ
loạ

á ể

bố trí thí nghi m

Gi i đoạn 2 2013-2017 đề tài Nghiên cứu chọn giống, k thuật trồng
và chế biến tràm có năng suất tinh dầu c o đã nhân giống in vitro thành cơng
một số dịng vơ tính tràm trà có triển vọng nhƣ A38.124, A38.39 và A30.310.
15


Kế thừa kết quả này, đề tài tiến hành sử dụng môi trƣờng MS* (nồng độ
NH4NO3 giảm đi 1/2 so với MS là môi trƣờng cơ bản trong nghiên cứu các
gi i đoạn nhân chồi, kích thích tăng trƣởng chồi và ra rễ.
2.4.1.1 Nghiên cứu tạo mẫu sạch (thí nghi m 1)
- Chọn mẫu cấy: Mẫu đƣợc sử dụng là chồi bên thân cây đã đƣợc tr
hoá chồi 1-1,5 tháng tuổi .
- Khử trùng sơ bộ mẫu cấy: Cắt bỏ lá để lại một phần lá và cuống lá,
loại bỏ chồi ngọn đỉnh trên cùng quá non. S u đó, ngâm cành vào dung dịch
xà phịng lỗng, dùng chổi rử để cọ sạch bề mặt ngoài của mẫu. Tráng rử
cành dƣới vòi nƣớc chảy cho sạch hết dung dịch xà phòng đi rồi dùng nƣớc
cất tráng sạch mẫu chuyển vào trong phịng để thực hiện k thuật trong box
cấy vơ trùng.
- Khử trùng trong box cấy: Thực hiện trong box cấy vô trùng, đầu tiên
mẫu đƣợc rử bằng nƣớc cất vô trùng 2-3 lần, mỗi lần rử khoảng 2-3 phút.
S u đó mẫu đƣợc khử trùng bằng Javel 5% với thời gi n 5, 10, 15 hoặc 20
phút. Cuối cùng, mẫu đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng từ 2-3 lần để loại
bỏ chất tẩy rửa còn dự lại trên mẫu vật.
- Mẫu đƣợc cấy vào môi trƣờng 1/2MS

30g đƣờng sucrose + 7g/l

Ag r, pH môi trƣờng = 5,8 s u khi đƣợc cắt bỏ bớt những phần mô bị tổn
thƣơng do ngấm dung dịch Javel mẫu cấy có chiều dài 2-3cm, có ít nhất 1
mắt ngủ .
- Thu thập số liệu: Sau 3 tuần nuôi cấy. Các chỉ tiêu thu thập: số mẫu
sạch nảy chồi, số mẫu sạch chết và số mẫu nhiễm.
2.4.1.2 Nghiên cứu t o
*Ả

ư ng của ch

đề

ị

ư

đến khả

ạo cụm chồi (thí

nghi m 2).
Kế thừa kết quả nghiên cứu nhân giống in vitro một số dòng vơ tính
tràm trà có triển vọng nhƣ A38.124, A38.39 và A30.310 củ đề tài Nghiên
cứu chọn giống, k thuật trồng và chế biến tràm có năng suất tinh dầu c o ,
16


gi i đoạn tạo cụm chồi các dòng nghiên cứu A32.23 và A26.218 đề tài tiến
hành cố định 0,1 mg/l NAA và 0,2 mg/l Kinetine, th y đổi nồng độ BAP 0,2 1,5 mg/l BAP. Thí nghiệm đƣợc thiết kế nhƣ s u:
- CT1: MS* +0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NA A + 0,2mg/l BAP

- CT2: MS* +0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NA A + 0,4mg/l BAP
- CT3: MS* +0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NA A + 0,6mg/l BAP
- CT4: MS* +0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NA A + 0,8 mg/l BAP
- CT5: MS* +0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NA A + 1,0 mg/l BAP
- CT6: MS* +0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NA A + 1,2 mg/l BAP
- CT7: MS* +0,2 mg/l Kinetin + 0,1 mg/l NA A + 1,5 mg/l BAP
- Cƣờng độ ánh sáng đƣợc sử dụng trong suốt chu kỳ nuôi là 1000 lux
- Thu thập số liệu: Sau 4 tuần nuôi cấy. Các chỉ tiêu thu thập: t lệ mẫu
tạo cụm chồi, chiều cao chồi.
*Ả

ư ng của Kinetin đến khả

í

í

ư ng chồi (thí nghi m 3)

- Sử dụng cơng thức tốt nhất ở thí nghiệm 2 tiếp tục điều chỉnh nồng độ
Kinetin từ 0,1-0,5mg/l.
- Môi trƣờng MS* bổ sung 20g/l đƣờng sucrose

10g/l đƣờng glucose

+ 6g/l Agar, pH= 5,8.
- Ánh sáng đƣợc sử dụng là 1000 lux trong suốt chu kỳ nuôi
- Thu thập số liệu: Sau 4 tuần nuôi cấy. Các chỉ tiêu thu thập: t lệ chồi
hữu hiệu, chiều cao chồi.
* Ả

ư ng củ á

á

đến khả

í

í

ư ng chồi (thí

nghi m 4)
Môi trƣờng dinh dƣỡng: Sử dụng công thức tốt nhất của thí nghiệm 3,
nghiên cứu ảnh hƣởng của chế độ chiếu sáng đến khả năng kích thích tăng
trƣởng chồi.
AS1: Cƣờng độ chiếu sáng 2000 lux trong 1 chu kỳ nuôi,
AS2: Cƣờng độ chiếu sáng 1000 lux trong 1 chu kỳ ni,
AS3: Che sáng hồn tồn trong 1 tuần đầu sau khi cấy, s u đó chiếu sáng
ở cƣờng độ 1000 lux thời gian ni cịn lại của chu kỳ nuôi.
17


- Thu thập số liệu: Sau 4 tuần nuôi cấy. Các chỉ tiêu thu thập: t lệ chồi hữu
hiệu, chiều cao chồi, chất lƣợng chồi.
2.4.1.3 Ả

ư ng củ

đến khả

ễ của chồi in vitro (thí nghi m 5)

Nghiên cứu ảnh hƣởng củ IBA 0,5, 1, 1,5 và 2mg/l đến khả năng r
rễ của chồi in vitro.
Môi trƣờng đƣợc bổ sung MS*+ 20g đƣờng sucrose +10g glucose +
7g/l Agar, pH=5,8. Mẫu cấy đƣợc nuôi trong môi trƣờng vật lý:
- Số giờ chiếu sáng trong ngày: 10h/ ngày.
- Cƣờng độ ánh sáng 2000- 3000 lux.
- Nhiệt độ phịng ni 25 ±20C
- Thu thập số liệu: Sau 3 tuần nuôi cấy. Các chỉ tiêu thu tập: t lệ ra rễ,
chiều dài rễ, số rễ /chồi.
2.4.1.4 Ả
ư

ư ng của thành phần giá thể đế

ư

y

ơ

đoạn

ươ (thí nghi m 6)
- Cây mô đƣợc rử sạch g r cắt bớt rễ nếu rễ quá dài và ngâm trong

dung dịch Viben C nồng độ 3% hoặc các loại dung dịch chống nấm khác từ 35 phút.

- Từng cây đƣợc cấy trực tiếp vào bầu; kích thƣớc túi bầu 7x12cm hoặc
8x12cm, dán đáy, đục lỗ xung qu nh. Thành phần ruột bầu:
+ GT1: 100% là đất tầng B
+ GT2: 30% trấu hun và 70% đất
+ GT3: 30% giá thể trồng nấm Linh chi sau khi thu hoạch quả thể
và 70% đất.
- Thu thập số liệu: Sau 3 tháng r ngôi trong vƣờn ƣơm.
Các chỉ tiêu thu tập: tỉ lệ cây sống, chiều cao cây, chất lƣợng cây.
- Chất lƣợng cây đƣợc đánh giá nhƣ s u:
+ Cây tốt: Lá xanh đậm, tƣơi, thân mập kho .
+ Cây trung bình: Lá xanh nhạt, tƣơi, thân mập kho .
+ Xấu: Lá xanh nhạt, thân mảnh yếu.
18