bài giảng thí nghiệm sinh học phân tử

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 1

MỤC LỤC
BÀI Trang
BÀI 1. CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG 2
BÀI 2. NHÂN BẢN SAO DNA/GEN MỤC TIÊU BẰNG PHẢN ỨNG PCR 7
BÀI 3. TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ TẾ BÀO CHỦ 10
BÀI 4. PHÂN TÍCH PLASMID BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐO MẬT ĐỘ QUANG,
CẮT GIỚI HẠN VÀ ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE 13
BÀI 5. THU NHẬN DNA/PLASMID TINH SẠCH TỪ BỘ KIT TINH CHẾ DNA 18
BÀI 6. NỐI DNA VÀO PLASMID 20
BÀI 7. BIẾN NẠP PLASMID TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ E. coli 22
TÀI LIỆU THAM KHẢO 25











Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 2

BÀI MỞ ĐẦU
NỘI QUY PHÒNG THÍ NGHIỆM & GIỚI THIỆU MÔN HỌC
I. Những quy định chung

1. Những ngƣời không có nhiệm vụ không đƣợc vào phòng thí nghiệm
2. Vật dụng cá nhân để đúng nơi quy định
3. Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse, đeo khẩu trang, mang găng tay,
cột tóc gọn gàng.
4. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng thí nghiệm.
5. Không sử dụng trang thiết bị trong phòng thí nghệm khi chƣa đƣợc hƣớng dẫn cụ thể.
6. Không đƣợc mang hoá chất, dụng cụ khi chƣa đƣợc sự đồng ý của trƣởng phòng thí nghiệm.
7. Khi rời phòng thí nghiệm phải kiểm tra điện, nƣớc, khóa cửa.
II. Quy định an toàn
An toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng trong phòng thí nghiệm. Đặc biệt đối với phòng thí
nghiệm sinh học phân tử và thao tác trên gen, sinh viên cần tuân thủ nghiêm ngặt các quy tắc
an toàn do thƣờng xuyên phải tiếp xúc với hóa chất độc hại để đảm bảo an toàn cho bản thân và
những ngƣời xung quanh. Sau đây là một số quy tắc:
- Đọc kỹ tài liệu thực tập và nắm vững nguyên tắc, vật liệu, phƣơng pháp thực hành trƣớc
khi vào phòng thí nghiệm.
- Chỉ mang những dụng cụ tối thiểu cần cho thực tập (tài liệu, tập ghi, bút) vào chỗ làm. Tất
cả vật dụng khác cần để ở vị trí riêng biệt.
- Trƣớc khi bắt đầu thực tập, cần lau sạch mặt bàn với cồn 70%.
- Đối với các hóa chất sử dụng trong thực tập, cần xem rõ tên hóa chất trƣớc khi dùng.
Trƣờng hợp không rõ, sinh viên cần hỏi cán bộ hƣớng dẫn. Không tự ý làm thử để tìm hiểu.
- Phenol, chloroform là các hóa chất nguy hiểm, có khả năng gây bỏng. Vì vậy, khi thao tác
với các hóa chất này, sinh viên tuyệt đối cẩn thận, không để tiếp xúc trực tiếp với da, đặc biệt là
mắt. trƣờng hợp bị dây vào da, cần rửa ngay dƣới vòi nƣớc. Trƣờng hợp nặng hơn, sinh viên
phải báo ngay với cán bộ hƣớng dẫn thực tập.
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 3

- Ethidium bromide là một chất độc, có khả năng gây ung thƣ. Khi thao tác với hóa chất
này, sinh viên phải mang bao tay và thao tác cực kỳ cẩn thận. Không để vƣơng vãi dung dịch
ethidium bromide xung quanh vị trí làm việc. Đầu típ hút ethidium bromide, bản gel sau khi

điện di và dung dịch hút bỏ trong quá trình thí nghiệm phải bỏ đúng nơi quy định, không vứt bỏ
lung tung.
- Trƣờng hợp lỡ tay làm đổ hóa chất lên bàn thực tập phải lau ngay tránh để ngƣời khác sơ ý
đụng phải.
- Lắng nghe và thực hiện nghiêm túc các hƣớng dẫn của cán bộ phụ trách thực tập trong
việc dùng hóa chất cũng nhƣ trang thiết bị thí nghiệm. Trƣờng hợp xảy ra tai nạn, sự cố, cần
báo ngay với cán bô phụ trách thực tập để có biện pháp xử lý thích hợp.
- Trƣớc khi rời phòng thí nghiệm phải rửa sạch tay.
III. Giới thiệu môn học
Môn học thực tập sinh học phân tử giúp sinh viên làm quen với các kỹ thuật cơ bản của
công nghệ gen thông qua đó nắm vững, hiểu rõ hơn các khái niệm, kiến thức của công nghệ
gen và có thể bƣớc đầu tiến hành các thí nghiệm về thao tác trên gen.
3.1. Nội dung
Bài 1. Các khái niệm cơ bản về tạo dòng
Bài 2. Nhân bản sao DNA/gen mục tiêu bằng phản ứng PCR
Bài 3. Tách chiết plasmid từ tế bào chủ
Bài 4. Phân tích plasmid bằng các phƣơng pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và điện di
trên gel agarose
Bài 5. Thu nhận DNA/plasmid tinh sạch từ bộ kit tinh chế DNA
Bài 6. Nối DNA vào plasmid
Bài 7. Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào chủ E. coli
3.2. Phƣơng pháp dạy và học
- Bài học đƣợc tiến hành dƣới hình thức bài giảng và thao tác thực hành.


Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 4

3.3. Phƣơng pháp đánh giá
Nội dung các bài thực tập có liên quan với nhau, các kết quả thu đƣợc của bài thực tập trƣớc

đƣợc dùng làm nguyên liệu để thực hiện các bài tiếp theo. Vì thế cần lƣu ý bảo quản kết quả
của bài thực tập trƣớc để sử dụng cho bài sau.
TT
Nội dung đánh giá
Tổng số
Ghi chú
1
Chuyên cần (Đ1)
0.1

2
Kỹ năng thực hành (Đ2)
0.3

3
Viết báo cáo (Đ3)
0.3

4
Kiểm tra kết thúc môn (Đ4)
0.3


Điểm môn học = (Đ1 x 0.1) + (Đ2 x 0.3) + (Đ3 x 0.3) + (Đ4 x 0.3)
IV. Phân công trực vệ sinh
- Dọn dẹp bàn ghế
- Sắp xếp đồ đạc
- Đổ rác

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 5

BÀI 1. CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ TẠO DÒNG
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Khái niệm về tạo dòng
- Ứng dụng của việc tạo dòng trong Sinh học phân tử
- Các bƣớc cơ bản của tạo dòng
- Khái niệm về tái tạo dòng (subcloning)
- Khái niệm chung về vector và chủng chủ
- Một số enzyme dùng trong tạo dòng
Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Sử dụng các trang thiết bị, dụng cụ chuyên dụng trong sinh học phân tử
- Cẩn thận, khéo léo và khả năng tập trung cao độ trong các thao tác sinh học phân tử đồng
thời có khả năng tƣ duy cao
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu
Số tiết lên lớp: 10 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng

TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết
3
2
Nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ cho thí
nghiệm sinh học phân tử
2
3
Thiết lập quy trình tạo dòng DNA/gen mục tiêu
vào tế bào chủ E. coli
5



Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 6

Trọng tâm bài giảng
- Mục đích của việc dòng hóa gen mục tiêu vào tế bào chủ E. coli
- Vector và đặc điểm của vector
- Nội dung của quy trình tạo dòng DNA/gen mục tiêu vào tế bào chủ E. coli
- Cách sử dụng các máy, dụng cụ và thiết bị chuyên dụng trong sinh học phân tử
Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1], [2]
1.1. Tạo dòng và tái tạo dòng
1.2. Vector và chủng chủ
1.3. Các enzyme dùng trong tạo dòng
1.4. Cách thức sử dụng eppendorf, pipetman, máy điện di DNA, Đèn UV, máy ly tâm,

bộ kit tinh sạch dành cho DNA, dung dịch, thuốc thử chuyên dụng trong sinh học phân
tử.
BÁO CÁO
Viết báo cáo quy trình tạo dòng DNA/gen mục tiêu vào tế bào chủ E. coli
Câu hỏi
1. Tạo dòng là gì?
2. Mục đích của việc tạo dòng?
3. Các bƣớc cơ bản của quy trình tạo dòng
4. Vector là gì?
5. Ứng dụng của vector trong việc tạo dòng gen mục tiêu
6. Chủng chủ là gì?
7. Đặc điểm của chủng chủ
8. Vi khuẩn E. coli và ứng dụng của nó trong công nghệ gen
9. Enzyme cắt giới hạn (RE) là gi?
10. Ứng dụng của RE trong dòng hóa gen quan tâm vào vector
11. Polymerase, Ligase, Nuclease và ứng dụng của nó trong sinh học phân tử



Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 7

BÀI 2. NHÂN BẢN SAO DNA/GEN MỤC TIÊU BẰNG
PHẢN ỨNG PCR
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Mục đích của việc PCR trong sinh học phân tử
- Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR
- Các thành phần phản ứng PCR

Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Sử dụng máy PCR
- Thiết lập phản ứng PCR để thu nhận DNA/gen mục tiêu làm nguyên liệu cho quy trình
tạo dòng
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu
Số tiết lên lớp: 5 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng
TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết
2
2
Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
0.5
3
Các bƣớc tiến hành
2.5
Trọng tâm bài thực hành
- Thực hiện các bƣớc trong quy trình nhân bản DNA/gen mục tiêu bằng phản ứng PCR
- Giải thích đƣợc cơ chế trong phản ứng PCR
- Thành phần của phản ứng PCR
I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1]
1.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 8

1.2. Các thành phần phản ứng PCR
1.3. Ứng dụng của PCR

II. Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
- DNA bộ gen
- 1 eppendorf 0.5 ml vô trùng và giá để eppendorf
- 1 eppendorf chứa mồi xuôi
- 1 eppendorf chứa mồi ngƣợc
- 1 eppendorf chứa dung dịch đệm cho phản ứng PCR
- 1 eppendorf chứa dung dịch dNTP
- 1 eppendorf chứa enzyme Taq DNA polymerase (luôn đƣợc giữ trong chậu nƣớc đá trong
khi thao tác)
- 1 eppendorf nƣớc cất hai lần vô trùng
- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip
- 1 máy PCR
III. Thực hành
Sinh viên tiến hành hút lần lƣợt các thành phần phản ứng PCR vào eppendorf 0.5ml theo
thứ tự và thể tích nhƣ sau:
dH
2
O 16.5ul
DNA bộ gen 2.0ul
Buffer (10X) 2.5ul
dNTP (10X) 2.5ul
Mồi xuôi 0.5ul
Mồi ngƣợc 0.5ul
Taq polymerase 0.5ul
Tổng thể tích phản ứng 25ul

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 9

Đặt eppendorf có chứa hỗn hợp phản ứng PCR vào máy PCR với chƣơng trình PCR nhƣ

sau:
94
o
C 94
o
C 72
o
C 72
o
C
5’ 1’ 55
o
C 1’ 10’
1’ x 30 chu kỳ 4
o
C
∞
BÁO CÁO
Viết báo cáo kết quả thí nghiệm về thiết lập phản ứng PCR, giải thích và kết quả thí
nghiệm.
Câu hỏi:
1. Phản ứng PCR là gì?
2. Mục đích của PCR trong bài thực hành?
3. Thành phần có trong phản ứng PCR
4. Cách thiết lập phản ứng PCR

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 10

BÀI 3. TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ TẾ BÀO CHỦ
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Khái niệm cơ bản về plasmid
- Quy trình tách chiết plasmid
- Ứng dụng của plasmid trong việc sử dụng làm vector
Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Thu nhận plasmid tinh sạch làm nguyên liệu cho quy trình tạo dòng
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu
Số tiết lên lớp: 5 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng
TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết

1.75
2
Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
0.25
3
Các bƣớc tiến hành
3

Trọng tâm bài thực hành
- Nguyên tắc tách chiết plasmid bằng phƣơng pháp SDS-kiềm
- Giải thích đƣợc các thành phần dùng để tách chiết plasmid bằng phƣơng pháp SDS-kiềm
I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1] [3]
1.1. Plasmid và đặc điểm sinh học của nó
1.2. Phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ
1.3. Nguyên tắc tách chiết plasmid bằng phƣơng pháp SDS-kiềm
II. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị
- 1 ống nghiệm chứa 5 ml dịch nuôi cấy thể biến nạp E. coli
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 11

- 6 eppendorf 1.5ml
- Các dung dịch I, II, III
- RNase, phenol, chloroform, ethanol tuyệt đối, ethanol 70%, TE
- Pipetman các loại: 0.5-10ul; 20-100ul; 200-1000ul, đầu tip
- Bình đựng nƣớc thải
- Máy vortex
- Máy li tâm ở nhiệt độ thƣờng và ly tâm lạnh
III. Thực hành
Sinh viên tiến hành tách chiết plasmid theo các bƣớc nhƣ sau:
- Nuôi cấy dòng E. coli mang plasmid pGEM trong 5ml môi trƣờng LB có bổ sung 5ul

Amp 50mg/ml, lắc qua đêm ở 37
o
C.
- Hút dịch vi khuẩn vào 3 eppendorf 1.5ml, mỗi eppendorf 1.5ml. Thu sinh khối bằng ly
tâm 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng. Hút bỏ dịch bên trên.
- Bổ sung 100µl dung dịch 1 vào eppendorf chứa sinh khối; vortex thật kỹ.
- Bổ sung 200µl dung dịch 2; đảo nhẹ. Bổ sung ngay 150µl dung dịch 3; đảo nhẹ.
- Ly tâm thu dịch nổi ở 13.000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng. Thu dịch nổi từ 3
eppendorf trên vào eppendorf mới, bỏ cặn.
- Bổ sung 1.5µl RNase vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi trên ủ ở 37
o
C trong 1 giờ.
- Sau đó, bổ sung vào mỗi eppendorf 250µl phenol pH 8 và 250µl chloroform; vortex nhẹ;
ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ phòng; thu dịch nổi.
- Thêm vào eppendorf trên 500ul ethanol tuyệt đối; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút,
4
o
C. Hút bỏ dịch nổi, thu tủa
- Rửa tủa trên với 500ul ethanol 70% lạnh; ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút, 4
o
C. Thu
tủa; phơi khô tự nhiên.
- Bổ sung 25µl TE; bảo quản mẫu ở 4
o
C.
Chú ý: Phenol, chloroform là những chất oxy hóa mạnh, có khả năng gây bỏng. Tránh tiếp
xúc trực tiếp với da, đặc biệt là mắt. trong trƣờng hợp nhỏ lên tay, cần rửa ngay bằng nƣớc.
trƣờng hợp bị nặng hơn, cần báo ngay với cán bộ hƣớng dẫn thực hành để kịp thời xử lý.
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 12

BÁO CÁO
Viết báo cáo kết quả thí nghiệm về các bƣớc tách chiết plasmid, giải thích và kết quả thí
nghiệm.
Câu hỏi:
1. Plasmid là gì?
2. Mục đích của việc tách chiết plasmid?
3. Giải thích các bƣớc của quá trình tách chiết plasmid bằng phƣơng pháp SDS- kiềm.




















Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 13

BÀI 4. PHÂN TÍCH PLASMID BẰNG CÁC PHƢƠNG PHÁP ĐO
MẬT ĐỘ QUANG, CẮT GIỚI HẠN VÀ ĐIỆN DI GEL AGAROSE
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Mục đích của việc xác định nồng độ và độ tinh sạch của một mẫu DNA
- Giá trị của một mẫu DNA đƣợc xem là sạch là nhƣ thế nào
- Nguyên tắc hoạt động của máy đo mật độ quang
- Mục đích của việc sử dụng enzyme cắt giới hạn trong bài thực hành
- Phƣơng pháp điện di trên gel agarose là nhƣ thế nào?
- Mục đích của phƣơng pháp điện di gel agrose
Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Biết cách sử dụng máy đo mật độ quang
- Biết cách phân tích bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid cho trƣớc đồng thời biết
cách sử dụng enzyme cắt giới hạn thích hợp cho phản ứng cắt kiểm tra plasmid
- Biết cách thu nhận thông tin kiểm chứng về trình tự plasmid mục tiêu
- Biết cách đọc, ghi nhận và giải thích kết quả trên bảng điện di gel agarose
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu
Số tiết lên lớp: 10 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng
TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết
4
2
Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
1.5

3
Các bƣớc tiến hành
3
4
Nhận xét kết quả thí nghiệm
1,5


Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 14

Trọng tâm bài thực hành
- Nắm vững phân tích mẫu plasmid bằng các phƣơng pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và
điện di trên gel agarose
I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1]
1.1. Phân tích plasmid bằng phƣơng pháp đo mật độ quang
1.2. Phân tích plasmid bằng phƣơng pháp cắt giới hạn
1.3. Phân tích sản phẩm cắt giới hạn bằng điện di gel agarose
II. Thực hành
II.1. Phân tích plasmid bằng phƣơng pháp đo mật độ quang
a. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị
- Dung dịch DNA plasmid thu đƣợc ở bài 2
- 1 buồng đo
- 1 eppedorf 1.5ml
- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip
- Nƣớc cất vô trùng
- Bình chứa nƣớc thải, giấy thấm
- Máy đo mật độ quang
b. Thực hành
- Tiến hành pha loãng mẫu 10 lần bằng cách hút 1.5ul dung dịch DNA plasmid thu đƣợc

vào 1 eppendorf sạch. Bổ sung 13.5ul nƣớc cất vô trùng. Lắc trộn đều.
- Mở máy đo mật độ quang, chọn chƣơng trình đo thích hợp theo hƣớng dẫn của cán bộ.
- Rửa sạch buồng đo, điều chỉnh blank
- Nạp 10ul mẫu vào buồng đo. Nhấn nút DNA để đo nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch
DNA.
- Ghi nhận kết quả và rút ra kết luận.
II.2. Phân tích plasmid bằng phƣơng pháp cắt giới hạn
a. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 15

- Dung dịch DNA plasmid thu đƣợc ở bài 2
- 1 eppedorf 1.5ml
- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip
- Nƣớc cất vô trùng
- Enzyme cắt giới hạn, dung dịch đệm (buffer)
- Bình chứa nƣớc thải, giấy thấm
- Tủ ấm 37
o
C
b. Thực hành
Dựa vào bản đồ plasmid cho trƣớc (Hình 2), sinh viên thực tập chọn enzyme cắt giới hạn sử
dụng cho phản ứng cắt kiểm chứng plasmid. Dự đoán kết quả thu đƣợc khi sử dụng enzyme đã
chọn cho phản ứng kiểm chứng.

Hình 2. Vùng trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn (MCS) và bản đồ giới hạn của
plasmid pGEM- T Easy [4]
Sinh viên tiến hành thực hiện phản ứng cắt giới hạn theo các bƣớc sau:
 Chuẩn bị một eppendorf sạch và thiết lập phản ứng cắt với thành phần sau đây:
DNA plasmid 1ug

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 16

Dung dịch đệm (10X) 1ul
Enzyme cắt giới hạn 0.5ul
Nƣớc cất bổ sung sao cho tổng thể tích phản ứng là 10ul
 Ủ hỗn hợp phản ứng này ở 37
o
C trong 2 giờ hoặc qua đêm
II.3. Phân tích sản phẩm cắt giới hạn của plasmid bằng điện di gel agarose
a. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị
- Sản phẩm PCR của bài 1; Dung dịch plasmid đã tách chiết của bài 2; Sản phẩm cắt giới
hạn của bài 3 của mỗi nhóm thực tập
- Agarose nóng chảy ở nhiệt độ thấp
- Dung dịch điện di TAE 1X (pha từ dung dịch TAE 50X)
- Dung dịch nạp mẫu
- Ethidium bromide (10mg/ml)
- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul, đầu tip
- Bộ điện di
- Hộp đèn soi UV
- Lò vi ba
b. Thực hành
- Chuẩn bị gel agarose
Sinh viên tiến hành đổ gel agarose theo các bƣớc sau:
+ Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lƣợc vào khuôn
+ Cân 0.5g agarose vào bình erlen 100ml, bổ sung 25ml dung dịch TAE 1X
+ Đun chảy dung dịch agarose trong lò vi ba; để nguội đến 35-40
o
C, lắc đều; đổ dung dịch
agarose vào khuôn lƣợc

+ Để nguội cho gel kết đông tự nhiên; sau khi gel đông gỡ 2 gờ của khuôn và tháo lƣợc ra
khỏi khuôn
+ Cho dung dịch TAE 1X vào buồng điện di, đặt miếng gel vào buồng điện di.
- Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 17

+ Chuẩn bị 1 miếng parafilm; hút 5ul dung dịch DNA (10ul đối với mẫu sản phẩm cắt giới
hạn) cần phân tích đặt lên bề mặt miếng parafilm; thay đầu tip, hút 3ul dung dịch nạp mẫu, trộn
đều với dung dịch DNA.
+ Dùng pipetman hút toàn bộ dung dịch mẫu vừa trộn và nạp vào giếng trên gel agarose
+ Đóng nắp buồng điện di, cắm điện cực
+ Điện di với điện thế 100V, 20 phút.
+ Xem kết quả điện di bằng hộp soi đèn UV
BÁO CÁO
Viết báo cáo kết quả thí nghiệm và giải thích mục đích của việc phân tích plasmid bằng các
phƣơng pháp đo mật độ quang, cắt giới hạn và điện di gel agarose .
Câu hỏi:
1. Tại sao cần xác định nồng độ và độ tinh sạch của một mẫu DNA?
2. Phân tích mẫu DNA plasmid sau khi tách chiết bằng phƣơng pháp nào?
3. Nguyên tắc hoạt động của máy đo mật độ quang
4. Mục đích của việc sử dụng enzyme cắt giới hạn trong bài thực hành
5. Gel agarose là gì? Đọc kết quả điện di trên bảng điện di gel agarose là nhƣ thế nào?

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 18

Bài 5. Thu nhận DNA/plasmid tinh sạch từ bộ kit tinh chế DNA
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Hiểu biết quy trình tinh sạch sản phẩm DNA/plasmid sau khi đã đƣợc thao tác (cắt bằng
enzyme cắt giới hạn) và kiểm tra trên gel agarose bằng bộ kit tinh sạch cho DNA.
Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Biết cách tinh chế sản phẩm bằng bộ kit dành cho DNA
- Biết sản phẩm sau tinh chế có đáp ứng yêu cầu cho việc dòng hóa tiếp theo hay không
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu
Số tiết lên lớp: 5 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng
TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết
2
2
Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
0.25
3

Các bƣớc tiến hành
1.75
4
Nhận xét kết quả thí nghiệm
1

Trọng tâm bài thực hành
- Nắm vững các bƣớc của quy trình tinh sạch DNA bằng bộ kit để thu đƣợc sản phẩm DNA
tinh sạch.
I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1], [5]
1.1. Mục đích của việc tinh sạch sản phẩm DNA/plasmid sau khi đã thao tác
1.2. Nguyên tắc của quy trình tinh sạch DNA/plasmid bằng bộ kit dành cho DNA
II. Yêu cầu nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị:
- Bộ kit dùng cho tinh chế DNA/plasmid EZ-10
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 19

- 3 eppedorf 1.5ml vô trùng
- Phenol bão hòa TE
- Chloroform
- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip
- Tủ ổn nhiệt
- Máy li tâm
III. Thực hành
- Bổ sung 50ul phenol bão hòa TE và 50ul chloroform vào từng eppendorf chứa dung dịch
DNA/plasmid; vortex kỹ
- Ly tâm 10,000g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng
- Chuyển phần dịch nổi sang một eppendorf mới
- Bổ sung 3V binding buffer (của bộ kit) vào eppendorf chứa phần dịch nổi. Trộn đều.
- Hút dung dịch trên vào cột tinh chế (của bộ kit), để yên trong 3 phút

- Ly tâm 10,000g trong 2 phút ở nhiệt độ phòng
- Tiếp theo bổ sung vào cột 500ul wash buffer
- Ly tâm 10,000g trong 2 phút ở nhiệt độ phòng
Lặp lại bƣớc wash buffer lần nữa
- Lấy 1 eppendorf sạch đựng cột tinh chế
- Bổ sung 25ul elution buffer vào cột tinh chế, để yên 5 phút
- Ly tâm 10,000g trong 2 phút ở nhiệt độ phòng
- Giữ ở -20
o
C đến khi sử dụng
BÁO CÁO
Viết báo cáo kết quả thí nghiệm và xem xét mẫu DNA/plasmid sau khi tinh sạch có sạch
không? Nồng độ của mẫu thu đƣợc nhƣ thế nào?
Câu hỏi:
1. Quy trình tinh sạch mẫu DNA gồm các bƣớc nào? Chi tiết của từng bƣớc?
2. Mẫu sau khi tinh sạch cần có đặc điểm gì?
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 20

BÀI 6. NỐI GEN MỤC TIÊU VÀO PLASMID
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Mục đích của việc nối gen mục tiêu vào plasmid.
- Quy trình của một phản ứng nối gen vào plasmid
- Các loại enzyme nối dùng trong sinh học phân tử
Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Biết cách tạo phản ứng nối gen vào plasmid dùng cho mục đích tạo dòng
- Cẩn thận trong các thao tác thí nghiệm
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu

Số tiết lên lớp: 5 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng
TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết
2
2
Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
0.25
3
Các bƣớc tiến hành
1.75
4
Nhận xét kết quả thí nghiệm
1

Trọng tâm bài thực hành
- Nắm vững các bƣớc của quy trình thiết lập phản ứng nối gen mục tiêu vào plasmid
I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1]
1.1. Mục đích của việc nối gen mục tiêu vào plasmid
1.2. Nguyên tắc của phản ứng nối.

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 21

II. Yêu cầu nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị:
- 1 eppedorf 1.5ml sạch
- 1 eppendorf chứa vector pGEM

- 1 eppendorf chứa sản phẩm PCR đã tinh chế
- T4 DNA ligase
- Dung dịch đệm
- Nƣớc cất 2 lần
- Chậu đựng nƣớc đá
- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip
- 1 bể ổn nhiệt lạnh
III. Thực hành
Sinh viên thực hành phản ứng nối nhƣ sau:
- Đặt eppendorf 1.5ml vào chậu đựng nƣớc đá và lần lƣợt bổ sung các dung dịch sau:
H
2
O cất 2 lần 2.4ul
Vector pGEM 3.0ul
Gen mục tiêu 7.0ul
Dung dịch đệm 1.6ul
T4 DNA ligase 1.0ul
- Đặt eppendorf chứa hỗn hợp phản ứng trên vào bể ổn nhiệt trong 45 phút ở 16
o
C
Sau 45 phút, tiến hành biến nạp hỗn hợp phản ứng chứa vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu
vào tế bào chủ E. coli thích hợp.
BÁO CÁO
Viết báo cáo kết quả thí nghiệm về quy trình và thành phần của phản ứng nối gen vào
plasmid.
Câu hỏi:
1. Mục đích của việc nối gen mục tiêu vào plasmid
2. Nguyên tắc và thành phần của phản ứng nối gen mục tiêu vào plasmid.
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 22

BÀI 7. BIẾN NẠP PLASMID TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ
BÀO CHỦ E. coli
MỤC TIÊU:
Sau khi học xong bài này, sinh viên có khả năng:
Về kiến thức: Sinh viên có khả năng củng cố và hình thành mới các kiến thức sau:
- Thế nào là biến nạp
- Mục đích của việc biến nạp plasmid vào tế bào chủ
- Nguyên tắc thực hiện quá trình biến nạp
- Tế bào khả nạp
Về kỹ năng: Sinh viên có khả năng củng cố và rèn luyện các kỹ năng sau:
- Biết quy trình thực hiện biến nạp plasmid vào tế bào chủ
- Hiểu biết đƣợc một tế bào đƣợc xem là khả nạp thì nhƣ thế nào
- Tế bào chủ nhƣ thế nào thì đƣợc xem là có khả năng mang vector tái tổ hợp
- Viết báo cáo, tổng hợp tài liệu
Số tiết lên lớp: 5 tiết
Bảng phân chia thời lƣợng
TT
NỘI DUNG
SỐ TIẾT
1
Cơ sở lý thuyết
2
2
Yêu cầu nguyên vật liệu, thiết bị và dụng cụ
0.25
3
Các bƣớc tiến hành
1.75
4

Nhận xét kết quả thí nghiệm
1

Trọng tâm bài thực hành
- Biến nạp và ứng dụng của quy trình này trong thao tác sinh học phân tử
- Nắm vững các bƣớc của quy trình biến nạp plasmid vào tế bào E. coli
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 23


I. Cơ sở lý thuyết: Tham khảo tài liệu [1]
1.1. Mục đích của việc biến nạp plasmid vào tế bào chủ E. coli
1.2. Nguyên tắc của quy trình biến nạp
II. Yêu cầu nguyên vật liệu, dụng cụ, thiết bị:
- 1 eppedorf chứa tế bào E. coli khả nạp
- 1ống nghiệm chứa 5ml môi trƣờng LB lỏng
- Dung dịch ampicillin (50mg/ml))
- 1 eppendorf chứa plasmid
- 1 petri chứa môi trƣờng LB + ampicillin + X-gal
- Chậu đựng nƣớc đá
- Đèn cồn, cốc thủy tinh chứa cồn, que trải
- Pipetman các loại: 0.5 – 10ul; 20 – 100ul; 200 – 1000ul, đầu tip
- Bình đựng nƣớc thải
- Máy lắc ổn nhiệt
III. Thực hành
 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α
- Bổ sung vào eppendorf chứa hỗn hợp phản ứng nối 100ul tế bào E. coli khả nạp
- Đặt eppendorf trong chậu nƣớc đá trong 5 phút; chuyển eppedorf vào bể ổn nhiệt ở 42
o
C

trong 30 giây; đặt eppendorf trở lại trong chậu đá trong 5 phút
- Bổ sung 1ml môi trƣờng LB vào eppendorf; ủ ở 37
o
C trong 1 giờ hoặc lắc trong máy lắc ở
37
o
C, 15 phút
- Trải 100ul dịch vi khuẩn trên lên đĩa môi trƣờng LB/amp; ủ ở 37
o
C, qua đêm
Tiến hành đồng thời với mẫu đối chứng không cho plasmid.
BÁO CÁO
Viết báo cáo kết quả thí nghiệm về thành phần cũng nhƣ quy trình biến nạp plasmid vào tế
bào chủ E. coli.
Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 24

Câu hỏi:
1. Biến nạp là gì?
2. Tại sao quá trình biến nạp lại quan trọng trong thao tác sinh học phân tử vi sinh vật?
3. Nguyên tắc của biến nạp
4. Các bƣớc thực hiện quy trình biến nạp
5. Tế bào khả nạp là gì? Đặc điểm?
6. Nhận biết plasmid tái tổ hợp có đƣợc biến nạp vào tế bào chủ E. coli bằng cách thức nào?

Bài giảng Thực tập Sinh học Phân tử
Trang 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Trần Linh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo, 2010. Thực tập kỹ thuật thao tác trên gen. Nhà
xuất bản Đại Học Quốc Gia TP. HCM.
TIẾNG ANH
2. Philip N. Benfey, 2001. Gene discovery lab. ISBN: 0-534-37717-3.
3. J. Shambrook, 2001. Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
TRANG WEB
4. www. pGEM T- Easy.com