nghiên cứu phát hiện sự gắn chèn gene e6 và e7 của human papilomavirus type 16 vào bộ gene người bằng kỹ thuật multiplex rt-pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN



TRẦN MINH ĐỊNH



NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE
E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO
BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX RT-PCR





LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC








BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

TRẦN MINH ĐỊNH



NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SỰ GẮN CHÈN GENE
E6 VÀ E7 CỦA Human papilomavirus TYPE 16 VÀO
BỘ GENE NGƯỜI BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX RT-PCR




Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số : 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC



Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Thị Phương Khanh



BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011


i
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ
một công trình nào khác.

Người cam ñoan



Trần Minh Định

ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn tất khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu
sắc tới:
Lãnh ñạo trường Đại học Tây Nguyên, các phòng ban và khoa chức năng
ñã tổ chức Đào tạo, quản lý và tạo ñiều kiện thuận cho tôi hoàn tất khóa học và
luận văn. Các Thầy, Cô giáo trong và ngoài trường ñã nhiệt tình giảng dạy và
cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt khóa học.
TS. Võ Thị Phương Khanh, người luôn quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn và
tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận.
PGS. TS Nguyễn Anh Dũng ñã có những trao ñổi quý báu và tạo ñiều
kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận.
Bộ môn SHTN, Bộ môn Sinh học thực vật và Phòng thí nghiệm
CNSH&MT là các ñơn vị ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện và hoàn tất
khóa luận.
Các anh, chị và các bạn học viên lớp Cao học SHTNK3; ñã luôn quan
tâm, chia sẻ và ñộng viên tôi trong suốt khóa học cũng như suốt thời gian thực
hiện khoa luận. Đặc biệt là bạn Hưng (Công ty CP TBR) ñã nhiệt tình và có
những trao ñổi quý báu trong quá trình thực hiện ñề tài; phòng Dịch vụ, Công ty

Việt Á ñã cung cấp chủng vi sinh vật tham khảo. Cô Giang (phòng khám ña
khoa Nguyễn Dũng), anh Nguyện (phòng khám ña khoa Hồng Đức), bạn Việt
(Bệnh viện ña khoa Thiện Hạnh), Cô Oanh (BS sản khoa, phòng khám số 120
Hồ Tùng Mậu) và các anh chị tại phòng xét nghiệm Bệnh viện ña khoa Thiện
Hạnh, phòng khám ña khoa Nguyễn Dũng, phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu,
phòng khám số 46 Phan Chu Trinh, phòng khám ña khoa Hồng Đức ñã nhiệt tình
giúp ñỡ tôi trong quá trình thu thập mẫu dịch phết cổ tử cung.
iii

Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới những người thân trong
gia ñình ñã luôn quan tâm, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như
thực hiện luận văn.
Buôn Ma Thuột, ngày tháng năm 2011
Tác giả



Trần Minh Định
iv
MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
1. Tính cấp thiết của ñề tài 1
2. Mục tiêu của ñề tài 2
3. Ý nghĩa khoa học 2
4. Ý nghĩa thực tiễn 2
Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Định nghĩa ung thư cổ tử cung 3
1.2. Tác nhân gây ung thư cổ tử cung 4
1.21. Tác nhân 4

1.2.2. Các type của Human papillomavirus 4
1.2.3. Bộ gen của virus HPV type 16 5
1.2.4. Sự xâm nhiễm về mặt phân tử - hiện tượng chèn gen của virus HPV
nguy cơ cao vào bộ gen người 6
1.2.5. Tình hình nghiên cứu gắn chèn gen E6 và E7 của HPV vào bộ gen
người hiện nay 9
1.3. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam 11
1.3.1. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung trên thế giới 11
1.3.2. Tình hình bệnh ung thư cổ tử cung tại Việt Nam 12
1.4. Các phương pháp phổ biến chuẩn ñoán ung thư cổ tử cung hiện nay 13
1.4.1. Chẩn ñoán lâm sàng 13
1.4.2. Các phương pháp chẩn ñoán dựa trên tế bào cổ tử cung 14
1.4.3. Các phương pháp chuẩn ñoán tác nhân HPV gây ung thư cổ tử cung 15
1.5. Phương pháp RT – PCR trong chuẩn ñoán gắn chèn gen gây ung thư cổ
tử cung 19
1.6. Các phương pháp ñiều trị tổn thương tiền ung thư và ung thư cổ tử cung 20
1.6.1. Điều trị tổn thương tiền ung thư cổ tử cung 20
1.6.2. Điều trị ung thư cổ tử cung 21
v
1.7. Các loại vaccine phòng HPV hiện nay 21
Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23
2.1. Nội dung nghiên cứu 23
2.2. Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu 23
2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu 23
2.2.2. Thời gian nghiên cứu 23
2.3. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu 23
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 24
2.3.2. Hoá chất nghiên cứu 25
2.3.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu 27
2.3.3.1. Dụng cụ nghiên cứu 27

2.3.3.2. Thiết bị nghiên cứu 27
2.4. Phương pháp nghiên cứu 28
2.4.1. Phương pháp thiết kế và kiểm tra mồi 28
2.4.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi 28
2.4.1.2. Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế 30
2.4.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại 30
2.4.2. Phương pháp thu và bảo quản mẫu bệnh phẩm 31
2.4.3. Phương pháp tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số 31
2.4.4. Phương pháp kiểm soát nội phản ứng 32
2.4.5. Phương pháp multiplex RT – PCR 33
2.4.5.1. Phản ứng RT 33
2.4.5.2. Phản ứng multiplex PCR 33
2.4.6. Phương pháp ñiện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT – PCR 34
2.4.7. Phương pháp xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của
HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR 35
2.4.7.1. Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết thu
nhận hoàn toàn RNA tổng số 35
2.4.7.2. Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 36
vi
2.4.7.3. Khảo sát nồng ñộ mồi 36
2.4.7.4. Khảo sát nồng ñộ Mg
2+
39
2.4.7.5. Khảo sát nồng ñộ dNTP 39
2.4.7.6. Khảo sát ñộ nhạy của quy trình 39
2.4.7.7. Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình 40
2.4.9. Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của
HPV type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các
mẫu bệnh phẩm thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột 40
Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch ñại ñặc hiệu gen E6 và E7
của HPV type 16 41
3.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi 41
3.1.2. Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế 44
3.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại 45
3.2. Xây dựng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16
vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR 47
3.2.1. Nghiên cứu nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch mẫu sau tách chiết 47
3.2.2. Khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 49
3.2.3. Khảo sát nồng ñộ mồi trong phản ứng PCR 50
3.2.4. Khảo sát nồng ñộ Mg
2+
54
3.2.5. Khảo sát nồng ñộ dNTP 55
3.2.6. Khảo sát ñộ nhạy của quy trình 56
3.2.7. Khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình 57
3.2.8. Quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16 vào bộ
gen người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR 58
3.3. Bước ñầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV
type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu dịch
phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột 60

vii

Phần IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65
4.1. Kết luận 65
4.2. Kiến nghị 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

viii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome: Hội chứng suy
giảm miễn dịch mắc phải ở người.
BLAST Basic Local Alignment Search Tool: Công cụ tìm kiếm
các trình tự tương ñồng.
Bp base pairs: Cặp base
CIN Cervical Intraepithelial Neoplasia: Tổn thương trong tế
bào biểu mô cổ tử cung.
Cs Cộng sự
CD Chứng dương
cDNA complementary DNA: DNA bổ sung
dATP Deoxyadenosine triphosphate
dCTP Deoxycytidine triphosphate
DEPC Diethylpyrocarbonate
dGTP Deoxyguanosine triphosphate
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxyribonucleotide triphotphate
dTTP Deoxythymidine triphosphate
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
EMBL European Molecular Biology Labolatories: Hội các
phòng thí nghiệm Sinh học phân tử Châu Âu.
HPV Human Papilomavirus
IARC International Agenecy For Research on Cancer
IDT Intergrated DNA Technology
Kb Kilo base
mRNA Messenger Ribonucleotide acid
NCBI National Center for Biotechnology Information: Trung
tâm Quốc gia về thông tin Công nghệ Sinh học.
ix

PCR Polymerase chain reaction: Phản ứng kéo dài chuỗi.
PK Phòng khám
PKĐK Phòng khám ña khoa
RNA Ribonucleotide acid
RT Reverse Transcriptase
RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase chain reaction
TAE Tris acetate EDTA
Taq Thermus aquaticus
TE Tris acid – EDTA
Tm melting Temperature: Nhiệt ñộ biến tính.

x
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH

Trang
Hình 1.1: Sự phát triển của các tế bào bất thường trong bệnh ung thư cổ tử
cung 3
Hình 1.2: Human papillomavirus type 16 4
Hình 1.3: Cấu trúc bộ gene của Human papillomavirus type 16 5
Hình 1.4: Quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của HPV type nguy cơ cao trong
tế bào chủ 7
Hình 1.5: Sơ ñồ biểu diễn phân bố tỉ lệ ung thư cổ tử cung trên thế giới 10
Hình 1.6: Tế bào cổ tử cung bình thường và nghịch sản 13
Hình 2.1: Thang DNA 100bp 26
Hình 2.2: Sơ ñồ biểu thị vị trí gắn mồi E6f-E6r trên gene E6 và trên amplicon 31
Hình 3.1: Kết quả ñánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế 44
Hình 3.2: Kết quả thực hiện phản ứng multiplex PCR trên 3 mẫu chứng
dương chưa xử lý enzym DNase I 45
Hình 3.3: Kết quả khảo sát nồng ñộ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết 47
Hình 3.4: Kết quả khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 47

Hình 3.5: Kết quả khảo sát nồng ñộ hệ mồi trong phản ứng 48
Hình 3.6: Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg
2+
52
Hình 3.7: Kết quả khảo sát nồng ñộ dNTP 53
Hình 3.8: Kết quả khảo sát ñộ nhạy của quy trình 54
Hình 3.9: Kết quả khảo sát ñộ ñặc hiệu của quy trình 55
Hình 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của
HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp.
Buôn Ma Thuột 61
xi
DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1: Tỷ lệ tiến triển của các giai ñoạn CIN sang ung thư cổ tử cung 9
Bảng 1.2: Các phương pháp ñiều trị tổn thương tiền ưng thư cổ tử cung 19
Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật và mẫu bệnh phẩm tham khảo sử sụng trong
ñề tài 23
Bảng 2.2: Địa ñiểm và số lượng mẫu thu thập sử dụng trong ñề tài 24
Bảng 2.3: Trình tự amplicon tổng hợp làm chứng nội 24
Bảng 2.4: Nồng ñộ của 2 cặp mồi khảo sát trong ñề tài 36
Bảng 3.1: Kết quả thiết kế mồi 41
Bảng 3.2: Đặc tính của hệ mồi thiết kế 42
Bảng 3.3: Cấu trúc thứ cấp của hệ mồi thiết kế 42
Bảng 3.4: Cấu trúc hetero-dimer (kcal/mole) của hệ mồi thiết kế 42
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát nhiệt ñộ lai của hệ mồi 48
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát nồng ñộ hệ mồi trong phản ứng 49
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát ñộ nhạy của quy trình 54
Bảng 3.8: Sơ ñồ quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của HPV type 16
vào bộ gene người bằng kỹ thuột multiplex RT-PCR 56

Bảng 3.9: Kết quả giải trình tự gene E6 và E7 của HPV type 16 gắn chèn vào bộ gene
người 58
Bảng 3.10: Kết quả kiểm chứng quy trình phát hiện gắn chèn gene E6 và E7 của
HPV type 16 vào bộ gene người trên các mẫu dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp.
Buôn Ma Thuột 62
23
Phần II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu thiết kế và kiểm tra mồi khuếch đại đặc hiệu gen E6 và E7 của
HPV type 16.
2. Xây dựng quy trình phát hiện sự gắn chèn gen E6 và E7 của HPV type 16
vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR
- Nghiên cứu nồng độ enzym DNase I xử lý dịch sau tách chiết
- Khảo sát nhiệt độ lai của hệ mồi
- Khảo sát nồng độ mồi
- Khảo sát nồng độ Mg
2+

- Khảo sát nồng độ dNTP
- Khảo sát độ nhạy của quy trình
- Khảo sát độ đặc hiệu của quy trình
3. Bước đầu ứng dụng quy trình phát hiện gắn chèn gen E6 và E7 của HPV
type 16 vào bộ gen người bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR trên các mẫu mẫu dịch
phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột.
2.2. Địa ñiểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa ñiểm nghiên cứu
- Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - Bộ môn Sinh học thực nghiệm, Khoa
KHTN&CN, trường Đại học Tây Nguyên.
- Phòng thí nghiệm CNSH&MT, trường Đại học Tây Nguyên.
2.2.2. Thời gian nghiên cứu

Đề tài thực hiện từ tháng 09/2010 tới tháng 08/2011.
2.3. Vật liệu, hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
24
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu
+ Mẫu chứng dương: 3 mẫu chứng dương (CD1, CD2, CD3) là mẫu bệnh
phẩm thu nhận từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung đã được xác định do HPV type 16
gây ra, được cung cấp từ Khoa Ung bướu, Bệnh viện Đa khoa Cần Thơ.
+ 8 chủng vi sinh vật và 1 mẫu bệnh phẩm sử sụng trong đề tài
Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật và mẫu bệnh phẩm sử sụng trong ñề tài
STT Tên vi sinh vật Nguồn gốc Số lượng
1
DNA của người không bị
ung thư cổ tử cung
Khoa Ung bướu, Bệnh viện
đa khoa Cần Thơ
1
2 HPV type 18
Công ty cổ phần công nghệ
Việt Á, Tp. Hồ Chí Minh
1
3 HPV type 11 1
4 HPV type 6 1
5 HPV type 33 1
6 HPV type 45 1
7 E.coli 1
8 Chlamydia trachomatis 1
9 Neisseria gonorrhoeae 1

+ Mẫu chứng âm: nước cất.
+ 86 mẫu bệnh phẩm dịch phết cổ tử cung thu thập tại Tp. Buôn Ma Thuột –

Đăk Lăk.
Bảng 2.2: Địa ñiểm và số lượng mẫu thu thập sử dụng trong ñề tài
STT Địa ñiểm thu mẫu Số mẫu thu thập
1 Bệnh viện đa khoa Thiện Hạnh 64
2 Phòng khám đa khoa Hồng Đức 2
25
3 Phòng khám số 46 Phan Chu Trinh 2
4 Phòng khám đa khoa Nguyễn Dũng 7
5 Phòng khám số 120 Hồ Tùng Mậu 11
Tổng cộng 86

+ Chứng nội: là yếu tố kiểm soát nội phản ứng nhằm kiểm chứng phản ứng
có diễn ra bình thường hay không. Một đoạn amplicon có kích thước 400bp được
tổng hợp tại Công ty IDT (Hoa Kỳ) dùng làm chứng nội, trình tự amplicon được
thiết kế với 2 vị trí lỗi (mismatch) thể hiện qua bảng 2.3
Bảng 2.3: Trình tự amplicon tổng hợp làm chứng nội
Trình tự amplicon (5’ – 3’)
Kích
thước (bp)

CACAGAGCTGCAAACAACTATCCAATTATCAACAATTACTACAT
GCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACGCAGCTTGGTGACAACG
CTATTAGCGGAGGCTCCAACGAGGGGTCCACGGACACCACCTCC
ACTCACACAACCAACACTCAGAACAATGACTGGTTTTCAAAGCT
GACCAGTTCCGCTTTTAGCGGTCTTTTCGGCGCTCTTCTTGCTGAC
AAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTCGAGGACCGCATCCTCAC
TACCCGCAACGGACACACGACCTCGACAACCCAGTCGAGCGTTG
GAGTCACTTACGGGTACGCAACAGCTGAGGACTTTGTGAGCGGA
CCAAACACATCTGGGCTTGAGACCAACCGTCAAAAGCCACTGTG
TC

400
Ghi chú: C vị trí mismatch trên amplicon
2.3.2. Hoá chất nghiên cứu
+ Hóa chất dùng cho tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số
- Dung dịch 1 (Trizol X100): phenol 38%, guanidium thyocianate 0.8M,
glycerol 5%, chỉnh về pH 4.0.
- Dung dịch 2: Chloroform.
26
- Dung dịch 3: Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa.
- Dung dịch 4: Ethanol 70%.
- Dung dịch 5: Nước xử lý với DEPC.
Hóa chất được cung cấp từ Công ty Cổ phần Công nghệ Việt Á – Tp. Hồ Chí
Minh.
+ Hóa chất dùng cho phân hủy DNA thu nhận RNA tổng số
Dnase I(hãng Fermentas)
+ Hoá chất dùng cho phản ứng multiplex RT – PCR
 Phản ứng RT
Đề tài sử dụng bộ Kit cDNA synthesis KIT (VA.A 92-003B) của Công ty cổ
phần công nghệ Việt Á.
 Phản ứng multiplex PCR
- Mồi xuôi và mồi ngược (tổng hợp từ Công ty IDT, Hoa Kỳ)
- dNTPs (dTTP, dATP, dGTP, dCTP) 2mM mỗi loại (hãng Fermentas)
- Taq DNA polymerase 500 U (hãng Fermentas)
- Dung dịch đệm 10X (hãng Fermentas)
- MgCl
2
25 mM (hãng Fermentas)
- Nước cất 2 lần đã loại bỏ enzym Dnase, Rnase.
+ Hoá chất dùng cho ñiện di trên gel agarose
- Agarose (hãng Biorad).

- Dung dịch điện di TAE 50X: 40mM Tris- 20mM Acetic Acid- 1mM EDTA
(hãng Fermentas)
- Dung dịch nạp mẫu 6X: 10 mM Tris-HCl (pH 7.6) 0.03% bromophenol
blue, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol 60 mM EDTA (hãng Fermentas)
- Dung dịch nhuộm mẫu Ethidium bromide.
27
- Thang DNA 100 bp (hãng Fermentas).






Hình 2.1. Thang DNA 100bp
2.3.3. Dụng cụ, thiết bị nghiên cứu
2.3.3.1. Dụng cụ nghiên cứu
- Micropipettes loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Axygen – Hoa Kỳ).
- Đầu tip thường, loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Greiner)
- Filter tip loại: 10µl, 100µl, 1000µl (hãng Greiner)
- Eppendorf 1.5ml (loại thường và loại Biopure), eppendorf 0.2ml nắp phẳng
(hãng Greiner)
- Vật liệu tiêu hao: găng tay không phấn, khẩu trang, cồn 70
0
,
2.3.3.2. Thiết bị nghiên cứu
- Máy tính và các phần mềm chuyên dụng để thiết kế và đánh giá mồi
- Máy Vortex (hãng IKA)
- Tủ lạnh âm 30
0
C và tủ lạnh thường

- Máy ly tâm lạnh tốc độ 13000 vòng/phút (hãng Hettich)
- Tủ tách chiết DNA/RNA vô trùng
- Tủ đặt phản ứng PCR vô trùng
28
- Máy PCR (C1000 Thermal Cycler – hãng Biorad)
- Máy ủ nhiệt khô
- Nồi hấp khử trùng (hãng Study)
- Lò vi sóng
- Hệ thống điện di hãng (Biorad)
- GelDoc XR với phần mềm chuyên dụng kết nối máy tính (Biorad).
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp thiết kế và kiểm tra mồi
2.4.1.1. Thiết kế và kiểm tra mồi
2.4.1.1.1. Các phần mềm hỗ trợ thiết kế và kiểm tra mồi
- Clustal X 1.81 (EMBL, Châu Âu)
- Annhyb 4.922, năm 2004 (Olivier Friard, Hoa Kỳ)
- Phần mềm trực tuyến Oligo Analyzer 3.0 (IDT, Hoa Kỳ)
(
- Phần mềm trực tuyến BLAST (NCBI, Hoa Kỳ)
(
2.4.1.1.2. Kỹ thuật thiết kế và kiểm tra mồi
Quy trình thiết kế và kiểm tra hệ mồi gồm 5 bước cơ bản sau:
- Bước 1: Thu thập các trình tự gen của gen E6 và E7 HPV type 16 từ ngân
hàng gen của NCBI ()
- Bước 2: Sắp gióng các trình tự gen thu được bằng phần mềm Clustal, so
sánh và xác định vùng bảo tồn của gen E6 và E7 từ các vùng bảo tồn thiết kế mồi
phù hợp.
- Bước 3: Tham khảo các cặp mồi đã công bố trên các bài báo uy tín quốc tế
hoặc thiết kế mới.
29

- Bước 4: Sắp gióng các trình tự gen E6 và E7 với từng mồi xuôi, mồi ngược,
đánh giá mức độ tương đồng của các trình tự trên bằng phần mềm clustal.
- Bước 5: Phân tích và đánh giá các thông số của mồi về Tm, %GC, hairpin
(kẹp tóc), self – dimer, hetero – dimer, độ tương đồng, kích thước sản phẩm PCR
tạo thành bằng các phần mềm BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), Oligo
Analyzer. Từ đó, chọn cặp mồi thích hợp nhất để thực hiện phản ứng multiplex RT
- PCR.
Sau khi thiết kế và kiểm tra, các cặp mồi đạt tiêu chuẩn về mặt lý thuyết sẽ
được gửi tổng hợp nhân tạo tại Công ty IDT (Hoa Kỳ).
2.4.1.1.3. Một số tiêu chuẩn thiết kế và ñánh giá mồi
Trong giai đoạn thiết kế mồi, qua tham khảo một số tài liệu về thiết kế mồi
của Andrew Wallace (1996), Alkami Biosystems (1999) , một số tiêu chuẩn của
mồi được rút ra như sau:
- Chiều dài của mồi tốt nhất nằm trong khoảng 18 – 25 cặp base.
- Thành phần các nucleotide của mồi phải cân bằng. Các mồi có hiệu quả
khuếch đại tốt nhất là những mồi có các base loại G, C tập trung thành nhóm và
chiếm tỉ lệ khoảng từ 40% - 60%. Ngoài ra, các base cuối ở đầu 3’hay gần đầu 3’
của các mồi này nên là G, C, GC hoặc CG.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi là một thông số quan trọng có ảnh hưởng
lớn đến khả năng bắt cặp của mồi với DNA bản mẫu. Để đạt hiệu quả nhân bản tốt
nhất, nhiệt độ nóng chảy của mồi nằm trong khoảng 50
0
C – 72
0
C. Ngoài ra, nhiệt
độ nóng chảy mồi xuôi và mồi ngược không được cách biệt quá xa, tối đa khoảng
5
0
C.
- Trong cấu trúc của mồi không được có những vùng trình tự có thể tự bắt

cặp bổ sung với nhau vì những vùng này có thể hình thành cấu trúc kẹp tóc (hairpin
loop) chặt chẽ làm giảm hiệu quả nhân bản của mồi. Ngoài ra, cần tránh chọn
30
những mồi có khả năng bắt cặp bổ sung chặt chẽ với nhau ở đầu 3’ do điều này có
thể dẫn tới việc tạo các mồi dimer, self-dimer (mồi bắt cặp với nhau), hetero-dimer
(mồi này bắt cặp với mồi khác),… làm giảm hiệu suất của phản ứng PCR.
- Mức năng lượng (∆G) hình thành nên các cấu trúc thứ cấp của các mồi phải
> -9 kcal/mol.
- Khi tìm kiếm và so sánh các trình tự tương đồng bằng công cụ BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool), giá trị E (xác suất của tương đồng xuất hiện
không ngẫu nhiên) càng nhỏ thì mức độ tương đồng càng cao; giá trị Score, chỉ số
query coverage càng cao thì mức độ tương đồng càng cao [8; 9].
2.4.1.2. Đánh giá khả năng khuếch ñại của hệ mồi thiết kế
Tiến hành tách chiết RNA của các mẫu chứng dương đã xác định ung thư cổ
tử cung do HPV type 16 gây ra. Thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR với chứng
nội luôn được bổ sung trong mỗi phản ứng ở giai đoạn PCR.
Mồi hoạt động bình thường sẽ có vạch của gen E6 và E7 như mong muốn.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
2.4.1.3. Giải trình tự kiểm tra sản phẩm khuếch ñại
Để khẳng định sản phẩm khuếch đại là trình tự của gen E6 và E7 của HPV
type 16 gắn chèn vào bộ gen người, chúng tôi gửi sản phẩm PCR đến công ty
Macrogen (Hàn Quốc) để giải trình tự. Sau khi giải trình tự, kết quả được kiểm tra
thông qua phần mềm ClustalX 1.81 và so sánh với các trình tự chuẩn được công bố
trên GenBank thông qua chương trình BLAST trên NCBI nhằm tìm kiếm trình tự
tương đồng với đoạn trình tự nhân bản được.
Kết quả có được từ sự so sánh bằng công cụ BLAST sẽ cho phép kết luận về
tính đặc hiệu của sản phẩm PCR thu được.
31
2.4.2. Phương pháp thu và bảo quản mẫu bệnh phẩm
86 mẫu dịch phết cổ tử cung được các nhân viên y tế thu nhận từ các bệnh

nhân tới khám sản tại các Phòng khám và Bệnh viện trên địa bàn thành phố Buôn
Ma Thuột. Mẫu lựa được chọn là các mẫu có kết quả Pap nghi ngờ hoặc viêm
nhiễm nặng và bệnh nhân 26 tuổi trở lên.
Mẫu được bảo quản trong dung dịch TE1X và vận chuyển về phòng thí
nghiệm trong điều kiện từ 0
0
C tới 4
0
C. Tại phòng thí nghiệm, bảo quản mẫu - 20
0
C.
2.4.3. Phương pháp tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số
Để tách chiết tế bào thu nhận RNA tổng số, sử dụng phương pháp tủa trong
phenol/chloroform theo phương pháp của Chomczynski & Sacchi (1987). Quy trình
tách chiết đã được thương mại hóa và cung cấp từ Công ty CP Công nghệ Việt Á –
Tp. Hồ Chí Minh, quy trình bao gồm các bước sau:
- Đánh dấu các eppendorf 1.5ml Bio-pure.
- Hút tất cả các dung dịch đều sử dụng đầu tip có phin lọc.
- Các mẫu bệnh phẩm được vortex kỹ. Sau đó, hút 200µl vào các eppendorf
vô trùng có chứa sẵn 900µl dung dịch 1. Vortex 30 giây, để yên 10 phút. Thêm
200µl dung dịch 2 (lắc kỹ trước khi hút), trộn đều, ly tâm 13000 vòng/phút, 10 phút.
- Cẩn thận hút 600µl dịch trong nổi có chứa RNA (tránh làm xáo trộn hai
lớp) và một eppendorf bio-pure khác có chứa sẵn 600µl dung dịch 3 (trộn đều trước
khi sử dụng). Trộn đều hỗn hợp, để yên 10 phút ở nhiệt độ lạnh, sau đó ly tâm
13000 vòng/phút, 10 phút.
- Hỗn hợp sau khi ly tâm được loại bỏ dịch nổi, thu cặn. Cho từ từ 900µl
dung dịch 4 vào, ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút.
- Tiếp tục loại bỏ hết dịch nổi và thu cặn. Để khô ở nhiệt độ 60
0
C trong 10

phút. Sau đó, thêm vào 50µl dung dịch DEPC.
32
Nếu chưa thực hiện phản ứng RT, bảo quản mẫu đã tách chiết ở -20
0
C.
2.4.4. Phương pháp kiểm soát nội phản ứng
Nhằm khẳng định trong mỗi phản ứng PCR không có hiện tượng ức chế, đề
tài tiến hành thiết kế và tổng hợp 1 đoạn amplicon có kích thước 400 bp tại công ty
IDT (Hoa Kỳ) dùng làm chứng nội (internal control) và luôn bổ sung trong mỗi
phản ứng PCR ở nồng độ 10
4
bản sao/ml.
Nhằm tiết kiệm chi phí, đề tài sử dụng mồi khuếch đại gen E6 để khuếch đại
amplicon của chứng nội nhưng trên mạch khuôn của amplicon đã tạo ra các điểm
lỗi (mismatch) tại vị trí nucleotid thứ 3 tính từ đầu 3’OH của vị trí mồi bắt cặp với
mạch khuôn amplicon. Việc tạo ra các điểm lỗi trên mạch khuôn của amplicon
nhằm mục đích mồi sẽ khuếch đại gen E6 với hiệu suất cao hơn khuếch đại
amplicon.
Như vậy, trong mỗi phản ứng sẽ luôn xuất hiện vạch của chứng nội có kích
thước 400 bp nhằm chứng minh phản ứng PCR diễn ra bình thường, không có hiện
tượng ức chế phản ứng và âm tính là âm tính thật.








Hình 2.2. Sơ đồ biểu thị vị trí gắn mồi E6f-E6r trên gen E6 và trên amplicon

33
A: vị trí gắn mồi E6f-E6r trên gen E6 tạo sản phẩm có kích thước 287bp
B: vị trí mismatch và gắn mồi E6f-E6r trên amplicon tạo sản phẩm có kích thước 400bp
2.4.5. Phương pháp multiplex RT – PCR
2.4.5.1. Phản ứng RT
- Phản ứng RT để phiên mã ngược RNA thành cDNA. Thành phần 1 phản
ứng 20µl bao gồm: 12.5µl dịch tách chiết RNA, 1µl enzym RT, 6.5 µl RT buffer.
Đậy nắp eppendorf thật kỹ, đặt vào máy PCR.
- Thao tác thực hiện trong điều kiện đá đang tan.
- Cài đặt chương trình luân nhiệt cho phản ứng RT:
25
0
C – 10 phút, 42
0
C - 30 phút, 85
0
C – 5 phút, giữ ở 4
0
C
2.4.5.2. Phản ứng multiplex PCR
- Thành phần cho một phản ứng 25µl bao gồm:
2.5µl dung dịch đệm (buffer) 10X; 0.625 unit Taq DNA polymerase; 3.0 mM
MgCl
2
; 280µM dNTPs; Mồi xuôi và mồi ngược E6: mỗi mồi 500nM; Mồi xuôi và
mồi ngược E7: mỗi mồi 500nM; 1µl chứng nội ở nồng độ 10
4
bản sao/ml; 2.5µl
dịch cDNA. Thêm nước cất hai lần cho đủ 25µl.
- Thao tác thực hiện trong điều kiện đá đang tan

- Cài đặt chương trình luân nhiệt của phản ứng PCR:
Bước 1: 95
0
C 5 phút 1 chu kỳ
Bước 2: 95
0
C 30 giây
55
0
C 30 giây 39 chu kỳ
72
0
C 30 giây
Bước 3: 72
0
C 6 phút 1 chu kỳ
34
2.4.6. Phương pháp ñiện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT – PCR
2.4.6.1. Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các
nucleic acid tích điện âm nên dưới tác động của điện trường sẽ di chuyển về cực
dương. Sử dụng ethidium bromide để phát hiện sự hiện diện của DNA sau khi
nhuộm là nhờ Ethidium bromide có khả năng gắn chèn vào phân tử DNA và phát
màu dưới đèn UV.
2.4.6.2. Pha hóa chất và chuẩn bị gel agarose
 Pha dịch nạp mẫu
Thành phần của dịch nạp mẫu như sau: 600 µl glycerol + 0.25% xylene
cyanol ff, thêm dung dịch TAE 1X cho đủ 1000 µl.
 Kỹ thuật đổ gel agarose 2%
Cân 2g agarose, thêm 100 ml TAE 1X, đun tan hoàn toàn, để nguội 60

0
C, đổ
vào giá nằm ngang có lắp lược, chờ gel đông, đặt vào bồn điện di có chứa dung dịch
TAE 1X, rút lược khỏi gel.
2.4.6.3. Kỹ thuật ñiện di kiểm tra sản phẩm multiplex RT - PCR
Thành phần điện di bao gồm 7µl sản phẩm PCR hoặc chứng dương, chứng
âm với 3 µl dịch nạp mẫu. Cho hỗn hợp trên vào các giếng trên gel agarose 2%.
Điện di ở điện thế 50V, 5 phút. Tăng lên 80V, 30 phút. Nhuộm gel trong dung dịch
TAE 1X có ethidium bromide 15 phút.
Quan sát kết quả điện di thông qua thiết bị chụp hình chuyên dụng GelDoc
XR có kết nối phần mềm chuyên dụng (Biorad). Kích thước các sản phẩm PCR
được ghi nhận sẽ đối chiếu với chứng dương, chứng âm và thang chuẩn 100bp.