phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm azosporillum trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh đăk nông

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN





NGUYỄN TIẾN DŨNG




PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum
TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA
ĐIỂM CỦA TỈNH ĐĂK NÔNG






LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011
















BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN

NGUYỄN TIẾN DŨNG




PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG
VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum
TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA
ĐIỂM CỦA TỈNH ĐĂK NÔNG






Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 604230

LUẬN VĂN THẠC SĨ: Sinh học



Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng





BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011

i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu,
kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ
một công trình nào khác.

Người cam ñoan


Nguyễn Tiến Dũng

ii
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn tất khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu
sắc nhất tới:
Trường Đại học Tây Nguyên, các Phòng ban và Khoa chức năng ñã tổ
chức ñào tạo, quản lý và tạo ñiều kiện thuận cho tôi hoàn tất khóa học và luận
văn. Các thầy, cô giáo trong và ngoài trường ñã nhiệt tình giảng dạy và cung cấp
những kiến thức quý báu trong suốt khóa học.
PGS. TS Nguyễn Anh Dũng, người quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn và tạo
mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận.
PGS. TS Nguyễn Hữu Hiệp thuộc viện nghiên cứu và phát triển Công
Nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ ñã có những trao ñổi quý báu và tạo
ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Bộ môn Sinh học thực vật, Bộ môn
SHTN, Bộ môn khoa học ñất, Trại thực nghiệm Khoa Nông Lâm và Phòng thí
nghiệm CNSH&MT là các ñơn vị ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện và
hoàn tất khóa luận.

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ, giáo viên trường
THCS Tô Hiệu, huyện Krông Ana, tỉnh Đăklăk ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi
thực hiện và hoàn tất khóa luận.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể lớp Cao học Sinh học thực
nghiệm K03 ñã cùng tôi san sẻ những buồn vui, cùng tôi học tập và trao ñổi kiến
thức trong suốt khóa học. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới em Nguyễn Xuân Tài lớp
Khoa học cây trồng K2007, em Lê Thị Hương lớp Cử nhân Sinh K2007 ñã cùng
tôi tham gia nghiên cứu ñề tài.
Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới những người
thân trong gia ñình ñã luôn quan tâm, tin tưởng, ñộng viên tôi trong suốt quá
trình học cũng như thực hiện luận văn.
Buôn Ma Thuột, tháng 09 năm 2011
Nguyễn Tiến Dũng

iii
MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

1. Tính cấp thiết của ñề tài 1

2. Mục tiêu của ñề tài 2

3. Ý nghĩa của ñề tài 2

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu về cây ngô 3

1.1.1 Phân loại thực vật 3

1.1.2 Đặc ñiểm hình thái cây ngô 3

1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây ngô 4

1.1.3.1 Yêu cầu nhiệt ñộ 4

1.1.3.2 Yêu cầu về ánh sáng 4

1.1.3.3 Yêu cầu về nước 5

1.1.3.4 Yêu cầu về ñất 5

1.1.3.5 Yêu cầu chế ñộ không khí trong ñất 5

1.1.4 Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô 6

1.1.4.1 Vai trò của ñạm 6

1.1.4.2 Vai trò của lân 6

1.1.4.3 Vai trò của kali 6

1.1.4.4 Vai trò các nguyên tố vi lượng 7

1.2 Tổng quan về vi khuẩn cố ñịnh Nitơ (N) 7

1.2.1 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do 7

1.2.1.1 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do hiếu khí 7

1.2.1.2 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do kỵ khí Clostridium 9

1.2.2 Vi khuẩn cố ñịnh N cộng sinh 9

1.2.2.1 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu 9

1.2.2.2 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu 10


iv
1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc 13

1.4 Nghiên cứu trong nước 15

PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Nội dung nghiên cứu 17

2.2 Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu 17

2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 17

2.2.2 Địa ñiểm nghiên cứu 18

2.2.3 Thời gian nghiên cứu 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp thu mẫu 18

2.3.2 Phương pháp phân lập 18

2.3.3 Phương pháp mô tả ñặc ñiểm hình thái, ñặc ñiểm sinh học của các chủng
Azospirillum 20

2.3.4 Phương pháp xác ñịnh khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum 20

2.3.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm
bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô 21

2.3.6 Phương pháp ñịnh danh các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn bằng kỹ
thuật PCR 23

2.3.7 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng
Azospirillum ñược tuyển chọn 23

2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh
khối của các chủng Azospirillum 23

2.3.7.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối
của các chủng Azospirillum 25

2.3.7.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của các
chủng Azospirillum 25

2.3.7.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến
sinh khối của các chủng Azospirillum 25

v
2.3.7.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối
của các chủng Azospirillum 25

2.3.8 Phương pháp ñánh giá khả năng cố ñịnh ñạm của các chủng vi khuẩn
Azospirillum ñược tuyển chọn trên ñồng ruộng 26

2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 28

PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số ñịa
ñiểm của tỉnh Đăk Nông 29

3.2 Mô tả ñặc ñiểm hình thái, ñặc ñiểm sinh học của các chủng Azospirillum 30

3.3 Kết quả nghiên cứu xác ñịnh khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum
34

3.4 Kết quả tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm bằng
nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô 37

3.4.1 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến sinh trưởng của cây ngô trong
bầu ñất 37

3.4.2 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến hàm lượng ñạm trong lá ngô 41

3.4.3 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến hàm lượng diệp lục trong lá 43

3.5 Kết quả ñịnh danh các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn bằng kỹ thuật
PCR 45

3.6 Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azospirillum
ñược tuyển chọn 46

3.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các
chủng Azospirillum 46

3.6.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối của
các chủng Azospirillum 47

3.6.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của các chủng
Azospirillum 49

3.6.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến sinh khối
của các chủng Azospirillum 51


vi
3.6.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường nuôi cấy ñến sinh
khối của các chủng Azospirillum 53

3.7 Kết quả ñánh giá khả năng cố ñịnh ñạm của các chủng vi khuẩn Azospirillum
ñược tuyển chọn trên ñồng ruộng 55

3.7.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển
chọn ñến sinh trưởng của cây ngô 55

3.7.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển
chọn ñến chiều cao cây ngô 55

3.7.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển
chọn ñến số lá của cây ngô 58

3.7.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển
chọn ñến chiều dài lá cây ngô 61

3.7.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn
ñến ñường kính gốc 63

3.7.1.5 Kết quả xác ñịnh hàm lượng diệp lục trong lá 65

3.7.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển
chọn ñến năng suất của cây ngô 66

PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72

4.1 Kết luận 72

4.2 Kiến nghị 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vii
CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ABA Abscisic acid

BNF Biological nitrogen fixation
bp Base pairs
Cs Cộng sự
Cl Clo
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxyribonucleotide triphotphate
ĐC Đối chứng
EtBr Ethidium bromide
GA Gibberillins
IAA Indole - 3 - acetic acid
IBA Indole - 3 - butyric acid
K
2
O Kali nguyên chất
Mg Magie
N Đạm
NT Nghiệm thức
PCR Polymerase chain reaction
PHB Poly hydroxybutyrate
P
2
O
5

Lân
nguyên ch
ất

S Lưu huỳnh
VK Vi khuẩn

viii
DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1. Đặc ñiểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Azospirillum 30

Bảng 3.2. Kết quả nhuộm gram của các chủng Azospirillum 33

Bảng 3.3. Giá trị OD
530nm
ño ñược ở các nồng ñộ IAA pha loãng khác nhau 34

Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA của các chủng
Azospirillum (mg/l) 35

Bảng 3.5. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô trồng trong bầu ñất 37

Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến sinh khối tươi và khô của
cây ngô 39

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến hàm lượng N tổng số
trong lá ngô. 41

Bảng 3.8. Hàm lượng diệp lục trong lá ngô (mg/g) 43

Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng
Azospirillum ( x 10

9
tế bào/ml) 46

Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng
Azospirillum ( x 10
9
tế bào/ml) 48

Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của các chủng Azospirillum (
x 10
9
tế bào/ml) 50

Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng
Azospirillum ( x 10
9
tế bào/ml) 52

Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng
Azospirillum ( x 10
9
tế bào/ml) 54

Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến chiều cao cây (cm) 56

Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến số lá của cây ngô (lá/cây) 59

Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến chiều dài lá của cây ngô (cm) 61

Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến ñường kính gốc cây ngô (mm) 64

Bảng 3.18. Hàm lượng diệp lục trong lá ngô (mg/g) 65


ix
Bảng 3.19. Các chỉ tiêu năng suất của cây ngô trồng ngoài ñồng 67

Bảng 3.20. Khối lượng khô 100 hạt và năng suất lý thuyết 70



x
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Trang
Biểu ñồ 3.1. Phương trình ñường chuẩn về mối tương quan tuyến tính giữa chỉ
số OD
530nm
và nồng ñộ IAA (mg/l) 35

Biểu ñồ 3.2. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng
Azospirillum 47

Biểu ñồ 3.3. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng
Azospirillum 49

Biểu ñồ 3.4. Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của các chủng Azospirillum
51

Biểu ñồ 3.5. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các

chủng Azospirillum 53

Biểu ñồ 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng
Azospirillum 55

Biểu ñồ 3.7. Hàm lượng diệp lục trong lá (mg/g) 66

Biểu ñồ 3.8. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến số
hạt/hàng của bắp ngô. 68

Biểu ñồ 3.9. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến chiều
dài của bắp ngô. 69

Biểu ñồ 3.10. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến năng
suất lý thuyết. 71



xi
DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 3.1. Phân lập vi khuẩn từ môi trường bán ñặc Nfb 29

Hình 3.2. Kết quả ñiện di DNA của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn 45

1
MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của ñề tài
Phân vi sinh có nhiều ưu ñiểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng nâng
cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản suất
thì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát
triển nông nghiệp bền vững. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta
vẫn chưa ñáp ứng ñủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô
sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn ñịnh. Do ñó, nghiên cứu
ñể hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết.
Trong ñó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu ñầu tiên và
quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [5].
Hướng ñến một nền sản xuất nông nghiệp sinh thái bền vững, trong vài
chục năm gần ñây ngày càng gia tăng các nghiên cứu vi khuẩn có ích khu trú
trong rễ cây trồng không thuộc cây họ ñậu, ñặc biệt ở cây ngũ cốc. Theo
Doebereiner, vi khuẩn Azospirillum ở trong rễ cây không gặp phải sự cạnh tranh
nguồn Carbon như vi khuẩn khu trú trên bề mặt rễ và có thể cung cấp ñạm cho
cây trồng mà không phải nhờ ñến khi tế bào chết [35].
Nhóm Azospirillum là vi khuẩn sống trong rễ các loại cây ngũ cốc như
lúa, ngô. Nhóm vi khuẩn này có khả năng cố ñịnh N, tổng hợp nhiều chất kích
thích sinh trưởng thực vật IAA, GA
3
… góp phần nâng cao ñộ phì nhiêu của ñất,
kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và
phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [35]
Ở Việt Nam ñã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn thuộc
chi Azospirillum trong rễ lúa. Bên cạnh ñó, ngô là một ñối tượng có vòng ñời
sinh trưởng và phát triển tương ñối ngắn, ít ñầu tư, hiệu quả kinh tế cao, ñược

trồng phổ biến. Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cố ñịnh ñạm
Azospirillum trong rễ cây ngô còn rất ít. Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên


2
cứu nào về thành phần loài của chi Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số ñịa
phương của tỉnh Đăk Nông.
Xuất phát từ thực tế ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Phân lập,
tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố ñịnh ñạm Azospirillum trong rễ cây ngô
tại một số ñịa ñiểm của tỉnh Đăk Nông”.

2. Mục tiêu của ñề tài
- Phân lập và tuyển chọn ñược một số chủng Azospirillum cố ñịnh ñạm
trong rễ cây ngô.
- Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủng Azospirillum có hoạt
tính cố ñịnh ñạm làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô.
3. Ý nghĩa của ñề tài
Ý nghĩa khoa học
Xác ñịnh ñược một số chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm, sống
nội sinh trong rễ cây ngô.
Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả của ñề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng Azospirillum sống
nội sinh trong rễ cây ngô có hoạt tính cố ñịnh ñạm ñể sản xuất phân vi sinh có
hiệu quả, nâng cao ñộ phì nhiêu của ñất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng
suất cây ngô và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững.




3

PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về cây ngô
1.1.1 Phân loại thực vật
Ngô có tên khoa học là Zea mays L (Zea: Từ Hi Lạp ñể chỉ cây ngũ cốc và
từ Mays là từ “Mahix” tên gọi cây ngô của người bản ñịa da ñỏ [7]. Cũng có thể
Mays là từ “Maya” tên một bộ tộc da ñỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của cây
ngô) [18].
Cây ngô thuộc: Ngành : Maopholiophyta
Lớp : Liliopsida
Bộ : Poales
Chi : Zea
Loài : Mays
1.1.2 Đặc ñiểm hình thái cây ngô [7],[15],[16]
Rễ ngô: trong quá trình sinh trưởng phát triển, cây ngô có 3 loại rễ. Đó là:
rễ mầm, rễ ñốt và rễ chân kiềng.
Thân ngô: thân ñặc, ñường kính thân khoảng 2 – 4cm tùy thuộc vào
giống, mùa vụ và trình ñộ thâm canh, thân có nhiều lóng. Trong ñiều kiện bình
thường ngô cao từ 1,8 – 2m, từ khi mọc ñến khi cây có 6 – 7 lá thân phát triển
chậm, từ lúc 8 – 9 lá ñến nhú cờ, nở hoa cây phát triển nhanh và ñến khi hoa ñực
phơi màu, bắp phun râu cây vẫn tiếp tục lớn. Sau khi thụ phấn thì thân ngừng
phát triển.
Lá ngô: gồm có lá mầm, lá thân, lá ngọn và lá bẹ. Lá ñược chia thành các
bộ phận như: bẹ lá, phiến lá và thìa lá. Phiến lá rộng và dài, mép lá gợn sóng, có
nhiều lông tơ. Gân lá song song. Lá mang bắp có chiều dài dài nhất.
Hoa ngô: gồm hoa ñực (bông cờ) và hoa cái. Bông cờ có nhiều nhánh,
mỗi nhánh có nhiều hoa xếp thành từng chùm, mỗi chùm có hai hoa, mỗi hoa có
3 nhị ñực, mỗi nhị ñực có 1 bao phấn, một bao phấn có hai ô, một ô chứa từ
1000 – 2500 hạt phấn. Hoa cái sinh ra từ nách lá gồm có lõi bắp có nhiều ñốt

4
ngắn có lá bao bi, mỗi hoa cái có một râu. Hoa cái mọc từng ñôi trên hoa tự. Mỗi
chùm hoa có hai hàng hoa nhưng hoa thứ hai bị thoái hóa chỉ một hoa hình thành
hạt, một ñôi chùm hoa cho hai hàng hạt nên hàng hạt ở trên bắp luôn luôn chẵn.
Hạt ngô: thuộc loại quả dĩnh, gồm các bộ phận chính là vỏ hạt, lớp
alơron, phôi và nội nhũ, phía dưới của hạt có gốc hạt là phần dính liền hạt với lõi
ngô. Hạt ngô ñược hình thành gồm các giai ñoạn: từ thụ phấn ñến chín sữa là 10
– 15 ngày, từ chín sữa ñến chín sáp là 15 – 20 ngày và từ chín sáp ñến chín hoàn
toàn là 10 – 15 ngày.
1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây ngô [18],[22]
1.1.3.1 Yêu cầu nhiệt ñộ
Ngô là cây trồng ưa khí hậu ẩm, nhiệt ñộ thích hợp vào khoảng 20
0
C - 28

0
C. Nhiệt ñộ có thể ảnh hưởng ñến thời gian sinh trưởng của cây ngô. Trong cả
chu kỳ sống cũng như trong từng thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây ngô cần
một lượng tích nhiệt nhất ñịnh. Đủ lượng nhiệt cây mới sinh trưởng phát triển
bình thường. Tùy vào từng giống khác nhau mà cần một lượng nhiệt khác nhau.
Giống càng chín muộn thì cần lượng tích nhiệt càng cao.
1.1.3.2 Yêu cầu về ánh sáng
Ngô là cây có nguồn gốc nhiệt ñới thuộc nhóm cây ngày ngắn. Ánh sáng
là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của cây ngô, tạo ñiều kiện
thuận lợi cho quá trình tích luỹ chất dinh dưỡng và ảnh hưởng ñến ñộ dài của
quá trình sinh trưởng. Trung bình cần 12 giờ chiếu sáng/ngày.
Nghiên cứu phản ứng của cây ngô với ñộ dài ngày cho thấy cây ngô hình
thành các kiểu hình thái khác nhau. D.Azit ñã chỉ ra rằng: Các giống ngô ở châu
Âu do kết quả chọn lọc ñã hoàn thành ñược chu kỳ ánh sáng trong ñiều kiện

ngày dài, loại trừ ñược yêu cầu ngày ngắn. Cuperman và Razumov cho rằng rút
ngắn thời gian chiếu sáng ban ngày ñến 12 giời sẽ thúc ñẩy sự trổ cờ và hình
thành bắp.
Ánh sáng ảnh hưởng ñến sinh trưởng của cây ngô ở hai mặt là số giờ
chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Những tia sáng dài ñã kìm hãm sự sinh


5
trưởng của cây ngô, các tia sáng ngắn lại thúc ñẩy sự phát triển. Nghiên cứu của
Cuperman ñã xác ñịnh thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng ñã gây ảnh
hưởng rất lớn ñến sự phát triển của bắp và bông cờ của cây ngô. Trong ñiều kiện
chiếu sáng bằng ánh sáng trắng và xanh lam thì sự phát triển của cây diễn ra
nhanh nhất. Trong diều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng ñỏ thì sự phát triển của
bông cờ hầu như không bị ảnh hưởng nhưng sự hình thành của bắp chậm lại.
Ánh sáng lục kìm chế sự sinh trưởng và phát dục của bắp.
1.1.3.3 Yêu cầu về nước
Ngô là cây trồng cạn, bộ rễ ngô phát triển rất mạnh, hút nước khỏe và sử
dụng tiết kiệm nước. Cây ngô sinh trưởng nhanh tạo ra sinh khối lớn. Do vậy cây
cần một lượng nước rất lớn. Trung bình cây ngô trong một chu kỳ sống cần
khoảng 200 lít nước ñể sinh trưởng và phát triển. Ở các thời kì sinh trưởng khác
nhau cây ngô yêu cầu lượng mưa và lượng nước tưới khác nhau. Cây ngô không
chịu ñược úng, ñộ ẩm của ñất quá cao, lớn hơn 80% có ảnh hưởng xấu ñến sinh
trưởng phát triển của cây ngô, ñặc biệt là từ lúc cây mọc ñến khi cây ñược 8 lá.
Vào giai ñoạn này chỉ cần ngập nước 1 – 2 ngày cây ngô cũng có thể bị chết úng.
Ẩm ñộ thích hợp khoảng 70%.
1.1.3.4 Yêu cầu về ñất
Đất rất quan trọng trong sản xuất ngô, ñất trồng ngô phải tơi xốp, nhiều
mùn, hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ thoát nước, tầng canh tác dày, pH từ 6 – 7,
thuận lợi cho việc tưới nước vào mùa khô và tiêu nước vào mùa mưa. Hầu hết,
ngô ñược trồng ở trên ñất cạn, không ngập nước, ñất có thành phần cơ giới nhẹ,

ñất cát pha, trên các loại ñất vụ trước trồng các cây họ ñậu, hoặc các cây phân
xanh cải tạo ñất.
1.1.3.5 Yêu cầu chế ñộ không khí trong ñất
Để thu hoạch sản lượng ngô cao, ngoài việc cung cấp nước và dinh dưỡng
còn phải chú ý ñến chế ñộ không khí ở trong ñất. Chế ñộ không khí ảnh hưởng
gián tiếp thông qua nhiều khâu khác nhau như là vi sinh vật, quá trình biến ñổi
hóa học trong ñất. Cây ngô ñặc biệt là rễ ngô phát triển tốt trong ñiều kiện háo


6
khí, nếu ñất chặt bí thiếu tơi xốp thì rễ ngô phát triển kém, ăn nông, rễ ngắn ít
lông hút, khả năng hút dinh dưỡng khoáng và nước kém. Dẫn ñến tình trạng cây
ngô thiếu dinh dưỡng sẽ sinh trưởng, phát triển kém.
1.1.4 Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô [16],[18],[22]
1.1.4.1 Vai trò của ñạm
Đạm là yếu tố dinh dưỡng quan trọng nhất, ñóng vai trò tạo năng suất và
chất lượng của ngô, 66% ñạm ñược tích luỹ trong hạt. Cây ngô hút ñạm tăng dần
từ khi cây có 3 – 4 lá tới trước trổ cờ. Ở nước ta, một số kết quả nghiên cứu cho
thấy thời kỳ hút ñạm mạnh nhất là 6 – 12 lá và trước khi trổ cờ, nếu các giai
ñoạn này mà thiếu ñạm thì năng suất giảm rõ rệt.
Triệu chứng thiếu ñạm ở ngô: cây thấp, lá nhỏ có màu vàng, các lá già có
vệt xém ñỏ, cây sinh trưởng chậm, cằn cỗi, cờ ít, bắp nhỏ, năng suất thấp.
1.1.4.2 Vai trò của lân
Lân có vai trò quan trọng với cây ngô tuy nhiên khả năng hút lân ở giai
ñoạn cây non lại rất yếu. Thời kỳ 3 – 4 lá, cây ngô hút không ñược nhiều lân, ñó
là thời kỳ khủng hoảng lân của ngô, nếu thiếu lân trong giai ñoạn này sẽ làm
giảm năng suất nghiêm trọng. Cây ngô hút nhiều lân nhất ( khoảng 62% tổng
lượng lân yêu cầu) ở thời kỳ 6 – 12 lá sau ñó giảm ñi ở các thời kỳ sau.
Triệu chứng thiếu lân của ngô biểu hiện bằng màu huyết dụ trên bẹ lá và
gốc cây, trái cong queo. Trường hợp thiếu nặng lá sẽ chuyển vàng và chết. Hiện

tượng này xảy ra ở lá già trước, sau ñó chuyển sang lá non và phổ biến ở ngô vụ
ñông trong ñiều kiện thời tiết khắc nghiệt.
1.1.4.3 Vai trò của kali
Kali có vai trò rất quan trọng tới sự sinh trưởng, phát triển và năng suất
của ngô. Kali tích luỹ nhiều ở thân, lá (khoảng 80%) và tích luỹ trong hạt ít hơn.
Cây ngô hút kali mạnh ngay từ giai ñoạn sinh trưởng ban ñầu. Từ khi cây mọc
tới trổ cờ ngô ñã hút khoảng 70% lượng kali cây cần.
Thiếu kali, protein và sắt sẽ tích tụ gây cản trở quá trình vận chuyển chất
hữu cơ. Thiếu kali là nguyên nhân rễ ngang phát triển mạnh, rễ ăn sâu kém phát


7
triển, do ñó cây dễ ñổ. Thiếu kali thể hiện ở các triệu chứng như chuyển nâu và
khô dọc theo mép và chóp lá, bắp nhỏ, nhiều hạt lép ở ñầu bắp (bắp ñuôi chuột)
và năng suất thấp.
1.1.4.4 Vai trò các nguyên tố vi lượng
Đối với cây ngô, các chất vi lượng thường thiếu là kẽm và molypñen.
Thiếu kẽm lá có màu trắng (bệnh bạch tạng), giữa các gân lá có những dải màu
vàng sáng, các lóng ngắn lại. Hiện tượng thiếu kẽm thường xảy ra trên ñất kiềm,
nghèo mùn, ñất giàu lân dễ tiêu hay bón quá nhiều lân. Thiếu molypñen lá
chuyển xanh nhạt, lá non teo lại và héo, nặng hơn lá ngọn không bung ra ñược,
có nhiều vết xém vàng.
1.2 Tổng quan về vi khuẩn cố ñịnh Nitơ (N )
Vi sinh vật cố ñịnh N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn
N
2
và cung cấp một lượng N ñáng kể cho cây trồng. Theo tính toán của các nhà
khoa học, các nhóm vi sinh vật cố ñịnh N BNF (Biological nitrogen fixation) có
thể cung cấp tới 240 x 10
6

tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cả
thế giới sản xuất bằng con ñường hóa học.
Vi sinh vật cố ñịnh N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí
N
2
dồi dào trong không khí (79%) thành dạng NH
4
+
cung cấp cho cây. Vi khuẩn
cố ñịnh N gồm có hai nhóm lớn:[5].
- Vi khuẩn cố ñịnh N tự do gồm:
+ Vi khuẩn cố ñịnh N tự do hiếu khí: Azotobacter và Beijerinskia sp.
+ Vi khuẩn cố ñịnh N kỵ khí: Vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium.
- Vi khuẩn cố ñịnh N cộng sinh như cộng sinh với rễ cây họ ñậu
Rhizobium, cộng sinh với rễ lúa Azoarcus,
1.2.1 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do
1.2.1.1 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do hiếu khí


8
Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp và Azotobacter sp.[5]
- Beijerinskia sp.
Được phân lập bởi Starkey (1939), là loại có ñặc ñiểm giống với Azotobacter
sp. Tế bào có hình dạng thay ñổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục.
Beijerinski là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử. Có khả năng sống tốt trong
môi trường axit ( pH=3). Vi khuẩn có khả năng cố ñịnh ñược 16 - 20 mg N khi
ñồng hóa hết 1g dinh dưỡng Carbon. Ngoài khả năng cố ñịnh N chúng còn có
khả năng tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng.
- Azotobacter sp.
Là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố ñịnh N tự do. Khi

chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, sinh sản bằng cách phân cắt, di
chuyển nhờ tiêm mao. Khi trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thu
nhỏ thành dạng cầu ñược bao bọc bởi một lớp nhầy.
Khuẩn lạc của Azotobacter có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo.
Các nòi phân lập từ tự nhiên có khả năng cố ñịnh 10 - 15mg N khi tiêu thụ hết 1g
dinh dưỡng Carbon. Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố ñịnh tới 30mg/1g
dinh dưỡng Carbon.
Trong ñất, Azotobacter tập trung ở vùng ñất xung quanh rễ cây. Ngoài khả
năng cung cấp dinh dưỡng N cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm,
kích thích sinh trưởng. Trong ñất, Azotobacter thường phổ biến các nòi sau:
+ Azotobacter chrococum: kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả
năng di ñộng khi còn non. Khi già hình thành nang xác. Khuẩn lạc có màu nâu
hoặc ñen khi về già, không khuếch tán ra môi trường.
+ Azotobacter beijerinckii: có kích thước 2,4 x 4,6 micromet. Không có
khả năng di ñộng và hình thành nang xác. Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng,
sắc tố không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy.


9
+ Azotobacter vinelandii: tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 micromet, có khả
năng di ñộng và hình thành nang xác. Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố
khuếch tán vào môi trường.
+ Azotobacter agilis: tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 micromet, có khả
năng di ñộng, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang,
sắc tố khuếch tán vào môi trường [5].
1.2.1.2 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do kỵ khí Clostridium
Clostridium ñược phát hiện lần ñầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Vi khuẩn
Clostridium có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 micromet, có thể ñứng riêng rẽ
hoặc kẹp ñôi thành chuỗi ngắn. Bào tử hình bầu dục, có khả năng chịu ñược
nhiệt ñộ cao và khô hạn. Clostridium có khả năng tích lũy ñược 10 - 15mg N

phân tử khi ñồng hóa hết 1g ñường Carbon [5].
1.2.2 Vi khuẩn cố ñịnh N cộng sinh
1.2.2.1 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu
Vi khuẩn cố ñịnh N cộng sinh với cây họ ñậu còn gọi là vi khuẩn nốt sần.
Chúng hình thành các nốt sần với rễ cây họ ñậu như cây ñậu tương, lạc, ñiền
thanh, muồng, cốt khí, trinh nữ, chúng sử dụng dinh dưỡng carbon của cây và
cố ñịnh N không khí ñể sử dụng và cung cấp một phần cho cây chủ.
Gồm có: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium và Sinorhizobium[9].
- Rhizobium
Năm 1868, nhà khoa học Hà Lan M.W.Beijrinck ñã phân lập ñược loài vi
khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ ñậu, ông ñã ñặt tên là
Basilusradicicola.
Năm 1889, vi khuẩn này ñược xếp vào chi Rhizobium ( B.Frank, 1989).
Trên môi trường ñặc, chúng có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, khi còn non có khả
năng di ñộng nhờ tiêm mao, khi tế bào già trở nên bất ñộng.


10
Rhizobium thuộc loại hảo khí ưa pH trung tính hoặc kiềm ( pH từ 6,5 -
7,5), nhiệt ñộ thích hợp 24 – 26
0
C. Chúng xâm nhiễm vào rễ cây bộ ñậu thông
qua lông hút, ñôi khi qua vết thương ở vỏ rễ. Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ
tiết ra enzyme polyalacturonase phân huỷ thành lông hút tạo ñiều kiện cho vi
khuẩn xâm nhập vào rễ. Theo tính toán của các nhà khoa học nhóm vi khuẩn này
có khả năng cung cấp cho cây 80 -120kg N/ ha.
- Bradyrhizobium
Vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5 - 0,9 x 1,2 - 3,0 µm, thường
chứa chất dự trữ PHB. Trên môi trường ñặc, khuẩn lạc của chúng có dạng trơn,
bóng, nhầy, không màu.

Bradyrhizobium là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể phát triển
ñược ngay trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0,001atm.
Chúng phát triển thích hợp ở pH= 6,5 - 7,5. Nhiệt ñộ phát triển thích hợp là 24 –
26
0
C, nhiệt ñộ 37
0
C sự phát triển của chúng bị cản trở một cách rõ rệt.
- Azorhizobium
Azorhizobium là một giống mới ñược ñề nghị với một loài là
Azorhizobium caulinodans chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của
Sesbania rostrata
- Sinorhizobium
Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây ñậu nành ñược
phân lập từ Trung Quốc. Giống Sinorhizobium gồm có 2 loài là Sinorhizobium
fredii và Sinorhizobium xinjiangensis.
1.2.2.2 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu
- Vi khuẩn lam (Cyanobacteria): Một số vi khuẩn lam tự dưỡng ñạm hay
thanh tảo sống chung với nhiều vi sinh vật chân hạch, từ các loại nấm cho ñến
các thực vật hạt kín [5].
- Azospirillum
Phát hiện năm 1974, là vi khuẩn Gram âm có dạng xoắn, sống tự do, ñường
kính 1µm, dài 2,1 - 3,8µm chuyển ñộng trong môi trường lỏng bởi một tiêm mao


11
dài ở ñầu ( polan flagellum), trong môi trường ñặc ở 30
0
C nhiều tiêm mao bên
(lateral flagellum) ngắn hơn cũng ñược thành lập.

Trong những năm gần ñây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn này
sống ở trong vùng rễ, trong rễ cây, thân cây và lá các cây không thuộc họ ñậu
như lúa, bắp, mía, sorghum, và một số loại cỏ.
Azospirillum giúp tăng năng suất lúa từ 32 - 81% ở ñiều kiện nhà lưới
(Mirza và ctv, 2000; Malik và ctv, 2002). Nhưng ở ñiều kiện ngoài ñồng vi
khuẩn nầy chỉ làm tăng năng suất lúa ñược 10 - 30% [9].
Azospirillum tăng sinh ở cả trong ñiều kiện hiếu khí và kỵ khí với sự hiện
diện hoặc không có hợp chất nitơ trong môi trường, nhưng thích hợp là vi hiếu
khí. Nhiệt ñộ tối hảo từ 35 - 37
0
C. Một số dòng Azospirillum là những vi sinh vật
tự dưỡng không bắt buộc. Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên muối của
những acid hữu cơ như malate, succinate, hay pyruvate. Fructore và những
ñường ñôi khác cũng có thể ñược vi khuẩn sử dụng như là nguồn carbon . Một
số dòng Azospirillum cần biotin cho sự phát triển của chúng [5], [9].
Ngoài khả năng cố ñịnh nitơ chúng còn có khả năng khử nitrat, chống lại
vi khuẩn gây bệnh thối lá ở cây dâu tằm. Theo Eckert (2001) chi Azospirillum
có 7 loài là: A. brasilense; A. lipoferum ; A. amazonense; A. irakense; A.
halopraeferens; A. largimobile và A. doebereineae [35].
Một số báo cáo gần ñây cho thấy vi khuẩn này có thể tiết ra những kích
thích tố tăng trưởng như: IAA (Indole - 3 - acetic acid), IBA (Indole - 3 - butyric
acid), ABA (abscisic acid) và cytokynins. Những kích thích tố ñó làm tăng chiều
dài rễ, tăng thể tích rễ và số lượng rễ. Từ ñó, chúng làm tăng khả năng hấp thu
khoáng chất và nước, tăng khả năng sinh trưởng và phát triển cũng như tăng
năng suất của cây. Ngoài ra, chúng còn giúp cho cây chống chịu ñược ñiều kiện
khô hạn.
- Gluconacetobacter diazotrophicus [9].
Năm 1988, ñược Cavalcante V. A và Dobereiner J phân lập lần ñầu tiên từ
rễ và thân cây mía trồng ở nhiều khu vực khác nhau trên khắp Brazil.

12
G. diazotrophicus là vi khuẩn Gram âm; ưa acid; vi hiếu khí bắt buộc; tế
bào dạng que thẳng tròn ñầu ( 0,7 - 0,9µm ñến khoảng 1 - 2µm) tồn tại ở dạng
ñơn, ñôi hoặc chuỗi mà không có nội bào tử; sử dụng ñường (glucose, fructose,
sucrose…) ở nồng ñộ khác nhau làm nguồn C nhưng tăng trưởng tốt nhất là ở
nồng ñộ sucrose 10% và pH = 5,5.
G. diazotrophicus có khả năng cố ñịnh ñạm và sản xuất ra hormone thực
vật ( auxin, gibberellin), có thể hoà tan Zn và phosphorus nên G. diazotrophicus
ñược xem là một loài vi khuẩn ñầy hứa hẹn, với khả năng cung cấp gần một nửa
nitơ cố ñịnh ñược ở dạng hữu ích cho cây [9].
- Herbaspirillum [9].
Herbaspirillum là các vi khuẩn hình que, Gram âm, rộng khoảng 0,5 -
0,6µm. Chúng sinh trưởng tốt trong môi trường có dicarboxylic và tổng hợp nitơ
trong một khoảng pH biến thiên từ 5,3 - 8. Trong môi trường bán ñặc vi khuẩn
Herbaspirillum tạo thành một lớp màng mỏng, trắng, mịn ( pellicle). Khi cấy
chuyển lên môi trường ñặc JNFb thì lớp màng này phát triển thành khuẩn lạc
nhỏ, ẩm, ánh xanh và trên môi trường ñặc BMS thu ñược khuẩn lạc màu trắng
sữa.
Herbaspirillum có khả năng cố ñịnh ñạm cộng sinh trong mô của những
cây thân cỏ như: Lúa, bắp, mía, sorghum, chuối và khóm. Ngoài ra chúng còn
tạo ra những sản phẩm của phytohormones như auxins và gibberillins rất tốt cho
sự tăng trưởng của cây.
- Burkholderia [9].
Vi khuẩn Burkholderia thuộc vi khuẩn Gram âm, có hình dạng hình que,
ñường kính khoảng 1µm, chúng có thể di chuyển nhờ các chiên mao ở ñầu (
Jesús et al, 2004).
Burkholderia sinh trưởng và phát triển trong ñiều kiện kỵ khí hoặc hiếu
khí, nhưng trong môi trường ít khí oxy thì phát triển tốt nhất, chúng phát triển sâu
trong môi trường nuôi cấy từ 1 - 4mm (Paulina et al, 2001). Trong môi trường