Đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung mô và thuốc plenastem trên mô hình chuột tổn thương gan do tắc ống dẫn mật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-------- ∞0∞--------

NGUYỄN MINH THƯ

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUÂ ĐIỀU TRỊ CỦA
TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ VÀ THUỐC PLENASTEM®
TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN

Tai Lieu Chat Luong

DO TẮC ỐNG DẪN MẬT

LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-------- ∞0∞--------

NGUYỄN MINH THƯ

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUÂ ĐIỀU TRỊ CỦA
TẾ BÀO GỐC TRUNG MƠ VÀ THUỐC PLENASTEM®
TRÊN MƠ HÌNH CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN

DO TẮC ỐNG DẪN MẬT
Chun ngành: Công nghệ sinh học
Mã số chuyên ngành: 8 42 02 01
LUẬN VĂN THẠC SĨ
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : PGS.TS TRƯƠNG HÂI NHUNG

TP. HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021


TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC

CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

GIẤY XÁC NHẬN

Tôi tên là : NGUYỄN MINH THƯ
Ngày sinh: 02/01/1984

Nơi sinh: TP.HCM

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã học viên : 18884202010006

Tôi đồng ý cung cấp tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp hợp lệ về bản quyền cho Thư
viện trường đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh. Thư viện trường đại học Mở Thành phố

Hồ Chí Minh sẽ kết nối tồn văn thơng tin khóa luận tốt nghiệp vào hệ thống thơng tin
khoa học của Sở Khoa học và Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh.

Ký tên
(Ghi rõ họ và tên)


CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

Ý KIẾN CHO PHÉP BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
CỦA GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN
Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS. Trương Hải Nhung
Học viên thực hiện: Nguyễn Minh Thư

Lớp: MBIO018A

Ngày sinh: 02-01-1984

Nơi sinh: TP.HCM

Tên đề tài: Đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung mô và thuốc Plenastem® trên
mơ hình chuột tổn thương gan do tắc ống dẫn mật.
Ý kiến của giáo viên hướng dẫn về việc cho phép học viên Nguyễn Minh Thư được bảo vệ
luận văn trước Hội đồng:
1. Về nội dung & đánh giá thực hiện nhiệm vụ nghiên cứu của đề tài:
Bệnh lý tổn thương gan nói chung hay hẹp đường mật nói riêng đã và đang tạo ra gánh nặng
bệnh tật ở nhiều quốc gia. Các phương pháp điều trị hiện nay chủ yếu tập trung vào điều trị
triệu chứng của bệnh, kết cục của bệnh nhân là xơ gan tiến triển và ung thư gan. Bệnh nhân
bệnh gan giai đoạn cần được ghép gan để kéo dài thời gian sống, trong khi đó nguồn mơ gan

hiến tạng khơng đáp ứng đủ nhu cầu ghép.
Nghiên cứu tìm kiếm các phương pháp điều trị khác giúp kéo dài thời gian sống cho bệnh
nhân hẹp đường mật là rất cấp thiết. Tế bào gốc được đề xuất như giải pháp tiềm năng cho
điều trị bệnh lý thối hố tế bào nói chung và bệnh lý gan nói riêng. Đề tài đã hồn thành
được các mục tiêu và nội dung đặt ra và góp phần trả lời câu hỏi nghiên cứu: “Đánh giá
hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung mô và thuốc Plenastem® trên mơ hình chuột tổn
thương gan do tắc ống dẫn mật”
2. Về phương pháp nghiên cứu độ tin cậy của các số liệu:
Mơ hình bệnh lý tắc mật trên chuột là mơ hình kinh điển đã được ứng dụng nhiều nên có độ
tin cậy cao.
Các phương pháp đánh giá của nghiên cứu tiếp cận đầy đủ từ các cấp độ: tế bào (flow
cytometry, thu nhận tế bào từ gan, mô (HE, IHC) và cơ thể (sinh lý, sinh hố).
Các số liệu ghi nhận là trung thực và có xử lý thống kê.
3. Về kết quả khoa học của luận văn
Luận văn đã đạt được các kết quả chính như sau:


- Áp dụng được quy trình phẫu thuật gây tạo chuột tổn thương gan do tắc mật
- Đánh giá được hiệu quả điều trị của USB-MSC trên mơ hình chuột BDL. Kết quả nghiên
cứu chỉ ra UCB-MSC liều 5x105 tb/con hiệu quả điều trị tốt.
-

Chưa thể đánh giá hiệu quả của việc kết hợp tế bào gốc trung mô từ cuống rốn người

(5x105 tb/con) với thuốc Plenastem® (184mg/kg) cùng lúc trên mơ hình chuột Swiss BDL
bởi vì tỷ lệ tử vong cao khi kết hợp tế bào và Plenastem®.
4. Về kết quả thực tiễn của luận văn:
Kết quả nghiên cứu của luận văn đóng góp mới cho ứng dụng điều trị bệnh lý gan nói chung
và bệnh lý hẹp đường mật nói riêng. Liệu pháp tế bào gốc trung mơ từ dây rốn có tính an
toồn và hiệu quả trên mơ hình chuột tổn thương gan do tắc mật. Từ kết quả nghiên cứu

không chỉ mở ra một tiềm năng trong ứng dụng liệu pháp tế bào gốc trung mô từ dây rốn
trong điều trị bệnh lý ống mật.
5.

Ý kiến kết luận (mức độ đáp ứng yêu cầu đối với LVThS: Luận văn đáp ứng

được các yêu cầu đối với luận văn thạc sĩ và được phép bảo vệ luận văn trước hội đồng
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 25 tháng 04 năm 2021.
Người nhận xét

PGS.TS. Trương Hải Nhung


LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan rằng luận văn “Đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung
mô và thuốc Plenastem® trên mơ hình chuột tổn thương gan do tắc ống dẫn
mật” là bài nghiên cứu của chính tơi.
Ngoại trừ những tài liệu tham khảo được trích dẫn trong luận văn này, tơi cam
đoan rằng tồn phần hay những phần nhỏ của luận văn này chưa từng được công bố
hoặc được sử dụng để nhận bằng cấp ở những nơi khác.
Khơng có nghiên cứu nào của người khác được sử dụng trong luận văn này mà
khơng được trích dẫn theo đúng quy định.
Luận văn này chưa bao giờ được nộp để nhận bất kỳ bằng cấp nào tại các
trường đại học hoặc cơ sở đào tạo khác.

TP. Hồ Chí Minh, Năm 2021

Nguyễn Minh Thư

LỜI CÁM ƠN
Đầu tiên tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến PTN. Nghiên cứu &
Ứng dụng Tế bào gốc cùng Quỹ Phát triển khoa học và công nghệ Quốc gia
(NAFOSTED) mã số 108.05-2017.30 đã hỗ trợ kinh phí thực hiện đề tài: “Đánh giá
hiệu quả điều trị của tế bào gốc trung mơ và thuốc Plenastem® trên mơ hình chuột
tổn thương gan do tắc ống dẫn mật.”
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Trương Hải Nhung, người đã tận tình
truyền đạt cho tơi những kiến thức cần thiết và hết lòng hướng dẫn, hỗ trợ tơi trong
suốt q trình thực hiện Luận Văn Thạc Sĩ. Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến em
ThS. Lê Văn Trình và ThS. Đặng Minh Thành đã theo sát, hướng dẫn và giúp đỡ tôi
rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện Luận Văn Thạc Sĩ. Ngoài ra tôi cũng xin chân
thành cảm ơn các em Thông, Thủy, Trân, Nhân và Ngọc, những người luôn bên cạnh,
động viên tinh thần cũng như chia sẻ với tôi rất nhiều kinh nghiệm quý báu, luôn sát
cánh, hỗ trợ tôi, mang lại nhiều niềm vui và kỉ niệm đáng nhớ.
Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn cô, các anh chị em làm việc tại PTN.
Nghiên Cứu và Ứng dụng Tế bào gốc cùng toàn thể các bạn sinh viên học tập tại đây
đã chỉ dạy cho tôi rất nhiều kiến thức cũng như hỗ trợ về vật chất và tinh thần, cho
tôi những trải nghiệm quý báu cũng như giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này. Tơi xin
cảm ơn Quý Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học và Quý Thầy Cô khoa Đào Tạo
Sau Đại Học trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo, truyền
đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm trong suốt thời gian học tập tại đây. Tôi xin
cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện
cho tơi có cơ hội được học tập và hồn thành trình độ đào tạo Thạc Sĩ.
Xin Chân Thành Cảm Ơn!
TP Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 04 năm 2021

Nguyễn Minh Thư

a

TÓM TẮT
Tắc mật bẩm sinh hay thủng đường mật ở những trẻ sơ sinh (BA) nếu không
được phát hiện sớm, không điều trị sẽ dẫn đến suy gan, xơ gan (Bates, Bucuvalas,
Alonso, & Ryckman, 1998). Thống kê cho thấy tỉ lệ mắc bệnh ở các nước Châu Á
cao hơn so với châu Âu và châu Mỹ, chẳng hạn như tỉ lệ mắc bệnh ở Mỹ là 1:19.000,
ở Anh và các nước châu Âu 1:16.000, trong khi đó tỉ lệ mắc bệnh ở các nước châu Á
như Nhật Bản và Trung Quốc khoảng 1:9.600, đặc biệt khá cao ở Việt Nam với tỉ lệ
1:2400 (M. B. Liu et al., 2017). Phương pháp phẫu thuật Kasai được phát triển bởi
bác sĩ người Nhật Morio Kasai giúp giảm bớt sự tắc mật bằng cách phẫu thuật nối
hỗng tràng với nhánh nhỏ mật trong gan (portoentersstomy). Các trường hợp bệnh
nhân không được tiến hành phẫu thuật thì sẽ tử vong trong vịng 2 năm, với thời gian
sống trung bình là 8 tháng (Bates et al., 1998). Tỷ lệ bệnh nhân sống sót sau 5 năm
không cấy ghép gan khoảng 32%-63% (Shinkai et al., 2009). Và tỷ lệ này khơng cải
thiện trong vịng 45 năm qua, ngay cả ở các nước phát triển. Theo WHO, Đơng Nam
Á, trong đó có Việt Nam, có tỷ lệ gánh nặng bệnh tật lớn nhất so với các khu vực
khác trên thế giới trong đó có bệnh BA (M. B. Liu et al., 2017). Một số phương pháp
được áp dụng sau phẫu thuật Kasai như sử dụng kháng sinh, thuốc vận mật
(choleretics), steroid nhằm giúp cải thiện tình trạng bệnh cho dù có chứa nhiều tác
dụng phụ.
Nghiên cứu này nhằm đánh giá tác động của tế bào gốc trung mô và tế bào gốc
trung mô kết hợp với thuốc Plenastem® đối với tổn thương gan do tắc ống dẫn mật
trên mơ hình chuột. Chuột Swiss được tiến hành phẫu thuật thắt ống dẫn mật (BDL)
để gây bệnh xơ gan. Sau BDL 7 ngày, chuột được chia làm 4 nhóm, nhóm tiêm giả
dược PBS (BDL-PBS), nhóm tiêm thuốc Plenasterm® với liều 184.5mg/kg trên chuột
(BDL-PLENA) (tương đương 15mg/kg trên người), nhóm tiêm tế bào gốc trung mô
được phân lập từ mô dây rốn (umbilical cord blood-derived - UCB-MSC) với liều
5x105 tb/con (BDL-MSC) và nhóm tiêm kết hợp thuốc Plenasterm® và UCB-MSC
với cùng liều lượng (BDL-PLENA/MSC). Hiệu quả điều trị được đánh giá thông qua

b

tỉ lệ sống chết, các chỉ số sinh hóa (AST, ALT, Albumin) và thay đổi cấu trúc mô học
(nhuộm H&E), sự tích lũy collagen trong mơ gan (nhuộm Sirius Red), sự hoạt hóa tế
bào hình sao (nhuộm hóa mơ miễn dịch với marker α-SMA) và sự tăng sinh ống mật
trong gan (nhuộm IHC với marker là Ck7).
Kết quả: Sau 12 ngày điều trị, so với nhóm đối chứng (Normal), chuột tiêm
MSC (5x105 tb/con) có tỉ lệ sống cao (100%), giảm tổn thương gan (chỉ số sinh hóa
men gan Alb, AST và ALT trung bình lần lượt là 2.42±0.14Dg/L, 355.53±102.82
UI/L và 329.95±112.98 UI/L,), giảm diện tích xơ gan thơng qua diện tích hoại tử
trung bình là 5.06±2.85%, sự tích lũy collagen trong gan trung bình là 1.81±0.76%
và tỷ lệ dương tính của protein α-SMA là 1.06±0.39% và số lượng ống mật tăng sinh
(Ck7) là 20.71±3.66 ống mật/mm2. Trong khi đó hai nhóm BDL-PBS và BDLPLENA chuột có tỷ lệ sống thấp (lần lượt là 62.5% và 61.53%); chỉ số men gan cao
(AST lần lượt đạt 498.77±69.18 UI/L và 344.58±133.59UI/L, ALT đạt
500.85±136.72 UI/L và 366.40±116.88 UI/L) và giảm khả năng sản xuất Alb ở gan
(Alb ở BDL-PBS và BDL-PLENA lần lượt là 2.14±0.07 Dg/L và 2.08±0.13 Dg/L);
diện tích hoại tử cao (8.73±4.86% và 21.49±10.98%), sự tích lũy collagen cũng nhiều
(2.83±1.53% và 2.55±0.84%), tỷ lệ dương tính protein α-SMA là 3.15±0.83%,
2.88±0.82% và số lượng ống mật tăng sinh là 9.20±1.22 ống mật/mm2 và 17.03±4.82
ống mật/mm2. Riêng nhóm BDL-PLENA/MSC có tỷ lệ sống thấp (14.29% tương
đương 1/8 con sống) nên khơng an tồn và khơng đủ cỡ mẫu, do đó trong nghiên cứu
này chúng tơi khơng đánh giá hiệu quả điều trị của nhóm.
Kết luận: Bước đầu đánh giá được tính an tồn và hiệu quả điều trị của chuột
tổn thương gan do tắc ống dẫn mật khi điều trị bằng tế bào gốc trung mơ phân lập từ
dây rốn (UCB-MSC) là an tồn và có hiệu quả trên chuột BDL. Sử dụng thuốc
Plenastem® với liều lượng 15mg/kg trên người = 184.5mg/kg đơn lẻ hay kết hợp
UCB-MSC liều 5x105 tb/con khơng thích hợp ở chuột Swiss trên mơ hình BDL.

c

ABSTRACT
Congenital obstruction or perforation of the Biliary atresia (BA) in newborn
infants, if not detected early, and untreated can lead to liver failure and cirrhosis
(Bates, Bucuvalas, Alonso, & Ryckman, 1998). Statistics show that the incidence rate
in Asia is higher than that in Europe and America, such as 1: 19,000 in the US, 1:
16,000 in the UK and European countries, while That is, the prevalence rate in Asian
countries such as Japan and China is about 1: 9,600, especially quite high in Vietnam
at the rate of 1: 2400 (MB Liu et al., 2017). Kasai surgery method developed by
Japanese doctor Morio Kasai helps to reduce the obstruction by surgically connecting
the jejunum with the small bile branch in the liver (portoentersstomy). If not treated
early, can lead to die within 2 years, with an average survival time of 8 months (Bates
et al., 1998). The proportion of patients who survive 5 years without liver
transplantation is about 32% -63% (Shinkai et al., 2009). And this rate has not
improved over the past 45 years, even in developed countries. According to WHO,
Southeast Asia, including Vietnam, has the largest rate of disease burden compared
to other regions in the world including BA disease (M. B. Liu et al., 2017). Some
methods are applied after Kasai surgery such as antibiotics, choleretics, steroids to
help improve the condition even though they contain many side effects.
This study aimed to evaluate the effects of mesenchymal stem cells and
mesenchymal stem cells in combination with the drug Plenastem® on liver damage
caused by bile duct obstruction in a mouse model. Swiss mice underwent bile duct
surgery (BDL) for cirrhosis. After 7 days of BDL, 4 groups, including injected
placebo PBS (BDL-PBS), injected the drug Plenasterm® (BDL-PLENA) with a dose
of 184.5 mg/kg in mice (equivalent to 15mg/kg in human), injected mesenchymal
stem cells isolated from umbilical cord blood-derived (UCB-MSC) at a dose of 5x10 5
cell/mice (BDL-MSC) and a groub of injection of Plenasterm® and UCB-MSC was
the same dose (BDL-PLENA/MSC). Treatment efficacy was assessed by mortality,

biochemical indicators (AST, ALT, Albumin) and histological changes (H&E


d

staining), collagen accumulation in liver tissue (Sirius Red staining), astrocytes
activation (immunohistochemical staining with α-SMA marker) and hepatic tubular
proliferation (IHC staining with marker Ck7).
Results: After 12 days of treatment, compared to the control group (Normal),
mice injected with MSC had a high survival rate (100%), reduced liver damage
(average liver enzymes of liver enzymes, Alb, AST and ALT. 2.42 ± 0.14Dg / L,
355.53 ± 102.82 UI / L and 329.95 ± 112.98 UI / L respectively,), reduction of area
of cirrhosis through mean area of necrosis of 5.06 ± 2.85%, collagen accumulation in
liver the mean was 1.81 ± 0.76% and the positive rate of α-SMA protein was 1.06 ±
0.39% and the number of bile ducts (Ck7) was 20.71±3.66 bile ducts/mm2.
Meanwhile, the two groups BDL-PBS and BDL-PLENA mice have low survival rates
(62.5% and 61.53% respectively); High liver enzyme index (AST reached 498.77 ±
69.18 UI/L and 344.58 ± 133.59UI/L, respectively, ALT 500.85 ± 136.72 UI/L and
366.40 ± 116.88 UI/L) and decreased liver production of Alb (Alb in BDL-PBS and
BDL-PLENA are 2.14 ± 0.07 Dg/L and 2.08 ± 0.13 Dg/L, respectively); area of
necrosis is high (8.73 ± 4.86% and 21.49 ± 10.98%). Also, collagen accumulation is
high (2.83 ± 1.53% and 2.55 ± 0.84%), α-SMA protein positive rate is 3.15 ± 0.83%,
2.88 ± 0.82% and the number of bile duct proliferation was 9.20±1.22 bile duct/mm2
and 17.03±4.82 bile duct/mm2. Particularly, the BDL-PLENA/MSC group has a low
survival rate (14.29%) which is not safe, so in this study we do not evaluate the
treatment effectiveness of the group.
Conclusion: Initially assessing the safety and therapeutic efficacy of mice with
liver damage caused by bile duct obstruction during umbilical cord mesenchymal
stem cell treatment (UCB-MSC) is safe and effective. The effectiveness of
Plenastem® at a dose of 15mg/kg in human = 184.5mg/kg in mice alone or in

combination with UCB-MSC at a dose of 5x105 cell /mice is not suitable in Swiss
mice on the BDL model.


i

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................... i
LỜI CÁM ƠN ........................................................................................................ b
TÓM TẮT .............................................................................................................. a
ABSTRACT ........................................................................................................... c
MỤC LỤC ............................................................................................................... i
DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ BIỀU ĐỒ .............................................................. v
DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................................. vii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................viii
CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU ................................................................................... 2
1.1.

CƠ SỞ HÌNH THÀNH LUẬN VĂN ............................................................. 2

1.1.1

Giới thiệu về bệnh hẹp đường mật ở trẻ sơ sinh ....................................... 2

1.1.2

Tình hình dịch tễ bệnh hẹp đường mật ở trẻ sơ sinh ................................ 3

1.1.3

Các phương pháp điều trị hiện nay .......................................................... 3

1.2.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU .......................................................................... 5

1.3.

GIẢ THUYẾT NGHIÊN CỨU ...................................................................... 5

1.4.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU ................................................ 5

1.5.

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN ..................................................... 6

CHƯƠNG 2: CƠ SỞ TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU .......................................... 8
2.1.

CẤU TẠO VÀ CHỨC NĂNG SINH LÝ CỦA GAN VÀ MẬT .................... 8

2.1.1.

Tổng quát về gan và ống mật ở chuột ...................................................... 8


ii

2.1.2.
2.2.

Khả năng tái tạo của gan và ống mật ....................................................... 9

SỰ TỔN THƯƠNG GAN DO TẮC ỐNG DẪN MẬT VÀ MƠ HÌNH

CHUỘT TỔN THƯƠNG GAN DO TẮC ỐNG DẪN MẬT ................................... 9
2.2.1.

Quá trình tổn thương gan do tắc mật ....................................................... 9

2.2.2.

Sơ lược về mơ hình chuột tổn thương gan do tắc ống dẫn mật ............... 10

2.3.

LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TRONG ĐIỀU TRỊ CÁC BỆNH

VỀ GAN................................................................................................................ 12
2.3.1.

Tế bào gốc trung mơ (MSC) .................................................................. 12

2.3.2.

Vai trị tiềm năng của tế bào gốc trung mô ............................................ 13

2.3.3.

Tế bào gốc trung mô được phân lập từ dây rốn (Umbilical cord blood –

derived mesenchymal stem cell-UCB-MSC) ...................................................... 14
2.3.4.
2.4.

Tính an tồn khi sử dụng tế bào MSC trong điều trị .............................. 15

THUỐC PLENASTEM® ............................................................................ 16

2.4.1.

Dược chất chính của thuốc .................................................................... 16

2.4.2.

Dược tính và chỉ định của thuốc Dexamethasone .................................. 16

2.5.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU HIỆN NAY .................................................... 18

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP ..................................................... 20
3.1.

VẬT LIỆU................................................................................................... 20

3.1.1.

Đối tượng thí nghiệm ............................................................................ 20

3.1.2.

Dụng cụ ................................................................................................ 20

3.1.3.

Hóa chất ................................................................................................ 20

3.1.4.

Thiết bị.................................................................................................. 20

3.2.

PHƯƠNG PHÁP ......................................................................................... 21

3.2.1.

Thiết kế thí nghiệm ............................................................................... 21


iii

3.2.2.

Phương pháp giải đơng, ni cấy dịng tế bào gốc trung mô từ cuống rốn

........................................................................................................................... 21

3.2.3.

Phương pháp phẫu thuật thắt ống dẫn mật ............................................. 22

3.2.4.

Phương pháp đánh giá chỉ số bạch cầu .................................................. 23

3.2.5.

Phương pháp định lượng các chỉ số sinh hóa ......................................... 24

3.2.6.

Phương pháp thu mơ gan chuột ............................................................. 25

3.2.7.

Phương pháp tiêm UCB-MSC và thuốc Plenastem vào chuột BDL ....... 25

3.2.8.

Phương pháp nhuộm Hematoxylin_Eosin và phương pháp tính tốn để

đánh giá mức độ hoại tử trên mô gan .................................................................. 26
3.2.9.

Phương pháp nhuộm Sirius Red và tính tốn tỉ lệ dương tính với collagen

........................................................................................................................... 27

3.2.10. Phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch và phương pháp tính tốn ........ 27
3.2.11. Phương pháp xử lý số liệu thống kê....................................................... 29
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN......................................................... 31
4.1.

KẾT QUẢ ................................................................................................... 31

4.1.1.

Kết quả đánh giá UCB-MSC ................................................................. 31

4.1.2.

Kết quả đánh giá mơ hình BDL ............................................................. 32

4.1.3.

Kết quả đánh giá hiệu quả điều trị chuột BDL ....................................... 34

4.2.

BÀN LUẬN ................................................................................................ 45

4.2.1.

Đánh giá giải đông và ni cấy tế bào UCB-MSC................................. 45

4.2.2.

Đánh giá mơ hình BDL ......................................................................... 46

4.2.3.

Hiệu quả điều trị của UCB-MSC và thuốc Plenastem® tác động lên chuột

tổn thương gan ................................................................................................... 47
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................... 54
5.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 54


iv

5.2. ĐỀ NGHỊ ....................................................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 55
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 64
Phụ lục 1. Kết quả chỉ số men gan AST các nhóm thí nghiệm ........................... 64
Phụ lục 2. Kết quả chỉ số men gan ALT các nhóm thí nghiệm ........................... 64
Phụ lục 3. Kết quả chỉ số men gan Alb các nhóm thí nghiệm ............................. 65
Phụ lục 4. Kết quả vùng hoại tử (nhuộm H&E) các nhóm thí nghiệm ................ 66
Phụ lục 5. Kết quả các vùng dương tính collagen (nhuộm Sirius Red) các nhóm
thí nghiệm .......................................................................................................... 67
Phụ lục 6. Kết quả dương tính với protein α–SMA các nhóm thí nghiệm........... 67
Phụ lục 7. Kết quả số lượng ống mật mới tăng sinh (nhuộm IHC-Ck7) các nhóm
thí nghiệm .......................................................................................................... 68
Phụ lục 8. Kết quả hình ảnh mơ hình BDL-PLENA/MSC ................................. 69
Phụ lục 9. Bảng 1 Danh sách các dụng cụ được sử dụng trong thí nghiệm ........ 69
Phụ lục 10. Bảng 2 Danh sách các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm ...... 70
Phụ lục 11. Bảng 3. Danh sách các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ....... 71
Phụ lục 12. Kiểm tra đạo văn bằng Turnitin....................................................... 73
Phụ lục 13. Giấy chứng nhận y được ................................................................. 74

v

DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ BIỀU ĐỒ
DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Gan bình thường và gan xơ hóa ............................................................ 3
Hình 2.1. Vị trí của gan và túi mật trong cơ thể chuột .......................................... 8
Hình 2.2. Sự xơ hóa do sản xuất ECM quá mức của các tế bào hình sao hoạt hóa
........................................................................................................................... 10
Hình 2.3. Tế bào gốc trung mơ (MSC) ............................................................... 13
Hình 3.1. Vị trí thắt ống dẫn mật ........................................................................ 23
Hình 3.2. Bạch cầu trung tính (Neutrophile) ...................................................... 24
Hình 3.3. Phẫu thuật mở ổ bụng thu gan chuột ................................................... 25
Hình 4.1 Tế bào gốc trung mơ có dạng hình sợi, thn nhọn hai đầu ................. 31
Hình 4.2. Kết quả phân tích tế bào dịng chảy (Flow cytometry) tế bào gốc trung
mơ từ cuống rốn người (UCB-MSC) .................................................. 32
Hình 4.3. So sánh hình thái bên ngoải của chuột normal và chuột BDL sau 7 ngày
........................................................................................................... 33
Hình 4.4. So sánh hình thái bên ngoải của các nhóm chuột thí nghiệm sau 19 ngày
........................................................................................................... 34
Hình 4.5. Huyết thanh của các nhóm nghiên cứu ............................................... 39
Hình 4.6. Gan các nhóm sau BDL19 ngày ......................................................... 40
Hình 4.7. Kết quả nhuộm H&E giữa các nhóm .................................................. 41
Hình 4.8. Kết quả nhuộm Sirius Red giữa các nhóm .......................................... 42
Hình 4.9. Kết quả nhuộm α–SMA giữa các nhóm .............................................. 43
Hình 4.10. Kết quả nhuộm Ck7 giữa các nhóm .................................................. 45
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đổ 4.1. So sánh bạch cầu giữa nhóm Normal và nhóm BDL sau 7 ngày ...... 33
Biểu đồ 4.2. Sự thay đổi khối lượng cơ thể giữa các nhóm ................................. 34

Biểu đồ 4.3. Tỷ lệ sống chết giữa các nhóm thí nghiệm ..................................... 36
Biểu đồ 4.4. Sự thay đổi khối lượng gan, lách giữa các nhóm ............................ 37


vi

Biểu đồ 4.5. So sánh bạch cầu tổng và bạch cầu trung tính giữa các nhóm ......... 38
Biểu đồ 4.6. Chỉ số sinh hóa máu giữa các nhóm ............................................... 39
Biểu đồ 4.7. Tỷ lệ dương tính vùng hoại tử giữa các nhóm ................................ 41
Biểu đồ 4.8. Tỷ lệ dương tính collagen giữa các nhóm ....................................... 42
Biểu đồ 4.9. Tỷ lệ dương tính protein α–SMA giữa các nhóm ............................ 44
Biểu đồ 4.10. Tỷ lệ dương tính Ck7 giữa các nhóm ........................................... 45


vii

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 2.1. Các marker bề mặt đặc trưng của UCB-MSC ..................................................... 15


viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tiếng Anh

Tiếng Việt

ADSC

Adipose tissue stem cell

Tế bào gốc từ mô mỡ

ALT

Alanine transaminase

AST

Aspartate transaminase

Alb

Albumin

BA

Biliary atresia

Hẹp đường mật ở trẻ sơ sinh

BDL

Bile duct ligation

Phẫu thuật thắt ống dẫn mật

BDL-PBS

Nhóm chuột BDL được giả dược
PBS

BDL-PLENA

Nhóm chuột BDL được tiêm
thuốc Plenasterm®

BDL-MSC

Nhóm chuột BDL được tiêm
MSC

BDL-

Nhóm chuột BDL được tiêm kết

PLENA/MSC

hợp Plenasterm® và MSC

BM-MSC

Bone marrow mesenchymal

Tế bào gốc trung mô từ tủy

stem cell

xương

CL

Caudate lobe

Thùy Caudate

Ck7

Cytokeratin 7

CCl4

CV

Tĩnh mạch trung tâm

ECM

Extracellular matrix

Chất nền ngoại bào

H&E

Hematoxyline & Eosin

HLA

Human leucocyte antigen

Kháng nguyên bạch cầu người

HSC

Hepatic stellate cell

Tế bào hình sao gan

IHC

Immunohistochemistry

Hóa mơ miễn dịch

LL

Left lobe

Thùy trái


ix

MHC

Major histocompatibility

Phức hợp phù hợp mô

complex
ML

Median lobe

Thùy giữa

MSC

Mesenchymal stem cell

Tế bào gốc trung mô

NK

Nature kill cell

Tế bào giết tự nhiên

PBS

Phosphate buffered saline

Dung dịch đệm muối Phosphate

PFA

Paraformaldehyde

PLENA

Plenasterm

PV

Thuốc Plenasterm
Tĩnh mạch cửa

RL

Right lobe

TAA

Thioacetamide

TGF-β

Tranfoming grow factor beta

UCB-MSC

Umbilical cord blood

Thùy phải

Tế bào gốc trung mô từ cuống rốn

mesenchymal stem cell

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

α-SMA

α-smooth muscle actin alpha

Tế bào sợi cơ trơn alpha


1

GIỚI THIỆU


2

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1. CƠ SỞ HÌNH THÀNH LUẬN VĂN
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (Jin et al.), Việt Nam là nước có tỷ
lệ người dân mắc bệnh xơ gan khá cao, chiếm 5% dân số. Trên thế giới ung thư gan
là bệnh đứng thứ 7 trong số 10 bệnh ung thư phổ biến, riêng tại Việt Nam thì ung thư
gan đứng thứ 2 chỉ sau ung thư phổi. Theo thống kê của WHO, Việt Nam là nước
đứng thứ 4 trên thế giới về tỉ lệ mắc bệnh gan (23/100.000 người) và đứng thứ 5 trên
thế giới với tỉ lệ người bị ung thư gan (theo World Cancer Research Fund-2018).
Mặc dù gan có khả năng phục hồi đáng kể, có thể duy trì kích thước khơng đổi
dù bị tổn thương kéo dài và mạn tính dẫn đến sự xuất hiện của bệnh viêm gan và tấn

công vào hệ thống tự miễn dịch của tế bào gan kích hoạt q trình apoptosis tế bào
gan, làm suy yếu hàng rào nội mô, tăng các tế bào viêm và kích hoạt các tế bào hình
sao gan (HSC) sẽ gây nên sự mất cân bằng tổng hợp các chất nền ngoại bào
(extracellular matric-ECM) làm tăng các nguyên bào sợi, trong đó chủ yếu là collagen
gây xơ gan (Eom, Shim, & Baik, 2015).
1.1.1 Giới thiệu về bệnh hẹp đường mật ở trẻ sơ sinh
Tắc mật bẩm sinh hay thủng đường mật ở những trẻ sơ sinh nếu không được
phát hiện sớm, không điều trị sẽ dẫn đến suy gan, xơ gan (Bates et al., 1998). Thống
kê cho thấy tỉ lệ mắc bệnh ở các nước Châu Á cao hơn so với châu Âu và châu Mỹ,
chẳng hạn như tỉ lệ mắc bệnh ở Mỹ là 1:19.000, ở Anh và các nước châu Âu 1:16.000,
trong khi đó tỉ lệ mắc bệnh ở các nước châu Á như Nhật Bản và Trung Quốc khoảng
1:9.600, đặc biệt khá cao ở Việt Nam với tỉ lệ 1:2400 (M. B. Liu et al., 2017).
Khi ống dẫn mật bị tắc nghẽn thì dịch mật bị ứ đọng lại có thể gây ra các tình
trạng bệnh lý nghiêm trọng như xơ gan, nhiễm trùng đường mật, nhiễm trùng máu...
Tắc mật trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng gan bị xơ hóa, khi gan bị xơ hóa thì
tổn thương gan lúc này sẽ khơng phục hồi (Nam, Ko, & Sohn, 2019).


3

Hình 1.1. Gan bình thường và gan bị xơ hóa (Nano Homeopathy)

1.1.2 Tình hình dịch tễ bệnh hẹp đường mật ở trẻ sơ sinh
Nguyên nhân gây bệnh tắc nghẽn ống mật (Biliary atresia-BA) vẫn chưa được
biết hết. Khi ống dẫn mật bị tắc nghẽn thì dịch mật bị ứ đọng lại có thể gây ra các tình
trạng bệnh lý nghiêm trọng như xơ gan, nhiễm trùng đường mật, nhiễm trùng máu...
Tắc mật trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng gan bị xơ hóa, khi gan bị xơ hóa thì
tổn thương gan lúc này sẽ thương khơng phục hồi (Nam et al., 2019).
Theo kết quả nghiên cứu “Biliary atresia in Viet Nam: Management and the
burden of diesea” của Liu và cộng sự năm 2017 tại Việt Nam phát hiện hơn một nửa

trẻ bị BA không được điều trị phẫu thuật so với 5.7% ở Pháp hay so với 2.2% ở Hoa
Kỳ hoặc là điều trị muộn (quá 4 tháng) khiến kết quả phẫu thuật Kasai không được
tốt do nhiều gia đình khơng chấp nhận điều trị do chi phí phẫu thuật khá cao và không
đủ điều kiện, khả năng tiến hành ghép gan sau đó (M. B. Liu et al., 2017).
Đối với bệnh viêm gan, nhất là khi gan đã bị xơ thì vẫn chưa có phương pháp
phục hồi, tái tạo lại tế bào mới ở gan.
1.1.3 Các phương pháp điều trị hiện nay
Phản ứng viêm của tế bào gan đóng vai trị quyết định trong sinh lý bệnh xơ
gan. Tùy theo các nguồn gốc gây ra bệnh mà lựa chọn điều trị bằng các phương pháp
có sẵn để điều trị bệnh xơ gan, cho phép ngăn ngừa tiến triển khi được phát hiện kịp
thời (Altamirano-Barrera, Barranco-Fragoso, & Méndez-Sánchez, 2017). Phương
pháp điều trị hiện nay là tiến hành phẫu thuật Kasai được phát triển bởi bác sĩ người
Nhật Morio Kasai. Phương pháp này giúp giảm bớt sự tắc mật bằng cách phẫu thuật
nối hỗng tràng với nhánh nhỏ mật trong gan (portoentersstomy). Các trường hợp bệnh


4

nhân khơng được tiến hành phẫu thuật thì sẽ gây tử vong trong vòng 2 năm, với thời
gian sống trung bình là 8 tháng (Bates et al., 1998). Tỷ lệ bệnh nhân sống sót sau 5
năm khơng cấy ghép gan khoảng 32%-63% (Shinkai et al., 2009). Và tỷ lệ này khơng
cải thiện trong vịng 45 năm qua, ngay cả ở các nước phát triển. WHO, Đơng Nam Á,
trong đó có Việt Nam, có tỷ lệ gánh nặng bệnh tật lớn nhất so với các khu vực khác
trên thế giới trong đó có bệnh BA (M. B. Liu et al., 2017). Một số phương pháp được
áp dụng sau phẫu thuật Kasai như sử dụng kháng sinh, thuốc vận mật (choleretics),
steroid nhằm giúp cải thiện tình trạng bệnh cho dù có chứa nhiều tác dụng phụ. Bệnh
nhi bị hẹp đường mật bẩm sinh cần kiểm sốt tình trạng suy gan mật để chuẩn bị cho
việc ghép gan sau đó. Tuy nhiên, việc cấy ghép bị nhiều hạn chế do thiếu hụt nguồn
tạng hiến, có nhiều biến chứng trong phẫu thuật, gây thải ghép miễn dịch và chi phí
y tế cao. Chính vì vậy các nước có thu nhập thấp hay trung bình thì điều trị bệnh này

là một gánh nặng vì chi phí phẫu thuật cao và chương trình ghép gan cịn hiếm. Đối
với bệnh viêm gan, nhất là khi gan đã bị xơ thì vẫn chưa có phương pháp phục hồi,
tái tạo lại tế bào mới ở gan.
Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cell- MSC)( là tế bào gốc trưởng
thành đa chức năng có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như từ tủy xương
(bone marrow), dây rốn (umbilical cord), mô mỡ (adipose tissue), nội mạc tử cung
(endometrium), nước ối (amniotic fluid), mơ răng (dental tissue)… có khả năng tăng
sinh và biệt hóa thành nhiều loại tế bào, lợi thế của MSC là có thể thu nhận dễ dàng,
có các đặc tính điều hịa miễn dịch, và sản sinh các chất tiết như các yếu tố tăng
trưởng, cytokine giúp cho MSC trở thành công cụ hiệu quả để điều trị các bệnh viêm
mạn tính… Ngồi ra, MSC cịn có khả năng đi đến mơ tổn thương, ngăn chặn các
phản ứng viêm, giảm apotosis tế bào gan, tăng tái tạo tế bào, hồi phục xơ gan và tăng
cường chức năng gan… Tế bào gốc được phân lập từ dây rốn (UCB-MSC) có tỷ lệ
tăng sinh tế bào cao và sự biểu hiện các dấu hiệu lão hóa thấp hơn đáng kể so với các
nguồn thu nhận từ tủy xương (BM-MSC) hay từ mỡ (ADSC). Ngồi ra UCB-MSC
cịn có khả năng chống viêm cao hơn so với nguồn thu nhận từ tuỷ xương hay mỡ,
nên UCB-MSC trở thành một mô hình hữu ích cho các ứng dụng lâm sàng của liệu


5

pháp tế bào như liệu pháp điều trị viêm gan… Ngồi ra, MSC có khả năng điều hịa
miễn dịch, tương tác với hàng rào miễn dịch do có thể hoạt động như những tế bào
trình diện kháng nguyên nên giúp giảm thiểu thải ghép với vật chủ nên đây sẽ là con
đường phát triển đầy tiềm năng cho việc điều trị bệnh viêm gan nói chung và tổn
thương gan do tắc mật nói riêng. Việc kết hợp thuốc Plenastem® có dược chất chính
là Dexamethasone giúp tăng khả năng biệt hóa UCB-MSC và giúp UCB-MSC về
vùng tổn thương gan nhiều hơn mà không bị giữ tại lách (M. Zhao et al., 2018).
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Mục tiêu chung: Nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả điều trị của tế bào

gốc trung mơ đơn lẻ và kết hợp với thuốc Plenastem® đối với tổn thương gan do tắc
ống dẫn mật trên mơ hình chuột.
Mục tiêu cụ thể:


Ni cấy tế bào gốc trung mô được phân lập từ cuống rốn người.



Đánh giá hiệu quả cấy ghép tế bào gốc trung mơ có hoặc khơng có kết hợp

thuốc Plenastem® trên chuột tổn thương gan do thắt ống dẫn mật.
1.3. GIẢ THUYẾT NGHIÊN CỨU
Việc ghép tế bào gốc trung mô từ cuống rốn người đơn lẻ hay kết hợp với
thuốc Plenastem® giúp cải thiện tình trạng tổn thương gan do tắc ống dẫn mật.
1.4. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tượng và vật liệu
-

Chuột trắng thuần chủng dòng Swiss khỏe mạnh, 6–8 tuần tuổi, trọng lượng
25–30g (do Phịng thí nghiệm chăm sóc và sử dụng động vật, Viện tế bào gốc,
trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia TPHCM cung cấp)

-

Tế bào gốc trung mô được phân lập từ cuống rốn người được cung cấp bởi
Viện tế bào gốc, Trường ĐH Khoa học tự Nhiên, ĐH Quốc gia TPHCM.

-

Thuốc Plenastem® của Cơng ty AVM, Hoa Kỳ.