Giống cây rừng-Chương 7 pot

Ch−¬ng VII Nh©n gièng b»ng
Ch−¬ng

VII
.
Nh©n

gièng

b»ng

ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« vμ tÕ bμo
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
1. Khái niệm.
Nh iố bằ h há i ấ ếb h
Nh
ân g

iố
ng
bằ
ng p
h
ơng p
há
p nuô
i
c
ấ
y mô v

t
ế

b
o t
h
ực
vật l phơng pháp sản xuất hng loạt cây con từ các bộ phận
của cây mẹ bằng cách nuôi cấy chúng trong ống nghiệm ở điều
kiện vô trùng, có môi trờng thích hợp v đợc kiểm soát.
- Bộ phận nuôi cấy có thể l cơ quan, mô hay tế bo. Song nói
chung chúng có kích thớc rất nhỏ hơn n
ữ
alạiđợc nuôi cấy
chung

chúng

có

kích

thớc

rất

nhỏ
,
hơn

n
ữ
a

lại

đợc

nuôi

cấy

trong không gian cũng rất nhỏ (ống nghiệm, bình thí nghiệm)
nên phơng pháp nhân giống ny còn đợc gọi l vi nhân giống
-Phơng pháp nhân giống ny đợc thực hiện ở điều kiện vô
trùng, với môi trờng sống nhân tạo v đợc kiểm soát nên còn
đợc gọi l nhân giống

in vitro
(nhân tạo)
đợc

gọi

l

nhân

giống

in

vitro
(nhân

tạo)
.
Ch−¬ng VII. Nh©n gièng b»ng ph−¬ng
ph¸p nu«i cÊy m« vμ tÕ bμo
ph¸p

nu«i

cÊy

m«

vμ

tÕ

bμo
2. C¬ së sinh häc cña ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« - tÕ bμo.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
+ Tính ton năng: theo sơ đồ trên thì bất cứ một tế bo no của cơ thể (ở mô
phân sinh hay mô phân hoá) đều có nhân giống hệt nhân tế bo hợp tử ban
phân

sinh

hay

mô

phân

hoá)

đều

có

nhân

giống

hệt

nhân

tế

bo

hợp

tử

ban

đầu, tức l đều mạng bộ gen giống hệt bộ gen của hợp tử ban đầu (bộ gen
chứa trong bộ NST). Bởi vậy khi đợc tách ra khỏi cơ thể v gặp điều kiện
sống thích hợp thì bất cứ tế bo no đều có thể phát triển thnh một cơ thể
hon chỉnh.

+ Hiện tợng phản phân hoá v tái phân hoá
: Theo sơ đồ trên, mỗi tế bo ở giai
đoạn 8
tế bo (tb phôi sinh) khi đợc tách rời ra thì đều có thể phát triển
thnh 1 cơ thể hon chỉnh gần đầy đủ các cơ quan. Vì bất cứ tế bo no cũng
đều có nhân v tế bo chất nh hợp tử (hay còn gọi l TB trắng/TB cha phân
hoá). Thế còn khi tách tế bo ra khỏi mô chuyên hoá để nuôi cấy thì từ TB
ế ẫ
n
y
sẽ hình thnh nên các t
ế
bo mới (
q
ua
p
hân hoá) v
ẫ
n theo hớn
g
đã đợc
phân hoá. Tức l trong trờng hợp ny chỉ có hiện tợng sinh trởng (tăng
sinh khôi của cơ quan cũ) chứ không có hiện tợng phát triển (hình thnh cơ
q an mới) > từ tế bo n ôi cấ sẽ không h
ì
nh thnh 1 cơ thể hon chỉnh
q
u
an

mới)
=
>

từ

tế

bo

n
u
ôi

cấy

sẽ

không

h
ì
nh

thnh

1

cơ

thể

hon

chỉnh
.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
3. ý nghĩa của nuôi cây mô - tế bo.
ể
-L
p
hơn
g

p
há

p
nhân
g
iốn
g
sinh dỡn
g
nên nó man
g
đầ
y
đủ các u đi
ể
m của
nhân giống sinh dỡng.
- Nhân giống bằng phơng pháp nuôi cấy mô - tế bo có hệ số nhân cao.
- Nhân giống bằng phơng pháp nuôi cấy mô - tế bo đợc tiến hnh một cách
chủ động trong mọi điều kiện thời tiết v mọi thời điểm trong năm.
-
Ngoi ra khác với nhân giống bằng hom th
ì
cây trồng đợc tạo ra bằng
-
Ngoi

ra

khác

với

nhân

giống

bằng

hom

th
ì
cây

trồng

đợc

tạo

ra

bằng

phơng pháp ny có độ trẻ cao hơn rất nhiều (gần bằng cây hạt), có bộ rễ tốt
hơn nhiều so với cây hom
ồ ấ
ế
ểố
-Câ
y

tr
ồ
n
g
đợc tạo ra từ
p
hơn
g

p
há
p
nuôi c
ấy
mô - t
ế
bo có hình th
ể

g
i
ố
n
g

cây hạt => khắc phục đợc hiện tợng "bảo lu cục bộ " thờng bắt gặp ở cây
trồng đợc tạo ra bằng giâm hom.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
4. Các hình thức nhân giống in vitro.
41 N i ấ h i h
4
.
1
.
N
uô
i
c
ấ
y mô p
h
ân s
i
n
h
:

- Nuôi cấy đỉnh sinh trởng:
+ Nuôi cấy đỉnh thân đỉnh cnh: thờng l cho cây l kim
+

Nuôi

cấy

đỉnh

thân
,
đỉnh

cnh:

thờng

l

cho

cây

l

kim
.
+ Nuôi cấy chồi nách: thờng dùng cho những cây lá rộng (vd:
Keo, Bạch đn rất phổ biến).

+ Nuôi cấychồi bất định: Chồi bất định l chồi đợc hình thnh
từ bất cứ bộ phận no của cây khi đợc kích thích (cơ giới hay
hoá học)
hoá

học)
.
- Từ mô phân sinh phát triển trực tiếp thnh cây.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
4.2. Nuôi cấy mô chuyên hoá: nuôi cấy bất cứ bộ phận no của
(ảhh láễđ háhh )
cây
(
m
ả
n

h
t
h
ân,
lá
, r
ễ
,
đ
oạn c

n
h
, c
á
n
h

h
oa,
)
.
Ch−¬ng VII. Nh©n gièng b»ng ph−¬ng
ph¸p nu«i cÊy m« vμ tÕ bμo
ph¸p

nu«i

cÊy

m«

vμ

tÕ

bμo
5. qui tr×nh nh©n gièng b»ng ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy m« - tÕ bμo.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
5.1. Giai đoạn chuẩn bị.
Đ
ố( i)ề ờ ờiố
-
Đ
a cây t
ố

t
(
cây u v
i
ệt
)
v
ề
v
ờ
n su tập, v
ờ
n g
iố
ng
+ Để giảm bớt nguồn cạnh (lai tạp xung quanh)
+
Đ
ể có điều kiện ch
ă
m sóc cho cây sinh trởng v phát triển
+

Đ
ể

có

điều

kiện

ch
ă
m

sóc

cho

cây

sinh

trởng

v

phát

triển

tốt
+ Để chủ động lấy mẫu nhân giống
Việc đa các cây tốt về vờn su tập có thể bằng phơng pháp
ghép hoặc giâm hom.
- Trẻ hoá cây giống gốc: Để tạo mẫu cấy còn non (trẻ hoá: dựa
trên quá trình tuổi quyết định của các tế bo)
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo

pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
5.2. Giai đoạn cấy khởi động. (tạo mẫu sạch trong ống nghiệm)
- Mục đích
: tạo đợc mẫu cây sống trong ống nghiệm sạch hoá học cũng nh sinh học. Tạo đợc
nguồn mẫu sạch (sạch về hoá học v sinh học) sống đợc trong điều kiện in vitro.
+ Sạch hoá học: không lm ảnh hởng đến môi trờng hoá học phù hợp với loi cây.
+ Sạch sinh học: (sạch nấm v vius) vì mẫu cấy chỉ l 1 bộ phận rất nhỏ của cây nên sau khi
tách khỏi cây mẹ cấy vob
ì
nh th
ì
nó cần một thời gian để hồi phục sau đó mới sinh trởng v
tách

khỏi

cây

mẹ

cấy

vo

b
ì
nh

th
ì
nó

cần

một

thời

gian

để

hồi

phục

sau

đó

mới

sinh

trởng

v

phát triển. Trong khi nấm v vi khuẩn l những sinh vật đơn bo hay đa bo, chúng vo theo
mẫu cấy l vo cả cơ thể nên chúng sinh trởng v phát triển ngay => sử dụng hết môi trờng
nuôi cấy => khi mẫu cấy hồi phục thì môi trờng đã hỏng.
h há
- P
h
ơng p
há
p:
+ Lm sạch hoá học bằng rửa: đầu tiên tiến hnh rửa bằng nớc máy, tiếp theo l rửa bằng x
phòng v cuối cùng l rửa bằng nớc cất.
+ Lm s
ạ
ch sinh h
ọ
c bằn
g
khử trùn
g
: khử trùn

g
bằn
g
dun
g
d
ị
ch canxi h
yp
oclorit 1% ho
ặ
c bằn
g

ạọgg gggị yp ặg
HgCl
2
0,1% trong 5 phút, tuỳ mẫu gi hay non.
+ Sau khi rửa v khử trùng thì tiến hnh cấy mẫu sạch vo bình chứa trong môi trờng hoá học
cũng đã đợc khử trùng (bằng nồi hấp). Việc cấy mẫu đợc tiến hnh trong tủ cấy mô trùng.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
5 3 Tái sinh chồi
5
.
3
.
Tái

sinh

chồi
.
- Mục đích
: kích thích mẫu cấy hình thnh chồi
để lm vật liệu nhân nhanh
để

lm

vật

liệu

nhân

nhanh

.
- Phơng pháp: Cấy chuyển mẫu cấy sang bình
óhứ i ờ h á h ới ới h h
c
ó
c
hứ
a mô
i
tr
ờ
ng
h
o
á

h
ọc m
ới
v
ới
t
h
n
h

phần chất điều ho sinh trởng kích thích tạo
hồi
c
hồi

.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
5.4. Nhân nhanh.
5.4.

Nhân

nhanh.
- Mục đích: tăng số lợng chồi trong giai đoạn nuôi
cấ
y

(
từ 1 thnh v
ạ
n chồi

,
tri
ệ
u chồi
)
. Đâ
y
l
g
iai
y( ạ,ệ)
y g
đoạn quan trọng nhất trong nhân giống in vitro.
- Phơn
g

p
há
p
: cấ
y
chu
y
ển chồi san
g
các b
ì
nh có
gp p
yy g

chứa môi trờng hoá học với thnh phần chất điều
ho sinh trởng kích thích tạo chồi nhiều lần (từ
ồ ềồ
ề
ch
ồ
i thnh nhi
ề
u ch
ồ
i/1 b
ì
nh); 1 b
ì
nh thnh nhi
ề
u
bình,
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
5.5. Tạo rễ cho cây.
(tạo cây hon chỉnh)
5.5.

Tạo

rễ

cho

cây.

(tạo

cây

hon

chỉnh)
- Mục đích: từ mỗi chồi tạo thnh 1 cây con hon
chỉnh
g
ồm đầ
y
đủ thân
,
rễ v lá.

gy ,
- Phơng pháp: cấy chuyển các chồi sau giai đoạn
nhân nhanh san
g
các b
ì
nh có chứa môi trờn
g
hoá
g
g
học có thnh phần chất điều ho sinh trởng kích
thích tạo rễ. Tất cả các lần cấy chuyển để tái sinh
ồ ễề ả
ch
ồ
i, nhân nhanh v tạo r
ễ
đ
ề
u
p
h
ả
i đợc thực hiện
trong buồng cấy vô trùng.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
5.6. Huấn luyện cây mô.
- Mục đích: lm cho câ
y
mô
q
uên dần với điều kiện tự
nhiên (nhiệt độ, ánh sáng v tình trạng nhiễm bệnh).
- Phơng pháp:
+ Đa dần các bình cấy cây hon chỉnh từ trong
phòng nuôi (có điều kiện vật lý thích hợp) ra khu
huấn luyện (có điều kiện vật lý hon ton tự nhiên).
ể
+ Mở dần nắ
p
b
ì
nh đ
ể
cho câ

y
thích n
g
hi dẫn với
điều kiện tự nhiên.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
5.7. Cấy cây vobầuđấtv ch
ă
msóccâyởvờn ơm.
5.7.

Cấy

cây

vo

bầu

đất

v

ch
ă
m

sóc

cây

ở

vờn

ơm.
- Mục đích: tạo cây con để đa vo sản xuất.
-
Phơng pháp
:
-
Phơng

pháp
:

+ Lấy cây ra khỏi bình nuôi cấy, rửa sạch môi trờng
hoá học bám vo rễ cây.
hoá

học

bám

vo

rễ

cây.
+ Cấy cây vo bầu đất giống nh cấy cây con từ hạt
ho
ặ
c
g
iâm hom.
ặg
+ Chăm sóc cây: giống chăm sóc cây hom.
5. Qui trình nhân giống bằng phơng pháp
nuôi cấy mô
-
tế bo.
nuôi

cấy

mô

tế

bo.
Cây mẹ Lấy mẫu GĐ chuẩn bị (Tạo chồi)
GĐ Cấy khởi độngGĐ Tái sinh chồi
G
Đ
h h h hồi
G
Đ
tạo rễ cho chồi
G
Đ
n
h
ân n
h
an
h
c
hồi
G
Đ
tạo

rễ

cho

chồi
Huấn luyện trong nh kính
ầ
Huấn

luyện

trong

nh

kính
Cây m
ầ
m
Cây con ở vờn ơm
Cây giống đem trồng
ừ
Cây

con

ở

vờn

ơm
r
ừ
ng

Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
6. Những vấn đề nảy sinh trong nhân giống in vitro.
61 S hiễ ẫ
6
.
1
.
S
ự n
hiễ
m m
ẫ
u.
- Trong quá trình nhân giống mẫu có thể bị nhiễm nấm hoặc virus
=
> do đó phá huỷ môi trờng (

ă
nhếtmôitrờng dinh dỡng)
=
>
>

do

đó

phá

huỷ

môi

trờng

(
ă
n

hết

môi

trờng

dinh

dỡng)

>

khi mẫu cấy phục hồi thì môi trờng dinh dỡng đã bị phá =>
mẫu cấy không sinh trởng v phát triển đợc.
ắ
-Kh
ắ
c phục:
+ Thay đổi chế độ khử trùng (dung dịch khử trùng v thời gian
khử trùng)
khử

trùng)
+ Sử dụng mô phân sinh để lm mẫu cấy (vì mô phân sinh l
phần cơ thể mới hình thnh nên cha bị nhiễm nẫm hay virus).
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
6.2. Sản sinh chất độc từ mẫu cấ
y
.
y
- Mẫu cấy có thể bị hoá nâu, hoá đen rồi chết. Do
trong mẫu cấy chứa nhiều tanin (chất chát)
trong

mẫu

cấy

chứa

nhiều

tanin

(chất

chát)
- Khắc phục: dùng mẫu cấy còn non để cấy, bổ
sung vomôitrờng hoá học than hoạt tính
sung

vo

môi

trờng

hoá

học

than

hoạt

tính

(hút các chất độc ra khỏi mẫu cấy).
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
6.3. Hiện tợng thuỷ tinh hóa.

- Trong trờng hợp cây mô trở nên mọng nớc, có thân v lá
trong suốt => không quang hợp đợc => cây chết.
Khắc phục:
-
Khắc

phục:

+ Tăng nồng độ đờng trong môi trờng hoá học (do có hiện
tợng thẩm thấu nồn độ đờng cao sẽ hút nớc ra khỏi tế
tợng

thẩm

thấu

nồn

độ

đờng

cao

sẽ

hút

nớc

ra

khỏi

tế

bo).
+
T
ăn
g
cờn
g
độ ánh sán
g
,
g
iảm nhiệt độ tron
g

p
hòn
g
nuôi.
g ggg gpg
+ Giảm nồng độ chất chứa nitơ trong môi trờng hoá học.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
6.4. Tính bất định về di truyền.
- Nếu tiến hnh cấ
y
chu
y
ển mẫu (chỉ tron
g
trờn
g
hợ
p

mô sẹo) qua nhiều thế hệ thì cng ở những thế hệ sau
ởẫ ấ ất hiệ đột biế ới tầ ố
ở
m
ẫ
u c
ấy

c

n
g
xu
ất

hiệ
n
đột

biế
n soma v
ới

tầ
n s
ố

cao. Nguyên nhân l do tế bo mô sẹo có trạng thái
giống tế bo phôi sinh nên rất trẻ
=> khi đợc chuyền
giống

tế

bo

phôi

sinh

nên

rất

trẻ
=>

khi

đợc

chuyền

qua nhiều thế hệ thì bộ gen của chúng dễ dng thay
đổi.
- Khắc phục: không cấy chuyển mẫu qua nhiều thể hệ
(không nhân mô sẹo qua nhiều thể hệ).
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
7. Môi trờng nuôi cấy.
71 M i ờó
i ờhứ ố hi
7
.
1
.
M
ô
i
tr
ờ
ng h
ó
a học. (mô
i
tr
ờ
n
g
c
hứ
a tron
g

ố

n
g
n
ghi
ệm,
bình tam giác)
711 Chứcn
ă
ng của loại môi trờng ny
7
.
1
.
1
.
Chức

n
ă
ng

của

loại

môi

trờng

ny

.
-L môi trờng dinh dỡng cho mẫu cấy v cây mô (thay cho
đất n
g
oi t
ự
nhiên)
g ự
-L giá thể để cấy mẫu
- Để điều tiết quá trình sinh trởng v phát triển của mẫu
theo ý muốn của con ngời.
7.1.2. Thnh phần của môi trờng.
7.1.2.1. Chất dinh dỡn
g
: bao
g
ồm 05
y
ếu tố
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
* Đờng:
Chứ
-
Chứ
c năng:
+ Cung cấp cacbon để cho mẫu cấy tổng hợp các chất hữu cơ
tạo nên chất nguyên sinh của tế bo
=
>tếbosinhtrởng
=
>tế
tạo

nên

chất

nguyên

sinh

của

tế

bo

>

tế

bo

sinh

trởng

>

tế

bo sinh sản (phân hoá) => mô hay mẫu cấy sinh trởng. (trong
tự nhiên cây tự tổng hợp đợc đờng bằng quá trình quang hợp)
ồ
ấểả
+ Ngu
ồ
n nguyên liệu cho quá tr
ì
nh hô h
ấ
p đ
ể
s
ả
n sinh năng

lợng cho mẫu cấy thực hiện các phản ứng trao đổi.
-
Chủng loại v liều lợng: có thể dùng đờng sacarose hay
Chủng

loại

v

liều

lợng:

có

thể

dùng

đờng

sacarose

hay

glucose với nồng độ 20 30g/lít dung dịch môi trờng
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
* Các nguyên tố đa lợng.
Chứ
Th i ấ á hấ h
ữ
ếb
-
Chứ
c năng:
Th
am g
i
a c
ấ
u tạo nên c
á
c c
hấ
t
h

ữ
u cơ trong t
ế

b
o
=> tạo chất nguyên sinh => sinh trởng v phát triển.
-
Chủng loại v liều lợng: đó l các chất h
ữ
ucơnh N, P, K, Ca,
Chủng

loại

v

liều

lợng:

đó

l

các

chất

h

ữ
u

cơ

nh

N,

P,

K,

Ca,

Mg, S với liều lợng 30mg/lít dung dịch môi trờng.
* Các nguyên tố vi lợng.
- Chức năng: tham gia vo cấu tạo của enzym phức (đóng vai trò
nhóm ngoại của enzym) => xúc tác các phản ứng trao đổi chất
trong tế bo
=
>tếbosinhtrởng v phát triển
trong

tế

bo

>

tế

bo

sinh

trởng

v

phát

triển
.
- Chủng loại v liều lợng: đó l các nguyên tố Fe, Cu, Mn, Zn,
Bo, I, Co với liều lợng < 30mg/lít.
Chơng VII. Nhân giống bằng phơng
pháp nuôi cấy mô v tế bo
pháp

nuôi

cấy

mô

v

tế

bo
* Các vitamin.
Chứ
ă
l tiề hất để t ê á l li
-
Chứ
c n
ă
ng:
l

tiề
n c
hất

để

t
ạo n
ê
n c
á
c coenzym, m

coemzyn
l

l
oạ

i

nhóm ngoại điển hình của enzym phức => vitamin tham gia vo hoạt
động xúc tác các phản ứng trao đổi chất của emzym phức.
-Các loại v hm lợng sử dụng trong nhân giống in vitro:
+ Nhóm B (B1, B2, B6): đợc sử dụng với hm lợng 0,01
0
,
1m
g/
lít môi trờn
g
.
,g/ g
+ Myo-inositol (chất ny bền với nhiệt độ cao): đợc sử dụng với
hm lợng 50 500mg/lít môi trờng.
Vit i C đ ửd ớih l 1
10 /lít ôi t ờ
+
Vit
am
i
n
C
:
đ
ợc s
ử

d

ụng v
ới

h
m
l
ợng
1
-
10
mg
/lít
m
ôi

t
r
ờ
ng.
Lu ý
: Các loại vitamin cần phải đợc bảo quản lạnh trớc khi sử dụng.
Ch−¬ng VII. Nh©n gièng b»ng ph−¬ng
ph¸p nu«i cÊy m« vμ tÕ bμo
ph¸p

nu«i

cÊy

m«

vμ

tÕ

bμo
* C¸c chÊt tù nhiªn.
§ã lμ c¸c hîp chÊt h÷u c¬ tù nhiªn, dÞch chiÕt tõ
nÉm men
,
n−íc Ð
p
hoa
q
u¶ cã vai trß cun
g
cÊ
p

, pq
gp
c¸c chÊt h÷u c¬ cho m«i tr−êng nu«icÊy