Tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillus subtilis có khả năng đối kháng nấm fusarium oxysporum

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
CĨ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM

LÊ CHÍ QUỲNH ANH

Đà Nẵng, năm 2023


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS
CĨ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM FUSARIUM OXYSPORUM

Ngành: Cơng nghệ sinh học
Khóa: 2019-2023
Sinh viên: Lê Chí Quỳnh Anh
Người hướng dẫn: TS. Phạm Thị Mỹ

Đà Nẵng, năm 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này hồn tồn trung thực. Đây
là kết quả nghiên cứu của tôi và giảng viên hướng dẫn chưa từng được cơng bố trong bất
kì cơng trình nào khác trước đây. Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kỳ quy
định nào về đạo đức khoa học.
Tên sinh viên
Lê Chí Quỳnh Anh

1


LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp tại Khoa Sinh - Môi trường, trường
Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng, tôi xin trân trọng trước sự quan tâm và tạo điều
kiện giúp đỡ của các quý thầy cô Bộ môn Công nghệ sinh học đã hỗ trợ, động viên tơi
trong suốt q trình thực hiện đề tài khóa luận của mình.
Để hồn thành được khố luận tốt nghiệp này, ngồi sự nỗ lực của bản thân, tơi xin
bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc trước sự tâm huyết tận tình hướng dẫn, động viên khích lệ,
dành nhiều thời gian trao đổi và định hướng cho tôi là cô TS. Phạm Thị Mỹ và cô ThS.
Lê Thị Mai trong suốt q trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cảm ơn các bạn 19CNSH và anh Bùi Đức Thắng đã luôn đồng hành cùng tôi, luôn
hỗ trợ và nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận
Cuối cùng, tơi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã ln động viên, khích lệ về
vật chất lẫn tinh thần để tôi đạt được kết quả tốt nhất.
Xin chân thành cảm ơn!

2


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
VSV

Vi sinh vật

LB

Luria Bertani

PTN

Phịng thí nghiệm

OD

Giá trị mật độ quang

3


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng

Tên bảng

Trang

3.1

Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập được

19

3.2

Kết quả thử nghiệm sinh hóa của 5 chủng Bacillius spp.

21

3.3
3.4

Khả năng đối kháng của Bacillus spp. đối với nấm Fusarium
oxysporum
Đường kính vịng phân giải enzyme của Bacillus subtilis BS5

4

23
27


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình

Tên hình

Trang

1.1

Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi (Wiki)

4

1.2

Fusarium Oxysporum ( Trần Ngọc Hùng, 2020).

5

2.1

Mối tương quan giữa OD và mật độ tế bào VSV

17

3.1

Hình thái khuẩn lạc và tế bào các các chủng Bacillus spp. đã phân lập

20

được
3.2

Kết quả thử nghiệm catalase

21

3.3

Hoạt tính sinh tổng hợp oxidase của vi khuẩn

21

3.4

Khả năng di động của vi khuẩn

22

3.5

Phản ứng dương tính với thử nghiệm Citrate

22

3.6

Phản ứng dương tính với thử nghiệm Nitrate

22

3.7

Các chủng Bacillus spp. đối kháng nấm Fusarium oxysporum

24

3.8

Kết quả điện di chủng BS5

25

3.9

Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn BS5

26

3.10

Đường cong sinh trưởng của B.subtilis B5

27

3.11

Vòng phân giải enzyem của Bacillus subtilis BS5

28

5

TÓM TẮT

Bệnh thối quả do nấm Fusarium oxysporum là một trong những bệnh gây thiệt hại
đến năng suất dẫn đến thiệt hại kinh tế và gặp nhiều khó khăn cho sản xuất và bảo quản
xoài. Biện pháp sử dụng vi sinh vật đối kháng để phòng trừ bệnh hại đang là xu hướng
hiện nay do tính an tồn và hiệu quả của nó. Trong số nhiều vi sinh vật đối kháng, các
chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus subtilis đã được nghiên cứu rất nhiều về khả năng
đối kháng với nấm gây bệnh. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu tuyển
chọn được chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có hoạt tính kháng nấm Fusarium oxysporum
gây bệnh tại Việt Nam. Phân lập và tuyển chọn được 5 chủng vi khuẩn thuộc chi Bacillus
spp. có khả năng đối kháng với nấm Fusarium oxysporum, hiệu lực ức chế dao động từ
29,72% đến 57%. Trong đó có chủng BS5 có khả năng kháng mạnh nhất với nấm
Fusarium oxysporum, đạt 57 %. Kết quả định danh BS5 bằng việc giải trình tự gen 16S
rRNA cho thấy chủng này là Bacillus subtilis và chủng BS5 có khả năng sinh enzyme
protease và chitinase lần lượt là 36,67mm và 26,66mm.
Từ khóa: Bacillus subtilis, Fusarium oxysporum, thối quả, đối kháng, định danh

6


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ................................................................................................................1
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................................2
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................................3
DANH MỤC BẢNG BIỂU .................................................................................................4
DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................................5
TĨM TẮT ............................................................................................................................6
MỤC LỤC ...........................................................................................................................7
MỞ ĐẦU .............................................................................................................................9

1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................................9
2. Mục tiêu đề tài ...............................................................................................................10
3. Ý nghĩa của đề tài ..........................................................................................................10
3.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................................10
3.2. Ý nghĩa thực tiễn .........................................................................................................10
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................11
1.1 Khái quát chung về Bacillus Subtilis ...........................................................................11
1.1.1 Đặc điểm phân loại ...................................................................................................11
1.1.2 Đặc điểm phân bố ....................................................................................................11
1.1.3 Đặc điểm hình thái ....................................................................................................12
1.2. Khái quát chung về Fusarium oxysporum ..................................................................13
1.2.1. Đặc điểm phân loại ..................................................................................................13
1.2.2. Đặc điểm hình thái ...................................................................................................13
1.2.3. Đặc điểm sinh học nấm Fusarium oxysporum ........................................................14
1.3. Tình hình nghiên cứu đối kháng nấm Fusarium spp. .................................................16
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..........................................................................16
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................................18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........20
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ..............................................................................20
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................................. 20
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................................20
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................................20
2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 20
2.3.1. Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu ..................................................................20
7


2.3.2. Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. bản địa ...........................21
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của Bacillus spp. ............................... 21
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn các chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng mạnh với

Fusarium oxysporum. ........................................................................................................23
2.3.5. Định danh chủng vi khuẩn Bacillus spp. được tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học
phân tử................................................................................................................................ 23
2.3.6. Xây dựng đường cong sinh trưởng ..........................................................................24
2.3.7. Phương pháp xác định khả năng sinh enzyme protease và chitinase của Bacillus
subtilis BS5 ........................................................................................................................25
2.3.8. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................................26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................27
3.1. Phân lập vi khuẩn từ đất vùng rễ cây ăn quả .............................................................. 27
3.2. Xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. phân lập
được....................................................................................................................................28
3.3. Tuyển chọn các chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng mạnh với Fusarium
oxysporum ..........................................................................................................................31
3.4. Định danh chủng vi khuẩn Bacillus spp. được tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học
phân tử................................................................................................................................ 33
3.5. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng Bacillus subtilis BS5 .........................34
3.6. Khảo sát khả năng sinh enzyme protease và chitinase của vi khuẩn Bacillus subtilis
BS5 .....................................................................................................................................35
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................................................37
1. Kết luận ..........................................................................................................................37
2. Kiến nghị ........................................................................................................................37
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................33
PHỤ LỤC............................................................................................................................. a

8


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, sản phẩm cây ăn quả nước ta được xuất khẩu hơn 60 quốc gia vùng lãnh

thổ, trong đó 10 thị trường xuất khẩu chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Mỹ, Nga, Hàn
Quốc. Do điều kiện sinh thái đa dạng cho nên trồng được nhiều loại khác nhau, qua
thống kê cho thấy rằng hiện nay diện tích cây ăn quả cả nước ta ước tính có hơn 1,1 triệu
ha, năng suất bình quân ước đạt hơn 10 tấn/ha và tổng sản lượng đạt 11 triệu tấn/năm
(Nguyên Phúc,2022). Với tiềm năng xuất khẩu các loại trái cây chủ lực của Việt Nam,
việc đảm bảo chất lượng nông sản cần được ưu tiên hàng đầu. Chính vì thế việc chăm sóc
phịng trừ bệnh hại đối với các cây ăn quả là điều luôn cần phải quan tâm. Tuy nhiên,
việc trồng, sẩn xuất cây ăn quả ở nước ta vẫn cịn gặp nhiều khó khăn, trở ngại do tính
thời vụ cao, thời gian thu hoạch ngắn khiến sản phẩm cây ăn quả khó bảo quản, vận
chuyển, dễ hư hỏng, tổn thương và dễ bị nhiễm các bệnh về nấm đặc biệt là nhiễm
Fusarium oxysporum gây nên hiện tượng thối quả ảnh hưởng đến năng suất cây trồng.
Bệnh thối quả do nấm Fusarium oxysporum ảnh hưởng đến năng suất có thể dẫn
đến thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người trồng. Tại Pakistan, đã phân lập và xác định
mầm bệnh F. oxysporum và Fusarium solani chịu trách nhiệm gây thối xoài sau thu
hoạch. Ngoài ra, các độc tố nấm mốc chính do nấm Fusarium spp. sinh ra như
fumonisins, zearalenone và trichothecenes gây ảnh hưởng tới sức khỏe của con người
(Bakker, Matthew G,2018).
Với nền nông nghiệp sạch hiện nay, người dân luôn tiên sử dụng các chế phẩm sinh
học do tính đặc hiệu và an tồn của nó. Và một trong những chủng tiềm năng đó, Bacillus
subtilis với những đặc điểm nổi bật về khả năng kháng khuẩn, kháng nấm bệnh cao đang
được quan tâm. Với mong muốn tìm ra được các chủng Bacillus subtilis bản địa có hoạt
tính kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh và tạo màng sinh học bảo quản nông sản
sau thu hoạch, để kéo dài thời gian bảo quản đồng thời duy trì chất lượng quả sau thu
hoạch. chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus
subtilis có khả năng đối kháng nấm Fusarium oxysporum ”.

9


2. Mục tiêu đề tài

Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng đối kháng mạnh
Fusarium oxysporum
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của nghiên cứu từ đề tài này cung cấp dẫn liệu khoa học mới về vi khuẩn
Bacillus subtilis phân lập được từ đất của các vườn tại tỉnh Quảng Nam, tạo cơ sở khoa
học cho các nghiên cứu tiếp theo.
Cung cấp thêm một số thông tin, tài liệu cho quá trình học tập và nghiên cứu về lĩnh
vực sinh học, công nghệ sinh học.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học cho việc ứng dụng sản xuất các màng
bioflim để kiểm soát nấm bệnh Fusarium oxysporum gây bệnh trên quả sau thu hoạch
nhằm góp phần nâng cao năng suất cây trồng, xây dựng một nền nông nghiệp sạch và bền
vững.

10


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái quát chung về Bacillus Subtilis
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi Tổ chức y
học Nazi của Đức. Lúc đầu, chủ yếu được sử dụng để phòng bệnh lý cho các bệnh sĩ Đức
chiến đấu ở Bắc Phi.
Việc sử dụng để điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 - 1957 khi Henry,
Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. Từ đó,
“subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại
tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá.
Ngày nay, vi khuẩn Bacillus subtilis trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi
trong chăn nuôi, y học, thực phẩm....

1.1.1 Đặc điểm phân loại
Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc
Giới: Bacteria
Ngành: Fimicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacilliales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài:Bacillus subtilis
1.1.2 Đặc điểm phân bố
Bacillus subtilis còn được gọi là trực khuẩn cỏ hoặc trực khuẩn rơm vì hay được tìm
thấy trong cỏ, rơm và cả đất. Tuy nhiên chúng phát triển nhiều trong ống tiêu hóa của
người và nhiều lồi gia súc, nhất là động vật nhai lại, có lợi cho người nên cũng gọi là lợi
khuẩn subtilis. Lồi này được chú ý nhiều vì có lợi và là sinh vật mơ hình trong nhiều
nghiên cứu khoa học, nhất là trong di truyền học, đồng thời cũng là đối tượng thuận lợi
để sản xuất một số loại protein cho con người trong công nghệ sinh học, giống như E.

11


coli đã được dùng làm "công xưởng" sản xuất ra insulin và somatostatin trong kỹ thuật di
truyền.
1.1.3 Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là vi khuẩn nhỏ, hai đầu tròn , Gram dương, kích thước 0,5-0,8µm
x 1,8-3µm đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động 8-12 lông. Sinh bào tử nhỏ hơn vi
khuẩn và nằm giữa tế bào , kích thước 0,8 -1,8 µm. Phát triển bằng cách nảy mầm do sự
nứt bảo tử, khơng kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ
(Tơ Minh Châu, 2000).
Theo Bùi Thị Phi, 2007 thì một trong những đặc điểm quan trong nhất của Bacillus
subtilis là khả năng sinh bào tử trong những điều kiện bất lợi như nhiệt độ tăng cao, môi

trường dinh dưỡng cạn kiệt, khô hạn để vượt qua điều kiện bất lợi, nếu gặp điều kiện
thuận lợi bào tử Bacillus subtilis sẽ nảy mầm và phát triển như một tế bào mới với chu kỳ
sống mới. Bào tử Bacillus subtilis có hình bầu dục, phân bố không theo quy tắc chặt chẽ
nào, lệch tâm, gần tâm nhưng khơng chính tâm.

Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis dưới kính hiển vi (Wiki)
Bào tử ở Bacillus subtilis khơng phải là hình thức sinh sản như ở nấm mà chúng là
dạng cấu trúc đặc biệt có tính kháng chun biệt giúp cho chủng lồi lưu tồn tốt trong
những điều kiện khó khăn của mơi trường sống mà chúng cịn có khả năng sống rất lâu.
Nhiệt độ 100ºC bào tử của một số loài Bacillus spp. có thể chịu đựng được từ 2,5 – 20
giờ. Ngồi việc chịu đựng được nhiệt độ khô cao, bào tử có thể chịu được khơ hạn cũng
12


như tác đọng của nhiều loại hóa chất cũng như các loại tia sáng (Phạm Hồng Sơn, Giáo
trình vi sinh đại cương).
1.2. Khái quát chung về Fusarium oxysporum
1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo khóa phân loại của Bergey, nấm F. oxysporum thuộc
Giới : Fungi
Chi: Fusarium,
Họ: Nectriaceae,
Bộ: Hypocreales,
Lớp: Ascomycetes,
Ngành: Ascomycotina,
Loài: Fusarium oxysporum
1.2.2. Đặc điểm hình thái
Nấm Fusarium oxysporum có dạng bào tử lớn trong suốt, có nhiều vách ngăn, bào
tử có hình trăng khuyết, một đầu thắt lại hình bàn chân. Dạng bào tử nhỏ, đơn hoặc đa
bào hình cầu hoặc hình bầu dục. Một số lồi Fusarium oxysporum có bào tử nhỏ, bào tử

hậu và quả thể hoặc khơng có bào tử hậu.

Hình 1.1. Fusarium Oxysporum ( Trần Ngọc Hùng, 2020).
13


C.Booth năm 1977 – 1979 đã chú ý vào bản chất tế bào phân sinh mà tử đó sinh ra
bào tử nhỏ, là trong những chỉ tiêu đầu tiên để phân loại nấm trên cơ sở đó ơng cho rằng
nấm Fusarium oxysporum có số lượng 90 lồi. Sau này Burgess và công sự (1993) đã
đưa ra cơ sở phân loại nấm Fusarium oxysporum gồm 7 chỉ tiêu như sau: Hình thành bào
tử lớn; hình thành bào tử nhỏ; hình dạng và kiểu bào tử nhỏ; kích thước của bào tử nhỏ;
sự có mặt hay khơng có mặt của bào tử hậu trên mơi trường PGA; đường kính tản nấm
trên mơi trường PGA; hình thái tản nấm.
Nấm Fusarium oxysporum ban đầu gồm hơn 100 lồi được mơ tả dựa trên kiểm
nghiệm về cấu trúc của ổ sinh bào tử lớn là thực vật. Theo phân loại của
WellenneperReikinh (1935), số loài sống cịn 65 lồi, 55 giống và 22 dạng. Bằng phương
pháp cấy truyền đơn bào tử dùng trong hệ thống phân loại của Snyder và Hanser đã bổ
sung về sự giống và khác nhau giữa các loài Fusarium oxysporum, Snyder và Hanser đã
đề nghị giảm số lượng xuống cịn 9 lồi.
1.2.3. Đặc điểm sinh học nấm Fusarium oxysporum
Nấm Fusarium sp. là một trong những loại nấm gây thiệt hại về kinh tế quan trọng
nhất. Nấm Fusarium sp. thuộc lớp nấm bất tồn (Deuteromycetes), giai đoạn sinh sản hữu
tính là Gibberella thuộc lớp nấm nang (Ascomycetes). Sợi nấm phát triển mạnh, màu sắc
biển đổi từ màu trắng đến màu tím violet, tán nấm thường sinh sắc tố màu hồng đến màu
tím đậm. Bào tử lớn hình thành có kích thước ngắn trung bình hoặc dài, phần lớn có 3
vách ngăn mỏng, một đầu nhọn hoặc thon nhọn, một đầu hình bàn chân, bào tử nhỏ hình
thành trên cành bào tử phân sinh đơn nhánh ngắn thường khơng có ngăn ngang, đơi khi
có một ngăn. Hình dạng bào tử thay đổi từ hình ovan, hình elip hoặc hình quả thận. Hậu
bào tử thường hình thành hầu hết trên mẫu phân lập sau 3 - 6 tuần nuôi cấy trên bề mặt
thạch của môi trường PGA (Burgess, Sazanne, Bullock, Gott, Backhouse, 1994).

Fusarium spp. gồm nhiều lồi khác nhau, có khả năng gây nhiều loại bệnh trên những
cây trồng khác nhau. Có nhiều lồi sản sinh ra độc tố có độc tính cao, có ảnh hưởng đến
động vật sống hoang dã, thú nuôi và con người ( Marasas và ctv, 1984). Tuy nhiên, có
nhiều lồi nấm Fusarium spp. là nấm hoại sinh sống phổ biến trong đất (Burgess và
ctv,1994).
- Sự phân bố và gây hại
14


Các yếu tố khách quan làm tăng sự phát triển của nấm Fusarium spp. là : bón phân
đạm quá nhiều, các yếu tố về hệ VSV có trong đất, ẩm độ của đất, nhiệt độ tối ưu cho
nấm Fusarium spp. phát triển là 27 - 30° C, tối đa là 36 - 40° C và tối thiểu là 7-8 °C
nhưng nhiệt độ thích hợp cho sự xâm nhiễm là 35 °C ( Ou, 1985).
Nấm Fusarium spp. gây nhiều bệnh trên cây trồng: Bệnh nghẽn mạch (héo), thối rễ,
thối thân, thối hạt, thối trái. Nấm Fusarium spp. sống phổ biến trong đất, lưu tồn dưới
dạng bào tử áo hoặc khuẩn ty sống trên xác bã thực vật dư thừa hay những chất hữu cơ.
Một số loại tạo bào tử đính bay trong khơng khí đây là ngun nhân gây ra những bệnh
trên thân, lá và bông ( Burgess và ctv, 1994). Các loài Fusarium spp. sản sinh độc tố nấm
mốc đã được phân lập từ bệnh thối quả chuối và dứa, đây là báo cáo duy nhất về độc tố
nấm mốc liên quan đến các loại cây ăn quả nhiệt đới chính. Một số lồi gây bệnh ảnh
hưởng đến cây ăn quả, bao gồm F. proliferatum, F. verticillioides, F. ananatum và F.
oxysporum, đã được tìm thấy để sản xuất fumonisins, moniliformin và beauvericin. Độc
tố nấm mốc cũng đã được phát hiện trong quả dứa bị nhiễm bệnh tự nhiên. Những phát
hiện này cho thấy độc tố nấm mốc có thể đóng một vai trò trong sinh bệnh học thực vật,
đặc biệt là trong quá trình nhiễm trùng và xâm chiếm vật chủ. Ngồi ra cịn có khả năng
nhiễm độc tố nấm mốc trong mơ trái cây. Ơ nhiễm trái cây do nấm mycotoxigenic có thể
xảy ra trên đồng ruộng, trong hoặc sau khi thu hoạch, trong quá trình bảo quản, vận
chuyển và tại điểm bán. Theo nghiên cứu của Abdul Salam Mengal và ctv, 2016 điều tra
cho thấy hầu hết các vườn ươm xoài đều bị một số bệnh nặng như thối trái, héo Fusarium
spp., dị tật, thán thư, đốm lá và cháy lá. Trong số tất cả chúng, bệnh thối Fusarium spp.

được tìm thấy là bệnh chiếm ưu thế nhất trong tất cả các vườn ươm.
Fusarium spp. gây bệnh thực vật có mặt rộng rãi trong mơi trường và có thể gây
nhiễm trùng ở những người bị suy giảm miễn dịch (Nucci , 2018), điều này cho thấy cây
ăn quả bị nhiễm bệnh cũng có thể lây nhiễm cơ hội cho người nhạy cảm. Triest và
Hendrickx, 2016 đưa ra giả thuyết rằng chuối bán trên thị trường bị nhiễm F. musae có
nhiều khả năng lây nhiễm sang người nhạy cảm nhất. Do đó, có khả năng các loại cây ăn
quả bị nhiễm Fusarium spp. khác cũng có thể lây nhiễm sang người nhạy cảm. Khả năng
phân lập lâm sàng của Fusarium spp. lây nhiễm ngô và Arabidopsis đã được chứng minh
bởi Meza-Menchaca et al 2020, người đã chứng minh nhiễm Fusarium spp. từ người

15


sang thực vật. Nghiên cứu của Meza-Menchaca et al. đã cung cấp thông tin liên quan đến
sự lây nhiễm của Fusarium spp. giữa thực vật và con người.
1.3. Tình hình nghiên cứu đối kháng nấm Fusarium spp.
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Vào năm 2021 Yujing Jia và cộng sự đã nghiên cứu phân lập được chủng vi khuẩn
kháng F. oxysporum phòng trừ bệnh đậu tương bằng phương pháp đối đầu mảng. Một
trong những chủng phân lập được của chúng tơi có tên là chủng BS06 có hoạt tính cao
nhất, được xác định là Bacillus subtilis . Nghiên cứu của họ cho thấy chủng BS06 có thể
kiểm sốt hiệu quả bệnh F. oxysporum đậu tương và giảm đáng kể F. oxysporum nhiễm
vào rễ cây đậu tương. So với nghiệm thức đối chứng và carbendazim, nghiệm thức BS06
có sinh khối rễ, chiều cao cây, hàm lượng diệp lục lá, đường kính gốc và hiệu quả phịng
trừ cao hơn. Kết quả của họ đã chỉ ra rằng BS06 có thể bảo vệ rễ đậu tương một cách
hiệu quả (chủng BS06 có thể tạo ra các chất ức chế F. oxysporum ), có khả năng hữu ích
cho việc trồng đậu tương.
Theo nghiên cứu của A Russi và cộng sự (2022) mục tiêu của nghiên cứu này là
đánh giá khả năng đối kháng của chủng Bacillus subtilis F62 với F. oxysporum in vitro
và in vivo, cũng như khả năng thúc đẩy tăng trưởng ở gốc ghép nho SO4. Trong thử

nghiệm in vitro, sự đối kháng bởi các hợp chất dễ bay hơi và khuếch tán của B. subtilis
F62 và sự ức chế sự nảy mầm của hạt trần của bốn loài Fusarium spp. phân lập đã được
đánh giá. Trong thử nghiệm in vivo, cành giâm và cây vi nhân giống SO4 được đưa vào
bốn nghiệm thức: đối chứng, Bac (cấy B. subtilis F62), Fus (cấy F. oxysporum) và Bac +
Fus. Họ đã quan sát thấy rằng sự ức chế sự phát triển của sợi nấm xảy ra chủ yếu bởi các
hợp chất khuếch tán B. subtilis F62 có tác động tích cực đến việc thúc đẩy tăng trưởng và
kiểm soát sinh học đối với F. oxysporum, làm giảm tần suất tái phân lập mầm bệnh ở
cành giâm (18,1%) và ở cây vi nhân giống (52,4%). Những kết quả này cho thấy khả
năng của B. subtilis F62 trong việc nâng cấp sự phát triển của cây và hỗ trợ kiểm soát
bệnh héo Fusarium ở gốc ghép nho SO4.
Nghiên cứu của OM Adedire (2023) các chủng F. oxysporum và Bacillus spp. được
phân lập từ cây cà chua được thu thập từ 21 trang trại. Khả năng ức chế của vi khuẩn nội
sinh được xác định thông qua một thử nghiệm nuôi cấy kép, liên quan đến sáu vi khuẩn
16


nội sinh và carbendazim (thuốc diệt nấm), được thiết lập theo một thiết kế hoàn toàn ngẫu
nhiên. Sử dụng thang đánh giá từ 0–9, mức độ héo rũ nghiêm trọng nhất (6,67) và tỷ lệ
mắc bệnh (39,30%) được quan sát thấy ở trang trại Akinware trong vùng nông nghiệp
Ibadan/Ibarapa của Bang Oyo. Fusarium oxysporum IB3q gây ra các triệu chứng héo rũ,
thối quả nghiêm trọng, bao gồm nhiễm úa lá, hoại tử, đổi màu mạch máu và héo rũ trên
các giống cà chua địa phương Alausa và Ibadan bị nhiễm bệnh. Ba mươi chín
chủng Bacillus spp. đã được phân lập từ các mô của cây cà chua khỏe mạnh. Trong đó
có sáu vi khuẩn Bacillus spp. được phân lập đã ức chế F. oxysporum. Trong đó chủng B.
subtilis Og04 có vùng ức chế 19,43 mm đối với F. oxysporum mạnh nhất so với các
chủng khác và gây ra sự phân hủy sợi nấm của mầm bệnh. Chúng tạo ra các enzym phân
hủy thành tế bào, với các hoạt động tương đối nằm trong khoảng từ 0,87 đến 5,04. Dựa
trên tiềm năng ức chế in vitro của chúng , B. subtilis Og04 nên được triển khai như các
biện pháp kiểm soát sinh học trong tương lai chống lại mầm bệnh Fusarium spp. truyền
qua hạt và bệnh héo rũ, thối quả Fusarium spp. trên cà chua.

B. Yassir và cộng sự 2022, mục tiêu chính của nghiên cứu này là đánh giá khả năng
kháng nấm của ba chủng Bacillus subtilis (S2DSP-B2C-BM14) được phân lập từ đất
nông nghiệp và được xác định bằng PCR 16S chống lại hai loại nấm Fusarium
oxysporum và Fusarium solani được phân lập từ cà chua bằng ba phương pháp khác nhau
trong ống nghiệm. Trong cả hai chế độ đối đầu, ba vi khuẩn Bacillus subtilis (S2DSPB2C-BM14) thể hiện xu hướng đối kháng với hai loại nấm thực vật gây bệnh, trong đó
Fusarium oxysporum là hiệu quả nhất. Chúng làm giảm đáng kể sự phát triển sợi nấm của
hai loại nấm được điều trị, với tỷ lệ ức chế đáng kể khác biệt đáng kể tùy thuộc vào thời
gian ủ, trong đó tỷ lệ ức chế đáng kể nhất đối với Fusarium oxysporium lần lượt là 85,43
± 00,62%, 84,42 ± 00,76% và 83,92 ± 1,60% sau 04 ngày ủ đối kháng gián tiếp. Điều này
chứng tỏ rằng cả ba loại vi khuẩn đều có thể tạo ra và thải ra các hợp chất dễ chống
nấm. Tỷ lệ ức chế sự phát triển sợi nấm của hai loại nấm gây bệnh thực vật thu được sau
khi xử lý dựa trên chất nổi trên bề mặt tế bào của các môi trường nuôi cấy ở các độ tuổi
khác nhau của từng loại vi khuẩn đối kháng, dao động từ 44,45 ± 6,31% và 70,15 ±
4,78%, đã khẳng định rằng các loại nấm đối kháng các hoạt động của vi khuẩn được sử
dụng trong nghiên cứu này, như được tiết lộ trong các thử nghiệm đồng nuôi cấy, chủ yếu
bắt nguồn từ các chất chuyển hóa thứ cấp có thể khuếch tán được. Phân tích kính hiển vi
17


quang học đã tiết lộ rằng các phương pháp điều trị này, đặc biệt là phương pháp liên quan
đến chủng S2DSP, gây ra những thay đổi đáng kể về hình thái tế bào của hai loại nấm
được nghiên cứu, bao gồm cả sự phá vỡ thành tế bào sợi nấm. Ba chủng vi khuẩn nghiên
cứu đều có đặc tính đối kháng mạnh, cho thấy chúng có thể là tác nhân kiểm sốt sinh học
hữu ích đối với bệnh héo rũ Fusarium spp. cà chua trên đồng ruộng và sau thu hoạch.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Đặng Thanh Tuấn và cộng sự, 2019 , chủng Bacillus subtilis được sử dụng như là
một tác nhân sinh học phòng trừ nấm bệnh trên cây ớt rất hữu hiệu tại nhiều nước trên thế
giới. Trong nghiên cứu này, bằng phương pháp đối kháng trực tiếp trên đĩa thạch với ba
chủng nấm bệnh Fusarium oxysporum NB01, NB02 và NB03 (gây bệnh thối trái ớt). Kết
quả cho thấy hai chủng Bacillus subtilis Ba02 và Ba36 cho hiệu quả đối kháng tốt với

NB01, NB02 và NB03 khi cấy đối kháng đồng thời. Trong đó, chủng Ba02 được ni
cấy lỏng và lắc 180-200 vịng/phút trong 48 giờ với môi trường chứa lactose 20 g/l, bột
trùn Quế thủy phân 10 g/l KH2PO4 0,4 g/l và MgSO4.7H2O 0,2 g/l ở pH 7,5 và chủng
Ba36 được nuôi cấy lỏng và lắc 180-200 vịng/phút trong 36 giờ với mơi trường gồm
glucose 45 g/l, pepton 12,5 g/l, và NH4H2PO4 1,5 g/l. Chế phẩm thu được sau khi trộn
canh trường với bột năng theo tỷ lệ 1:1,5 và sấy ở 45oC có tác dụng kích thích sự nảy
mầm của hạt giống, hỗ trợ khả năng nảy mầm của hạt giống khi có sự hiện diện của nấm
bệnh, giảm tỷ lệ chết của cây con, làm tăng sức sống và sức đề kháng cây trồng. Q
trình thử nghiệm bước đầu cho thấy có thể sản xuất được chế phẩm dạng bột từ Bacillus
subtilis để phòng trừ nấm bệnh
Nguyễn Thị Kim Cúc, 2014 Hiện nay, có khoảng hơn 80.000 lồi nấm được biết có
khả năng gây bệnh cho cây trồng, trong đó F.oxysporum, F.solani, Phytophthora sp là
những lồi gây thiệt hại lớn nhất, chúng có thể phá hủy toàn bộ vụ thu hoạch của các cây
trồng quan trọng như: tiêu, cà phê, cà chua... Cùng với sự phát triển nhanh chóng của
khoa học và cơng nghệ, nhiều nhà khoa học trên thế giới đã nghiên cứu ứng dụng biện
pháp sinh học để phòng chống dịch hại, sử dụng khả năng đối kháng của một số loại nấm,
vi khuẩn, xạ khuẩn để trừ bệnh hại cây trồng. Trong nghiên cứu này, 37 chủng vi khuẩn
và 10 chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất và rễ tiêu bị bệnh ở Quảng Trị và được đánh
giá hoạt tính ức chế sinh trưởng một số nguồn bệnh nấm thực vật bằng phương pháp
khuếch tán đĩa thạch. Kết quả nhận được cho thấy 31 chủng vi khuẩn và 5 chủng xạ
18


khuẩn phân lập đối kháng nấm F.oxysporum, tất cả 37 chủng vi khuẩn và 2 chủng xạ
khuẩn ức chế sinh trưởng của F.sonali, 10 chủng vi khuẩn và 6 chủng xạ khuẩn đối
kháng với Phytophthora sp. Đã định danh 5 chủng vi khuẩn và 2 chủng xạ khuẩn phân
lập có hoạt tính đối kháng cao nhất bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA hoặc
bằng KIT API đến các loài: Paenibacillus sp; Paenibacillus xylanilyticus; Bacillus
subtilis; Burkholderia cepacia; Pseudomonas luteola; Streptomyces diastatochromogenes;
Streptomyces antimycoticus. Đã tiến hành xác định hoạt tính đối kháng F.oxysporum in

vivo trong điều kiện phịng thí nghiệm trên mơ hình cây cà chua của một số chủng tuyển
chọn. Kết quả nhận được cho thấy các chủng tuyển chọn khơng những có khả năng ức
chế sinh trưởng của F.oxysporum, mà cịn kích thích sinh trưởng của cây cà chua trong
điều kiện phịng thí nghiệm.
Trần Ngọc Hùng, 2021 đã nghiên cứu phân lập được ba chủng nấm Fusarium spp.
có hoạt lực gây bệnh cao từ rễ cây rau cảo, cây dưa lưới và cà chua. Trong đó, chủng nấm
Fusarium F03 gây bệnh thối dưa lưới bị ức chế mạnh bởi dịch nuôi cấy vi khuẩn Bacillus
vezelensis. Dịch nuôi cấy trên mơi trường PG sau 5 ngày có đường kính vòng kháng nấm
đạt 9mm và hiệu quả ổn định trong 6 tháng. Làm giảm 66,7% tỷ lệ cây quả chết héo so
với đối chứng ở thử nghiệm. Hoạt chất kháng nấm thu được ở phương pháp tủa với
ethanol 50% và thời gian kết tủa 60 phút cho hiệu quả kháng nấm không thay đổi so với
dịch nuôi cấy gốc.
Từ những nghiên cứu đã nêu trên cho thấy rằng chủng Bacillus subtilis có khả năng
đối kháng hiệu quả nấm Fusarium oxysporum. Các chất đối kháng và chiết xuất của nó
đều có hiệu quả trong việc kiểm soát mầm bệnh trên các loại cây và trái cây. Trong số
các biện pháp kiểm soát sinh học thay thế cho thuốc trừ sâu, diệt nấm được sử dụng để
giảm thiểu tỷ lệ mắc bệnh và mức độ bệnh nghiêm trọng của thực vật, việc áp dụng các vi
khuẩn đặc biệt là probiotic để giảm thiểu các tình trạng trên, an tồn với người sử dụng là
điều rất hứa hẹn.

19


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ các mẫu đất vùng rễ cây ăn quả.
- Chủng nấm mốc Fusarium oxysporum được cung cấp bởi Viện công nghệ sinh
học Huế.

2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
- Địa điểm thu mẫu ngồi thực địa bao gồm: thơn Phong Thử, xã Điện Thọ, thị xã
Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam.
- Địa điểm nghiên cứu trong phịng thí nghiệm: phịng thí nghiệm (PTN) Vi sinh sinh lý thực vật - hóa sinh, PTN Cơng nghệ sinh học, PTN Sinh học phân tử thuộc khoa
Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. từ các mẫu đất vùng rễ cây ăn quả trên
địa bàn xã Điện Thọ, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam.
- Tuyển chọn các chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng mạnh với Fusarium
oxysporum.
- Nghiên cứu định danh chủng đã phân lập bằng phương pháp PCR và giải trình tự.
- Khảo sát khả năng sinh enzyme protease và chitinase của chủng Bacillus subtilis
tuyển chọn được.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu đất xung quanh vùng rễ được thu thập ở độ sâu tối đa 20 cm (Lamsal et at.,
2012) từ thôn Phong Thử, xã Điện Thọ, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam. Mỗi vườn thu
7 điểm, trộn đều lại thành 1 mẫu chứa trong túi nilon vô trùng, bảo quản trong thùng mát
4oC và được vận chuyển về phịng thí nghiệm cho các thí nghiệm tiếp theo (Sun et al.,
2017).
20


2.3.2. Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. bản địa
Tiến hành phân lập:
- Cân 10g mẫu đất pha trong bình tam giác chứa 90ml nước cất vơ trùng và được
đồng nhất hóa trên máy lắc trong 10 phút. Gia nhiệt 80oC trong 15 phút ở bể ủ nhiệt để
loại trừ các tế bào sinh dưỡng và các tế bào khơng sinh bào tử.
- Sau đó pha lỗng đến các nồng độ khảo sát từ 106 ,107, 108. Hút 100uL dung dịch
mẫu trải trên đĩa petri chứa môi trường LB và ủ ở 37oC. Trong 24 đến 48 giờ, quan sát

những khuẩn lạc có dạng trịn, rìa răng cưa khơng đều, trắng sữa có thể là chủng vi khuẩn
Bacillus subtilis.
Tiến hành cấy thuần khiết giống
Các dạng khuẩn lạc vừa phân lập trên sẽ tiếp tục được làm thuần:
- Chọn các khuẩn lạc đặc trưng và tiếp tục cấy ria trên môi trường LB cho đến khi
trên môi trường chỉ có một dạng khuẩn lạc đồng nhất. Để xác định giống thuần khiết và
có thêm cơ sở khẳng định là vi khuẩn Bacillus spp. . Tiến hành quan sát dưới kính hiển
vi, nhuộm Gram và xác định các phản ứng test sinh - hóa.
2.3.3. Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của Bacillus spp.
* Phương pháp nhuộm Gram
Các bước nhuộm Gram được tiến hành như sau:
- Làm tiêu bản vệt bôi mẫu cần nhuộm.
- Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn.
- Nhuộm dung dịch crystal violet trong 30 giây, rửa nước, thấm khô.
- Thêm dung dịch lugol 30 giây, rửa nhẹ nhàng với nước và rửa bằng cồn 3-5 giây,
rửa lại bằng nước, thấm khô.
- Nhuộm bổ sung fuchsin trong 30 giây, rửa lại bằng nước, thấm khơ rồi mang đi
quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu 100x. Ghi nhận khả năng bắt màu
thuốc nhuộm, mơ tả hình dạng tế bào. Sau khi quan sát dưới kính hiển vi nếu thấy tiêu

21


bản vi khuẩn nào phù hợp với những đặc điểm của vi khuẩn Bacillus spp. thì tiếp tục thử
phản ứng sinh hóa để khẳng định.
* Thử nghiệm Oxidase
Nhỏ vài giọt thuốc thử tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1% trên
giấy lọc đã được khử trùng trên một lam kính sạch. Dùng que thủy tinh vơ trùng lấy một
ít khuẩn lạc vi khuẩn chọ lên vùng thuốc thử trên giấy lọc. Nếu chuyển qua màu xanh
dương hay tím sẫm cho kết quả dương tính, nếu khơng đổi màu cho kết quả âm tính.

Bacillus spp. cho kết quả dương tính (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998).
* Thử nghiệm catalase
Lấy một ít khuẩn lạc vi khuẩn phết lên giữa lam kính sạch. Nhỏ vài giọt H2O2 3%
phủ lên VK. Đọc kết quả sau khoảng 15 giây. Phản ứng catalase dương tính: có hiện
tượng sủi bọt khí. Bacillus spp. thường cho kết quả dương tính (Nguyễn Lân Dũng et al.,
1998; Buchanan and Gibbons, 1974).
* Khả năng di động
Lấy một khuẩn lạc vi khuẩn, cấy đâm sâu trong môi trường thạch mềm (0,7% agar),
khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ ở 37°C trong 24 giờ. Dương tính: VSV mọc lan ra khỏi
đường cấy và làm đục môi trường xung quanh. Âm tính: VSV mọc trong đường cấy, mơi
trường xung quanh vẫn trong (Nguyễn Lân Dũng et al., 1998; Bùi Văn Lệ et al., 1999).
* Thử nghiệm Nitrate
Tăng sinh giống trong môi trường LB để ổn định giống cho thử nghiệm, sau khi
tăng sinh xong giống vi khuẩn sẽ được cấy chuyền qua môi trường đĩa thạch LB và ủ
trong tủ ấm 37ºC trong 24h lấy khuẩn lạc thuần. Dùng que cấy vào môi trường Nitarte
Broth đã hấp khử trùng.
Ủ môi trường nuôi cấy trong tủ ấm 37ºC sau 48 giờ
Nhỏ thử thuốc Griess A và Griess B lần lượt vào môi trường nuôi cấy và quan sát
sự thay đổi màu sắc. Kết quả: Môi trường không thay đổi (-); Môi trường chuyển đỏ (+).

22


* Thử nghiệm citrate
Tăng sinh giống trong môi trường LB để ổn định giống cho thử nghiệm, sau khi
tăng sinh xong giống vi khuẩn sẽ được cấy chuyền qua môi trường đĩa thạch LB và ủ
trong tủ ấm 37ºC trong 24h lấy khuẩn lạc thuần. Dùng que cấy vào môi trường Simmon
Citrate Agar đã hấp khử trùng. Sau khi hấp khử trùng xong tiến hành để thạch nghiêng.
Cấy ria chủng vi khuẩn khảo sát lên môi trường và ủ ở nhiệt độ 37ºC trong 2 ngày.
Quan sát sự thay đổi màu sắc. Kết quả: Môi trường đổi màu xanh dương (+); Môi trường

không thay đổi, mọc lốm đốm các vi khuẩn (-).
2.3.4. Phương pháp tuyển chọn các chủng Bacillus spp. có khả năng đối kháng mạnh với
Fusarium oxysporum.
Thí nghiệm được bố trí với số nghiệm thức tương ứng với số chủng Bacillus spp. đã
phân lập. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Tiến hành thực hiện phương pháp cấy kép: nấm
được cấy vào đĩa petri chứa môi trường Potato Dextrose Agar (Potato: 200g, Dextrose:
20g, agar: 20g) và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày. Sau 2 ngày, tiến hành cấy vi khuẩn
lên bề mặt đĩa nấm đã ủ. Sau 3,5,7 ngày quan sát sự hình thành vùng kháng nấm và tính
hiệu suất ức chế sự phát triển của nấm bởi vi khuẩn được tính theo cơng thức:
I = (R -r)/ R x 100
I: hiệu suất đối kháng của vi khuẩn;
R: bán kính của hệ sợi nấm đối chứng (cm);
r: bán kính của hệ sợi nấm trên đĩa có chủng vi khuẩn (cm) (Nguyễn Thị Kim Liên
và ctv, 2017).
2.3.5. Định danh chủng vi khuẩn Bacillus spp. được tuyển chọn bằng kỹ thuật sinh học
phân tử
- Tách chiết DNA
Vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường LB ở nhiệt độ 37ºC trong 24 giờ, lắc 150
vòng/phút. Sinh khối tế bào sau khi nuôi cấy được sử dụng để tách chiết DNA tổng số
theo phương pháp CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) (Saghai-Maroof et al.,
1984). Sau khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh, hút 1,5ml dịch vi khuẩn vào mỗi ống
Eppendorf 1,5 ml, ly tâm 8.000 vòng/phút trong 5 phút. Tái huyền phù sinh khối bằng
700 μL đệm chiết (Sorbitol 0.35M, Tris-HCl 2M pH 8.0, EDTA 0.5M, NaCl 5M, CTAB
23