Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh bacteriocin cao từ các sản phẩm lên men truyền thống

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HỒNG
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ
NĂNG SINH BACTERIOCIN CAO TỪ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN
TRUYỀN THỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ thực phẩm

Khoa

: CNSH – CNTP

Khóa học

: 2013 – 2017

THÁI NGUYÊN, NĂM 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

NGUYỄN THỊ HỒNG
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN LACTIC CÓ KHẢ
NĂNG SINH BACTERIOCIN CAO TỪ CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN
TRUYỀN THỐNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Hệ đào tạo

: Chính quy

Chuyên ngành

: Công nghệ thực phẩm

Lớp

: K45 - CNTP

Khoa

: CNSH – CNTP

Khóa học

: 2013 – 2017

Giảng viên hƣớng dẫn: TS. Trần Văn Chí

THÁI NGUYÊN, NĂM 2017


i

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập tại phòng Công nghệ Lên Men, Khoa Công
nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái
Nguyên, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ Ban chủ nhiệm Khoa
CNSH – CNTP, thầy cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình.
Trước hết, em xin chân thành cảm ơn TS. Trần Văn Chí, giảng viên
Khoa CNSH – CNTP, đã tạo điều kiện, hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em
hoàn thành khóa luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Vi Đại Lâm giảng viên Khoa
CNSH- CNTP, người đã hướng dẫn em các thao tác thực hành và chỉ cho em
những sai lầm giúp em hoàn thành tốt khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn đến các thầy cô trong Khoa CNSH – CNTP,
trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong
quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này.
Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người
đã luôn ở bên cạnh động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện
khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, ngày

tháng

năm 2017

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Hồng


ii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Phân loại bacteriocin theo Jack ........................................................ 7
Bảng 2.2: Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer .................... 10
Bảng 2.3: Độ bền nhiệt, pH và enzym thủy phân của một số bacteriocin sinh
tổng hợp bởi vi khuẩn lactic ............................................................. 12
Bảng 2.4: Sự đa dạng của giống vi khuẩn lactic (Gasson Michad. J, 1993) .. 26
Bảng 3.1: Môi trường thạch MRS (de Man, Rogosa and Sharpes) (g/l) ........ 32
Bảng 3.2: Các nguồn mẫu phân lập ................................................................ 34
Bảng 4.1. Kết quả xác định hình thái khuẩn lạc của các chủng LAB từ các
mẫu .................................................................................................... 39
Bảng 4.2. Hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của các chủng vi
khuẩn Lactic ...................................................................................... 44
Bảng 4.3. Khảo sát điều kiện tách bacteriocin từ chủng nghiên cứu .............. 47


iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Cấu trúc của nisin ( Nguồn: Ruiz-Larrea và cộng sự, 2005) ............ 6
Hình 2.2 : Cấu trúc sakacin P ............................................................................ 8

Hình 2.3: Cơ chế hoạt động của bacteriocin(Nguồn Fidel Toldrá, 2009) ...... 15
Hình 2.4: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm I ............................................... 19
Hình 2.5: Cơ chế tổng hợp bacteriocin nhóm II(Nguồn P.Michael Davidson,
2005) ..............................................................................................................20
Hình 3.1 : Vùng kháng khuẩn của dịch Bacteriocin trên đĩa petri.................. 36
Hình 4.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic sinh tổng hợp bacteriocin . 43
Hình 4.2. Kiểm tra hoạt tính bacteriocin của vi khuẩn lactic bằng phương
pháp khuyếch tán đĩa thạch với chủng kiểm định Staphylococcus
aureus ................................................................................................ 45
Hình 4.3. Biểu đồ đường kính kháng khuẩn của chủng SC2 và SC3 đối với
Samonella .......................................................................................... 45
Hình 4.4. Đường kính kháng khuẩn của SC2 và SC3 với chủng kiểm định
Samonella .......................................................................................... 46
Hình 4.5. Ảnh hưởng của tốc độ ly tâm đến khả năng kháng khuẩn của dịch
bacteriocin ......................................................................................... 48


iv

DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT

DNA

: Deoxyribonucleic acid

LAB

: Lactic acid Bacteria

MRS

: de Man, Rogosa and Sharpes


v

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG ......................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... iii
DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT ......................................................... iv
MỤC LỤC ......................................................................................................... v
PHẦN 1. MỞ ĐẦU .......................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu của đề tài ..................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu của đề tài ...................................................................................... 2
1.4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 2
1.4.1. Ý nghĩa khoa học .................................................................................... 2
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn ..................................................................................... 2
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
2.1. Bacteriocin ................................................................................................. 3
2.1.1. Khái niệm ................................................................................................ 3
2.1.2. Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin.................................................... 3
2.1.3 Phân loại ................................................................................................... 5
2.1.4. Tính chất của bacteriocin ...................................................................... 11
2.1.5. Cơ chế hoạt động................................................................................... 14
2.1.7. Ứng dụng của Bacteriocin..................................................................... 20
2.2. Vi khuẩn Lactic ........................................................................................ 23
2.2.1. Khái quát về lịch sử phát triển vi khuẩn lactic...................................... 23
2.2.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic .................................... 23

2.3. Tình hình nghiên cứu ............................................................................... 27
2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ........................................................ 27
2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước.......................................................... 30


vi

PHẦN 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 32
3.1. Đối tượng và vật liệu nghiên .................................................................... 32
3.1.1. Đối tương nghiên cứu............................................................................ 32
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 32
3.1.3. Môi trường sử dụng............................................................................... 32
3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 33
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 33
3.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 33
3.4.1. Phương pháp phân lập và tuyển chọn vi sinh vật ................................. 33
3.4.2. Khảo sát và chọn lọc các dòng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin có tính
kháng khuẩn cao bằng phương pháp khuyếch tán trên giếng thạch ............... 35
3.4.3. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc độ ly tâm tới độ tinh sạch
của dịch bacteriocin thô .................................................................................. 37
3.4.4. Phương pháp nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chế phẩm
bacteriocin thô ................................................................................................. 37
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 39
4.1. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn lactic ................................................... 39
4.2. Kết quả chọn lọc các dòng vi khuẩn lactic sinh Bacteriocin có tính kháng
khuẩn cao bằng phương pháp khuyếch tán trên giếng thạch .......................... 43
4.3. Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của chế phẩm bacteriocin thô .......... 46
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................... 49
5.1. Kết luận .................................................................................................... 49

5.2. Kiến nghị .................................................................................................. 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 50
PHỤ LỤC


1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Vi khuẩn lactic (LAB) được sử dụng nhiều trong thực phẩm lên men
như dưa muối, cà muối, lên men rượu, sữa chua, nem chua, phomai, bia [5].
Chúng có vai trò quan trọng trong đời sống như tăng cường miễn dịch, ức chế
các vi sinh vật có hại, bổ sung các vi sinh vật có lợi, tác dụng kháng khuẩn…
Và gần đây có nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng LAB có khả năng sinh
tổng hợp bacteriocin.
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là protein được tổng hợp ở
riboxom từ các chuỗi peptit hoặc protein ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram
dương [9]. Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn do sự tạo thành các
kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có
khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan làm suy yếu
thành tế bào của vi khuẩn gây hại [7]. Vì vậy bacteriocin có rất nhiều ứng
dụng, trong mỹ phẩm, xử lí môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi, trong y
học và trong công nghệ thực phẩm [4]. Trong y dược, bacteriocin còn được
ứng dụng như một chế phẩm sinh học để điều trị một số bệnh như viêm
đường tiết niệu, hay nhiễm trùng đường tiêu hóa và còn sử dụng trong điều trị
kháng sinh đồ [6]… Trong ngành mỹ phẩm, bacteriocin được sử dụng trong
thành phần của một số loại mỹ phẩm chăm sóc da vì có tính diệt khuẩn và giữ
ẩm. Trong công nghệ thực phẩm, bacteriocin được nghiên cứu và ứng dụng
rộng rãi trong chế biến và bảo quản một số loại thực phẩm như phomat, xúc

xích, sữa chua, một số loại sản phẩm thịt, rau quả đóng hộp [2].
Ở Việt Nam bacteriocin sử dụng trong công nghiệp thực phẩm được sản
xuất chủ yếu bởi các công ty ở Châu Âu, Mỹ và gần đây ở Trung Quốc, có
giá thành rất cao, trong khi ở nước ta có rất nhiều các sản phẩm lên men


2

truyền thống như tương, chao, mắm tôm, dưa muối… Nhận thấy tiềm năng
ứng dụng của Bacteriocin sản xuất từ vi khuẩn LAB nên em chọn tiến hành
nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả
năng sinh bacteriocin cao từ các sản phẩm lên men truyền thống”.
1.2. Mục tiêu của đề tài
Nghiên cứu, tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh
bacteriocin cao từ các sản phẩm lên men truyền thống.
1.3. Yêu cầu của đề tài
- Từ các sản phẩm lên men tự nhiên phân lập chủng LAB có khả năng
sinh tổng hợp bacteriocin.
- Tuyển chọn một số chủng có khả năng sinh bacteriocin cao.
- Nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn kiểm định (Staphylococcus
aureus, Samonella, E coli) của chế phẩm bacteriocin thô.
1.4. Ý nghĩa của đề tài
1.4.1. Ý nghĩa khoa học
Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học vào nghiên
cứu khoa học.
Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý, phân
tích số liệu và trình bày một bài báo cáo khoa học.
1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn
Tuyển chọn được một số chủng LAB có khả năng sinh bacteriocin cao,
giúp làm phong phú thêm bộ sưu tập chủng vi sinh vật sinh chất kháng khuẩn,

tạo ra nhiều sự lựa chọn cho việc tuyển chọn chủng.


3

PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Bacteriocin
Nghiên cứu đầu tiên và lâu đời nhất về bacteriocin là công trình nghiên
cứu của Gratia và cộng tác viên vào năm 1925 về khả năng kháng khuẩn của
Escherichia coli (colicin V) và thuật ngữ bacteriocin không xuất hiện cho đến
những năm 1950. Định nghĩa về bacteriocin đầu tiên đã dựa trên đặc tính của
colicin, đó là một chất sinh tổng hợp gây tử vong, phổ hoạt động hẹp bị giới
hạn ở những loài tương tự như vi khuẩn sản xuất. Ba chủng vi khuẩn Gram
(+) được nghiên cứu cho việc sản sinh bacteriocin lúc bấy giờ là: Bacillus sp;
Listeria sp và Staphylococcus sp. Các nghiên cứu trong những năm 1980 đã
cho thấy có sự gia tăng đáng kể về số lượng các công bố trên bacteriocin. Từ
thời điểm này bắt đầu bùng nổ những nghiên cứu bacteriocin, định hướng như
một chất kháng khuẩn an toàn trong lĩnh vực công nghệ thực phẩm [14, 35].
2.1.1. Khái niệm
Bacteriocin là chất kháng khuẩn có bản chất là peptide hay protein
được tổng hợp trên ribosome ở cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương để
chống lại vi khuẩn khác có quan hệ gần gũi với chúng [35]. Như vậy, loại vi
khuẩn tạo ra bacteriocin nào thì có khả năng kháng lại chính bacteriocin đó.
Ngoài ra không gây ra phản ứng dị ứng trong con người và vấn đề về sức
khỏe, bị phân hủy nhanh bởi enzym proteinase, lipase [27].
2.1.2. Các chủng vi sinh vật sinh bacteriocin
Bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm hoặc vi khuẩn
Gram dương với những đặc điểm :
- Bacteriocin của vi khuẩn gram âm: gồm nhiều loại khác nhau về kích

thước, nguồn gốc chủng vi sinh vật sản xuất, kiểu tác động và cơ chế miễn dịch.


4

Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương
[27].
- Bacteirocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều
như ở vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn gram âm ở chỗ là:
việc tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết vi sinh vật chủ và sự sinh
tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram dương cần nhiều gen hơn ở vi khuẩn
Gram âm [15].
Những nghiên cứu trước đây về bacteriocin chủ yếu tập trung vào vi
khuẩn Gram âm, điển hình là E. coli sinh tổng hợp colicin. Tuy nhiên những
nghiên cứu về bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương cũng
đã được tiến hành và đã có nhiều báo cáo cung cấp những thông tin về vấn đề
này. Ba chủng vi khuẩn Gram dương được nghiên cứu cho việc sản sinh
bacteriocin lúc bấy giờ là Bacillus sp. Listeria sp. và Staphylococcus sp [27].
Ngày nay thì các chủng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin được nghiên
cứu nhiều hơn, do tính ưu việt của bacteriocin này dùng trong bảo quản thực
phẩm là an toàn với người sử dụng, không độc với tế bào nhân chuẩn, bị phân
hủy bởi proteinase trong hệ tiêu hóa nên ít ảnh hưởng đến quần xã sinh vật
trong ruột người [23]. Thêm vào đó chúng hoạt động trong khoảng pH rộng,
chống lại nhiều vi khuẩn gây hư hỏng thực phẩm, cơ chế hoạt động dựa trên
màng tế bào vi khuẩn nên không gây ra tính đề kháng chéo với các kháng sinh
và được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid nên thuận tiện cho thao tác di
truyền [23].
Vi khuẩn lactic từ lâu đã được sử dụng trong thực phẩm vì chúng có
hoạt tính kháng các loại vi sinh vật khác. Đặc tính này là do vi khuẩn lactic
sinh acid hữu cơ và sinh bacteriocin kháng khuẩn kháng nấm [32].

5

2.1.3 Phân loại
Cho đến nay có khoảng 200 loại bacteriocin được xác định, tuy nhiên
việc phân loại các bacteriocin vẫn chưa được xác định rõ ràng và nó vẫn đang
là vấn đề tranh cãi. Các bacteriocin thường được phân loại dựa trên các tiêu
chí khác nhau. Những tiêu chí chính là họ vi khuẩn sản xuất, trọng lượng
phân tử của chúng và cuối cùng là trình tự chuỗi amino acid [27]. Trong đó,
phương pháp phân loại được chấp nhận và sử dụng phổ biến là bacteriocin
được chia thành 4 lớp: lớp I, lớp II, lớp III và lớp IV. Hai nhóm bacteriocin
lớp I và lớp II là đối tượng được tìm hiểu và nghiên cứu nhiều hơn hơn hai
nhóm còn lại.
2.1.3.1. Lớp I
Bacteriocin lớp I hay còn gọi là Lanbiotic là những peptide nhỏ (<5
kDa), bền nhiệt và tác động lên cấu trúc màng. Một bacteriocin của nhóm này
là nisin. Các lantibiotic chia thành 2 phân lớp là Ia và Ib dựa trên sự tương
đồng cấu trúc.
 Phân lớp Ia
Phân lớp Ia gồm các peptide dạng thuôn dài, linh hoạt và tích điện
dương, chúng hoạt động bằng cách kết hợp với các lipid mang điện tích âm
hình thành các lỗ trong màng tế bào chất của các loài vi khuẩn nhạy cảm [42].
Nisin cũng thuộc nhóm này. Đây là một peptide được hình thành bởi 34
amino acid, các loại acid amin phổ biến có trong nisin là lanthionine (Lan),
methyllanthionine (MeLan), didehydroalanine (DHA) và acid didehydro
aminobutyric (Dhb). Nisin có 2 biến thể của nisin được ghi nhận là nisin A và
nisin Z.

6

Hình 2.1: Cấu trúc của nisin ( Nguồn: Ruiz-Larrea và cộng sự, 2005)
Loại bacteriocin này được sản xuất bởi một vài chủng Lactococcus
lactic, được sử dụng như một chất phụ gia trong thực phẩm. Nó có phổ kháng
khuẩn Gram (+) rộng, E. coli và các vi khuẩn Gram (-) khác chỉ bị ảnh hưởng
bởi nisin khi màng ngoài của chúng bị phá hỏng. Nisin được cho là có hoạt
tính kháng khuẩn hiệu quả đối với Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, các tế bào sinh dưỡng của Bacillus spp. và Clostridium spp.
[42]. Chúng được sử dụng chủ yếu trong các thực phẩm đóng hộp và các sản
phẩm từ sữa, đặc biệt trong sản xuất phô mai, nhằm chống lại các vi sinh vật
chịu nhiệt như Bacillus và Clostridium. Nisin cũng được ghi nhận có hiệu quả
chống lại các bệnh viêm vú do vi khuẩn Gram (+) gây ra [11].
 Phân lớp Ib
Phân lớp Ib gồm các peptide có dạng hình cầu, cấu trúc không linh
động, tích điện âm hoặc không tích điện. Chúng thể hiện hoạt động bằng cách
gây ức chế sinh tổng hợp peptidoglycan [12], gây nhiễu với các phân tử
enzyme thiết yếu của vi khuẩn nhạy cảm. Chúng thường hoạt động trong các
phản ứng lên men quan trọng
của vi khuẩn. Nhóm này bao gồm các chất kháng khuẩn như
mersacidine, actagardin, cinnamycin, mutacin A [27].


7

Bảng 2.1: Phân loại bacteriocin theo Jack [28]
Khối
lƣợng
phân tử
(kDa)

Amino
acids

Lantibiotic
Actagardine
Ancovenin
Cinnamycin
Duramycin
Epidermin
Gallidermin
Lanthiopeptin
Mersacidin
Nisin
Pep5
Subtilin

1,9
2,0
2,0
2,0
2,2
2,2
2,0
1,8
3,4
3,5
3,3

19

19
19
19
22
22
19
19
34
34
32

Actinoplanes spp.
Streptomyces spp.
Streptomyces cinnamoneus
Streptomyces cinnamoneus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus gallinarum
Streptoverticullum cinnamoneum
Bacillus sp.
Lactococcus lactis
Staphylococcus epidermidis
Bacillus subtilis

Cystibiotics
Pediocin AcH/PA1
Leucocin A/UAL 187
Mesentericin Y 105
Sakacin A
Sakacin P
Lactacin F

Carnobacteriocin A
Carnobacteriocin BM1
Carnobacteriocin B2
Cerein 7/8

4,6
3,9
3,8
4,3
4,4
5,6
5,1
4,5
4,9
4,9

44
37
37
41
43
57
53
43
48
56

Pediociccus acidilactici H/PAC 1.0
Leuconostoc gelidium UAL 187
Leuconostocmesenteroides Y 105

Lactobacillus sake LB 706
Lactobacillus sake LTH 674
Lactobacillus acidophilus 11088
Carnobacterium piscicola LV 17 A
Carnobacterium piscicola LV 17 B
Carnobacterium piscicola LV 17 B
Bacillus cereus Bc7

Thiolbiotics
Lactococcin B

5,3

47

Lactococcus lactic subsp. cremoris 9 B4

No cysteine
Lactococcin A

5,8

54

4,3
4,4
4,3
4,1

48

47
39
35

Lactococcus lactis subsp. cremoris 9 B4
L. lactis subsp. cremoris LMG 2130
L. lactis subsp. lactis bv. diacetylactis
WM4
L. lactis subsp. cremoris 9 B4
L. lactis subsp. cremoris 9 B4
L. lactis subsp. lactis LMG 2081
L. lactis subsp. lactis LMG 2081

Bacteriocin

Lactococcin Ma
Lactococcin Na
Lactococcin Gαa
Lactococcin Gβa

Vi sinh vật sản xuất


8

2.1.3.2. Lớp II
Còn được gọi là lớp Non-Lanbiotic, bao gồm các bacteriocin có trọng
lượng phân tử nhỏ hơn 10 kDa, bền nhiệt và không chứa lanthionine. Các
bacteriocin nhóm II có thể chia thành 3 phân lớp, bao gồm IIa, IIb và IIc.
 Lớp IIa

Lớp IIa là lớp lớn nhất, gồm các peptide hoạt động chống Listeria, đại
diện đặc trưng cho nhóm này là Leucocin A, pediocin PA-1. Các sakacin A,
sakacin P cũng là đại diện đặc trưng cho nhóm này. Các bacteriocin nhóm
này hoạt động bằng cách phá vỡ tính toàn năng của màng tế bào, làm mất cân
bằng và thất thoát ion phosphate hữu cơ do đó mà tiêu diệt vi khuẩn [27].
Sakacin A là bacteriocin được sản xuất bởi Lactobacillus sakei LB
706, được cấu tạo bởi 41 acid amin (tiền thân là 90 acid amin). Bacteriocin
này là một polypeptide ổn định nhiệt, mang đặc tính di truyền [14].
Sakacin P là một polypeptide nhỏ, ổn định nhiệt, được tổng hợp bởi
ribosome, mang đặc tính di truyền [23], được sản xuất bởi Lactobacillus
sakei LB 673.

Hình 2.2 : Cấu trúc sakacin P
Các bacteriocin này hứa hẹn cho nhiều ứng dụng công nghiệp nhờ vào
hoạt động kháng Listeria mạnh của chúng. Thậm chí chúng còn là các tác
nhân kháng Listeria được chú ý nhiều hơn là bacteriocin lớp I (nisin). Sakacin


9

được ứng dụng trong sản xuất xúc xích, xử lý ở các sản phẩm thịt để giữ được
lâu (như sản phẩm jăm bông và thịt đông lạnh [32]), pho mát, các sản phẩm
lên men acid lactic khác. Ngoài ra, còn được sử dụng để ức chế sự phát triển
của vi khuẩn không mong muốn, có thể là nguyên nhân gây nhớt và gây mùi
ở các sản phẩm.
 Lớp IIb
Lớp IIb hình thành bởi một phức hợp của 2 peptide riêng biệt, những
peptide này ít hoặc không có hoạt động nào và nó không có sự giống nhau
giữa các peptide bổ sung. Các bacteriocin nhóm này có thể hoạt động riêng lẻ,
cũng có thể liên hiệp khi hoạt động cùng nhau (enterocin L50A, L50B) tạo lỗ

trên màng tế bào, hoặc chúng có thể cùng cần thiết cho hoạt động kháng
khuẩn (lactococcins Gα/Gβ, Lactococcins M/N và plantaricins EF, JK). Các
bacteriocin đặc trưng cho nhóm này là lactococcin G, plantaricin EF và
plantaricin JK.
Lactococcin G là một bacteriocin có hoạt động phụ thuộc vào hoạt
động bổ sung của 2 peptide, là lactococcins Gα và Gβ. Lactococcin Gα gồm
có 39 acid amin, còn Lactococcin Gβ gồm có 35 acid amin. Bactericoin này
được sử dụng như một chất bảo quản thực phẩm, có khả năng kháng tế bào vi
khuẩn Lactococcus lactis. Hoạt động diệt khuẩn chỉ xảy ra khi có sự hiện diện
của cả 2 peptid, mặc dù 2 peptide này có khả năng diệt khuẩn độc lập [37].
 Lớp IIc
Lớp IIc là những peptide nhỏ, bền nhiệt, gồm những bacteriocin không
đồng nhất nên phương thức hoạt động của chúng cũng khác nhau. Nhóm IIc
bao gồm tất cả các bacteriocin lớp II không rơi vào nhóm IIa, IIb. Trong phân
lớp này tìm thấy có 2 dạng [27]:
- Chất kháng khuẩn có 1 hoặc 2 gốc cystein (như thiolbiotics có một
và cystibiotics có 2 gốc cystein).
- Kháng khuẩn không có cystein (lactoccin A và acidocin B).


10

Bảng 2.2: Bacteriocin lớp IIc theo phân loại của Klaenhammer [27]

Bacteriocin

Vi sinh vật sản xuất

Khối
lƣợng

phân tử
(Da)

Amino
acid

Gốc
cystein

Cerein 7/8

Bacillus cereus Bc7

4893

56

2

Enterocin B

Entrococcus faecium T136

5465

53

2

5053

53

2

5778

54

0

5328

47

1

Carnobacteriocin A
Lactococcin A

Entrococcus
CECT492

faecium

Carnobacterium piscicola
LV17A

Lactococcin B

Lactococcus
LMG2130

Divergicin Aa

Lactococcus cremoris 9B4

4224

46

2

Acidocin Ba

Lactococcus lactis WM4

5754

59

0

lactis

Carnobacterium divergens
LV13
Carnobacterium
acidophilus M46

2.1.3.3. Lớp III
Lớp này bao gồm những peptide lớn, có trọng lượng phân tử lớn hơn
30 kDa, không bền nhiệt. Nhóm này có thể bao gồm các enzyme ngoại bào
kháng lại các vi khuẩn có thể bắt chước các hoạt động sinh lý của bacteriocin.
Các bacteriocin lớp III cho đến nay chỉ được phân lập từ các thành viên của
giống Lactobacillus [42]. Đại diện cho nhóm này là halveticin J [30] được sản
xuất bởi vi khuẩn L. halveticus 481 và helveticin V, acidifilicin A và lactacin
A, lactacin B được sản xuất bởi L. acidophilus.


11

2.1.3.4. Lớp IV
Hiện nay, có rất ít tài liệu nghiên cứu về nhóm này. Một cách tổng quát
các bacteriocin nhóm IV được định nghĩa là bacteriocin phức tạp có chứa
lipid hoặc carbohydrate moities. Bao gồm các glycoprotein (lactocin 27), hoặc
lipoprotein (lacstrepcins) được quy định bởi non-protein [27].
2.1.4. Tính chất của bacteriocin
2.1.4.1. Tính chất hóa học
Bacteriocin có bản chất là protein, nhưng cũng có thể là hỗn hợp của
protein với các chất khác. Để kiểm tra bản chất protein, người ta sử dụng các
enzyme đặc trưng như proteinase. Dựa vào bảng phân tích hóa học cho thấy
một vài bacteriocin là protein đơn giản. Tuy nhiên, trong khi làm sạch
bacteriocin của Staphylococcus, Clostridium và Lactobacillus cho thấy là
những phân tử phức tạp với thành phần lipid, hydratcarbon và cộng thêm với
protein. Một ví dụ khác về phân tử bacteriocin có nhiều thành phần, streptocin
STH1 là một trong những phân tử phức tạp bao gồm protein, lipid và nhóm
gốc phosphate [41, 13].
2.1.4.2. Tính chất vật lý
Các đặc tính lý học về độ bền nhiệt, pH hoạt động và khả năng bị thủy

phân bởi enzym của một số bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic
được thể hiện trong Bảng 2.3.


12

Bảng 2.3: Độ bền nhiệt, pH và enzym thủy phân của một số bacteriocin
sinh tổng hợp bởi vi khuẩn lactic [26]
Bacteriocin

Độ bền nhiệt

Megacin A-216

600C, 30 phút

2

–7

Clostosin A

1000C, 30 phút

4

–9

Clostosin B

800C, 10 phút

4

–9

Clostosin C

800C, 10 phút

4

–9

Clostosin D

1000C, 30 phút

4

–9

Boticin E-S5

1000C, 10 phút

1,1

– 9,5

Bioticin P

600C, 30 phút

6,5

– 7,5

Butyricin 7423
Perfringocin
11105

1000C, 10 phút

2 – 12

Enzym thủy phân
bacteriocin
Chymotrypsin, Pepsin,
Trypsin
Trypsin,Chymotrypsin,
Dnaza,
Pronaza P, Rnaza
Trypsin, Chymotrypsin,
Dnaza,
Pronaza P, Rnaza
Trypsin, Chymotrypsin,
Dnaza,
Pronaza P, Rnaza
Trypsin, Chymotrypsin,

Dnaza,
Pronaza P, Rnaza
Trypsin, Chymotrypsin,
Dnaza,
Pepsin
Trypsin, Rnaza,
Alkalinphotphataza,
Photpholipaza C, D
Trypsin

1000C, 30 phút

2 – 12

Trypsin

pH hoạt động


13

2.1.4.3. Tính miễn dịch
Bacteriocin có khối lượng phân tử lớn, thành phần cấu tạo là protein và
nhiều bacteriocin có tính kháng nguyên cao. Tuy nhiên, hiện nay chỉ có duy
nhất một vài bài báo cáo nghiên cứu tính kháng nguyên của bacteriocin sinh
bởi vi khuẩn Gram dương. Megacin A-216 là một kháng nguyên và tế bào
cũng sinh ra một kháng thể có khả năng chống lại ảnh hưởng giết chính nó.
Việc nghiên cứu những kháng thể đến bacteriocin trong huyết thanh của con
người có lẽ là một lĩnh vực thú vị cho những nghiên cứu sau này.
Một thuộc tính cần thiết để bảo đảm sự sống sót của vi sinh vật sinh

bacteriocin là có sự miễn dịch đặc biệt. Theo Koponen (2004) tế bào vi khuẩn
có một số cơ chế miễn dịch, đây là khả năng của tế bào trong việc bảo vệ
chính nó để chống lại bacteriocin sinh ra bởi sự trao đổi của chính mình.
Cả cấu tạo thành tế bào và thành phần cấu tạo màng lipid của vi khuẩn
cho thấy sự liên quan đến hoạt động của bacteriocin cũng như sự kháng cự
bacteriocin. Sự biến đổi nhạy cảm của vi khuẩn Gram dương về phía những
bacteriocin đáng kể. Hoạt động kìm hãm của bacteriocin có thể thay đổi giữa
những gen khác nhau, những loài cùng bộ gene và thậm chí đến môi trường
nuôi cấy từ những điều kiện ngoại cảnh khác.
Có hai kiểu miễn dịch được thấy ở Lantibiotic. Một kiểu miễn dịch dựa
vào protein miễn dịch đặc trưng LanI. Trong khi kiểu miễn dịch khác dựa vào
vật chuyên chở nhiều thành phần riêng biệt (Lan EFG). Bacteriocin sẽ
nhận biết được những vi sinh vật sinh bacteriocin nhờ sự không có mặt
của những thụ thể đặc biệt và kết quả là chúng không bám được vào tế bào vi
sinh vật đó [15].


14

2.1.5. Cơ chế hoạt động
2.1.5.1. Phạm vi hoạt động
Phạm vi hoạt động của bacteriocin được xem xét dựa trên phạm vi
kháng khuẩn, giống vi sinh vật sinh ra, khối lượng phân tử, tính ổn định, tính
chất hóa sinh và kiểu hoạt động của bacteriocin. Hầu hết các bacteriocin được
tổng hợp bởi vi khuẩn Gram âm có hoạt tính ức chế các loài cùng họ hàng.
Đối với bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn Gram dương có hoạt tính
ức chế các loài vi khuẩn Gram dương đôi khi nó cũng ức chế một số loài vi
khuẩn Gram âm.
2.1.5.2. Cơ chế hoạt động
Bacteriocin có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn khác do sự tạo thành các

kênh làm thay đổi tính thấm của màng tế bào, nhiều loại bacteriocin còn có
khả năng phân giải DNA, RNA và tấn công vào peptidoglycan để làm suy
yếu thành tế bào.
Một loại bacteriocin là Lacticin 3147 có tác dụng diệt khuẩn trên những
tế bào nhạy cảm bởi sự tương tác đầu tiên với thành tế bào. Đó là nguyên
nhân mà trên màng tế bào tạo ra những kênh cho K+ và phosphate vô cơ đi ra
khỏi tế bào. Trong sự nổ lực để tái tích lũy lại những ion này, các ATP sẽ bị
thủy phân. Khi ATP được yêu cầu cho sự duy trì của những chức năng quan
trọng trong tế bào, như gradient pH tại màng tế bào, thì đã không còn nữa,
những chức năng sẽ bị phá vỡ và tế bào dần mất năng lượng và chết [9, 20].


15

Hình 2.3: Cơ chế hoạt động của bacteriocin(Nguồn Fidel Toldrá, 2009)
2.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp Bacteriocin
2.1.6.1. Gene và sinh tổng hợp
Bacteriocin được tổng hợp với ribosome. Gen mã hóa cho sản xuất và
miễn dịch của bacteriocin thường được tổ chức thành các operon cluster.
Nhóm gene bacteriocin có thể được định vị trên nhiễm sắc thể (subtilin và
mersacidin), cũng có thể được định vị trên plasmid (divergicin A và sakacin
A), hay là trên transposon (nisin và lacticin 481) [19].
Operon sinh tổng hợp lantibiotic thường chưa gen mã hóa trên tiền
peptide, enzyme chịu trách nhiệm cho các phản ứng biến đổi, quá trình phân
hủy protein chịu trách nhiệm tách rời peptide chỉ đạo, ABC (ATP – binding
cassette), họ protein vận chuyển bao gồm protein vận chuyển peptide, protein
điều hòa, và các protein tự bảo vệ tế bào sản xuất. Peptide chỉ đạo có một vai
trò rất quan trọng, nó giữ cho tiền peptide ở dạng bất hoạt trong tế bào, phát ra
tín hiệu vận chuyển lantibiotic ra khỏi tế bào, chứa các trình tự đặc biệt chỉ
đường cho enzyme sinh tổng hợp đi tới nơi thích hợp để thực hiện sự biến đổi

các amino acid và ổn định hình dạng của domain propeptide [19, 31].


16

Gene mã hóa cho sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II như lactococcin
A, B, và M, pediocin PA – 1/AcH, và plantaricin A có nhiều điểm giống nhau
trong tổ chức gen, bao gồm một gen cấu trúc mã hóa cho tiền peptide, theo
sau bởi một gen miễn dịch, gen để vận chuyển và protein phụ thêm. Một số
trường hợp đã tìm ra được gen điều hòa, các protein phụ thêm là rất cần thiết
để các bacteriocin nhóm II được xuất ra. Không có bản sao nào của các
protein phụ thêm ở lantibiotic được tìm thấy [17, 19].
Sự tạo các bacteriocin vi khuẩn G+ thường cần nhiều gen, ví dụ như
cụm gen tạo nisin:
- Nis A: prepeptid.
- Nis B, nis C: enzyme biến đổi amino acid.
- Nis P: cắt các peptide leader.
- Nis L, nis FEG: miễn dịch.
- Nis R, nis K: điều hòa và biểu hiện [19].
2.1.6.2. Cơ chế
Hầu hết các bacteriocin được tổng hợp như là các tiền peptide ở dạng
bất hoạt mang một peptide chỉ đạo có đầu N gắn với tiền peptide tại đầu C.
Đối với lantibiotic, gốc serine, threonine, và cystein trong phần tiền peptide
phải trải qua bước kéo dài biến đổi sau dịch mã để hình thành Lan/MeLan.
Con đường sinh tổng hợp của lantibiotic đi theo một kế hoạch chung: hình
thành tiền peptide, phản ứng biến đổi, phản ứng tách rời phân hủy peptide chỉ
đạo và di chuyển tiền peptide đã được biến đổi hay tiền peptide trưởng thành
xuyên qua màng tế bào chất. Sự tách rời peptide chỉ đạo có thể diễn ra trước,
trong suốt quá trình hay sau khi xuất ra khỏi tế bào. Trong sản xuất lantibiotic
nhóm I, như trong trường hợp của nisin, epidermin, subtilin, và Pep5, phản

ứng dehydrate có lẽ được xúc tác bởi Lan B [19].


17

Bacteriocin nhóm II được sinh tổng hợp như là một tiền peptide có
chứa một trình tự chỉ đạo đầu N bảo tồn và một điểm làm phân tách protein,
với ngoại lệ là bacteriocin nhóm IIc, được sản xuất với trình tự đơn đầu N
điển hình dạng sec và được tiến hành thông qua một con đường còn chưa
được biết rõ. Không giống như lantibiotic, bacteriocin nhóm II không trải
qua quá trình biến đổi sau dịch mã. Sau khi hình thành tiền peptide, tiền
peptide được tách khỏi peptide chỉ đạo đồng thời với việc được xuất ra khỏi
tế bào [19].
Peptide chỉ đạo có một vùng nhận biết điều khiển tiền peptide trong suốt
quá trình trưởng thành, và protein vận chuyển, bảo vệ chủng hoang dại bằng
cách giữ lantibiotic ở trạng thái không có hoạt tính khi nó ở bên trong sinh vật
sản xuất và tương tác với domain tiền peptide để chắc chắn rằng có một cấu
hình phù hợp cần thiết cho tương tác enzyme – cơ chất [17, 19].
2.1.6.3. Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin [17,19]
Hầu hết các bacteriocin hoạt động bằng cách tạo kênh hay lỗ trên
màng làm phá hủy năng lượng hữu ích của tế bào sống. Các bacteriocin của vi
khuẩn G+ thường không có receptor đặc hiệu để hút bám mặc dù vẫn có
những ngoại lệ. Hoạt động khác với vi khuẩn G- ở hai điểm sau:
- Việc tạo bacteriocin thì không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật
sản xuất, sự khác biệt này là do cơ chế vận chuyển để giải phóng
bacteriocin. Ở một vài vi sinh vật thì phụ thuộc vào hệ thống tiết. Ngoài
ra, ở vi khuẩn G+ có sự điều hòa đặc hiệu bacteriocin nên các bacteriocin
chỉ dựa vào hệ thống điều hòa của tế bào chủ.
- Hầu hết các bacteriocin kích thước nhỏ hoạt động trong phạm vi pH
rộng từ 3 – 9, thậm chí acidocin B có thể hoạt động ở pH 11, ở điểm đẳng

điện cao cho phép chúng tương tác với bề mặt diện tích âm của màng tế bào
vi khuẩn. Đối với bacteriocin phổ kháng khuẩn rộng các hợp chất cần thể