Tạo dòng gen mã hóa endo β 1,3 glucanase từ vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens vào hệ thống vector pgem® t

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DỊNG GEN MÃ HĨA ENDO-β-1,3-GLUCANASE TỪ VI
KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens VÀO HỆ THỐNG VECTOR
PGEM®-T

NGUYỄN THỊ PHƯỢNG

Đà Nẵng, năm 2023


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DỊNG GEN MÃ HĨA ENDO-β-1,3-GLUCANASE TỪ VI
KHUẨN Bacillus amyloliquefaciens VÀO HỆ THỐNG VECTOR
PGEM®-T

Ngành

: Cơng nghệ sinh học

Khóa

: 2019-2023

Sinh viên

: Nguyễn Thị Phượng

Người hướng dẫn: ThS. Vũ Đức Hoàng

Đà Nẵng, năm 2023


LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào
khác.
Người cam đoan

Nguyễn Thị Phượng

i


LỜI CẢM ƠN

Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến ThS.
Vũ Đức Hoàng và TS. Nguyễn Đức Huy đã tận tình giúp đỡ, truyền đạt kiến thức và tạo mọi
điều kiện tốt nhất trong suốt quá trình thực hiện và hồn thành khóa luận.

Tơi xin chân thành cảm ơn Cử nhân Lê Thị Nhật Anh đã tận tình giúp đỡ và truyền đạt
kinh nghiệm cho tơi trong q trình nghiên cứu.
Tôi xin gửi lời cảm ơn các thầy cô giáo trong Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại
học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng đã giúp đỡ, hỗ trợ tạo mọi điều kiện tốt nhất để thực hiện đề
tài và đã tận tình giảng dạy, truyền đạt kiến thức cho tôi học tập trong 4 năm đại học.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ động viên tôi
trong suốt thời gian làm khóa luận.
Tơi xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, ngày tháng năm 2023
Sinh viên

Nguyễn Thị Phượng

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN.................................................................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................................................... ii
MỤC LỤC .......................................................................................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................................................................... v
DANH MỤC HÌNH ẢNH .................................................................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ..............................................................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................................................................1
2. Mục tiêu đề tài ................................................................................................................................................2
3. Ý nghĩa đề tài ...................................................................................................................................................2
3.1. Ý nghĩa khoa học...........................................................................................................................................2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn ..........................................................................................................................................2

4. Nội dung nghiên cứu .......................................................................................................................................2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU......................................................................................................................3
1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens .....................................................................................................3
1.2. Tổng quan về β-1,3-glucanase......................................................................................................................4
1.2.1.

Đặc điểm và cấu trúc phân tử của β-glucan ........................................................................................4

1.2.2. Hoạt tính phân giải β-1,3-glucan của β-1,3-glucanase ..............................................................................4
1.2.3. Nguồn gốc và phân loại endo β-1,3-glucanase .........................................................................................4
1.2.4. Ứng dụng endo β-1,3-glucanase ...............................................................................................................5
1.3. Kỹ thuật tạo dịng gen ngoại lai ...................................................................................................................8
1.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới ............................................................................................ 11
1.4.1. Trong nước ............................................................................................................................................. 11
1.4.2. Trên thế giới ........................................................................................................................................... 13
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................................. 16
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ............................................................................................................. 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................................................................ 16
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu ................................................................................................................................ 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................................................... 16
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ B. amyloliquefaciens .................................................................................. 16
2.2.2. Phân lập và giải trình tự gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase ................................................................. 17
iii


2.2.3. Tạo dịng gen endo-β-1,3-glucanase vào hệ thống vector pGEM®-T..................................................... 18
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................................................................. 21
3.1. Tách chiết DNA tổng số ............................................................................................................................. 21
3.2. Khuếch đại PCR gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase .................................................................................. 21
3.3. Tạo dịng gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase vào hệ thống vector pGEM®-T........................................... 26

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................................................................. 30
1. Kết luận......................................................................................................................................................... 30
2. Kiến nghị ....................................................................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................................................... 31
PHỤ LỤC ......................................................................................................................................................... 37

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene diamine tetra-acetic acid

GH

Glycosyl hydrolase

LB

Luria bertani (môi trường Luria bertani)

NCBI

National Center for Biotechnology Information (Trung tâm thông tin
công nghệ sinh học Quốc gia Hoa Kỳ)

PCI

Phenol : chloroform : isoamylalcohol

PCR

Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

TAE

Tris-acetate-EDTA

TE

Tris-EDTA

v


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1.

Cấu trúc phân tử của β-glucan Cấu trúc glucan

4

1.2.

Enzyme thủy phân β-1,3-glucanase

4

1.3.

Mơ hình plasmid sử dụng cho cloning

9

2.1.

Vector pGEM®-T

16

3.1.

Hình ảnh điện di DNA tổng số của chủng B. amyloliquefaciens

21

3.2.

Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại PCR gen mã hóa endo-β-1,3-

22

glucanase
3.3.
3.4.

Hình ảnh điện di sản phẩm tinh gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase

23

Trình tự amino acid suy diễn gen endo-β-1,3-glucanase của chủng

24

B. amyloliquefaciens
3.5.

Mơ hình cấu trúc khơng gian 3 chiều của từ chủng B.

24

amyloliquefaciens
3.6.

Kết quả so sánh trình amino acid suy diễn gen mã hóa endo-β-1,3-

25

glucanase của chủng B. amyloliquefaciens với Bacillus halotolerans
Y6 (mã số: MH643779.1)
3.7.

Kết quả kiểm tra khả năng biến nạp và chất lượng của tế bào E. coli

26

DH5α khả biến
3.8.

Thể biến nạp trên môi trường LB rắn có bổ sung ampicillin

27

3.9.

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR các khuẩn lạc màu trắng trên đĩa

27

môi trường chọn lọc
3.10.

Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pGEM®-T/endo-β-1,3glucanase

vi

28


TÓM TẮT

Endo-β-1,3-glucanase thu hút được nhiều nhà nghiên cứu nhờ ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực. Đặc biệt, enzyme endo-β-1,3-glucanase có khả năng phân giải β-1,3-glucan
thành 1-3-β- d -glucan oligosaccharid với đặc tính điều hịa miễn dịch và chống khối u. Chính
vì thế, enzyme này ngày càng thu hút được sự chú ý của các nhà khoa học. Trong nghiên cứu
này, gen mã hóa cho endo-β-1,3-glucanase từ chủng B. amyloliquefaciens được tạo dòng sử
dụng cặp mồi thiết kế dựa trên trình tự của gen endo-β-1,3-glucanase từ chủng Bacillus
halotolerans Y6 (mã số: MH643779.1). Sản phẩm khuếch đại được gửi xác định trình tự. Kết
quả giải trình tự gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase có kích thước 732 bp. Đoạn chèn endo-β1,3-glucanase được gắn vào pGEM®-T và biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt vào E. coli
DH5α. Kết quả biến nạp được kiểm tra bằng cách PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi của gen mục
đích và cắt bằng enzyme giới hạn BstXI. Kết quả cho thấy đã tạo dịng thành cơng gen mã hóa
endo-β-1,3-glucanase từvi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens vào hệ thống vector pGEM®-T.

vii


MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
β-1,3-glucan là một polysaccharide phổ biến rộng rãi trong vi sinh vật, nấm và thực vật
(Wu & cs, 2021). Do cấu trúc đặc biệt, β-1,3-glucan có nhiều chức năng sinh học khác nhau.
Tuy nhiên, khả năng hòa tan của β-1,3-glucan là rất thấp do có khối lượng phân tử cao dẫn tới
khó hấp thu, hoạt tính sinh học thấp và khó áp dụng rộng rãi ở quy mô công nghiệp. Gần đây,
một số nghiên cứu đã cho thấy β-1,3-glucan có khối lượng phân tử thấp và tan trong nước có

hoạt tính sinh học cao hơn so với β-1,3-glucan có khối lượng phân tử cao (Byun & cs., 2008).
Nhiều phương pháp lý học, hóa học và sinh học đã được áp dụng để làm ngắn mạch polymer
này. Sử dụng enzyme đặc hiệu β-1,3-glucanase thủy phân β-1,3-glucan thành các polymer
ngắn hoặc các oligomer là phương pháp sinh học thân thiện mơi trường, an tồn, hiệu quả. Vì
thế các enzyme β-1,3-glucanase đã và đang thu hút được sự quan tâm lớn của các nhà khoa
học.
β-1,3-glucanase thuộc nhóm O-glycosyl hydrolase, một enzym quan trọng trong q
trình chuyển hóa carbohydrate. Có nhiều β-1,3-glucanase đã được tinh chế và đặc trưng từ các
loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm Bacillus (Yamamoto & Horikoshi,1993), Paenibacillus
(Hong & Meng, 2003), Micromonospora (Gacto & cs, 2000), Streptomyces (Shi & cs, 2010)
và Cellulosimicrobium (Tanabe & Oda, 2011). β-1,3-Glucanase có thể thủy phân các β-1,3glucans, như một biện pháp bảo vệ chống lại nấm bệnh trên thực vật, cũng như ngăn chặn sự
phát triển của nấm trong công nghệ lên men (Lee & cs, 2012; Jadhav & Gupta, 2016).Dựa
trên cơ chế thủy phân cơ chất, β-1,3-glucanase được phân loại thành hai loại: exo-1,3-β-Dglucanase (EC 3.2.1.58) và endo-1,3-β-D-glucanase (EC 3.2.1.6 và EC 3.2.1.39). Exo-1,3-βD-glucanase thủy phân glucan bằng cách cắt liên tiếp dư lượng glucose ở đầu không khử và
sản phẩm thu được chủ yếu là glucose. Trong khi đó, endo-1,3-β-D-glucanase xúc tác q
trình thủy phân các liên kết β-1,3-glucosidic bên trong tại các vị trí ngẫu nhiên và giải phóng
các oligosaccharide ngắn với đặc tính điều hòa miễn dịch và chống khối u bởi enzyme endoβ-1,3-glucanase (Hida & cs, 2009; Fu & cs, 2015).
1


Tiềm năng ứng dụng của β-1,3-glucanase là rất lớn, đặc biệt là endo-β-1,3-glucanase.
Do đó, cần có phương pháp thích hợp để sản xuất chúng ở quy mô công nghiệp. Các nghiên
cứu sâu hơn là cần thiết để tạo điều kiện cải thiện sản xuất endo-β-1,3-glucanase. Trong đó,
cơng nghệ DNA tái tổ hợp với việc chọn lọc các gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase từ Bacillus
amyloliquefaciens để tạo dòng và biểu hiện trong các vật chủ thích hợp nhằm tạo ra một lượng
lớn endo-β-1,3-glucanase tái tổ hợp có hoạt tính cao được coi là phương thức có triển vọng và
khả thi.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tạo dịng gen mã hóa endoβ-1,3-glucanase từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens vào hệ thống vector pGEM®-T”.
2. Mục tiêu đề tài
Tạo dịng thành cơng gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase từ Bacillus amyloliquefaciens
vào hệ thống vector pGEM®-T.

3. Ý nghĩa đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về quy trình tạo dịng gen mã
hóa endo-β-1,3-glucanase từ vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens góp phần làm phong phú
hơn cơ sở dữ liệu về tạo dòng gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả là cơ sở để tạo nguồn nguyên liệu di truyền cho những nghiên cứu tiếp theo sâu
hơn về tạo dòng biểu hiện và biểu hiện gen endo-β-1,3-glucanase, từ đó nghiên cứu ứng dụng
sản xuất endo-β-1,3-glucanase quy mơ phịng thí nghiệm.
4. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và giải trình tự gen mã hóa endo-β-1,3-glucanase từ vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens
- Tạo dịng gen endo-β-1,3-glucanase vào vector pGEM®-T và biến nạp vào E. coli
DH5α.

2


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tổng quan về Bacillus amyloliquefaciens
Phân loại theo khóa phân loại của Bergey (Buchanon và cs, 1989):
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus amyloliquefaciens
Vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens là một loại vi khuẩn mới được phát hiện gần

đây, thuộc loại vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng sinh acid từ aesculin,
amygdalin, arbutin,... (Wang và cs, 2008). Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra tiềm năng kiểm sốt
sinh học của B. amyloliquefaciens thơng qua bốn cơ chế chính: kháng sinh qua trung gian
chất chuyển hóa kháng khuẩn, sản xuất các hormone tăng trưởng dễ hấp thu chất dinh dưỡng
cạnh tranh dinh dưỡng với các vi sinh vật khác và sản sinh các hợp chất để bay hơi cùng với
các hợp chất lipopeptide bề mặt (Adetomiwa Ayodele Adeniji và cs, 2019). Nhiều chủng
của loài này đã được báo cáo là ngăn chặn sự phát triển của mầm bệnh vi sinh vật, bao gồm
vi khuẩn, nấm và tuyến trùng.
Vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh nhiều enzyme ngoại bào: amylase, protease,
cellulose, lipase, chitinase...vì vậy chúng rất có tiền năng ứng dụng rất lớn trong công
nghiệp, xử lý môi trường,…
Nhiều chủng Bacillus đã được khai thác mạnh mẽ để lên men sản xuất các enzyme
công nghiệp, vitamin, kháng sinh và các sản phẩm giá trị khác. Lên men sử dụng các chủng
Bacillus, chẳng hạn như B. subtilis, B. licheniformis và B. pumilus chiếm ưu thế trong sản
xuất protease chất tẩy rửa công nghiệp. Một trong những lợi thế của enzyme được sản xuất
từ Bacillus là khả năng chịu nhiệt của nó ở nhiệt độ làm việc cao. Ví dụ, protease kiềm do
B. clausii tạo ra có nhiệt độ tối ưu khoảng 60°C, trong khi một α-amylase được tổng hợp từ
3


B. licheniformis hoạt động ở 90°C và chịu được tới 110°C, chitinase được tạo ra bởi B.
subtilis SL13 có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 55oC, chitinase từ vi khuẩn B. thuringiensis
HBK-51 hoạt động tốt nhất ở 110ºC và được coi là một loại enzyme chịu nhiệt (Kuzu và cs,
2012). Biến đổi gen cho phép các chủng Bacillus tái tổ hợp có khả năng biểu hiện tối ưu các
enzyme quan tâm và do đó cải thiện khả năng sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp và
protein dị loại (Du và cs, 2011).
1.2. Tổng quan về β-1,3-glucanase
1.2.1. Đặc điểm và cấu trúc phân tử của β-glucan
β-glucan là một biopolymer của 1,3-D-glucose (hoặc 1,6-D-glucose). β-glucan bao
gồm những liên kết không phân nhánh của liên kết -1,3 và liên kết -1,4-glucopyranose tạo

nên các chuỗi polysaccharide, chứa khoảng 250.000 phân tử glucose.

(b)

(a)

Hình 1.1. Cấu trúc phân tử của β-glucan Cấu trúc glucan. (a) Cấu trúc hóa học; (b) Cấu
trúc khơng gian của phân tử β-glucan
1.2.2. Hoạt tính phân giải β-1,3-glucan của β-1,3-glucanase
Sự phân giải β-1,3-glucan đòi hỏi sự hoạt động phối hợp của một nhóm enzyme được
gọi tên chung là β-1,3-glucanase, các phản ứng phối hợp đó nhằm thủy phân cầu nối 1,3-D–
glycoside trong các phản ứng β-1,3-glucan tạo ra các đơn vị oligosaccharide và glucose.

Hình 1.2. Enzyme thủy phân β-1,3-glucanase
1.2.3. Nguồn gốc và phân loại endo β-1,3-glucanase
β-1,3-glucanase thuộc nhóm O-glycosyl hydrolase, là loại enzyme tham gia xúc tác
quá trình thủy phân phân các liên kết β-1,3-glucoside của các phân tử β-glucan ở dạng không
4


hòa tan trong nước và một số cơ chất tương tự khác thành các oligosaccharide hòa tan (Wu
& cs, 2021). β-1,3-glucanase hiện diện nhiều trong vi khuẩn, nấm, thực vật và động vật biển.
Theo sự phân kỳ của trình tự axit amin, β-1,3-glucanase từ thực vật được chia thành họ
glycosyl hydrolase (GH) 17 trong khi các enzym của vi khuẩn được xếp vào họ GH16
(Henrissat, 1991). β-1,3-glucanase được tổng hợp trong thực vật được đánh dấu vì tác dụng
bảo vệ thực vật chống lại nấm bệnh. Ngoài ra, chúng cũng đóng vai trị trong các q trình
sinh học và phát triển bình thường ở thực vật và nấm. Ở vi khuẩn, β-1,3-glucanase tham gia
vào quá trình phân hủy polysaccharid được sử dụng như một nguồn dinh dưỡng (De La Cruz
& cs, 1995; Liu & cs, 2010).
Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật được xem là có nhiều ưu điểm nổi

bật so với động vật và thực vật. Vì thế, chúng được sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất
các chế phẩm enzyme. Trước hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme
với số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo ra được. Chu
kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ). Vi sinh vật sinh trưởng và phát triển
với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong
tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi
cao. Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác. Đối
với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme (Nguyễn
Lân Dũng, 2000).
Dựa trên cơ chế thủy phân cơ chất, β-1,3-glucanase được phân loại thành hai loại
exo-β-1,3-glucanase (EC3.2.1.58 ) và endo-β-1,3-glucanase (EC3.2.1.6 hoặc EC3.2.1.39)
(Hong & Meng, 2003). Exo-β-1,3-glucanase thủy phân glucan bằng cách cắt liên tiếp dư
lượng glu cose ở đầu không khử, và sản phẩm thu được chủ yếu là glucose. Endo β-1,3glucanase phân cắt các liên kết β-1-3 glycosidic một cách ngẫu nhiên dọc theo chuỗi βglucan, và sản phẩm cuối cùng chủ yếu là oligosaccharide (Giese, & da Silva, 2011). Trình
tự axit amin của endo β-1,3-glucanase có ba miền: trình tự đầu tận cùng N, trình tự đầu C
giàu cysteine và một trình tự khơng xác định.

1.2.4. Ứng dụng endo β-1,3-glucanase
Glucanase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: công nghiệp
thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ,
công nghiệp giấy và bột giấy.
5


Trong công nghiệp thực phẩm: sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong
những phương hướng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước uống không
cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào thịt quả và các chất sơ có
bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục. Glucanase thường được
sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch
quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong. Glucanase kết hợp với các
hemicellulase, pectinase trong chế phẩm enzyme Viscozyme L của hãng NOVOZYMES

(Mỹ) được ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ màng tế bào đậu tương (Đặng Thị Thu và cs,
2004). Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngồi các thành phần đường, protein cịn
có một lượng không nhỏ các phân tử khối lượng cao như cellulose và β-glucan, làm ảnh
hưởng xấu đến quá trình lọc và chất lượng sản phẩm. Người ta thường sử dụng β-glucanase
để loại bỏ những thành phần này. Các chế phẩm như Finizyme gồm các cellulase từ
Aspergillus niger, β-glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã
được sử dụng trong sản xuất bia. Ngoài ra, glucanase cịn được sử dụng trong cơng nghệ
sản xuất bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicolainsolens
được ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho bánh mỳ. Glucanase
từ Trichoderma reesei, A. niger được ứng dụng trong sản xuất fructooligosaccharide. Đây
là một trong số các oligosaccharide chức năng (prebiotic) được sản xuất để bổ sung vào
khẩu phần ăn. Prebiotic có nhiều lợi ích về mặt dược phẩm cũng như có ảnh hưởng tốt đến
sức khỏe. Khi được bổ sung vào cơ thể người và động vật, prebiotic có nhiều tác động sinh
lý quan trọng như: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh, bảo vệ các
chức năng của gan, làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh, tăng khả năng miễn dịch
của cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát triển của các vi sinh vật trong khoang
miệng (Hsu và cs, 2004). Các phế phụ phẩm nơng nghiệp như lõi ngơ, bã mía, bã sắn, vỏ
trấu là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất các oligosaccharide. Các enzyme tốt nhất sử dụng
cho q trình này chủ yếu có nguồn gốc từ nấm mốc. Hiện nay, nhu cầu sử dụng các
oligosaccharide ở các nước trên thế giới là rất lớn. Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về các
oligosaccharide vào khoảng 1000 - 2000 tấn/năm (Nakakuki, 2003).
Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc: thức ăn gia súc, gia cầm được chế biến từ
các loại ngũ cốc có chứa nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này thường khơng
được tiêu hóa triệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày. Do đó chúngđã hạn chế sự hấp thu
các chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung β-glucanase vào
6


thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên, giải phóng glucose và các
oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp thu và chuyển hóa thức ăn (Đặng Thị

Thu và cs, 2004). Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung glucanase độc lập hoặc kết hợp
với các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi làm tăng đáng kể tốc độ tăng trưởng và giảm
thiểu bệnh tật cho vật nuôi. Omogbenigun và cs (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợp chế
phẩm β-glucanase và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase)
xử lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng tiêu hóa so với đối
chứng (là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme) như sau: khả năng tiêu hóa tinh bột tăng
87- 94%, các polysaccharide khác tăng 10 - 18%, phytate tăng 59 - 70%. Tiềm năng ứng
dụng to lớn của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sự quan tâm của nhiều công ty chế
biến thức ăn gia súc, gia cầm. Một số chế phẩm là tổ hợp các enzyme khác nhau có thể kể
đến như: Rovazyme G2 (DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 3 loại
enzyme (cellulase, β-glucanase và xylanase); Roxazyme G (DSM Nutritional Products Ltd,
Thụy Sỹ) là tổ hợp của 7 loại enzyme (cellulase, glucanase, protease, amylase, pectinase,
xylanase, hemicellulase); Natugrain (tập đoàn BASF, Đức) là hỗn hợp của endoxylanase và
endo-glucanase; Rhodizyme-CF (Rampart-Power Bangladesh Ltd) là tổ hợp của 5 loại
enzyme (cellulase, amylase, protease, lipase, pectinase). Chế phẩm SSF của Mỹ hiện đang
bán tại thị trường Việt Nam là tổ hợp của 6 loại enzyme: β-glucanase, phytase, α-amylase,
pectinase, protease và xylanase (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2006).
Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ: sử dụng glucanase xử lý nguyên liệu
giàu cellulose, glucan trước khi lên men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung
bình là 1,5%. Nhiều chế phẩm enzyme đã được sử dụng trong ngành cơng nghiệp này như
Neutrase có chứa β-glucanase sử dụng trong công nghiệp sản xuất ethanol. Đồng thời, nhiều
chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium sinh tổng hợp glucanase được sử dụng trong
công nghệ lên men sản xuất dung môi hữu cơ, acetic acid (Cheryan MS và cs, 1997), sản
xuất acetone, butanol và isopropanol (Dürre P, 1998).
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy: trong công nghiệp sản xuất giấy và bột
giấy, nguyên liệu ban đầu được nghiền cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ được tách
riêng khỏi nhau chuyển thành bột giấy chứa các sợi và bột mịn. Trong quy trình sản xuất
giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy, cịn cellulose thì được giữ lại. Phương pháp thơng
thường là bổ sung dung dịch chlor hoặc chlor diocide. Đây là một phương pháp tốn kém và
thường gây ô nhiễm môi trường do thành phần chlor tồn dư trong nước thải. Vì thế, trong

7


những năm gần đây một giải pháp mới được đưa ra để thay thế phương pháp truyền thống,
đó là sử dụng các chế phẩm enzyme trong đó có glucanase để xử lý bột giấy. Glucanase
thường được bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi
cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền
cơ học. Đồng thời xử lý glucanase trước khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ làm phá
vỡ lớp vỏ ngồi của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ, tăng
hiệu quả khử lignin (Hồ Sỹ Tráng, 2006). Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, glucanase
được sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng đầy hứa hẹn
cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh (Howard và cs, 2003).
1.3. Kỹ thuật tạo dịng gen ngoại lai
Đây là q trình hình thành một dòng tế bào chứa một hay nhiều bản sao của DNA
mục tiêu ở dạng tái tổ hợp với một vector. Mục đích của tạo dịng nhằm thu nhận lượng lớn
và tinh sạch DNA mục tiêu, thu nhận dòng tế bào biểu hiện gen mục tiêu…Các bước cơ bản
trong tạo dòng là: Đầu tên thu nhận và xử lý DNA mục tiêu. Tiếp theo chọn và xử lý vector
phù hợp. Sau đó tạo vector tái tổ hợp bằng các nối gen mục tiêu vào vector nhận. Đưa vector
tái tổ hợp vào dịng tế bào chủ và sau đó tiến hành sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ
hợp.
Plasmid: được dùng phổ biến và thực hiện trong các phịng thí nghiệm về sinh học
phân tử. Trong tự nhiên plasmid có nhiều dạng có kích thước khác nhau từ vài ngàn cặp
base tới vài trăm kilobase. Thường các plasmid dùng trong cloning có kích thước từ 2 – 5
kb. Plasmid là phân tử DNA vịng, xoắn đơi độc lập với tế bào vi khuẩn. Chúng có khả năng
mang một hoặc nhiều gen, thường là gen có ích cho vi khuẩn như ampicillin giúp cho vi
khuẩn tồn tại trên mơi trường có kháng sinh này. Và đây cũng được xem như một dấu hiệu
để chọn lọc hay đặc điểm xác nhận sự hiện diện của gen ngoại lai.

8

Hình 1.3 . Mơ hình plasmid sử dụng cho cloning
Cấu trúc của plasmid bao gồm vùng ori giúp quá trình nhân nhanh về số lượng nhưng
không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ. Những plasmid nhỏ có thể sử dụng
genome của tế bào kí chủ cho việc nhân bản của nó, nhưng đối với plasmid lớn chúng mang
những gen mã hóa chun biệt giúp cho q trình tái bản của chính nó. Tuy nhiên một vài
plasmid gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy số lượng plasmid được nhân lên cùng
với sự phân chia tế bào vi khuẩn. Những plasmid hợp nhất gọi là episome thường ổn định
qua nhiều chu kỳ phân chia tế bào, nhưng trong một giai đoạn nào đó plasmid cũng có thể
ở dạng tự do. Phân loại plasmid dựa vào đặc tính cơ bản mã hóa bởi gen của nó. Được chia
làm 5 loại: thứ nhất là Fertility plasmid chỉ mang gen tra có khả năng chuyển vị và tiếp hợp.
Thứ hai là R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp chất kháng lại chất kháng sinh
giúp tế bào chủ tồn tại trong môi trường sống. Thứ ba là Col plasmid tạo ra colycin gây chết
vi khuẩn khác. Thứ tư là Degradative plasmid giúp kí chủ tạo các chất sinh học có tính chất
đặc biệt trong điều nào đó như toluen, acid salycylyc. Thứ năm là Virulence plasmid xác
định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ (Nguyễn Thị Lang và cs, 2005).
Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme-RE). Hiện tượng giới hạn và enzyme giới hạn
do Hamilton Smith phát hiện đầu tiên (1970) ở vi khuẩn Hemophilus influenzae đặt tên là
Hind II. Enzyme giới hạn thuộc nhóm enzyme endonuclease, cắt các liên kết trong phân tử
DNA. Các RE có đặc tính cắt DNA khơng đặc hiệu lồi, nghĩa là RE tách chiết từ vi khuẩn
có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay
điểm giới hạn. Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay ngắn tuỳ thuộc vào số lượng điểm
giới hạn trên phân tử DNA. Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi enzyme giới hạn gọi là bản đồ
9


giới hạn. Mỗi loại enzyme giới hạn chỉ hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về
nhiệt độ và dung dịch đệm thích hợp. Tiến hành phản ứng của các enzyme giới hạn cần thực
hiện trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để RE tiếp xúc tốt với cơ chất. Hiện nay phát hiện
có hàng nghìn enzyme giới hạn được ly trích từ vi khuẩn. Dựa vào khả năng nhận biết và

cắt các trình tự đặc hiệu khoảng 4 – 7 cặp nucleotide, người ta chia enzyme giới hạn làm ba
loại. Loại thứ nhất gồm các enzyme giới hạn nhận biết được trình tự đặc hiệu (vị trí giới
hạn) di chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1000 – 5000 nucleotide cắt
tại đó và giải phóng độ vài chục nucleotide. Loại thứ hai gồm các enzyme giới hạn nhận
biết vị trí giới hạn cắt ngay tại đó. Loại này thường sử dụng nhiều trong kỹ thuật gen và
công nghệ DNA tái tổ hợp. Loại thứ ba gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí giới hạn
và cắt ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide về phía trước.
Enzyme nối: Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng
enzyme cắt giới hạn liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hóa trị giữa gốc phosphate và
gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi liền kề. Sự hình thành liên kết này có thể được
xúc tác bởi enzyme T4 DNA ligase.
Tế bào khả biến: Hiện tượng biến nạp đã được chứng minh lần đầu tiên năm 1928 trên
vi khuẩn Streptococcus pneumoniae bởi Fred Griffiths và đến năm 1944 đã được kiểm
chứng lại bởi Avery và cs. Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng ở trạng thái khả
nạp tự nhiên nên có khả năng hấp thu DNA có sẵn trong mơi trường sống. Đó là các DNA
có nguồn gốc từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy. Kết quả thu được là vi khuẩn
thể hiện một vài tính trạng mới, ổn định và có khả năng di truyền. Trạng thái khả nạp tự
nhiên xuất hiện ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ chất dinh dưỡng và hàm lượng oxy
trong môi trường giảm xuống thấp. Thực tế khi nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế
bào để chúng ở trạng thái khả nạp, có khả năng hấp thu DNA. Để tăng khả năng khả nạp
của tế bào có hai phương pháp. Phương pháp vật lý: Phương pháp này sử dụng xung điện
tác động lên tế bào chủ từ đó gây nên sự thay đổi trong cấu trúc tế bào và tính thấm ở màng.
Ưu điểm của phương pháp này là tiến hành nhanh chóng, tế bào sau xử lý có hiệu suất biến
nạp cao. Phương pháp hóa học. Là phương pháp sử dụng hoá chất xử lý tế bào (có thể kết
hợp với nhiệt độ). Phương pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp
hơn phương pháp vật lý nhưng đơn giản và dễ thực hiện. Hiện nay để tạo tế bào E. coli khả
nạp theo các phương pháp hóa học, người ta có thể tiến hành theo 3 cách khác nhau. Thứ
nhất, phương pháp Hanahan, cho phép tạo những tế bào E. coli khả nạp có hiệu quả biến
10

nạp cao (5 x 108 khuẩn lạc/μg plasmid DNA). Thứ hai, phương pháp Inoue, phưng pháp
Inoue dễ lặp lại hơn phương pháp Hanahan và tạo ra các tế bào khả nạp có hiệu quả biến
nạp từ 1 x 108 đến 3 x 108 khuẩn lạc/μg plasmid DNA. Thứ ba, phương pháp Calcium
chloride, phương pháp này được phát triển từ hơn 30 năm qua và tạo ra các tế bào khả nạp
có hiệu quả biến nạp từ 5 x 106 đến 2 x 107 khuẩn lạc/μg plasmid DNA. Thông thường,
người ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch muối lạnh của kim loại hoá trị II như CaCl2,
MgCl2, RbCl2. Việc biến nạp DNA plasmid vào E. Coli đạt hiệu quả cao hơn khi có sự hiện
diện của ion Ca2+ ở nhiệt độ thấp (0 – 4oC). Ion Ca2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng
tế bào làm cho DNA xâm nhập tế bào E. coli dễ dàng hơn. Giai đọan sốc nhiệt kế tiếp để
kích thích sự chuyển của phân tử DNA vào trong tế bào, môi trường dưỡng chất được thêm
vào sau đó cho phép tế bào phục hồi và DNA tiến hành sao mã, dịch mã để tạo ra các protein
tương ứng.
Giải trình tự bằng hệ thống tự động: Nguyên tắc chung của máy giải trình tự tự động
dựa trên phương pháp dideoxy. Máy đọc trình tự trên cả hai mạch đơn, do vậy có thể phát
hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Cả hai loại primer xuôi và ngược đều đực sử dụng
để dọc cả hai mạch đơn DNA. Giải trình tự theo phương pháp tự động khơng phải dùng chất
phóng xạ mà sử dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA, máy sequencer có thể phát
hiện cùng lúc hiện tượng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng khác nhau (Bùi Chính Bửu và cs,
1999).
1.4. Tình hình nghiên cứu trong nước và thế giới
1.4.1. Trong nước
Tại Việt Nam việc nghiên cứu về β-glucanse đã được nghiên cứu nhiều nhưng vẫn tập
trung vào vấn đề phân lập và tinh chế các sản phẩm β-glucanase từ các chủng sinh vật được
phân lập từ tự nhiên. Trong khi đó việc nghiên cứu và sản suất enzyme tái tổ hợp β-glucanase
vẫn là một lĩnh vực khá mới chưa được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng nhiều.
Nguyễn Hoàng Lộc và cs đã nghiên cứu sản xuất enzyme β-glucanase tái tổ hợp từ
Trichoderma asperellum trong nấm men. Nguyên liệu nghiên cứu gồm 4 chủng nấm
Trichderma asperellum CH2, SH16, PQ34 và TN 42 có mang gen mã hóa β glucanase được
phân lập từ các địa điểm khác nhau ở Quảng Trị và Thừa Thiên Huế. Sau 2 năm nghiên cứu

đề tài đã tạo ra những kết quả; 4 chủng nấm Trichderma asperellum (CH2, SH16, PQ34 và
TN 42) điều có khả năng sinh β-glucanase ngoại bào. Trong đó, chủng PQ34 có hoạt tính
11


enzyme mạnh nhất; β-glucanse của chủng PQ34 được tổng hợp nhiều nhất sau 4 ngày ni
cấy ở mơi trường có CMC 1%, hoạt động chung là 0,083 u/mL và hoạt động riêng là 3,624
u/mg protein. Enzyme này có nhiệt độ và pH hoạt động tối thích là 5oC và pH 4, chúng bền
ở nhiệt độ thấp và ở phạm vi pH rộng từ 3-8; tạo dịng thành cơng hai gen mã hóa endoβ1,4-glucanase từ T. asperellum PQ34 (gọi là Glul-TA và Glu2-TA). Các gen Glul-TA và
Glu2-TA có kích thước lần lượt là 1.278 và 1.255 bp, tương đồng 99% và 100% với các gen
tương ứng của chủng T. asperellum CBS 433.97. Các gen Glul-TA và Glu2-TA đã được
biểu hiện thành công trong tế bào nấm men P. pastoris.
Năm 2012, Minh Thị Tuyết Phấn và cs tạo dịng thành cơng và xác định được trình tự
gen endo-1,4-β – glucanase từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. VLSH08. Gen mã hóa endo-1,4beta-glucanase từ chủng này đã được nhân bản trong Escherichia coli sử dụng véc tơ
pCR2.1. Toàn bộ gen của enzym chứa một khung đọc mở đơn 1500 bp mã hóa 500 axit
amin, bao gồm một peptit tín hiệu 29 axit amin. Trình tự axit amin của enzym này rất gần
với trình tự EG của Bacillus subtilis ( EU022560.1 ) và EG của Bacillus amyloliquefaciene
( EU022559.1 ), tất cả đều thuộc họ cellulase E2. Hỗn hợp enzyme chứa endo-1,4-betaglucanase này được sử dụng để thủy phân sinh khối cho thấy rằng quá trình chuyển đổi
cellulose đạt tới 72,76% cellulose sau 48 giờ.
Năm 2015, Huỳnh Hoàng Như Khánh và cs nghiên cứu sự phân bố và điều kiện xúc
tác của β-1,3-glucanase ở động vật không xương sống biển Việt Nam. 41 mẫu động vật
không xương sống biển Việt Nam thuộc nhóm động vật da gai (echinoiderms), nhóm hai
mảnh vỏ (bivalves) và nhóm chân bụng (gastropods) đã được khảo sát khả năng thủy phân
laminaran. Kết quả nghiên cứu cho thấy β-1,3-glucanase phân bố rộng rãi ở các mẫu kháo
sát. Điều kiện xúc tác phản ứng thủy phân của enzym cũng đã được khảo sát ở năm lồi có
hoạt tính thủy phân cao đối với laminaran là Conus quercinus, Haliotis ovina, Perna viridis,
Tapes literata và Turbo chrysotomus. Các enzym được khảo sát thể hiện pH và nhiệt độ tối
ưu khác nhau nhưng phần lớn đều hoạt động tốt ở giới hạn pH 4 - 7 và ở 30 - 40 oC, thời
gian thủy phân cũng khác nhau dao động từ 10 - 30 phút.
Năm 2016, Phan Thị Tuyết Minh và cộng sự đã thiết kế thành cơng hệ thống biểu hiện

ổn định gen mã hóa endoglucanase trong Bacillus subtilis 168M. Trong nghiên cứu này ba
thành phần chính được tổ hợp với nhau dựa trên phương pháp megaprimer bao gồm
promoter (180bp) của gen α–amylase từ chủng chủ B. subtilis 168M, toàn bộ khung đọc mở
12


của gen β-D-1,4-endoglucanase (1500 bp) từ chủng B. amyloliquefacient VLSH08 với đoạn
terminator (81 bp) tổng hợp của gen α–amylase từ chủng B. licheniformis 3BT2. Tồn bộ tổ
hợp này có độ dài 1800 bp được đưa vào vector pHT43 đã được cắt bỏ trước đoạn promoter
và peptide tín hiệu và biến nạp vào tế bào khả biến B. subtilis 168M. Kết quả cho thấy chủng
B. subtilis 168M tái tổ hợp mang vector pHT43[Bspr.endo.Blter] có hoạt tính β-D-1,4endoglucanase là 7 U/ml, cao hơn 23 lần so với hoạt tính enzyme từ chủng tự nhiên B.
amyloliquefacient VLSH08.
1.4.2. Trên thế giới
Năm 2005, Zhiwei Xu và cs đã tạo dòng và biểu hiện chức năng endo-β-glucanase
ngoại bào từ Pichia pastoris. Trong nghiên cứu này trình tự gen mã hóa cho β-1,3-glucanase
từ chủng Pichia pastoris được chuyển vào vector pPICZ và được biểu hiện trong tế bào nấm
men Saccharomyces cerevisiae. Bằng cách sử dụng một trình tự gen từ Pichia pastoris mã
hóa cho cả đoạn protein chứa 414 amino acid trong đó bao gồm chuỗi peptide tín hiệu
(signal-peptide) ở đầu N (N-terminal) và họ mong đợi sau khi protein trưởng thành sẽ cho
ra một protein chứa 392 amino acid. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy sự biểu hiện
của của enzyme tái tổ hợp.
Năm 2019, Shuai-Bing Zhang và cs nghiên cứu biểu hiện của β -1,3-glucanase lúa mì
trong Pichia pastoris, trọng lượng phân tử của β-1,3-glucanase tái tổ hợp là khoảng 33 kDa.
β-1,3-glucanase hiển thị hoạt động tối ưu ở pH 6,5, còn lại tương đối cao ở pH 5,5–8,0.
Nhiệt độ phản ứng tối ưu của β-1,3-glucanase là 50°C, giữ lại khoảng 84,0% hoạt tính còn
lại sau khi xử lý nhiệt ở 50 ° C trong 1 giờ. Các thông số động học ở trạng thái ổn định của
β-1,3-glucanase chống lại laminarin được xác định và Km và Vmax lần lượt là 1,32 ± 0,20
mg / ml và 96,4 ± 4,4 U mg − 1 protein. Sự ức chế tác dụng của β-1,3-glucanase tinh khiết
chống lại bảy loại nấm thường liên quan đến hạt lúa mì đã được đánh giá trong ống nghiệm.
β-1,3-glucanase có tác dụng ức chế khác biệt đối với sự phát triển sợi nấm của Fusarium

graminearum, Alternaria sp., A. glaucus, A. flavus, A. niger, và Penicillium sp. Sự hình
thành bào tử và hình thái sợi nấm của Alternaria sp., A. flavus và A. niger bị ảnh hưởng
đáng kể bởi β-1,3-glucanase (1U). Kết quả hiện tại sẽ giúp làm sáng tỏ cơ chế cơ bản của
sự ức chế β-1,3-glucanase của lúa mì đối với mầm bệnh.
Năm 2020, Nardiah Rizwana Jaafar và cs đã biểu hiện gen mã hóa endo-β-1,3glucanase từ vi khuẩn ưa kiềm, Bacillus lehensis G1 (Blg32) bao gồm 284 axit amin với
13


khối lượng phân tử dự đoán là 31,6 kDa vào Escherichia coli và được tinh chế để đồng nhất
Kết quả sản xuất ra enzyme hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 70°C, giá trị pH là 8,0 với hoạt tính
xúc tác của nó được tăng cường mạnh mẽ bởi Mn 2+. Đáng chú ý, enzyme tinh khiết có độ
bền cao trong điều kiện nhiệt độ cao và kiềm. Nó thể hiện hoạt tính cao nhất trên laminarin
(376,73 U / mg), tiếp theo là curdlan và men β-glucan.
Năm 2020, Shah Taif và cs nghiên cứu một gen β ‐ 1,3 ‐ glucanase được phân lập từ
Panax notoginseng và được đặt tên là PnGlu1. Gen này mã hóa một protein gồm 379 axit
amin chứa một peptit tín hiệu tiềm năng, và phân tích bản địa hóa dưới tế bào đã xác nhận
rằng protein PnGlu1 đã được định vị trong thành tế bào. Mức độ biểu hiện PnGlu1 trong rễ
P. notoginseng rõ ràng được gây ra bởi quá trình xử lý Methyl jasmonate, axit salicylic,
ethylene và hydrogen peroxide. Hơn nữa, gen PnGlu1 cho thấy mức độ phiên mã cao sau
khi được cấy nấm Fusarium solani, là tác nhân quan trọng của bệnh thối rễ P. notoginseng.
Ngoài ra, protein tái tổ hợp PnGlu1 biểu hiện trong Escherichia coli cho thấy hoạt động ức
chế mức độ cao chống lại sự phát triển của Fusarium solani và Fusarium oxysporum.
Năm 2021, Minjie Gao và cs nghiên cứu biểu hiện endo-β-1,3-glucanase hiệu quả ở
Pichia pastoris để đồng nuôi cấy với Agrobacterium sp. để sản xuất oligosaccharide curdlan
trực tiếp. Các điều kiện đồng ni cấy được tối ưu hóa và quy trình được thực hiện trong
bioreactor. Sản lượng tối đa của oligosaccharides curdlan đạt 18,77 g/L với 3–10 độ trùng
hợp.
Năm 2021, Miroslav Rajninec và cs đã nghiên cứu Β-1,3-Glucanase cơ bản từ Drosera
binata và cho thấy tiềm năng kháng nấm ở cây thuốc lá chuyển gen. Β-1,3-glucanase cơ bản
của cây Drosera binata đã được thử nghiệm như một protein tinh khiết, cũng như dưới sự

kiểm soát của promoter CaMV35S kép trong thuốc lá chuyển gen để có khả năng ức chế sự
phát triển của Trichoderma viride , Rhizoctonia solani , Alternaria solani, và Fusarium poae
trong một thử nghiệm in vitro. Protein tinh khiết đã ức chế các phytopathogens đã được thử
nghiệm nhưng không ức chế nấm T. viride hoại sinh . Trong số các cây chuyển gen được
phân tích, các dòng 13, 16, 19 và 22 thể hiện sự phong phú phiên mã DbGluc1 cao được
chuẩn hóa cho phiên mã actin . Vì DbGluc1 biểu hiện gen chuyển, dịng 13 và 16 tăng 1,7
lần và dòng 19 và 22 cho thấy tổng hoạt tính β-1,3-glucanase tăng hơn 2 lần so với đối
chứng không chuyển gen. Theo thử nghiệm kháng nấm β-1,3-glucanase tinh khiết trong ống
nghiệm, chiết xuất protein thô của dòng 19 và 22 đã ức chế đáng kể sự phát triển của
14


phytopathogens (14–34%). Các phân tích sâu hơn cho thấy rằng hoạt động bổ sung của β1,3-glucanase chuyển gen và hoạt động cao hơn 20% của (các) chitinase nội sinh trong các
dịng này là rất quan trọng để tối đa hóa hiệu quả kháng nấm của các chiết xuất protein thô.
Năm 2021, Min-Jie Gao và cs nghiên cứu sự biểu hiện của β-1,3-glucanase có thể điều
chỉnh nhiệt từ Trichoderma harzianum trong Pichia pastoris và sử dụng trong quá trình thủy
phân oligoglucosides. Trong nghiên cứu, gen endo-β-1,3-glucanase từ Trichoderma
harzianum được biểu hiện trong Pichia pastoris KM71 lần đầu tiên nhằm tạo ra dòng endoβ-1,3-glucanase năng suất cao. Các điều kiện tối ưu để nuôi cấy tế bào và cảm ứng endo-β1,3-glucanase sau đó đã được xác định trong các thí nghiệm bình lắc. Hoạt động endo-β1,3-glucanase tái tổ hợp sau đó được đánh giá trong lò phản ứng sinh học 7 L, đạt tối đa
198,57 U/mL sau 118 giờ lên men. Endo-β-1,3-glucanase tái tổ hợp hoạt động tối ưu ở pH
5,5 và 50°C ngồi ra cịn ổn định trong phạm vi pH 4,0–6,0 và phạm vi nhiệt độ 30°C 50°C. Ngoài ra, glucanase thể hiện có thể thủy phân hiệu quả scleroglucan và schizophyllan
để tạo ra các oligoglucoside phân nhánh thể hiện các mức độ trùng hợp khác nhau (DP 3–
10) và các cấu trúc. Hoạt tính và tính đặc hiệu của enzym cao đối với polysaccharid có gốc
glucose liên kết β-1,3 như chuỗi chính tạo ra endo-β-1,3-glucanase tái tổ hợp, một enzym
ứng cử lý tưởng cho sản xuất oligoglucoside trong công nghiệp.

15


CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Chủng B. amyloliquefaciens được cung cấp bởi Phịng thí nghiệm Công nghệ
enzyme và protein - Viện Công nghệ Sinh học – Đại học Huế.
- Hệ thống vector pGEM®-T (Promega, Mỹ) (Hình 2.1.).
- Chủng vi khuẩn E. coli DH5α (Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử - trường Đại học
Sư phạm – Đại học Đà Nẵng).

Hình 2.1. Vector pGEM®-T (Promega, Mỹ). Ampr: Gen kháng kháng sinh ampicillin, f1
ori: Trình tự khởi đầu sao chép, lacZ: gen mã hóa tiểu phần α của β galactosidase giúp
chọn lọc những khuẩn lạc mang gen chèn trên sự chọn lọc màu sắc trắng/xanh của khuẩn
lac.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Phịng thí nghiệm Vi sinh và Sinh học phân tử thuộc khoa Sinh - Môi trường, Trường
Đại học Sư Phạm – Đại học Đà Nẵng.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số từ B. amyloliquefaciens
Vi khuẩn B. amyloliquefaciens được nuôi cấy trong môi trường LB ở nhiệt độ 37oC
trong 24 giờ, lắc 185 vòng/phút. Sinh khối tế bào sau khi nuôi cấy được sử dụng để tách
16