khảo sát ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi trên mật số và sức sống của chủng vi khuẩn bacillus amyloliquefaciens

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG






VÕ HUỲNH PHONG




KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI
TRƯỜNG NHÂN NUÔI TRÊN MẬT SỐ VÀ
SỨC SỐNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS






LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT

Cần Thơ, 2014




TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG







LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH: BẢO VỆ THỰC VẬT




KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA
MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI TRÊN MẬT SỐ
VÀ SỨC SỐNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

Cán bộ hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. Trần Vũ Phến Võ Huỳnh Phong
MSSV: 3103658
Lớp: TT1073A1




TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT


Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Bảo vệ Thực vật với đề tài

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA
MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI TRÊN MẬT SỐ
VÀ SỨC SỐNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS




Do sinh viên Võ Huỳnh Phong thực hiện

Kính trình lên hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp.









Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014
Cán bộ hướng dẫn






TS. Trần Vũ Phến


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN BẢO VỆ THỰC VẬT



Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã chấp nhận luận văn tốt nghiệp kỹ
Bảo Vệ Thực Vật với tên:

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA
MÔI TRƯỜNG NHÂN NUÔI TRÊN MẬT SỐ
VÀ SỨC SỐNG CỦA CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS


Do sinh viên Võ Huỳnh Phong thực hiện và bảo vệ trước hội đồng
Ý kiến của hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp:


Luận văn tốt nghiệp hội đồng đánh giá ở mức:






DUYỆT KHOA Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014
Chủ tịch Hội đồng


i

LƯỢC SỬ CÁ NHÂN

Họ và tên: Võ Huỳnh Phong
Năm sinh: 30-04-1992
Nơi sinh: thị trấn Nhà Bàng, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang.
Họ tên cha: Võ Văn Dũng

Họ tên mẹ: Phan Thị Măng
Quê quán: thị trấn Tịnh Biên, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang.
Quá trình học tập:
1997 - 2002: học tiểu học tại trường tiểu học “B” thị trấn Nhà Bàng, huyện
Tịnh Biên, tỉnh An Giang.
2002 - 2007: học THCS tại thị trấn Tịnh Biên, huyện Tịnh Biên, tỉnh An
Giang.
2007 - 2008: học THCS tại thị trấn Nhà Bàng, huyện Tịnh Biên, tỉnh An
Giang.
2008 - 2010: học THPT tại tại thị trấn Nhà Bàng, huyện Tịnh Biên, tỉnh An
Giang.
2010 - 2014: học đại học tại trường Đại học Cần Thơ, ngành Bảo vệ Thực vật,
khoá 36, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng.











ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số

liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ luận văn nào trước đây.



Tác giả luận văn





Võ Huỳnh Phong

iii

LỜI CẢM TẠ

Kính dâng,
Cha, Mẹ suốt đời tận tụy vì sự nghiệp và tương lai của các con. Những
người thân đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.

Thành kính ghi ơn,
Thầy Trần Vũ Phến đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em trong suốt
thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn này.
Thầy cố vấn học tập, quý thầy cô trong khoa Nông Nghiệp và Sinh Học
Ứng Dụng trường Đại Học Cần Thơ đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em
trong thời gian học tại trường.

Chân thành biết ơn,
Anh Huỳnh Văn Nghi và các anh chị trong nhà lưới của bộ môn Bảo vệ
Thực vật đã đóng góp ý kiến quý báu và tạo điều kiện cho em hoàn thành tốt
thí nghiệm.

Thành thật cảm ơn,
Các bạn lớp Bảo vệ Thực vật K36 đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian thực hiện đề tài. Chúc các bạn hạnh phúc, sức khỏe và thành đạt
trong tương lai.

Trân trọng !


Võ Huỳnh Phong
iv

Võ Huỳnh Phong. 2014. “Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi
trên mật số và sức sống của chủng vi khuẩn Bacillus Amyloliquefaciens”.
Luận văn tốt nghiệp Kỹ sư Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học
ứng dụng, Đại học Cần Thơ, Cán bộ hướng dẫn TS. Trần Vũ Phến.
TÓM LƯỢC
Đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nhân nuôi trên mật số và sức
sống của chủng vi khuẩn Bacillus Amyloliquefaciens” được thực hiện từ
3/2013 đến tháng 3/2014 trong điều kiện phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ
Thực vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng. Đề tài được thực hiện với
mục tiêu khảo sát loại môi trường thích hợp để nhân nuôi vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens đạt tối ưu về mật số và sự tạo nội bào tử phục vụ cho sản
xuất chế phẩm sinh học và tồn trữ chế phẩm ở các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm được thực hiện với chủng vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens được cung cấp bới phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học,
Bộ môn Bảo vệ Thực vật.
Thí nghiệm 1 được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lặp lại
với 8 nghiệm thức là các loại môi trường khác nhau như: dịch trích khoai tây,
dịch trích khoai mì, dịch trích khoai lang, dịch trích bã đậu nành, khoai tây,
khoai mì, khoai lang và môi trường King’s B làm đối chứng. Kết quả cho thấy
môi trường khoai mì đạt được mật số vi khuẩn cao nhất so với các nghiệm
thức còn lại sau 6 ngày khảo sát với mật số 3,37 x10
9
CFU/ml. Tỷ lệ nội bào
tử cao nhất kể từ ngày đầu tiên thí nghiệm là 11,30% và đến ngày thứ 6 thì đạt

100%.
Thí nghiệm 2, khảo sát hiệu quả đối kháng đối với nấm Fusarium
oxysporum, nấm Sclerotium rolfsii và vi khuẩn Ralstonia solanacearum của 3
nghiệm thức là các chế phẩm Bacillus amyloliquefaciens ở các tỷ lệ nội bào tử
khác nhau (5%, 50%, 100%), thí nghiệm được lặp lại 4 lần. Kết quả ghi nhận,
vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens duy trì được sức sống trong chế phẩm
dạng bột sau 3 tháng tồn trữ, chế phẩm với tỷ lệ nội bào tử 100% có mật số và
hiệu quả đối kháng đối với nấm F. oxysporum, nấm S. rolfsii và vi khuẩn R.
solanacearum vẫn được duy trì khá ổn định.


MỤC LỤC
LƯỢC SỬ CÁ NHÂN i
LỜI CAM ĐOAN ii
LỜI CẢM TẠ iii
TÓM LƯỢC iv
GIỚI THIỆU 1
CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2
1.1. Một số đặc điểm của vi khuẩn thuộc chi Bacillus 2
1.1.Nghiên cứu việc sử dụng Bacillus sp. trong phòng trừ sinh học bệnh cây
4
1.3.1 Bệnh héo rủ gốc mốc trắng (Sclerotium rolfsii Sacc.) 6
1.3.2 Bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua, khoai tây. 7
1.3.3 Bệnh héo vàng do Fusarium sp. 8
1.4 Dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 9
1.4.1 Thành phần tế bào vi khuẩn 9
1.4.2 Nhu cầu dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi khuẩn 9
1.5 Sinh trưởng của vi khuẩn 13
1.5.1 Yếu tố sinh trưởng 13
1.5.2 Sự tăng trưởng của vi khuẩn 14

1.5.3 Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến sinh trưởng vi khuẩn 15
1.6 Sự thành lập và “nảy mầm” của nội bào tử vi khuẩn 18
1.7 Một số hợp chất trong công thức tồn trữ vi khuẩn 20
1.8 Một số kết quả nghiên cứu về môi trường nhân nuôi vi khuẩn và tồn trữ
vi khuẩn 21
1.8.1 Những kết quả nghiên cứu về môi trường nhân nuôi vi khuẩn 21
1.8.2 Những kết quả nghiên cứu về tồn trữ vi khuẩn 22
CHƯƠNG 2: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 24


2.1 PHƯƠNG TIỆN 24
2.2 PHƯƠNG PHÁP 24
2.2.1 Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng nhân mật số và tạo nội bào tử của
chủng vi khuẩn PGPR1 trong các loại môi trường khác nhau. 24
2.2.1.1 Chuẩn bị 24
2.2.1.2 Tiến hành 27
2.2.1.3 Chỉ tiêu theo dõi 27
2.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi lên thời
gian lưu tồn trong chế phẩm dạng bột của chủng vi khuẩn PGPR1. 28
2.2.2.1 Thí nghiệm 2.1: Đánh giá ảnh hưởng của thời gian tồn trữ trên
sức sống của chủng vi khuẩn PGPR1 trong chế phẩm. 28
2.2.2.1.1 Chuẩn bị 28
2.2.2.1.2 Tiến hành 28
2.2.2.1.3 Chỉ tiêu theo dõi 29
2.2.2.2 Thí nghiệm 2.2: Khảo sát hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với
nấm F. oxysporum, nấm S. rolfsii và vi khuẩn R. solanacearum. 29
2.2.2.2.1 Khảo sát hiệu quả đối khángcủa chế phẩm đối với nấm
Fusarium oxysporum và nấm Sclerotium rolfsii. 29
2.2.2.2.2 Khảo sát hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với vi khuẩn
Ralstonia solanacearum 30

2.2.2.2.3 Chỉ tiêu theo dõi 31
2.2.3 Phân tích số liệu 32
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1 Ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy khác nhau lên sự phát triển
mật số và hình thành nội bào tử của chủng vi khuẩn PGPR1. 34
3.1.1 Sự tăng trưởng của chủng vi khuẩn PGPR1 ở các nghiệm thức môi
trường nuôi cấy khác nhau qua thời điểm quan sát. 34
3.1.2 Tỉ lệ nội bào tử/tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn PGPR1 diễn biến
theo thời gian 37


3.2 Hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với nấm F. oxysporum, S. rolfsii
và vi khuẩn R. solanacearum. 42
3.2.1 Hiệu quả đối kháng của chế phẩm đối với nấm F. oxysporum 42
3.2.2 Hiệu quả đối kháng của các loại chế phẩm sinh học đối với nấm
Sclerotium rolfsii 45
3.3 Khảo sát khả năng sinh trường của chủng vi khuẩn PGPR1 trong các loại
chế phẩm sau 3 tháng tồn trữ. 49
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 52
4.1 KẾT LUẬN 52
4.2 ĐỀ XUẤT 52


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt
Nguyên văn
CFU/ml
Mật số vi khuẩn sống trên 1 ml
NBT

Nội bào tử
NSKN
Ngày sau khi nuôi
PGPR
Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng
rpm
Vòng/phút
TBSD
Tế báo sinh dưỡng



DANH SÁCH BẢNG

Bảng
Tựa bảng
Trang
3.1
Mật số vi khuẩn PGPR1 ở các nghiệm thức môi trường nuôi cấy
khác nhau qua thời điểm quan sát
34
3.2
Mật số vi khuẩn PGPR1 theo thời điểm khảo sát ở từng nghiệm
thức
36
3.3
Tỉ lệ nội bào tử/tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn PGPR1 ở các
nghiệm thức môi trường nuôi cấy khác nhau qua thời điểm quan
sát
38

3.4
Tỉ lệ nội bào tử/tế bào sinh dưỡng của vi khuẩn PGPR1 ở các
nghiệm thức môi trường nuôi cấy khác nhau qua thời điểm quan
sát
40
3.5
Bán kính nấm Fusarium oxysporum bị ức chế bởi bởi các chế
phẩm chứa tỷ lệ nội bào tử khác nhau theo thời gian tồn trữ
43
3.6
Hiệu suất đối kháng của các chế phẩm chứa tỷ lệ nội bào tử khác
nhau đối với nấm Fusarium oxysporum theo thời gian tồn trữ
44
3.7
Bán kính vùng nấm Sclerotium rolfsii bị ức chế bởi bởi các chế
phẩm chứa tỷ lệ nội bào tử khác nhau theo thời gian tồn trữ
46
3.8
Hiệu suất đối kháng của các chế phẩm chứa tỷ lệ nội bào tử khác
nhau đối với nấm Sclerotium rolfsii theo thời gian tồn trữ
47
3.9
Bán kính vành khăn vùng vi khuẩn R. solanacearum bị ức chế
bởi bởi các chế phẩm có tỷ lệ nội bào tử khác nhau theo thời
gian tồn trữ
48
3.10
Mật số vi khuẩn PGPR1 ở các nghiệm thức có tỷ lệ nội bào tử
khác nhau theo từng khoảng thời gian tồn trữ
49

3.11
Biến động của mật số vi khuẩn PGPR1 trong từng dạng chế
phẩm có tỷ lệ NBT khác nhau theo thời gian tồn trữ
50



DANH SÁCH HÌNH

Hình
Tựa hình
Trang
2.1
Nguyên liệu khoai tây (A), khoai lang (B), khoai mì (C), bã đậu
nành (D) để làm thí nghiệm.
26
2.2
Máy lắc nuôi vi khuẩn ở 150 vòng/phút với các nghiệm thức khác
nhau.
28
2.3
Sơ đồ thử nghiệm hiệu quả của chế phẩm đối với nấm Sclerotium
rolfsiivà Fusarium oxysporum.
30
2.4
Sơ đồ thử nghiệm hiệu quả của các loại chế phẩm đối với vi
khuẩn Ralstonia solanacearum
31
3.1
Nghiệm thức dịch trích khoai tây (A), dịch trích bã đậu nành (B),

dịch trích khoai lang (C), dịch trích khoai mì (D).
33
3.2
Nội bào tử (A) và mật số vi khuẩn của vi khuẩn PGPR1(B) ở tỷ lệ
nội bào tử 100% của môi trường khoai mì vào thời điểm 6 NSTN.
39
3.3
Tủ sấy chế phẩm trước (A) và sau (B) khi đưa chế phẩm vào sấy.
41
3.4
Chế phẩm sau thời gian sấy.
42
3.5
Máy phối trộn.
42
3.6
Chế phẩm PGPR1 với các tỷ lệ nội bào tử 5% (A), 50% (B),
100% (C).
51

1


GIỚI THIỆU
Việc phòng trị những bệnh do các tác nhân Fusarium spp. và vi khuẩn
Ralstonia solanacearum trên cây trồng này thường rất khó khăn do chúng lưu
tồn rất hữu hiệu trong đất (Đỗ Tấn Dũng, 2001). Sử dụng thuốc hóa học trong
phòng trị có thể để lại dư lượng thuốc bảo vệ thưc vật cho cây trồng hoặc ảnh
hưởng đến sức khỏe người nông dân và người tiêu dùng, còn biện pháp canh
tác thì tốn nhiều công, chi phí, thời gian và khó áp dụng cho các vùng chuyên

canh (Lê Thị Thủy, 2000; Ngô Quang Vinh, 2004).
Chủng vi khuẩn vùng rễ Bacillus amyloliquefaciens (PGPR1) (Trần Vũ
Phến và ctv., 2010), có khả năng kiểm soát bệnh do nấm Fusarium spp. và vi
khuẩn Ralstonia solanacearum trên nhiều loại cây trồng như cà chua, ớt,
gừng…(Trần Vũ Phến và ctv., 2010; Trần Văn Nhã, 2011; Trần Thị Thúy Ái,
2011) và nhiều loại nấm, vi khuẩn gây bệnh trên nhiều loại cây trồng khác
đang được nghiên cứu.
Tuy nhiên việc ứng dụng vi khuẩn trong phòng trừ bệnh như một tác
nhân sinh học chưa được áp dụng rộng rãi vì chưa có dạng chế phẩm phù hợp
đáp ứng được nhu cầu sử dụng của thực tế. Bên cạnh đó, thời gian tồn trữ của
các chế phẩm vẫn chưa đủ lâu để thương mại hóa (Vidhyasekaran et al., 1997;
Bora et al., 2004; Dương Thị Nguyễn Quyên và ctv., 2007). Một trong các yêu
cầu đối với chế phẩm vi sinh khi thường mại hóa là thời gian sử dụng dài mà
không giảm hiệu lực, có thể chống chịu với điều kiện ngoại cảnh (thời tiết, các
hóa chất), an toàn, dễ sử dụng và giá thành sản phẩm thấp (Nelson, 2004). Cho
nên việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến mật số và khả năng tạo nội bào
tử cao để góp phần vào quy trình sản xuất chế phẩm sinh họclà rất cần thiết.
Từ đó, đề tài: “Ảnh hưởng của điều kiện nuôi nhân lên sự sinh trưởng
và sự hình thành nội bào tử của vi khuẩn PGPR1” được thực hiện nhằm tìm ra
loại môi trường nuôi cấy phù hợp nhất để nhân nuôi vi khuẩn PGPR1 đạt tối
ưu về mật số và sự tạo nội bào tử phục vụ cho tồn trữ và sản xuất chế phẩm
sinh học.




2

CHƯƠNG 1: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1. Một số đặc điểm của vi khuẩn thuộc chi Bacillus

Phân loại:
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales
Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Đặc điểm hình thái
Bacillus thường có dạng hình que với kích thước 1,0-1,2 x 3,0-5,0 µm,
gram dương, không có lớp capsule, hiếu khí. Vi khuẩn nội bào tử có kích
thước 1,0 x 1,5 µm (Cook and Baker, 1989). Khuẩn lạc của các vi khuẩn thuộc
chi Bacillus thường có màu hoặc không màu, mặt khuẩn lạc nhăn. Trong môi
trường lỏng chúng tạo thành lớp nhăn, đục và lắng cặn (Dương Văn Điệu,
1989).
Bacillus amyloliquefaciens là vi khuẩn gram dương có dạng hình roi,
kích thước 0,7-0,9 x 1,83-3 µm, các tế bào thường kết thành chuỗi, các chiên
mao được đính ở trung tâm hoặc hơi lệch tâm, nhiệt độ tối ưu cho sự tăng
trưởng là 30 – 40
0
C. Tăng trưởng không xảy ra dưới 15
0
C hoặc trên 50
0
C
(Priest et al, 1987).
Đặc điểm sinh thái
Bacillus có những nét đặc trưng riêng biệt, phân bố rộng rãi trong đất, có
khả năng chịu đựng ở nhiệt độ cao, có thể phát triển nhanh trong môi trường
lỏng và hình thành nội bào tử trong môi trường khắc nghiệt. Vi khuẩn này
được đánh giá hội tụ những tính năng căn bản trong việc ức chế bệnh cây
trồng. Chúng được xem như là những tác nhân sinh học an toàn và có tiềm

năng cao trong phòng trừ sinh học (Silo-suh et al., 1994).
pH của môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong sản xuất
chitinase, phần lớn các vi khuẩn sản xuất chitinase mức tối đa ở mức trung
tính hoặc hơi acid (Ulhoa and Peberdy, 1991; Sharaf, 2005). Ngược lại, B.
laterosporus mmL2270 sản xuất chitinase cao nhất ở pH 8.0 và không sản
xuất chitinase ở pH 4.0. tương tự như pH 9.0 ở mức tối ưu cho sản xuất
chitinase B. pabuli K1 đã được báo cáo (Frandberg and Schnurer, 1994).
Đặc tính sinh sản và khả năng lưu tồn
3

Một số vi khuẩn ở cuối giai đoạn sinh trưởng, khi chất dinh dưỡng ở
môi trường cạn kiệt và chất qua trao đổi độc hại quá nhiều, hoặc do có sự thay
đổi đột ngột các điều kiện sinh trưởng có khả năng hình thành bào tử ở bên
trong tế bào, được gọi là nội bào tử (endospores). Mỗi tế bào vi khuẩn chỉ tạo
một nội bào tử nên loại bào tử này không phải là bào tử sinh sản, khác với các
loại đính bào tử (conidiospores), bào tử túi (ascospores) hay bào tử đảm
(basidiospores) ở nhiều loài nấm, chúng là những bào tử sinh sản vô tính hay
hữu tính (Biền Văn Minh và ctv., 2006).
Chu trình sống của nhiều vi khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng hình
thành nội bào tử thường tồn tại dưới 2 dạng, tế bào sinh dưỡng để sinh sản
nhân mật số và dạng nội bào tử để sống sót khi gặp điều kiện môi trường bất
lợi. Nội bào tử có thể tồn tại dưới tác động của các tác nhân diệt khuẩn bao
gồm nhiệt độ cao (thậm chí 100
0
C), khô, bức xạ ion hóa, tia cực tím, hóa chất
(chất khử trùng, kháng sinh), chất tẩy rửa và enzyme (Errington, 2003). Ở
nhiệt độ 100
0
C nội bào tử của một loài Bacillus có thể chịu được từ 2,5 – 1200
phút (20 giờ). Những tế bào này rất bền vững với những chất sát trùng hoặc

trạng thái khô. Nội bào tử có thể tồn tại trong một thời gian dài cho đến khi
điều kiện môi trường thuận lợi cho sự tăng trưởng (Phạm Văn Kim, 2000;
Nguyễn Như Hiền, 2005).
Nội bào tử có khả năng chịu nhiệt do thành phần cấu tạo có hàm lượng
calcium và dipicolinic acid cao, tạo thành calcium dipicolinate làm tế bào mất
kiệt nước và không còn hoạt động biến dưỡng nữa; lớp vỏ ngoài và vỏ trong
dầy, không thấm nước bảo vệ nội bào tử trước tác động của bức xạ và hóa chất
(Cowan, 2013).
Vai trò của vi khuẩn Bacillus trong hệ sinh thái nông nghiệp
Vi khuẩn thuộc chi Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên và đa dạng
về sinh thái. Các loài thuộc chi Bacillus đã và đang trở thành những vi sinh vật
quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng (Ngô Tự Thành và ctv., 2009). Vi
khuẩn thuộc chi Bacillus có khả năng tiết các enzyme ngoại bào, trong đó có
nhiều enzyme có khả năng thủy phân các phân tử hữu cơ, chính vì thế Bacillus
có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau (Gupta et al., 2002).
Vi khuẩn thuộc chi Bacillus được đánh giá hội tụ những tính năng căn
bản cho việc ứng dụng trong sản xuất nông nghiệp. Trước hết, một số
Bacillus, như B. subtilis, thuộc nhóm những vi sinh vật đã được nghiên cứu
và hiểu biết nhiều và được xác nhận tính an toàn, không gây bệnh, nói chung
khi dùng làm tác nhân phòng trừ sinh học của chúng. Mặc khác, các Bacillus
có khả năng tạo nội bào tử trong điều kiện môi trường không thuận lợi, nhờ đó
4

Bacillus có khả năng sống sót với các điều kiện khác nghiệt của môi trường,
như nhiệt độ cao, pH ngoài khoảng thông thường, thiếu dưỡng chất hay
nước, (Cawoy et al., 2011).
Trong nuôi nhân công nghiệp, nội bào tử thường hình thành vào cuối
giai đoạn nuôi nhân, do đó thuận lợi cho việc gia công các chế phẩm dạng bột
có tỷ lệ nội bào tử cao (Lolloo et al., 2010). Chế phẩm sinh học có tác nhân là
vi khuẩn tạo nội bào tử thường có thời gian hiệu quả qua tồn trữ lâu hơn so với

các dạng sống khác. Ngoài cơ chế sống sót dựa trên việc tạo nội bào tử, một số
Bacillus, còn có khả năng sống hiếm khí tùy ý, nên có thể sống sót trong điều
kiện oxy thấp, khi môi trường có thay đổi. Bên cạnh đó, nhờ có roi nên các
Bacillus có thể di chuyển chủ động đến và định vị ở vùng rễ cây và phát huy
hiệu quả bảo vệ cây ở đây. Với khả năng tác động trong phòng trừ sinh học và
kích thích sinh trưởng thực vật theo nhiều cơ chế khác nhau, nhiều chủng
Bacillus được xem như là những tác nhân sinh học an toàn và có tiềm năng
cao trong phòng trừ sinh học (Silo-suh et al., 1998; Cawoy et al., 2011)
Một số loài thuộc chi Bacillus, trong đó B. subtilis và B.
amyloliquefaciens là hai loài được xem là có hiệu quả phòng trừ sinh học đối
với nhiều bệnh cây trồng có nguồn gốc từ đất (Leclere et al., 2005) hoặc các
tác nhân gây bệnh sau thu hoạch (Kotan et al., 2009).
1.2.Nghiên cứu việc sử dụng Bacillus sp. trong phòng trừ sinh học
bệnh cây
Bacillus spp. đã được thử nghiệm trên một loạt các loại cây trồng khác
nhau và được xác định có triển vọng về khả năng phòng trừ sinh học bởi vì
khả năng sản xuất nội bào tử giúp chúng có thể tồn tại được trong điều kiện
nhiệt và khô hạn. Nghiên cứu của Broadbent et al., (1977) nhận thấy B.
subtilis A13 có khả năng kiểm soát đối với Sclerotium rolfsii. Khi thử nghiệm
B. subtilis A13 trong điều kiện in vitro có khả năng ức chế một số tác nhân
gây bệnh và cải thiện sự phát triển của nhiều loài thực vật (Broadbent et
al.,1977). Khi sử dụng B. subtilis A13 để xử lý hạt giống, nhận thấy nó làm
tăng năng suất của cà rốt 48%, yến mạch 33% (Merriman et al.,1974 trích dẫn
bởi Weller, 1988) và đậu phộng lên đến 37%. B. subtilis A13 được sử dụng để
cải thiện sự phát triển của cây trồng như sản xuất auxin tạo điều kiện thuận lợi
cho sự tăng trưởng và phát triển của đậu tương (Figueiredo, 2011), và ức chế
các tác nhân gây bệnh có thể cũng bằng cách kích thích tăng trưởng thực vật
(Weller, 1988). Kết quả nghiên cứu của Monteiro et al.,(2005) cho thấy vi
khuẩn Bacillus có khả năng sản xuất lipopeptide hoạt động chống lại
Xanthomonas campestris pv. campestris.

5

Ở Thái Lan, các nhà nghiên cứu đã thành công trong việc sử dụng vi
khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani tác nhân gây bệnh đốm vằn trên
lúa. Ruộng lúa được phun vi khuẩn đối kháng (Pseudomonas sp. và Bacillus
sp.) 3 lần trong mỗi vụ. Vi khuẩn đối kháng này ức chế sự sinh sản ra hạch
nấm của R. solani, sau 5 vụ phun vi khuẩn đối kháng liên tục, bệnh đốm vằn
đã giảm một cách đáng kể và giúp tăng năng suất so với đối chứng (Phạm Văn
Kim, 2000).
Bacillus amyloliquefaciens
Đây là một trong những loài vi khuẩn có hiệu quả phòng trừ sinh học đối
với nhiều loại bệnh cây trồng từ đất hoặc các tác nhân gây bệnh sau thu hoạch
(Kotan et al., 2009).
Bacillus amyloliquefaciens chủng RC-2 sản xuất ra các hợp chất kháng
nấm và ức chế sự phát triển của nấm Colletotrichum dematium gây bệnh thán
thư trên dâu tằm, khi phun lên lá trước khi lây bệnh với C. dematium sẽ ức chế
sự phát triển của vết bệnh (Yoshida et al., 2002).
Theo Park et al. (2006) thì B. amyloliquefaciens có tác dụng ức chế bệnh
héo xanh vi khuẩn R. solanacearum trên cà chua trong 4 tuần sau xử lý. Trong
thí nghiệm này, vi khuẩn gây bệnh được chủng vào rễ cây cà chua 20 ngày
tuổi và vi khuẩn được chủng trước đó 7 ngày, kết quả cho thấy vi khuẩn không
chỉ ức chế bệnh héo xanh mà còn giúp gia tăng chiều cao cây.
Nghiên cứu của Luz (2003), chứng minh vi khuẩn B. amyloliquefaciens
cho kết quả cao với việc giúp cây lúa mì ở Brazil tăng năng suất từ 459 đến
594 kg/ha và có liên quan đến kích kháng, hạn chế sự gây hại của những vi
sinh vật gây bệnh từ 17,3 đến 22,4%.
Jetiyanon et al. (2003) ghi nhận hổn hợp hai dòng vi khuẩn B.
amyloliquefaciens IN937a và B. pumilus IN937b, qua cơ chế kích kháng lưu
dẫn bảo vệ cây chống laị các bệnh trên cà chua do nấm Sclerotium rolfsii,
Colletotrichum gloeosporioides, và cả bệnh khảm do CMV. Dòng B.

amyloliquefaciens EXTN-1 giúp kiểm soát bệnh thán thư do nấm
Colletotrichum orbiculare trên dưa leo (Park et al., 2001)
Còn ở Việt Nam, tại Trường Đại học Cần Thơ đã phân lập được 214
dòng vi khuẩn có bán kính vòng vô khuẩn từ 1 mm trở lên và trong 214 dòng
này có 2 dòng vi khuẩn có khả năng đối kháng đáng kể là
Pseudomonascepacia TG17, Bacillus sp. TG19 với bán kính vòng vô khuẩn
theo thứ tự là 16,5 mm và 14,5 mm. Và khi sử dụng hai nguồn vi khuẩn này
kết hợp với ¼ liều Validacin phun 3 lần, lần đầu vào 45 ngày sau khi gieo, lần
phun sau cách lần phun trước 5 hoặc 7 ngày thì có hiệu quả hạn chế bệnh đốm
vằn tốt tương đương với nghiệm thức phun Validacin đủ liều (Phạm Văn Kim,
6

2000). Nguyễn Văn Chương (2007) đã thử nghiệm khả năng đối kháng đối với
nấm Fusarium moniliforme gây bệnh lúa von, ghi nhận dòng Bacillus sp.
TG19 có hiệu quả ức chế sự phát triển khuẩn ty của 41 dòng nấm Fusarium
moniliforme thu thập tại Đồng bằng sông Cửu Long. Theo Trần Vũ Phến và
ctv. (2008) cho thấy có thể dùng các chủng vi khuẩn vùng rễ thuộc chi
Bacillus để kiểm soát các bệnh héo xanh do vi khuẩn R. solanacerum và bệnh
héo rủ do F. oxysporum trên cà chua và ớt. Các chủng vi khuẩn Bacillus
amilyliquefaciens và Brevibacillus brevis có khả năng kiểm soát bệnh héo
xanh do vi khuẩn R. solanacerum và bệnh héo vàng do nấm Fusarium spp. cả
trong nhà lưới và ngoài đồng (Trần Vũ Phến và ctv. tài liệu chưa công bố).
1.3 Sơ lược các loại nấm Fusarium sp., Sclerotium rolfsii và vi khuẩn
Ralstonia solanacearum.
1.3.1 Bệnh héo rủ gốc mốc trắng (Sclerotium rolfsii Sacc.)
Theo Vũ Triệu Mân (2007), cây bệnh héo rủ, xanh hoặc héo vàng. Cổ rễ
và đoạn thân ngầm bị bệnh có vết màu nâu, thối mục, khô xác, nhổ cây dễ bị
đứt gốc, trên gốc thân cây bệnh mọc lớp nấm trắng đâm tia lan rộng ra mặt
đất, hình thành nhiều hạch nấm hình tròn như hạt cải màu trắng, về sau có màu
nâu hạt chè. Theo khảo sát thấy ở Bắc bộ và Nghệ An do nấm Sclerotium

rolfsii Sacc gây ra.
Ngoài ra, hiện tượng héo rủ, thối gốc lở cổ rễ trên đồng ruộng với nhiều
màu sắc khó phân biệt còn có thể do nấm Rhizoctonia đôi lúc còn gặp cả bệnh
do nấm Fusarium solani, F. oxysporium hại ở gốc thân, cây héo rủ, lá vàng
(gọi là bệnh héo vàng).
Loại héo rủ gốc mốc trắng do Sclerotium rolfsii Sacc có sợi nấm trắng,
hạch non màu trắng, hạch già có màu nâu, tương đối tròn đồng đều, đường
kính 1 - 2 mm. Nấm Sclerotium rolfsii là loài nấm đa thực, phạm vi ký chủ rất
rộng, phá hại ở trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, khoai tây, cà, đậu
đỗ, đay.
Sợi nấm Sclerotium trực tiếp xâm nhập qua biểu bì, qua vết thương mà
phát triển thành đám sợi trắng ở cổ rễ, gốc thân làm mô bệnh thối mục, cây
khô chết. Trên đồng ruộng những loại nấm trên đều nhờ nước tưới, mưa gió
mà lan truyền.
Bệnh phát sinh, phát triển trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao, ẩm uớt,
cây sinh trưởng kém. Trên đất trồng độc canh, đất cát thô bệnh tương đối nặng
hơn. Riêng loại héo rủ gốc mốc đen, mốc trắng còn phát triển mạnh trên đất có
nhiều chất hữu cơ, tàn dư cây chưa hoai mục.
7

Bệnh xuất hiện trong suốt quá trình sinh trưởng của cây nhưng ở mỗi giai
đoạn sinh trưởng mức độ bệnh khác nhau, các loại bệnh héo rủ phá hại cũng
khác nhau. Ở giai đoạn cây con phân cành phần lớn bị bệnh héo rủ gốc mốc
đen và lở cổ rễ nhưng đến giai đoạn chớm hoa, củ non thì bị bệnh héo rủ nặng
hơn nhiều, phần lớn là héo rủ gốc mốc trắng, nhất là đối với lạc xuân và lạc vụ
thu, kể cả bệnh gây hại trên một số cây trồng khác như khoai tây, cà chua vụ
thu đông và vụ xuân muộn
1.3.2 Bệnh héo xanh vi khuẩn hại cà chua, khoai tây.
Ralstonia solanacearum
= Pseudomonas solanacearum (Smith) E.F. Smith

= Burkholderia solanacearủm (E.F Smith) Yabuuchi
Theo Vũ Triệu Mân (2007), bệnh héo xanh vi khuẩn do P. solanacearum
được Erwin Smith phát hiện đầu tiên trên cây họ cà ở Mỹ vào năm 1896. Cho
đến nay, bệnh phổ biến rất rộng ở hầu hết các châu Á, Phi, Mỹ, Úc, bệnh bắt
đầu xuất hiện ở châu Âu (Bỉ, Thụy Điển…) gây hại nghiêm trọng chủ yếu ở
các nuớc vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới có khí hậu nóng, ẩm. Bệnh gây hại trên
278 loài cây thuộc trên 44 họ thực vật khác nhau, trong đó đáng chú ý nhất là
các cây có ý nghĩa kinh tế cao như cà chua, khoai tây, thuốc lá, ớt, cà, lạc,
vừng, hồ tiêu, đậu tương, dâu tằm, chuối….
Bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn, giảm năng suất từ 5 - 100% tuỳ theo loài
cây, giống cây, vùng địa lý và nhiều yếu tố khác.
Bệnh xuất hiện trên cây con và cây lớn ra hoa đến thu hoạch. Khi cây
còn non (khoai tây, lạc…) toàn bộ lá héo rủ nhanh chóng đột ngột, lá tái xanh
và cây khô chết. Trên cây đã lớn thường dễ phát hiện trên đồng ruộng với các
triệu chứng rõ rệt: một hai cành, nhánh có lá bị héo rủ xuống, tái xanh, sau 2 -
5 ngày toàn cây héo xanh, trên thân vỏ vẫn còn xanh hoặc xuất hiện những sọc
nâu, vỏ thân phía gốc xù xì, thân vẫn rắn đặc. Cắt ngang thân, cành nhìn rõ
vòng bó mạch dẫn, mô xylem có màu nâu sẫm, bên trong bó mạch chứa đầy
dịch nhờn vi khuẩn, ấn nhẹ vào đoạn cắt hoặc ngâm đoạn cắt thân có mạch
dẫn màu nâu vào cốc nước có thể thấy dịch vi khuẩn ở trong chảy qua miệng
cắt ra ngoài. Đặc điểm này được coi là một cách chẩn đoán nhanh bệnh héo do
vi khuẩn. Khi cây đã héo, nhổ lên thấy rễ bị thâm đen, thối hỏngđối với khoai
tây, củ cũng nhiễm bệnh ở ngoài đồng cho tới kho bảo quản.
Cắt đôi củ bệnh thấy các vòng mạch dẫn nâu đen có giọt dịch vi khuẩn
màu trắng đục tiết ra trên bề mặt lát cắt bó mạch. Đây là loại bệnh thuộc kiểu
hại bó mạch xylem, tắc mạch dẫn gây hiện tuợng chết héo cây, dễ nhầm lẫn
8

với các bệnh héo do nấm hoặc các nguyên nhân khác gây ra song vẫn có thể
phân biệt đuợc.

Bệnh truyền lan từ cây này sang cây khác trên đồng ruộng nhờ nước
tưới, nước mưa, gió bụi, đất bám dính ở các dụng cụ dùng để vun xới, chăm
sóc cây. Vai trò của tuyến trùng bứu rễ Meloidogyne incognita và các loài
tuyến trùng khác hoạt động ở trong đất, tạo vết thương cho vi khuẩn lan
truyền, lây bệnh hỗn hợp rất đáng chú ý để ngăn ngừa.
Bệnh phát triển mạnh và nhanh trong điều kiện nhiệt độ cao, mưa gió,
nhất là ở trên đất cát pha, thịt nhẹ hoặc đất đã nhiễm vi khuẩn, trồng các giống
mẫn cảm với bệnh từ trủớc. Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự
phát sinh phát triển của bệnh. Nhiệt độ thích hợp nhất là lớn hơn 30
0
C. Triệu
chứng xuất hiện rõ trên cây khi mà nhiệt độ ít nhất phải trên 20
0
C và nhiệt độ
đất phải > 14
0
C, ẩm độ cao, tưới nhiều, tưới ngập rãnh đều là điều kiện tốt cho
bệnh xâm nhiễm phát triển mạnh, truyền lan dễ dàng. Đất khô ải hoặc ngâm
nước dài ngày (luân canh lúa nước), bón phân đạm hữu cơ, phân hoai mục với
lượng cao (thâm canh) đều có khả năng làm giảm bệnh.
Nguồn bệnh vi khuẩn đầu tiên lưu truyền qua đất, tàn dư cây bệnh và củ
giống (khoai tây…). Ở trong đất vi khuẩn có thể bảo tồn sức sống lâu dài tới 5
- 6 năm hoặc 6 - 7 tháng tuỳ thuộc vào ảnh huởng của nhiệt độ, độ ẩm, loại
đất, các yếu tố sinh vật và các yếu tố khác.
1.3.3 Bệnh héo vàng do Fusarium sp.
Theo Vũ Triệu Mân (2007), bệnh héo vàng do nấm Fusarium sp. đuợc
mô tả đầu tiên bởi Masse G.E ở Anh vào năm 1895.
Bệnh có khắp trên thế giới nhưng chủ yếu ở vùng nhiệt đới đặc biệt là ở
Việt Nam.
Cây con bị bệnh còi cọc, kém phát triển, sau bị chết. Cây trưởng thành bị

bệnh các lá phía dưới gốc thường biến vàng, ban đầu từ một lá chét của một
bên cây, sau đó lan ra toàn cây; lá héo rủ, màu vàng, không bị rụng. Vết bệnh
ở trên thân sát mặt đất hoặc cổ rễ màu nâu, vết bệnh lớn dần làm khô tóp cả
đoạn thân sát mặt đất, bộ rễ phát triển kém, rễ bị thối dần. Khi trời ẩm, trên
mặt vết bệnh có lớp nấm màu hồng nhạt, chẻ dọc thân thấy bó mạch libe có
màu nâu. Cây bị bệnh ban ngày héo, ban đêm phục hồi, cây sinh trưởng kém.
Sau 1 tuần đến 1 tháng cây sẽ chết hoàn toàn.
Nấm có 3 chủng sinh lý. Chủng 1 phân bố rộng khắp thế giới; chủng 2
được tìm thấyở bang Ohio (1940), Florida (Mỹ), Australia, Brazil, Anh,
9

Mehico (1961); chủng 3 có ở Brazil, California và Florida (Mỹ), Bowen
(Australia).
Bệnh phát triển ở nơi có thời tiết ấm, trên đất cát và đất chua. Nấm tồn
tại trong đất vài năm, nhiệt độ thích hợp là 28
0
C. Bệnh phát sinh phát triển
mạnh vào tháng 4, 5 hại cà chua vụ đông xuân và xuân hè; bệnh xuất hiện ở
tháng 9, 10 gây hại cà chua vụ đông sớm.
Phân bón có ảnh huởng đến tính độc của nấm: tính độc của nấm tăng khi
bón phân vi lượng, phân lân, đạm amôn; tính độc của nấm giảm khi bón đạm
nitrat (Jones , 1993). Nấm truyền lan qua hạt giống, cây con bị nhiễm trước
khi trồng hoặc do gió, nước, công cụ làm đất, v.v…. Nấm có thể tồn tại trong
đất nhiều năm (Dhesi et al.,1968).
1.4 Dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi khuẩn
1.4.1 Thành phần tế bào vi khuẩn
Trong tế bào vi sinh vật, các hợp chất được phân thành hai nhóm lớn:
nước và các muối khoáng, các chất hữu cơ (Lê Văn Hoàng, 2007; Nguyễn Lân
Dũng và ctv., 2007):
Nước và muối khoáng: nước chiếm đến 70 - 90 % khối lượng cơ thể vi

sinh vật. Phần nước có thể tham gia vào quá trình trao đổi chất của vi sinh vật
được gọi là nước tự do. Đa phần nước trong vi sinh vật đều ở dạng nước tự do.
Nước kết hợp là phần nước liên kết với các hợp chất hữu cơ cao phân tử trong
tế bào. Nước liên kết mất khả năng hoà tan và lưu động. Muối khoáng chiếm
khoảng 2 - 5 % khối lượng khô của tế bào. Chúng thường tồn tại dưới các
dạng muối sulfate, phosphate, carbonate, chloride Trong tế bào chúng thường
ở dạng các ion. Các ion trong tế bào vi sinh vật luôn luôn tồn tại ở những tỷ lệ
nhất định, nhằm duy trì độ pH và áp suất thẩm thấu thích hợp cho từng loại vi
sinh vật.
1.4.2 Nhu cầu dinh dưỡng và môi trường nuôi cấy vi khuẩn
Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật quyết định nhu cầu dinh
dưỡng của chúng. Thành phần hoá học của các chất dinh dưỡng được cấu tạo
từ các nguyên tố C, H, O, N, các nguyên tố khoáng đa vi lượng. Theo
Madigan et al., (1997), vai trò của các nhóm chất dinh dưỡng như sau:
- Nhóm nguyên tố đa lượng
Carbon, nitrogen, oxygen và hydrogen là các nguyên tố đa lượng vi
khuẩn đòi hỏi với lượng lớn. Carbon chiếm 50% trọng lượng khô của tế bào,
là nguyên tố chính cấu tạo nên các đại phân tử. Nitrogen là nguyên tố quan
10

trọng thứ hai sau carbon trong tế bào vi khuẩn, nitrogen chiếm khoảng 12%
trọng lượng khô. Nitrogen là thành phần chính của protein, nucleic acid …
Phần lớn vi khuẩn thích sử dụng đạm NH
3
và cũng có thể sử dụng NO
3
-
, còn
N
2

chỉ sử dụng được bởi vi khuẩn cố định đạm. Theo Biền Văn Minh và ctv.,
(2006) thì các hợp chất hữu cơ chứa cả C và N (pepton, nước thịt, nước chiết
ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu, ) có thể
sử dụng vừa làm nguồn C vừa làm nguồn N đối với vi sinh vật. Trong công
nghiệp lên men, rỉ đường là nguồn carbon rẻ tiền và rất thích hợp cho sự phát
triển của nhiều loại vi sinh vật khác nhau. Oxygen và hydro được vi sinh vật
lấy từ nước, các hợp chất vô cơ và hữu cơ có hydro và oxygen.
Ngoài 4 nguyên tố C, H, O, N, các nguyên tố đa lượng khác cũng rất cần
cho sự tăng trưởng của vi khuẩn như P, S, K,… P cần cho vi khuẩn để tổng
hợp nucleic acid và phospholipids. S giữ vai trò quan trọng trong cấu trúc
amino acid, cystein, biotine, lipoic acid và cả coenzyme A. K rất cần thiết cho
tất cả vi sinh vật vì K cần thiết cho hầu hết các enzyme đặc biệt là các enzyme
có liên quan trong quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn. Mg giữ chức năng
ổn định ribosome, màng tế bào, nucleic acid và cần cho hoạt động của
enzyme. Ca không cần thiết nhiều cho sự phát triển của vi sinh vật. Ca giúp ổn
định vách tế bào và đóng vai trò ổn định nhiệt của endospore của tế bào vi
khuẩn. Na cần thiết cho một số vi khuẩn và nhu cầu về Na thường liên quan
với sự thích nghi của vi sinh vật đó trong môi trường sống, như trong môi
trường nước biển, hàm lượng Na cao nên các vi sinh vật biển thường đòi hỏi
cho sự phát triển, trong khi ở môi trường nước ngọt các loài vi sinh vật vẫn có
thể phát triển trong sự vắng mặt của Na. Fe tuy được xem là nguyên tố vi
lượng nhưng sắt được yêu cầu nhiều hơn các nguyên tố kim loại khác bởi vi
sinh vật. Fe có vai trò chính trong hô hấp của tế bào, là thành phần nồng cốt
của các sắc tố và các protein liên kết với lưu huỳnh có liên quan trong quá
trình vận chuyển điện tử. Tuy nhiên phần lớn các sắt vô cơ trong tự nhiên
thường ít hòa tan nên vi sinh vật lấy sắt bằng cách tiết ra các gốc thích sắt
(siderophores) có tác dụng hòa tan các muối sắt và vận chuyển vào trong tế
bào. Những gốc thích sắt này là dẫn xuất của các phức chất màu và có sự ái
lực cao đối với sắt.
- Nhóm nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố vi lượng là các kim loại như Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se,
Zn, … Tuy vi sinh vật chỉ yêu cầu các nguyên tố này với số lượng nhỏ nhưng
các nguyên tố này giữ vai trò rất quan trọng như các nguyên tố đa lượng.
Nhiều loại đóng vai trò trong cấu trúc của nhiều loại enzyme. Do yêu cầu của
vi sinh vật thấp nên trong nuôi cấy vi sinh vật không cần thiết bổ sung thêm
11

các nguyên tố vi lượng vào trong môi trường, ngoại trừ trường hợp nước cất
và hóa chất sử dụng quá tinh khiết không chứa khoáng.
- Các chất hổ trợ tăng trưởng
Các chất hổ trợ tăng trưởng là những phức hợp hữu cơ như vitamin,
amino acid, purine và pyrimidine,… Giống như các nguyên tố vi lượng, vi
khuẩn yêu cầu chúng với lượng rất thấp. Mặc dù hầu hết vi sinh vật có thể
tổng hợp tất cả các phức chất này, tuy nhiên một số loài vi sinh vật vẫn cần
được bổ sung nhân tố này từ bên ngoài.
- Môi trường nuôi cấy
Trong nuôi cấy vi sinh vật có hai loại môi trường chính: loại môi trường
có thành phần hóa học xác định và loại môi trường có thành phần hóa học
không xác định, mỗi loại đều có những ưu khuyết điểm. Ở môi trường có hàm
lượng hóa chất xác định có ưu điểm là giúp xác định được các thành phần dinh
dưỡng mà vi sinh vật cần cũng như biết được hóa chất ức chế sự phát triển của
chúng, tuy nhiên môi trường này thường đắt tiền. Còn ở môi trường có thành
phần hóa chất không xác định như môi trường sữa, thịt bò, đậu nành,… có
thuận lợi là dễ thực hiện vì nguồn nguyên liệu dễ tìm trong tự nhiên, rẻ tiền,
tuy nhiên do không có thành phần hóa chất xác định nên khó khăn trong các
nghiên cứu sâu về yêu cầu dinh dưỡng chi tiết của vi sinh vật.
Ở mỗi loại vi sinh vật khác nhau có sự khác biệt nhau về yêu cầu dinh
dưỡng rất lớn, một môi trường nuôi cấy nào đó thích hợp cho sự phát triển của
vi sinh vật này nhưng lại không thích hợp cho vi sinh vật khác. Nên việc tìm
ra môi trường nuôi cấy tốt cho vi sinh vật đòi hỏi phải biết được nhu cầu dinh

dưỡng của vi sinh vật đó và cung cấp cho chúng trong môi trường nuôi cấy.
Hiện nay, môi trường King’s B là môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông
thường nhất và thích hợp cho sự tạo sắc tố huỳnh quang. Tuy nhiên, không
phải tất cả các vi sinh vật đều tạo huỳnh quang trên môt trường này (Madigan
at al, 1997).