Phân tích khác biệt di truyền của các quần thể cây khôi nhung (ardisia silvestris pitard) bằng chỉ thị phân tử rapd

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN TÍCH KHÁC BIỆT DI TRUYỀN CỦA CÁC QUẦN
THỂ CÂY KHÔI NHUNG (Ardisia silvestris Pitard) BẰNG CHỈ
THỊ PHÂN TỬ RAPD

NGUYỄN HOÀNG UYÊN

Đà Nẵng, năm 2023


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH - MƠI TRƯỜNG
⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN TÍCH KHÁC BIỆT DI TRUYỀN CỦA CÁC QUẦN
THỂ CÂY KHÔI NHUNG (Ardisia silvestris Pitard) BẰNG CHỈ
THỊ PHÂN TỬ RAPD

Ngành: Cơng nghệ sinh học
Khóa: 2019- 2023
Sinh viên: Nguyễn Hoàng Uyên
Người hướng dẫn: TS. Trần Quang Dần

Đà Nẵng, năm 2023


LỜI CAM ĐOAN

Tơi cam đoan các dữ liệu trình bày trong khóa luận này là trung thực. Đây là kết
quả nghiên cứu của tác giả và chưa từng được công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác
trước đây. Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm nếu vi phạm bất kì quy định nào về đạo đức
khoa học.
Người cam đoan

Nguyễn Hoàng Uyên

i


LỜI CẢM ƠN

Để hồn thành khóa luận tốt nghiệp này, tôi xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Bộ
môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh- Môi trường, Trường đại học Sư phạm - Đại học Đà
Nẵng.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Quang Dần - người trực tiếp
hướng dẫn cũng như tận tình chỉ dạy, hướng dẫn, định hướng tư duy, giúp đỡ tôi trong
suốt q trình thực hiện đề tài.
Tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Sinh - Môi trường đã giúp đỡ,
động viên tơi trong suốt q trình tơi thực hiện khóa luận của mình.
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình, bạn bè đã ln
động viên, khích lệ tơi cả về vật chất lẫn tinh thần để tơi có thể đạt được kết quả tốt nhất.
Đà Nẵng, ngày 15 tháng 05 năm 2023

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Hoàng Uyên

ii


MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ...............................................................................................................i
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................................. 1
2. Mục tiêu đề tài ............................................................................................................... 2
3. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................................... 2
3.1. Ý nghĩa khoa học ........................................................................................................ 2
3.2. Ý nghĩa thực tiễn......................................................................................................... 2
4. Nội dung nghiên cứu...................................................................................................... 3
4.1. Ảnh hưởng của khối lượng mẫu và thời gian ủ đến chất lượng DNA tổng số cây
Khôi nhung ........................................................................................................................ 3
4.2. Ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi đến chất lượng phản ứng PCR ..................................... 3
4.3. Xác định sự khác biệt di truyền của các quần thể cây Khôi nhung bằng chỉ thị phân
tử RAPD. ........................................................................................................................... 3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 4
1.1. Giới thiệu về cây khôi nhung ...................................................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm thực vật học ............................................................................................. 5
1.1.2. Giá trị dược liệu ....................................................................................................... 5
1.2. Hiện trạng nghiên cứu đa dạng di truyền và giá trị dược liệu của chi Ardisia ........... 6
1.2.1. Trong nước............................................................................................................... 6
1.2.2. Ngoài nước............................................................................................................... 7
1.3. Các chỉ thị phân tử dựa trên phản ứng PCR trong nghiên cứu đa dạng di truyền ...... 8

1.3.1. Kỹ thuật RAPD ........................................................................................................ 8
1.3.1.1. Cơ sở kỹ thuật RAPD ............................................................................................ 8

iii


1.3.1.2. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD .............................................................................. 9
1.3.2. Kỹ thuật ISSR ........................................................................................................ 11
1.3.3. Kỹ thuật AFLP ....................................................................................................... 12
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 13
2.1. Vật liệu nghiên cứu ................................................................................................... 13
2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................................. 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 13
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................................ 13
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu ...................................................................................................... 13
2.3.3. Điện di ................................................................................................................... 16
2.3.4. Phân tích khác biệt di truyền của các quần thể cây Khôi nhung ........................... 16
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 18
3.1. Ảnh hưởng của khối lượng mẫu và thời gian ủ đến chất lượng DNA tổng số cây
Khôi nhung......................................................................................................................... 18
3.1.1. Ảnh hưởng của khối lượng mẫu đến chất lượng DNA tổng số cây Khôi nhung .. 18
3.1.2. Khảo sát thời gian ủ CTAB trong quá trình tách chiết ......................................... 18
3.2. Khảo sát nhiệt độ gắn mồi trong phản ứng PCR ..................................................... 21
3.3. Xác định sự khác biệt di truyền của quần thể Khôi nhung bằng chỉ thị phân tử
RAPD ............................................................................................................................... 23
3.3.1. Tính đa hình của các mồi RAPD ........................................................................... 23
3.3.2. Sự khác biệt di truyền của các quần thể cây Khôi nhung ...................................... 25
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 28
1. Kết luận ........................................................................................................................ 28
2. Kiến nghị .................................................................................................................... 28

iv


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Cs

Cộng sự

CI

Chloroform: isoamylalcohol

TAE

Tris- acetate- EDTA

TBE

Tris- borate- EDTA

TE

Tris- EDTA

CTAB

Cetyltrimethylammonium bromide

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

PIC

Polymorphic Information Content

v


DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng

Tên bảng

Trang

2.1.

Thông tin các mẫu lá khôi nhung sử dụng trong nghiên cứu

13

2.2.

Trình tự các đoạn mồi RAPD sử dụng trong nghiên cứu

16

3.1.

Hàm lượng DNA tổng số, giá trị OD 260/ 280 và OD 160/ 230 được

21

tách theo các điều kiện tốt nhất đã được khảo sát
3.2.

Các chỉ số đánh giá tính đa hình của quần thể 11 mẫu Khôi nhung

23

được khuếch đại bới 04 mồi RAPD
3.3.

Hệ số tương đồng di truyền 11 mẫu Khôi nhung được khuếch đại
bằng chỉ thị RAPD

vi

26


DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình

Tên hình

Trang

1.1.

Cây Khơi nhung ngồi tự nhiên

4

3.1.

Điện di DNA tổng số được tách chiết với các khối lượng mẫu khác

18

nhau
3.2.

Điện di DNA tổng số được tách chiết với các thời gian ủ khác nhau

19

3.3.

DNA tổng số các mẫu được sử dụng trong phản ứng PCR

20

3.4.

Khảo sát các nhiệt độ gắn mồi RAPD

22

3.5.

Điện di các mẫu Khôi nhung bằng mồi RAPD OPA08

24

3.6.

Điện di các mẫu Khôi nhung bằng mồi RAPD OPB18

24

3.7.

Điện di các mẫu Khôi nhung bằng mồi RAPD OPC11

25

3.8.

Điện di các mẫu Khôi nhung bằng mồi RAPD B28

26

3.9.

Cây phân loại di truyền 11 mẫu Khôi nhung nghiên cứu được khuếch

27

đại bằng chỉ thị RAPD

vii


TĨM TẮT

Khơi nhung (Ardisia silvestris Pitard) là một cây thuốc có giá trị trong điều trị bệnh.
Ở Việt Nam, cây chỉ phân bố ở một số nơi và các nghiên cứu về sự đa dạng di truyền của
cây Khôi nhung vẫn còn hạn chế. Trong nghiên cứu này, sự khác biệt về mặt di truyền
của các quần thể cây Khôi nhung phân bố ở: Sơn Trà, Hà Giang và cây in vitro được
đánh giá bằng chỉ thị RAPD. DNA được tách chiết bằng phương pháp CTAB với khối
lượng mẫu 30 mg và thời gian ủ 90 phút. Các mồi lựa chọn cho phân tích bắt cặp tốt nhất
ở nhiệt độ 35℃. Phản ứng PCR được thực hiện với 4 mồi RAPD đều cho các băng đa
hình. Có tổng số 103 băng được khuếch đại từ 4 mồi RAPD, với tỷ số băng đa hình đạt
62,5%. Hệ số đa dạng PIC của các mồi thấp nhất là 0,3752 (mồi OPC11) và cao nhất là
0,4742 (mồi OPA08), hệ số đa dạng trung bình đạt 0,3928. Biểu đồ hình cây thể hiện mối
quan hệ di truyền giữa 11 mẫu Khôi nhung được phân tích qua chỉ thị RAPD, biểu đồ di
truyền 2 quần thể Khôi nhung dựa trên chỉ thị RAPD cho thấy 2 quần thể Khôi nhung ở
tỉnh Hà Giang và bán đảo Sơn Trà nghiên cứu được phân làm 2 nhánh riêng biệt với hệ
số tương đồng di truyền trong khoảng 0,38- 0,85. Vậy giữa các quần thể Khơi nhung có
sự khác biệt di truyền với nhau.
Từ chìa khóa: RAPD, Ardisia silvestris Pitard, Khôi nhung, CTAB.

viii

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Khơi nhung (Ardisia silvestris Pitard) tên Tiếng Việt: Lá khơi, Khơi tía, Cơm
nguội rừng, Đơn tướng quân. Khôi nhung được phát hiện phân bố ở Việt Nam và Trung
Quốc (Hải Nam). Trong một số nghiên cứu cho thấy, cây Khơi nhung có chứa các hợp
chất sinh học như tinh dầu, chất béo, alkaloid, flavonoid, coumarin, tanin, anthocyanoid,
các acid hữu cơ, chất khử, proanthocyanidin, saponin, và anthraquinon (Huỳnh Văn Biết
& cs, 2020). Theo y học cổ truyền, cây khơi nhung có tác dụng chống oxy hóa, kháng
khuẩn, chống viêm, làm se vết loét, làm liền sẹo và giảm sự gia tăng acid dạ dày (Đỗ Tất
Lợi, 2006). Hiện nay, nhu cầu sử dụng cây Khôi nhung làm dược liệu làm thuốc ngày
càng cao, trong đó có cây. Khơi nhung nên dẫn đến hiện tượng khai thác quá mức làm
cho số lượng cây trong tự nhiên giảm. Do đó, cây Khơi nhung được liệt kê vào sách đỏ
Việt Nam (2007), “thuộc loài “sẽ nguy cấp”, chỉ khai thác có mức độ và giữ lại những
cây con chưa đến tuổi thu hái, cấm khai thác loài này trong vườn quốc gia”.
Kỹ thuật chỉ thị phân tử đang trở nên phổ biến và ngày càng phát triển, đặc biệt
trong lĩnh vực ứng dụng các chỉ thị phân tử rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân
tích đa dạng sinh học, xác định khoảng cách di truyền và đặc trưng cá thể và quần thể
thực vật nhằm mục đích bảo tồn và chọn giống (Nguyễn Đức Thành, 2014). Khác với các
chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh), chỉ thị DNA khơng giới hạn về
số lượng, không ảnh hưởng bởi yếu tố môi trường và giai đoạn phát triển của cây. Các kỹ
thuật chỉ thị DNA ngày càng phát triển như: RAPD, AFLP, ISSR, SSR,… cho phép đánh
giá mối quan hệ di truyền giữa các cá thể, quần thể một cách dễ dàng và nhanh chóng
(Nguyễn Đức Thành, 2014). Các phương pháp đánh giá bằng chỉ thị phân tử khác nhau
về đặc điểm cũng như sự phong phú của bộ gen, mức độ đa hình được phát hiện, tính đặc
hiệu của locus, độ tái lập, yêu cầu kỹ thuật cũng như chi phí. Chỉ thị RAPD thuận lợi hơn
so với các chỉ thị khác là vì nó đơn giản nhất, tiết kiệm chi phí, nhanh, u cầu lượng
DNA ít và có thể được thực hiện trong một phịng thí nghiệm vừa phải cho hầu hết các
ứng dụng của nó.

1


Ở Việt Nam, cây Khơi nhung được tìm thấy ở một số vùng núi phía Bắc và Trung
như Lào Cai (Sa Pa), Lạng Sơn (Hữu Lũng), Cao Bằng, Hà Giang, Quảng Ninh, Vĩnh
Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Ba Vì), Ninh Bình (Cúc Phương), Thanh Hóa (Lang Chánh,
Ngọc Lạc, Thạch Thành), Nghệ An (Quỳ Châu), Quảng Trị, Thừa Thiên- Huế (Phú Lộc),
Đà Nẵng. Sự phân bố ở các vị trí địa lý, môi trường sống khác nhau dẫn đến khả năng
phát sinh những đột biến tự nhiên hoặc tái tổ hợp di truyền. Thơng qua một số tài liệu cho
thấy hình thái lá của các quần thể khác khu điều kiện sống là có sự biến đổi. Bên cạnh đó,
đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứu nào tại Việt Nam được công bố đánh giá biến
đổi di truyền giữa các quần thể cây Khôi nhung. Các nghiên cứu về cây Khơi nhung chỉ
có một số báo cáo ở các nghiên cứu nhân giống in- vitro, tái sinh callus (Đức Trần Minh,
2021), đánh giá các hoạt tính dược liệu (Huỳnh Văn Biết & cs, 2020) của chúng.
Trong nghiên cứu này, phân tích sự khác nhau di truyền được thực hiện đối với các
mẫu cây Khôi nhung được thu từ các quần thể khác nhau, bao gồm: cây từ Sơn Trà - Đà
Nẵng, cây từ Hà Giang và cây in vitro tái sinh từ cây Sơn Trà. Qua đó đề tài nghiên cứu
được thực hiện với mục đích đánh giá khác biệt di truyền giữa các quần thể cây Khơi
nhung góp phần vào sự bảo tồn loài cây này hiệu quả hơn.
2. Mục tiêu đề tài
Đánh giá được sự khác biệt di truyền giữa các quần thể cây Khôi nhung, bao gồm:
quần thể Khôi nhung Sơn Trà, quần thể Khôi nhung Hà Giang và cây Khôi nhung tái sinh
in vitro.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Cung cấp thông tin khoa học về sự khác biệt di truyền giữa các quần thể cây Khôi
nhung ở bán đảo Sơn Trà và cây Khơi nhung ở tỉnh Hà Giang nói riêng và sự khác biệt di
truyền của các quần thể cây Khơi nhung nói chung.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu về mối tương quan di truyền
của cây khôi nhung sau này, góp phần trong việc bảo tồn và sử dụng hiệu quả các nguồn
gen quý. Ngoài ra, nền tảng khoa học của khóa luận là nguồn tài liệu tham khảo phục vụ
cho công tác giảng dạy.
2


4. Nội dung nghiên cứu
4.1. Ảnh hưởng của khối lượng mẫu và thời gian ủ đến chất lượng DNA tổng số cây
Khôi nhung
- Ảnh hưởng của khối lượng mẫu đến chất lượng DNA tổng số: được khảo sát ở các
nghiệm thức 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg và 40 mg.
- Ảnh hưởng của thời gian ủ đến chất lượng DNA tổng số: được khảo sát ở các
nghiệm thức 60 phút, 75 phút, 90 phút và 120 phút.
4.2. Ảnh hưởng nhiệt độ gắn mồi đến chất lượng phản ứng PCR
Phản ứng PCR khuếch đại các đoạn đa hình ngẫu nhiên với các mồi thiết kế được
tiến hành ở các nhiệt độ gắn mồi: 33℃, 35℃ và 37℃. Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi
đến chất lượng phản ứng được đánh giá qua sản phẩm sau phản ứng PCR.
4.3. Xác định sự khác biệt di truyền của các quần thể cây Khôi nhung bằng chỉ thị
phân tử RAPD.
Các mẫu cây Khôi nhung ở các quần thể bao gồm: 5 mẫu Sơn Trà, 3 mẫu Hà Giang
và 3 mẫu tái sinh từ cây in vitro. Sự khác biệt di truyền của các quần thể được đánh giá
qua sản phẩm sau phản ứng RAPD – PCR.

3


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu về cây khơi nhung

Phân loại khoa học:
Giới:

Plantae

Bộ:

Ericales

Họ:

Myrsinaceae

Chi:

Ardisia

Lồi:

Ardisia silvestris Pitard

Tên tiếng việt: khơi nhung
Tên gọi khác: lá khơi, khơi tía, cơm nguội rừng, đơn tướng qn

Hình 1.1. Cây Khơi nhung ngồi tự nhiên
Cây khơi nhung có vùng phân bố rộng ở các tỉnh miền núi phía Bắc và Trung như
Lào Cai (Sa Pa), Lạng Sơn (Hữu Lũng), Cao Bằng, Hà Giang, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc
(Tam Đảo), Hà Tây (Ba Vì), Ninh Bình (Cúc Phương), Thanh Hóa (Lang Chánh, Ngọc
Lạc, Thạch Thành), Nghệ An (Quỳ Châu), Quảng Trị, Thừa Thiên- Huế (Phú Lộc), Đà
Nẵng. Và cây khôi nhung phân bố trên thế giới Trung Quốc (Hải Nam, Quảng Tây).

4


1.1.1. Đặc điểm thực vật học
Cây khơi nhung ưa bóng dưới tán rừng rậm ẩm ướt, phát triển tốt trên lớp đất nhiều
mùn trong rừng nguyên sinh, ở độ cao từ 400- 1200m. Khôi nhung phân bố chủ yếu ở các
rừng thứ sinh, khe suối, nơi có khí hậu ẩm mát, độ cao từ 300- 600m, nhiệt độ trung bình
khoảng từ 20- 24℃, độ ẩm khơng khí trung bình từ 81- 84%, lượng mưa từ 1195,6mm1648,9 mm, độ che sáng từ 50- 70%. Đất nơi Khơi nhung phân bố có màu từ xám nhạt
đến xám đen, tầng đất mặt rất tơi xốp, nhiều mùn (Lý Đức Long, 2020).
Là 1 loài thực vật có hoa trong họ anh thảo. Khơi nhung là 1 loại cây nhỏ, mọc
thẳng đứng, cao chừng 1,5- 2cm, thân rỗng, xốp, ít phân nhánh hay khơng phân nhánh,
gần trên ngọn có nhiều lá. Lá mọc so le, phiến lá nguyên, mép có răng cưa nhỏ và mịn,
dài 25- 40cm, rộng 60- 10cm. Mặt trên tím, gân nổi hình mạng lưới (Đỗ Tất Lợi, 2006).
Thời gian ra hoa vào tháng 4- 7. Hoa mọc thành chùm, dài 10-15cm, hoa rất nhỏ,
chùm kép ngoài nách lá; cọng hoa 10-12mm; lá đài cao 1,5mm; cánh hoa 3mm, màu
trắng pha hồng tím 5 lá đài 5 cánh hoa.Lá đài hình tam giác hoặc thn, nhọn. Cánh hoa
màu hồng, hình mác, dài 3 mm, đầu tù hoặc nhọn, có điểm tuyến. Nhị ngắn hơn cánh
hoa, bao phấn hình mác nhọn, chỉ nhị rất ngắn. Quả mọng, khi chín có màu đỏ. Hạt đơn,
hình cầu, lõm ở gốc. Tái sinh bằng hạt và chồi. Có quả vào tháng 9- 1 và 1- 2 năm sau
(Đỗ Tất Lợi, 2006).
1.1.2. Giá trị dược liệu
Khôi nhung được liệt kê vào sách đỏ Việt Nam (2007), thuộc lồi “sẽ nguy cấp”,
chỉ khai thác có mức độ và giữ lại những cây con chưa đến tuổi thu hái, cấm khai thác
loài này trong vườn quốc gia. Một số nghiên cứu cho thấy, trong cây khơi nhung có chứa
các hợp chất sinh học như tinh dầu, chất béo, alkaloid, flavonoid, coumarin, tanin,
anthocyanoid, carotenoid, các acid hữu cơ, chất khử, proanthocyanidin, saponin và
anthraquinon (Huỳnh Văn Biết & cs, 2020).
Theo y học cổ truyền, cây Khơi nhung có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn,
chống viêm, làm se vết loét, làm liền sẹo và giảm sự gia tăng acid dạ dày ( Đỗ Tất Lợi,

2006). Khôi nhung được hầu hết các đồng bào trên cộng đồng các dân tộc ở tỉnh Thái
Nguyên và một số đồng bào nơi khác sử dụng làm vị thuốc chính trong các bài thuốc
5


chữa các bệnh viêm loét dạ dày vô cùng hiệu quả. Lá khôi nhung chứa hàm lượng cao
tannin và glucosid, hai nhóm chất này có tác dụng điển hình như làm se vết loét, chống
viê, làm liền sẹo, giúp làm giảm bớt ợ chua, nóng rát vùng thượng vị, đồng thời kích
thích lên da non, làm lành tổn thương ở dạ dày, tá tràng nhanh chóng, từ đó giúp bệnh
nhân cảm thấy dễ chịu. (Lê Thị Thanh Hương & cộng sự, 2020).
1.2. Hiện trạng nghiên cứu đa dạng di truyền và giá trị dược liệu của chi Ardisia
1.2.1. Trong nước
Nghiên cứu của Huỳnh Văn Biết và cộng sự (2020) phân tích thành phần hóa thực
vật và xác định khả năng chống oxy hóa và kháng khuẩn của dịch chiết từ lá của cây
Khôi nhung, kết quả cho thấy lá cây Khơi nhung có chứa các hợp chất như tinh dầu, chất
béo, alkaloid, flavonoid, coumarin, tanin, anthocyanoid, carotenoid, các acid hữu cơ, chất
khử, proanthocyanidin, saponon và anthraquinon. Hàm lượng polyphenol có trong lá cây
Khôi nhung là 0,26% chất khô. Hàm lượng tanin của lá cây Khôi nhung là 8,80%. Hàm
lượng Flavonoid của lá cây Khôi nhung là 1,442 mg/g. Dịch chiết ethyl acetate và dịch
chiết nước của lá cây Khôi nhung có khả năng kháng oxy hóa, nhưng thấp hơn so với
acid ascorbic lần lượt là 4,2 và 4,4 lần. Dịch chiết ethyl acetate của lá cây Khơi nhung có
hoạt tính oxy háo cao nhất. Các dịch chiết ethyl acetate và dịch chiết ethanol thể hiện rõ
tính kháng vi khuẩn thơng qua đường kính vịng vơ khuẩn, đối với vi khuẩn E.coli lần
lượt từ 9,67mm đến 20,67mm và Salmonella. sp là 14,67mm và 15,33 mm, không thể
hiện đối với vi khuẩn Staphylococus aureus.
Nghiên cứu của Đức Trần Minh và cộng sự (2021), tái sinh in vitro qua cơ chế phát
sinh callus các đoạn lá, nốt sần và mẫu cấy từ thân cây trưởng thành để tạo mô sẹo và tái
sinh thực vật Ardisia silvestris Pitard. Nghiên cứu đã chứng minh rằng trong mơi trường
tói ưu cho cảm ứng mơ sẹo từ ba loại mẫu cấy được xác định là chất dinh dưỡng cơ
Murashige và Skoog (MS) được bổ sung 1,0mg TDZ và 0,8% agar. Môi trường này đạt

tỷ lệ cảm ứng mô sẹo > 80%. Môi trường bổ sung 1mg TDZ và 0,4 mg IAA có hiệu quả
nhất trên sự cảm ứng chồi, với tỷ lệ cảm ứng chồi cao nhất và số chồi trên mẫu lá (85%
và 14,6 tương ứng). Đối với sự ra rễ của chồi, môi trường MS bổ sung 1,5mg IBA cho
thấy tỷ lệ tái sinh rễ cao nhất (90%).

6


Trong nghiên cứu tác dụng của chế phẩm HPmax trong điều trị loét hành tá tràng có
Helicobacter pylori của Phạm Bá Tuyến (2014). Trong nghiên cứu này chế phẩm kết hợp
cây cao khô, chè dây, dạ cẩm và lá khôi kết quả cho thấy Hpmax có tác dụng chống loét
dạ dày, tá tràng, giảm đau, liền sẹo, giảm thể tích dịch rỉ viêm, chống viêm mãn tính.
Trong nghiên cứu cho thấy lá khơi có tác dụng chống viêm cấp, làm giảm độ phù chân
chuột rõ rệt và cho thấy tác dụng chống viêm của lá khôi mạnh xấp xỉ bằng 2/3 tác dụng
chống viêm của Analgin liều 100mg/kg thể trọng. Nghiên cứu lá khơi trên mơ hình gây
đau bằng tiêm màng bụng chuột acid acetic. Kết quả cho thấy với dịch chiết lá khơi tỷ lệ
1:1 có tác dụng giảm đau rõ rệt. Tác dụng diệt HP với nghiên cứu cao lỏng là khơi 1:1 và
mẫu dịch chiết flavonoid tồn phần của là khơi đều có tác dụng ức chế vi khuẩn đối với
vi khuẩn Gr(+) và Bacillus sp.
1.2.2. Ngoài nước
Theo nghiên cứu của Ae Kyng Lee và cs (2003) phân tích mối quan hệ di truyền
của Ardisia spp sử dụng chỉ thị phân tử RAPD. Ba loài Ardisia là A. latexilla, A.japonica
và A. cranata có nguồn gốc từ miền nam Hàn Quốc, Nhật Bản và Trung Quốc và được
bán trên thị trường như một loại cây cảnh lấy quả mọng. Mối quan hệ di truyền giữa ba
cây Ardisia bản địa này được thu thập từ các địa điểm khác nhau ở Hàn Quốc cũng như
Ardisia bán trên thị trường không rõ nguồn gốc đã được điều tra bằng cách phân tích các
dấu hiệu DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên. Các loại mồi tùy ý 10 mer oligonucleotide
và 12 mer oligonucleotide tạo ra tổng cộng 78 dải đa hình khác nhau, từ 400 bp đến 2000
bp. Các loại của mỗi lồi Ardisia được nhóm lại với nhau bằng biểu đồ dendrogram. Tại
giá trị khoảng cách euclid bình phương là 15 Ardisia được chia thành 2 nhóm lớn, nhóm

chính bao gồm A. latexilla và A. japonica và một nhóm khác của A. crenata. Vì vậy nó
được coi là A. latexilla và A. japonica có quan hệ họ hàng gần với nhau hơn là A.crenata.
được xây dựng bằng cách sử dụng khoảng cách bình phương là 10,0. A. purilla liên kết
chặt chẽ với A. japonica hơn A. crenata. A. japonixa hiện được bán trên thị trường trong
lĩnh vực trồng tọt và vườn ươm có quan hệ họ hàng gần nhất với một loài thực vật bản
địa từ Jindo, Hàn Quốc.
Sự đa dạng di truyền của ba loài Ardisia solanacea, Embelia và Maesa indiaca
được đánh giá bằng cách sử dụng các điểm đánh dấu RAPD và ISSR. 25 mẫu được thu
thập từ các bộ phận khác nhau của Wesstern Ghats of Karnataka. 9 mồi RAPD và 5 mồi
7


ISSR tạo ra tổng cộng 48 và 40 locus tương ứng. Phần trăm đa hình tổng thể của RAPD
và ISSR là 44, 17% ± 13,13; 36,5 ± 13, 57% tương ứng. Nội dung thơng tin đa hình cho
phân tích RAPD và ISSR lần lượt là 0,629- 0,884 và 0, 524- 0,783. Khả năng phân giải
của mồi RAPD dao động từ 1,6 đến 6,24, trong khi đối với mồi ISSR dao động từ 4, 6410,10 (Shrisha N. Bajpe, 2018).
1.3. Các chỉ thị phân tử dựa trên phản ứng PCR trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Các chỉ thị phân tử là chỉ thị di truyền, chỉ những thay đổi tỏng phân tử DNA,
được chia thành nhiều loại dựa trên sự khác nhau về phương pháp và kỹ thuật xác định sự
đa hình. Các chỉ thị phân tử được sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ di truyền phát
sinh chủng loại và phân loại phân tử, trong lập bản đồ liên kết di truyền, nhận biết gen và
trong chọn giống bao gồm: đánh giá đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn lọc các tính
trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, năng suất và phẩm
chất giống, xây dựng phát triển trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nhận biết giống, chọn
lọc các tính trạng kháng bệnh, chống chịu các điều kiện bất lợi của môi trường, xây dựng
phát triển trong nghiên cứu đa dạng di truyền, phát sinh loài, phân loại, đánh dấu và xác
định gen, chọn lọc nguồn gen và chọn giống nhờ chỉ thị phân tử.
Chỉ thị phân tử sử dụng rất rộng rãi do số lượng chỉ thị không hạn chế, không ảnh
hưởng bởi yếu tố môi trường và giai đoạn phát triển của cây. Thường nằm ở các vùng
không phiên mã, các chỉ thị này được hình thành từ các loại đột biến DNA khác nhau như

thay thế (đột biến điểm), sắp xếp lại (thêm vào hay bớt đi nucleotide) hoặc các sai sót
trong sao chép các đoạn DNA lặp lại liền kề.
1.3.1. Kỹ thuật RAPD
1.3.1.1. Cơ sở kỹ thuật RAPD
Cơ sở của kỹ thuật RAPD (Random amplified polymorphic DNA) là nhân bản
DNA genome bằng phản ứng PCR với các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình DNA do
sự tái sắp xếp hoặc mất nucleotide ở vị trí bắt mồi (John G. K. William, 1990). Mồi sử
dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên, thường là 10 nucleotide và có nhiệt độ
kéo dài mồi thấp (34- 37℃). Mặc dù trình tự mồi RAPD là ngẫu nhiên nhưng phải đạt
được hai tiêu chí là: tỷ lệ GC tối thiểu phải là 40% (thường 50- 80%) và khơng có trình tự
bazo đầu xi và ngược giống nhau. Sản phẩm PCR- RAPD thường được phân tách trên
8


gel agrose 1,5- 2%. Sự đa hình được phát hiện là do sự xuất hiện hoặc không xuất hiện
băng và có thể do cả việc thay đổi trong trình tự bắt cặp của mồi và do cả hiện tượng
chèn đoạn/ mất đoạn giữa 2 vị trí gắn mồi. Kỹ thuật RAPD không cần thông tin về
genome của đối tượng nghiên cứu và có thể ứng dụng cho các lồi khác nhau với các mồi
chung (Nguyễn Đức Thành, 2014).
Trong số các chỉ thị DNA thì chỉ thị RAPD thuận lợi hơn so với các chỉ thị khác là
đơn giản nhất, tiết kiệm chi phí, nhanh, yêu cầu lượng DNA ít và có thể được thực hiện
trong một phịng thí nghiệm vừa phải cho hầu hết các ứng dụng của nó. Ngồi ra, RAPD
có thể thực hiện ở phần lớn các bộ gen và có ưu điểm là khơng cần biết trước về bộ gen
đang được nghiên cứu. Nhưng kỹ thuật RAPD có hạn chế là sản phẩm PCR khơng ổn
định do mồi ngắn, nhiệt độ bắt mồi thấp, ngoài ra kỹ thuật này tạo ra các chỉ thị trội do đó
khơng phân biệt được các cá thể dị hợp tử với các cá thể đồng hợp tử (Kantipudi N.
Babu, 2014).
Gần như tất cả RAPD marker đều là đồng trội, vì các đoạn DNA cùng độ dài được
khuếch đại từ một cá thể. Nó khơng thể phân biệt một đoạn DNA được khuếch đại từ một
DNA dị hợp tử (1 bản sao) hoặc đồng hợp tử (2 bản sao) (John G. K. William, 1990). Kỹ

thuật RAPD được ứng dụng rộng rãi vì các thủ tục đơn giản, sử dụng các đoạn mồi ngẫu
nhiên tùy ý, hiệu quả về chi phí và chỉ yêu cầu số lượng nhỏ DNA để nghiên cứu di
truyền và xác định quan hệ di truyền giữa các loài. RAPD được sử dụng để phân tích đa
dạng di truyền ở động vật và ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu thực vật.
1.3.1.2. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD
VM Shinde cùng cs (2007) đã sử dụng kỹ thuật RAPD để xác định các thành phần
trong một đơn thuốc thảo dược Ayurvedic, Rasayana churna. 120 mồi oligonucleotide
decamer đã được sàng lọc trong RAPD để xác định ba loại thuốc Ayurvedic, thân khô
của cây Tinospora cordifolia, trái khô của Emblica officinalis và trái khô của Tribulus
terestris. Điểm đánh dấu 600 bp là đặc trưng cho Tinospora cordifolia; điểm đánh dấu
500 bp dành riêng cho Emblica officinalis và điểm đánh dấu cịn lại > 1000 bp có mặt
trong Tribulus terestris. Sự hiện diện của ba loại thuốc thảo dược được xác định khi phản
ứng RAPD với OPC- 6 được thực hiện. Kỹ thuật này đã được chứng minh là đóng góp
vào việc xác định các thành phần trong việc chuẩn bị thảo dược Ayurvedic và do đó giúp
đóng góp vai trị như một cơng cụ bổ sung để kiểm sốt chất lượng.
9


Nguyễn Văn Giang cùng cộng sự (2012), đã nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền
các mẫu giống khoai môn- sọ với 2 loại chỉ thị DNA là RAPD và SSRs. Sản phẩm PCR
của hai chỉ thị này được phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1. Kết quả 67 allen được
nhân lên đối với 5 chỉ thị RAPD, trong đó có 47 allen đa hình chiếm 70,1% và 20 allen
được nhân lên đối với 5 chỉ thị SSRs, có 9 allen đa hình chiếm 45%. 60 mẫu giống khoai
mơn- sọ được phân thành 12 nhóm với hệ số tương đồng là 0,8. Kết quả trong nghiên cứu
này có thể sử dụng trong công tác bảo tồn giống cũng như lai chọn tạo giống khoai sọ
mới.
Theo Huỳnh Kim Diệu và cộng sự (2014), đánh giá sự đa dạng di truyền và tính
kháng khuẩn của cây lược vàng (Callisia fragrans LINDL.) cho thấy 15 mẫu Lược vàng
có sự đa dạng về di truyền DNA. Trong 15 primer RAPD đã sử dụng thì có 8 primer cho
băng rõ, xuất hiện trên tất cả 15 mẫu và đều cho kết qua đa hình. Tổng cộng có 95 băng

được ghi nhận, trong đó có 65 băng đa hình chiếm tỉ lệ 66,51%, băng đa hình OPB08 có
tổng số băng cao nhất, số băng ghi nhận được là 19 băng và có tỉ lệ đa hình cao nhất
(100%) như primer OPB04. Tỉ lệ đa hình thấp nhất ghi nhận được ở primer OPB06
(18,2%). Mối quan hệ giữa 15 cây Lược vàng được chia làm 4 nhóm với khoảng cách
liên kết dao động từ 2,646 đến 5,816.
Theo nghiên cứu của Khuất Hữu Trung và cộng sự (2016), đánh giá đa dạng di
truyền các lồi quế Thanh Hóa bằng chỉ thị RAPD, kết quả nghiên cứu cho thấy 22 mồi
ngẫu nhiên đã được sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền 32 mẫu giống quế Thanh Hóa.
Kết quả phân tích PCR nhân lên được 3.137 băng bao gồm 126 loại băng với kích cỡ
khác nhau. Trong đó 61 băng cho đa hình (chiếm 48.81%) và 65 băng đơn hình (chiếm
51,59%). Số băng nhân lên ở mỗi mồi dao động từ 3- 11 loại băng, trung bình 5,8 băng/
mồi. Dựa vào hệ số tương đồng, có thể chia 32 mẫu quế thành 6 nhóm lớn.
Phạm Thanh Huyền (2017) nghiên cứu sử dụng chỉ thị DNA (RAPD- PCR) trong
nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng công tác bảo
tồn và phát triển ở Việt Nam. Nhằm mục đích bảo tồn và chọn, tạo giống loài cây thuốc
Đảng sâm trong tương lai Việt Nam. Tổng cộng 15 mẫu quần thể Đảng Sâm đã được thu
thập để tách chiết DNA và phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD- PCR sử dụng
12 mồi có trình tự 10 nucleotide ngẫu nhiên. Kết quả phân tích bằng phần mềm
NTSYSpc 2.1 cho thấy trong tổng cộng 106 băng RAPD- PCR thu được có 88 băng đa
10


hình (83%) và 18 băng đồng hình (17%). 15 mẫu quần thể chia làm 2 nhóm lớn, tách biệt
rõ rệt giữa nhóm mẫu thu ở Tây Bắc và nhóm mẫu thu ở Tây Nguyên. Các mẫu thu thập
ở vị trí địa lý gần nhau có khác biệt di truyền nhỏ hơn cho thấy nhiều khả năng chúng có
nguồn gốc chung. Sự khác biệt di truyền cao giữa các quần thể cách xa về địa lý cho thấy
những nguồn gen này cần được bảo tồn độc lập phục vụ cho công tác chọn lọc và tạo
giống trong tương lai
Nghiên cứu của R. Refika A. Giachino (2019), điều tra sự biến đổi di truyền của cây
hồi (Pimpinella anisum L.) bằng cách sử dụng chỉ thị RAPD và ISSR. Hồi là một loại cây

gia vị và làm thuốc hàng năm nay thuộc họ Hoa tán (Apiaceae). Trong nghiên cứu, sự đa
dạng của 15 giống hồi Thổ Nhĩ Kỳ được thu thập từ các vùng khác nhau của Thổ Nhĩ Kỳ
và bốn giống nước ngồi thu được từ Síp, Syria và Pháp đã được phân tích bằng cách sử
dụng các chỉ thị phân tử RAPD và ISSR. DNA bộ gen của 19 giống hồi được khuếch đjai
với 9 đoạn mồi RAPD tạo ra 71 dải đa hình và 5 đoạn mồi ISSRs tạo ra 45 dải đa hình.
Cây di truyền đã nhóm 19 giống hồi thành 2 nhóm chính dựa trên 2 chỉ thị đánh dấu. Xác
định được sự đa dạng di truyền trong P. anisum L. và sự biến đổi giữa các giống.
1.3.2. Kỹ thuật ISSR
ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) là những chỉ thị được nhân bản bằng PCR với
một mồi được bổ trợ với tiểu vệ tinh (microsattlite) đích. Mỗi băng tương ứng với chuỗi
DNA được giới hạn bở các tiểu vệ tinh đảo ngược. Kết quả dẫn đến đa locus, có sự đa
hình cao và tạo ra các chỉ thị trội. Kỹ thuật ISSR là kỹ thuật nhân bản đoạn DNA nằm
giữa hai vùng lặp lại giống hệt và ngược chiều nhau. Kỹ thuật này sử dụng các tiểu vệ
tinh như các mồi trong phản ứng PCR với một mồi cho nhiều locus đích để nhân bản chủ
yếu các chuỗi lặp lại đơn giản với độ dài khác nhau. Các tiểu vệ tinh sử dụng như mồi
trong kỹ thuật ISSR có thể là 2 đến 5 nucleotide. Kỹ thuật ISSR sử dụng mồi dài (15- 30
nucleotide) vì vậy nhiệt độ bắt mồi cao dẫn đến độ ổn định cao của phản ứng (Nguyễn
Đức Thành, 2014).
Kỹ thuật ISSR được sử dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền, nghiên
cứu đặc điểm di truyền trong quần thể, lấy dấu di truyền, … Kỹ thuật ISSR có một số lợi
thế so với các kỹ thuật khác là có thể phân biệt được các kiểu gen gần và không cần
thông tin về trình tự gen của cây nghiên cứu. Giống như RAPD, ISSR là kỹ thuật nhanh,
dễ tiến hành. Nó ưu việt hơn RAPD là cho nhiều thơng tin và có thể lặp lại ở các thí
11


nghiệm do mồi dài hơn. Nhược điểm chủ yếu của ISSR là tạo ra các chỉ thị trội và sự dị
đồng nhất của các sản phẩm nhân bản do sự di chuyển đồng thời (Nguyễn Đức Thành,
2014).
1.3.3. Kỹ thuật AFLP

Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism) được sử dụng để
phát hiện đa hình DNA. Phân tích AFLP được kết hợp cả RFLP và PCR bằng việc gắn
các chuỗi nhận biết vào mồi hay gọi là chuỗi tiếp hợp để nhân chọn lọc các phân đoạn
DNA được cắt hạn chế. Các cặp mồi thường tạo được từ 50- 100 băng trong một phân
tích. Số lượng băng phụ thuộc vào số nuclotide chọn lọc trong tổ hợp mồi. Kỹ thuật
AFLP cho phép lấy dấu DNA từ bất kỳ nguồn gốc nào. Các phân đoạn AFLP được phân
tách bằng gel polyacrlamide kết hợp nhuộm bạc (

) hoặc bằng máy giải trình tự tự

động.
Phân tích AFLP khơng dễ như RAPD nhưng hiệu quả hơn RFLP. Kỹ thuật này có
ưu điểm như: có độ tin cậy và lặp lại cao, không cần thông tin về trình tự DNA của sinh
vật nghiên cứu, cho nhiều thơng tin do có khả năng phân tích số lượng lớn locus đa hình
với một tổ hợp mồi trên gel và có thể cho thấy các locus đặc thù, các số liệu có thể lưu
giữ trong cơ sở dữ liệu để so sánh. AFLP có một số nhược điểm như: phải trải qua nhiều
bước mới có kết quả; DNA cần phải sạch, khơng có các chất ức chế hoạt động của
enzyme cắt hạn chế; địi hỏi cơng sức và giá thành cao. Kỹ thuật tạo ra chỉ thị trội, không
phân biệt được đồng hợp tử và dị hợp tử (Nguyễn Đức Thành, 2014).

12


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Vật liệu nghiên cứu
Mẫu lá cây Khôi nhung được thu từ khu bảo tồn thiên nhiên Bán đảo Sơn Trà, TP
Đà Nẵng.
Mẫu lá cây Khôi nhung tái sinh từ nuôi cấy in vitro có nguồn gốc ở Bán đảo Sơn
Trà (Trà Thanh Lin, 2021). Mẫu được thu tại vườn ươm ở Sơn Trà.

Mẫu lá cây Khơi nhung có nguồn gốc ở tỉnh Hà Giang được gieo bằng hạt tại
vườn ươm ở Sơn Trà.
2.2. Phạm vi nghiên cứu
- Thời gian: Từ tháng 11/2022 đến tháng 05/2023.
- Địa điểm: Phịng thí nghiệm Sinh học tế bào thuộc Khoa Sinh- Môi trường,
Trường Đại học Sư phạm- Đại học Đà Nẵng.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu
Mẫu lá cây khôi nhung được chọn để tách chiết không bị sâu bệnh. Rửa mẫu bằng
nước cất vô trùng vài lần, sau đó lau bằng cồn 70℃, để khơ trên giấy sạch (giấy thấm đã
được hấp khử trùng). Sau khi thu được bỏ trong túi zip có ký hiệu mẫu và bảo quản trong
tủ lạnh -20 ℃.
Bảng 2.1. Thông tin các mẫu lá khôi nhung sử dụng trong nghiên cứu
Quần thể cây

Ký hiệu mẫu

Số mẫu thu (lá)

Bán đảo Sơn Trà

ST

5

Tỉnh Hà Giang

HG

3

Cây in vitro

IV

3

13


2.3.1.2. Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng đệm CTAB
DNA tổng số được chiết tách từ lá khôi nhung bằng phương pháp CTAB theo mô
tả của Doyle và Doyle (1990) có cải tiến.
Mẫu được tiến hành tách DNA bằng dung dịch đệm CTAB 2% (Tris HCl 2M;
pH= 7.5; EDTA 0.5M; NaCl 5M; Sarkosy 5%; Sorbitol 0.35M; CTAB 2%).
❖ Khảo sát khối lượng mẫu đầu vào khi tách chiết:
(1) Cân lần lượt 20 mg, 25 mg, 30 mg, 35 mg, 40 mg mẫu, nghiền mịn trong 200
µl dung dịch đệm CTAB trong ống eppendorf;
(2) Bổ sung thêm 400 µl dung dịch đệm CTAB vào ống eppendorf đang nghiền
mẫu;
(3) Ủ mẫu ở 65℃ trong vòng 90 phút, Vortex sau mỗi 15 phút ủ;
(4) Bổ sung 700 µl C:I (24 chloroform: 1 iso amyl alcolhol), lắc nhẹ, sau đó ly tâm
10 phút với tốc độ 10.000 vòng/phút;
(5) Thu dịch nổi, chuyển sang ống eppendorf mới;
(6) Bổ sung thêm isopropanol với tỷ lệ 1:1, lắc nhẹ, giữ ở -20℃ trong vòng 30
phút nhằm mục đích tủa DNA;
(7) Ly tâm 10.000 vịng/phút trong 10 phút. Lấy tủa loại phần dịch;
(8) Rửa tủa DNA bằng EtOH 70º, ly tâm 5 phút với tốc độ 10.000 vịng/ phút (lặp
lại 2 lần). Sau đó để khơ tự nhiên.

(9) Kết tủa được tái hịa tan trong 50 µl đệm TE 1X và được bảo quản trong điều
kiện 4℃ để sử dụng cho các phản ứng RAPD- PCR.
❖ Khảo sát thời gian ủ mẫu với đệm chiết:
(1) Cân mẫu lá khôi nhung với khối lượng lựa chọn được từ khảo sát ở mục trên,
nghiền mịn mẫu trong 200 µl dung dịch đệm CTAB trong ống eppendorf;
(2) Bổ sung thêm 400 µl dung dịch đệm CTAB vào ống eppendorf đang nghiền
mẫu;

14


(3) Ủ mẫu ở 65℃ trong các khoảng thời gian 60 phút, 75 phút, 90 phút, 120 phút.
Vortex sau mỗi 15 phút ủ;
(4) Bổ sung 700 µl C:I (24 chloroform: 1 iso amyl alcolhol), lắc nhẹ, sau đó ly tâm
10 phút với tốc độ 10.000 vòng/phút;
(5) Thu dịch nổi, chuyển sang ống eppendorf mới;
(6) Bổ sung thêm isopropanol với tỷ lệ 1:1, lắc nhẹ, giữ ở -20℃ trong vòng 30
phút nhằm mục đích tủa DNA;
(7) Ly tâm 10.000 vịng/phút trong 10 phút. Lấy tủa loại phần dịch;
(8) Rửa tủa DNA bằng EtOH 70º, ly tâm 5 phút với tốc độ 10.000 vịng/ phút (lặp
lại 2 lần). Sau đó để khơ tự nhiên.
(9) Kết tủa được tái hòa tan trong 50 µl đệm TE 1X và được bảo quản trong điều
kiện 4℃ để sử dụng cho các phản ứng RAPD- PCR.
2.3.2. Phản ứng PCR
❖ Khảo sát nhiệt độ gắn mồi:
Thực hiện khảo sát nhiệt độ gắn mồi của các mồi RAPD với thành phần phản ứng
PCR có thể tích 20µl: Bao gồm dung dịch đệm Master mix PCR 2X của công ty Phù Sa;
10 pmol mồi; 40 ng DNA khuôn mẫu. Phản ứng PCR được thực hiện với chu trình nhiệt:
biến tính ở 95℃/ 5 phút; 35 chu kỳ: 95℃/ 45 giây 72℃/ 1 phút; cuối cùng 72℃/ 7 phút
với nhiệt độ gắn mồi 33℃, 35℃ và 37℃.

❖ Phản ứng RAPD- PCR:
Sau khi khảo sát được nhiệt độ gắn của mồi, t tiến hành phản ứng RAPD- PCR
với thành phần phản ứng PCR có thể tích 20µl: Bao gồm dung dịch đệm Master mix PCR
2X của công ty Phù Sa; 10 pmol mồi; 40 ng DNA khuôn mẫu. Phản ứng PCR được thực
hiện với chu trình nhiệt: biến tính ở 95℃/ 5 phút; 35 chu kỳ: 95℃/ 45 giây; 35℃/ 45
giây và 72℃/ 1 phút; cuối cùng 72℃/ 7 phút.

15