Sự glycosyl hóa protein ở Eukaryote pot

S
ự glycosyl hóa protein ở
Eukaryote


Các glycoprotein chiếm thị phần
chính trên thị trường các protein
dược phẩm. Hầu hết các protein
này đều được sản xuất bởi công
nghệ protein tái tổ hợp nhờ vào
vi
ệc sử dụng các hệ thống biểu hiện
như vi khuẩn, nấm men, tế bào
động vật. Hệ thống biểu hiện của
nấm men và tế bào động vật có
nhiều ưu điểm trong sản xuất các
protein tái tổ hợp. Ở sinh vật nhân
chuẩn, các protein thường được
biến đổi sau quá trình dịch mã, đi
ều
này có liên quan mật thiết đến hoạt
tính của các protein. Sự glycosyl
hóa là sự biến đổi thông dụng nhất
trong các hệ thống này và nó cần
thiết cho các chức năng của protein
như sự nhận diện, sự truyền tín
hiệu, sự tương tác giữa các protein
và tế bào. Vì vậy, bộ máy glycosyl
hóa của các hệ thống này là một
vấn đề rất quan trọng mà chúng ta

cần phải hiểu khi biểu hiện một
protein nào đó.

1. Các dạng glycosyl hóa protein

1.1. Glycosyl hóa protein ở vị trí N


Sự glycosyl hóa protein ở vị trí N l
à
quá trình biến đổi sau dịch mã đư
ợc
bảo tồn ở nấm men và các
eukaryote khác. Glycosyl hoá ở vị
trí N bắt đầu từ mạng lưới nội chất
(ER) với sự chuyển chuỗi
oligosaccharide vào vị trí
asparagine c
ủa một protein [19,20].
Vị trí gắn bao gồm trình tự ba axit
amin là Asn-Xaa-Ser/Thr nơi mà v
ị
trí thứ hai không phải là Pro. Chu
ỗi
oligosaccharide này chứa 3 phân tử
đường glucose ở đuôi không khử
của cấu trúc lõi Man
9
GlcNAc
2

gắn
vào protein và nó bị cắt bởi các
enzyme glucosidase của lưới nội
chất và enzyme α-1,2 mannosidase
và đi vào bộ máy Golgi .

Cơ chế glycosyl hóa ở vị trí N:

- Glc
3
Man
9
GlcNAc
2
được tập hợp
ở mạng lưới nội chất nhám và đư
ợc
biến đổi thành Man
8
GlcNAc
2
.
- Sự cắt bỏ bớt các phân tử đường
diễn ra trong Golgi bởi các enzyme
mannosidase tạo thành
Man
5
GlcNAc
2
để tổng hợp các

oligosaccharide phức tạp hoặc hình
thành các oligomannoside.
- Sự chuyển thành dạng đa anten
phức tạp xảy ra ở thuỳ giữa của
Golgi và trans-Golgi, có hoặc
không có đuôi sialic acid, và từ đó
protein được tiết ra môi trường
ngoại bào.

1.2. Glycosyl hóa ở vị trí O

Sự glycosyl hóa ở vị trí O là việc
tạo liên kết cộng hóa trị giữa một
monosaccharide với axit amin Ser
hay Thr. Tính đặc hiệu của trình tự
cho thấy Glycosyl hoá ở vị trí O
không quyết định sự gấp cuộn và
tính tan của protein. Dạng phổ biến
của hiện tượng glycosyl hoá
ở vị trí
O ở người thường xảy ra ở Golgi ,
liên quan tới sự chuyển GalNAc từ
UDP-GalNAc sang axit amin Ser
hoặc Thr thông qua hoạt động của
enzyme GalNAc transferase kéo
theo sự chuyển của hàng hoạt các
phân tử đường khác nhau như
galactose, GalNAc, and N-
GlcNAc,
fucose, glucose, mannose,

hydroxyproline…

2. Sự glycosyl hóa protein ở tế
bào động vật có vú

Các tế bào động vật có vú (như tế
bào CHO, tế bào myeloma, tế bào
HEK) đang được ưa chuộng bởi vì
bộ máy glycosyl hoá của chúng rất
giống ở người, mặc dù các phân tử
đường được gắn vào protein không
hoàn toàn giống ở người, chúng
vẫn được bán trên thị trường.
Các protein được glycosyl hóa ở vị
trí N đều có cấu trúc nhánh chuẩn
bao gồm mannose, galctose, N-
acetylglucosamine (GlcNAc) và
axit neuramic. Các protein được
glycosyl hóa ở vị trí O thì bao gồm
một số lượng phân tử đường khác
nhau bao gồm galactose, N-
acetylglucosamine, N-
acetylgalactosamine, axit sialic và
axit neuramic.
Kiểu mẫu glycosyl hóa các protein
dược phẩm được sản xuất bởi hệ
thống tế bào động vật có vú l
à khác
nhau và thay đổi theo từng mẻ. Vì
vậy, sự đa dạng này phải được

kiểm tra lâm sàng và tiền lâm sàng.
Trong thực tế, các kiểu mẫu
glycosyl hóa này có thể được thay
đổi bằng cách tối ưu hóa quy trình
lên men, sử dụng các enzyme biến
đổi, hoặc tạo ra những hệ thống
biểu hiện được làm giàu hoặc loại
bỏ những dạng gắn phân tử đường
đặc biệt nào đó.

3. Sự glycosyl hóa protein ở hệ
thống nấm men

Saccharomyces
cerevisae and Pichia pastoris đang
ngày càng được sử dụng rộng rãi
trong việc sản xuất các
glycoprotein dược phẩm bởi dễ
thao tác, dễ sản xuất với quy mô
lớn, chi phí sản xuất thấp và chu k
ỳ
sản xuất ngắn. Một ưu điểm khác l
à
chúng có khả năng tạo ra các kiểu
mẫu glycosyl hóa giống nhau và đã
được hiểu rõ vai trò của phần
carbonhydrate.
Các protein được glycosyl hóa ở vị
trí N trong S. cerevisiae có đặc
điểm phân nhánh rất nhiều v

à mang
rất nhiều đường mannose. Trong
khi các protein đư
ợc glycosyl hóa ở
vị trí O chỉ bao gồm nhiều nhất l
à 5
phân tử mannose.
Sự glycosyl hóa ở vị trí N
trong Pichia h
ầu hết bao gồm chuỗi
ManGlcNAc, giống với kiểu
glycosyl hóa protein điển hình
trong tế bào động vật có
vú. In Pichia, the outer
oligosaccharide chain of secreted
proteins is mostly unaltered and
consists of Man
8
–9GlcNAc
2
. Mặc
dù có nhiều sự khác nhau về số
lượng và độ phức tạp của sự kiểu
glycosyl hóa liên kết với N được
thấy, nhưng chúng vẫn có chứa
trình tự bảo tồn nhận biết cho sự
khởi đầu sự glycosyl hóa, Asn-Xaa-
Ser/Thr.
Ở Pichia có sự gắn chuỗi
oligosaccharide tại vị trí O nhưng

nó không phải là thành phần quan
trọng của các glycoprotein tan. Sự
gắn chuỗi oligosaccharide chỉ bao
gồm các phân tử mannose. Tuy
nhiên, số lượng mannose trên một
chuỗi, các liên kết tạo ra, tần số và
tính đặc hiệu của sự glycosyl hóa ở
vị trí O trong Pichia pastoris vẫn
chưa xác định được. Chúng ta
không nên thừa nhận rằng một
protein không bị glycosyl hóa ở vị
trí O trong tế bào chủ tự nhiên thì
sẽ không bị glycosyl hóa
trong Pichia.

4. Các enzyme dùng cho nghiên
cứu về glycoprotein

Các enzyme thường được sử dụng
trong những nghiên c
ứu về cấu trúc
đường của các glycoprotein:

Enzyme Loại enzyme

Sự đặc hiệu
Endoglycosidase D

Endo Cắt các phân
tử glycan chứa

nhiều mannose

Endoglycosidase F

Endo Cắt các phân
tử glycan chứa
nhiều mannose

Endoglycosidase H

Endo Cắt các phân
tử glycan chứa
nhiều mannose

β-galactosidase

Exo Loại bỏ các
enzyme
galactosidase
khỏi Gal-β1, 5,
8, 9
3-GlcNAc;
Gal-β1,4-
GlcNAc;
Galβ1,3
GalNAc

N-glycosidase F Endo

Các

glycoprotein
giữa Asn và
GlcNAc
Stalidases
(Neuraminidases)
Exo NeuAc-α2,6-
Gal; NeuAc-
α2,6-GlcNAc;
2
or NeuAc-
α2,3-Ga


5. Kết luận

Glycosyl hóa là một quá trình phức
tạp và đa dạng trong các sinh vật
nhân chuẩn. Vì vậy, nó không thể
khái quát hóa theo những kiểu mẫu
glycosyl hóa chuẩn. Trước khi biểu
hiện một protein tái tổ hợp, chúng
ta nên hiểu rõ hệ thống biểu hiện v
à
phải nắm được mục đích sử dụng
của sản phẩm.
Các nhà khoa h
ọc đang cố gắng tạo
ra các ch
ủng vi sinh vật mới có khả
năng t

ổng hợp các glycoprotein với
cấu trúc giống với khi chúng được
tổng hợp ở người. Gần đây, nhóm
nghiên cứu của Roland Contreras ở
trường đại học Ghent, Bỉ và
Tillman Gerngross ở trường
Glycofi, Boston, Mỹ đã báo cáo về
việc tạo ra được chủng Pichia
pastoris
có khả năng sản xuất
protein v
ới kiểu gắn mannose giống
với ở con người. Nhóm nghiên cứu
này hy vọng sẽ có thể tạo ra được
chủng Pichia pastoris có khả năng
tổng hợp được các protein hoàn
toàn giống như chúng được tổng
hợp ở con người

Phước Toàn

Tài liệu tham khảo

1. Sue Macauley-Patrick, Mariana
L. Fazenda, Brian McNeil and
Linda M. Harvey.
2005.Heterologous protein
production using the Pichia
pastoris
expression

system. Yeast, 22: 249–270.
2. James Cregg, Ph.D., Keck
Graduate Institute, Claremont,
Calif. The Pichia System
3. Benjamin Lewin. 2000. Genes
VII. Oxford Univerisity Press Inc.,
NewYork. Chapter 26.Gen VII
4. Huijuan Li and Marc d’Anjou.
2009. Pharmacological
significance of glycosylation in
therapeutic proteins. Current
Opinion in Biotechnology, 20:678–
684