Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào tạo dòng tế bào cá để làm nguyên vật liệu phân lập virus

Me

ỦY BAN NHÂN DÂN TP. HỒ CHÍ MINH

SỞ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ VÀ MÔI TRƯỜNG

|

BAO CAO NGHIEM THU

DE TAI:

|

|

|

NGHIEN CUU UNG DUNG CONG NGHỆ NI

cẤy TẾ BÀO TẠO DỊNG TẾ BÀO CÁ LÀM
NGUYÊN LIỆU PHÂN LẬP VIRUS

Chủ

nhiệm: TS. Trần Thị Minh Tâm

Cộng tác viên :

|

|

Ths. Nguyễn Ngọc Du
CNSH.Nguyễn.T.Mộng Hoàng

TP. HỒ CHÍ MINH - 2003

43


ĐÊ TÀI
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào tạo
dòng tế bào cá làm nguyên liệu phân lập virus
Chủ nhiệm để tài : TS. Trần Thị Minh Tâm

Mục tiêu để tai:
Tạo dòng tế bào cá và ứng dụng phân lập virus gây bệnh cá.
Nội dung nghiên cứu
- Điễu tra hiện trạng ni và tình hình dịch bệnh cá ở các cơ sở ni cá Tp. Hồ Chí Minh

- Ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào trong việc tạo các dòng tế bào:
. Tạo 3 dòng tế bào
. Xác định đặc tính sinh học của các dịng tế bào cá.

. Theo đối thử nghiệm thời gian bảo quản của các dòng tế bào ở ~70°C và trong nitd

lỏng (- 196°C).

- Ứng dụng các dòng tế bào làm nguyên liệu phân lập virus.

. Thu mẫu cá Trê, cá Tra, cá Bống tượng bị dịch bệnh xuất huyết.
. Xử lý mẫu và phân lập virus

. Xác định độc lực TCIDso
. Xác định virus bằng phản ứng kháng thể trung hòa...
- Hướng dẫn biện pháp phòng bệnh truyền nhiễm do virus trên cá.


ba bo

PHAN 1. DAT VAN DEE ssssssssssssssesccsessssssssenssceusssssnescesecseanseseenssasesssssnsssessseeesevsens 1
PHAN 2. TONG QUAN
2.1. NI CẤY TE BAO ĐỘNG VA
2.2.

Lịch sử ni cấy và phát triển dịng tế bào cá
Mơi trường ni cấy tế bào.......................

in

2.1.1.
2.1.2

LỊCH SỬ NGHIÊN cou BENH VIRUS CA..

2.3.

TINH HINH CHUNG VỀ DỊCH BỆNH VÀ NHỮNG TỔN THẤTDO_

2.4.

VÀINÉT VỀ TÁC NHÂN GÂY BỆNH LỞ LOÉT Ở CÁ (Epizootic

DỊCH BỆNH GÂY RA TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM..................... 8
ulcerafive syndrome ~ EUS)....................-..«---
2.4.1.

Vikhuẩn.

2.4.2.

Vưrus....

2.4.4.

Nấm.......

2.4.3.

2.5.

Ký sinh trùng..

MỘT SỐ BỆNH
NGHIÊN CỨU

DO

VIRUS ĐÃ ĐƯỢC

2.5.3.
Bệnh hoại tử gan tụy
2.5.4.
Bệnh virus mùa xuân ở cá Chép (SVC)
2.5.5. _ Bệnh xuất hoại huyết do nhiễm trùng (HN) trên cá hỗ

2.5.6.

Bệnh xuất huyết mùa xuân (VHS),

2.6.3.

Đặc điểm sinh học cá Trê....

2.6. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÁC LOÀI CÁ
2.6.4.
2.6.5.

27.

Đặc điểm sinh học cá tra (Pangasianodon hypophthamus)..
Đặc điểm sinh học cá Bong tượng...
“
"

ĐIỂU KIỆN PHÁT SINH VÀ QUÁ TRÌNH TRUY

2.73.
2 74.

Điều kiện phát sinh bệnh.
Quá trình truyền lây....

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG: PHAP NGHIÊN CỨU

3.1.

NGUYEN VAT LIEU..

3.1.1. _ Các loài cá dùng trong thực nghiệm ..

3.1.2.

Môi trường nuôi cấy và các hố chất

3.1.4.

Ngun liệu.......................

3.1.3.
3.1.5.

3.2.

Dung cụ ni cấy tế bào.
Thiếtbị

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..

3.2.1.

Điêu tra tình hình ni và địch bệnh..

3.2.2.

Tạo dịng tế bào cá.........................

N

ÂY BENH.....18



4.3.3.

So sánh sự sinh trưởng của ba dòng tế bào RCK,HCK và SGK ở các

4.3.4.

So sánh sự sinh trưởng của ba dịng tế bào RCK, HCK và SGK trong
mơi trường EMEM với các nồng độ huyết thanh khác nhau : 0%, 2%,

43.5

nhiệt độ ni cấy : 179, 272 và 37ƠC...........................s2cccvrrirrriirrrrrrrerree 43

5%, 1076 và 20đ%...........................
ch HH1 h2
rrererrirtirrdree

Kết quá kiểm ra sự tạp nhiễm vì sinh vật

43.6

Kết quả bảo quần tế bào ở các nhiệt độ - 70°C va - 196°C

4.3.8

Kết quả chuẩn độ virus.......

4.3.7

4.3.9
4.3.9.1
4.3.9.2
4.3.10.

Kết quả phân lập virus (Xem phân phụ lục).
Kết quả phản ứng trung hòa..

Kết quả phân ứng trung hòa với các mẫu virus phân lập trên cá
Bống tượng
Kết quả phần ứng trung hòa với các mẫu virus phân lập trên cá
Trê...

Biện pháp phòng trị bệnh chung

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.

51.

52.

KẾT LUẬN.

ĐỀ NGHỊ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO..
PHỤ LỤC 1.
PHỤ LỤC 2.


DANH SACH CAC BANG
Bang 1:
Bang 2:
Bang 3:
Bảng 4:
Bảng 5 :
Bảng 6:
Bảng7:
Bảng 8 :
Bảng 9:
Bảng 10:
Bang 11:
Bang 12:
Bang 13:
Bang 14:
Bang 15:

Các dòng tế bào cá nhạy cảm với một số loại virus gây bệnh trên cá
Diện tích ni.

Thơng tin về trình độ văn hóa

Nghề nghiệp chính và kinh nghiệm mơi cá.

Nguồn nước cấp
Chuẩn bị ao

Nguôn gốc giống..
Mật độ thả........
Thức ăn và cách xác định thức ăn cho cá
Theo dõi và quản lý sức khoẻ cá

Số trường hợp mắc bệnh và thời điểm mắc bệnh..

Lửa tuổi mắc bệnh xuất huyết ...........................

Tỷ lệ chết và nguyên nhân chết.

Chữa bệnh và biệu quả chữa bệnh.
Kết quả bảo quần các dòng tế bào RCK, HCK và SGK ở

nhiệt độ —70°C và —196fC......................

Bang 16: Kết quả phân lập virus trên các mẫu cá Bống tượng, c cá4 Tre,
cá Tra tai cdc6 dich BONN

1...

..c.sceecscessessssscssesssssssecsseesseesssessecssseessecetecsceesnessneess 50

Bang 17: Kết quả chuẩn độ virus gây bệnh trên cá Bống tượng ni thịt

trên dịng tế bào SGK...
Bang 18: Kết quả chuẩn độ virus ...

Bang 19: Kết quả phản ứng trung hòa giữa kháng huyết thanh Birnavirus

và Rhabdovirus với virus phân lập trên mẫu cá Bống tượng

giai đoạn giống được thực hiện trên dòng tế bào SGK................................. 53

Bang 20 : Kết quả phần ứng trung hòa giữa kháng huyết thanh Birnavirus

và Rhabdovirus với virus phân lập trên mẫu cá Bống tượng

giai đoạn thương phẩm được thực hiện trên dòng tế bào SGK .................... 53
Bang 21: Kết quả phản ứng trung hòa giữa kháng huyết thanh Birnavirus
và Rhabdovirus với virus phân lập trên mẫu cá Trê

giai đoạn giống được thực hiện trên đòng tế bào HCK ............................... 54
Bang 22: Kết quả phản ứng trung hòa giữa kháng huyết thanh Birnavirus
và Rhabdovirus với virus phân lập trên mẫu cá Trê
giai đoạn thương phẩm được thực hiện trên dòng tế bào HCK.................... 54


DANH SÁCH CÁC HÌNH ẢNH
Hình 1 : Dụng cụ chun biệt dùng trong ni cấy tế bào.................................

cv, 30
Hình 2 : Dòng tế bào RCK cấy chuyển lần 4 (P4), ŒX100).......................................... 38

Hình 3 : Dịng tế bào HCK cấy chuyển lân 5 (Ps), @X100)..........................-..ccecsvececee 39
Hình 4 : Đồng tế bào SGK cấy chuyển lần 4 (P4), @{100)......................... ii

39

Hình 5 : Cá Tra thịt và giống bị xuất huyết
Hình 6

: Biểu hiện bệnh lý cá Tra bệnh .................................-.oĂS5Ăcseeeerseree.
7E

Hình 7 : Cá Bống tượng thịt và giống bị xuất huyết ...............................

sec. 75

Hình 8 : Biểu hiện bệnh lý cá Bống tượng bệnh ....................................................... TỔ
Hình 9 : Cá Trê thịt và giống bị xuất huyết...........................
ch he
76
Hình !0 : Biểu hiện bệnh lý cá Trê bệnh...............................-

cceeerrieerire

Hình 11 : Tế bào HCK sơ cấp (Primary) ngày thứ 5.............................. che

76
77

Hình 12 : Tế bào RCK sơ cấp (Primary) ngày thứ 5............................ecsrrserreere 71
Hình 13 : Tế bào SGK sơ cấp (Primary) ngày thứ 11...........................c--scecreetrerrvee 78

Hình 14 : Tế bào SGK sau 48 - 72 giờ gây nhiễm.....................
tt 2S2.1211.e.x.z 78
Hình 15 : Tế bào HCK sau 48 - 72 giờ gây nhiễm...............................eiiiiiekee 79

Hình 16 : Soi tế bào trên kính hiển vi soi ngược ...................................ccceriericeririe 79


DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ

Đề thị1:
Đồ thị2:
Đồ thị3:
Đô thị 4:

Đề thị 5:
Dé thị6:

Đề thị7:

Đề thị 8
Đô thị 9:

Đề thị 10.

Đường cong sinh trưởng của các đòng tế bào RCK, HCK và SGK
nuôi cấy đơn lớp trong môi trường EMEM với 10% huyết thanh ở

40

Đường cong sinh trưởng của dòng tế bào RCK nuôi cấy đơn lớp

41

272C

trong các môi trường khác nhau
Đường cong sinh trưởng của dịng tế bào HCK ni cấy đơn lớp
trong các môi trường khác nhau

42

trong các môi trường khác nhau
Đường cong sinh trưởng của tế bào RCK nuôi cấy đơn lớp ở các

44

Đường cong sinh trưởng của dịng tế bào SGK ni cấy đơn lớp

42

nhiệt độ khác nhau

Đường cong sinh trưởng của tế bào HCK nuôi cấy đơn lớp ở các
nhiệt độ khác nhau

Đường cong sinh trưởng của tế bào SGK nuôi cấy đơn lớp ở các

nhiệt độ khác nhau
Đường cong sinh trưởng của đòng tế bào RCK nuôi cấy đơn lớp ở

các nồng độ huyết thanh khác nhau
Đường cong sinh trưởng của dòng tế bào HCK nuôi cấy đơn lớp ở
các nông độ huyết thanh khác nhau.
Đường cong sinh trưởng của dịng tế bào SGK ni cấy đơn lớp 6
các nông độ huyết thanh khác nhau
Kết quả chuẩn độ TCID sp virus c4

45
46
47
47
52


PHAN 1. DAT VAN DE:
Nghề nuôi cá là một trong những nghề truyền thống của nông dân Việt Nam,

đặc biệt đối với các tỉnh phía Nam đo điều kiện địa hình và khí hậu thích hợp cho

việc phát triển ngành nghề. Trong những năm gần đây, việc nuôi cá nước ngọt dang
ngày càng được đẩy mạnh để phục vụ cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Để có
năng suất và sản lượng

cao, người dân đã mở rộng nhiều mô hình ni và diện tích

ni đo đó có nhiều vấn đê phát sinh. Với qui mô và cường độ nuôi ngày càng tăng,

mức độ các yếu tố gây stress trong môi trường tự nhiên cũng tăng như mật độ nuôi

cao, chất lượng nước xấu, quần lý kém... làm cá yếu đi tạo điều kiện cho các bệnh
truyền nhiễm phát triển. Tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng,
đặc biệt là virus, đã gây tổn thất nặng nề cho nghề nuôi trồng thủy sản với mức độ
và cường độ ngày một gia tăng.
Dịch bệnh cá năm 1988 - 1989 đã gây thất thoát 5,6 triệu USD ở Bangladesh

(Barua, G. 1990), va 8,7 triệu USD ở Thái Lan vào năm 1982 - 1983 (Tonguthai, K.

1985). Dịch bệnh cá gây thiệt hại cho các nước Châu Á mỗi năm khoảng 3 tỷ USD.
Ở Việt Nam, dịch bệnh lan rộng khắp cả nước đã gây thiệt hại đáng kể. Ở vùng
sông Đà vào năm 1988, 100 bè cá chép bị dịch bệnh. Năm 1989, tại tỉnh Hà Bắc,

hàng tấn cá chép nuôi bị bệnh lở loét (EUS). Ở vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long, cá
nuôi bè bị tổn thất nặng né do dịch bệnh đã được ghi nhận vào năm 1992 (Tuấn,

P.A., 1994).

Trong số các loại cá nước ngọt, cá Trê lai (bố Tré Phi: Clarias garjepinus X
mẹ Trê Vàng: C. marcocephalus) là đối tượng nuôi phổ biến, cá Tra (Pangasianodon
hyphphihalmus) và cá Bống Tượng (Oxyeleotris marmoratus Bleeker) là những đối
tượng ni có giá trị kinh tế cao, sản phẩm được thị trường trong và ngoài nước ưa

chuộng, tuy nhiên địch bệnh luôn là mối đe dọa lớn trong quá trình ni, trong đó

bệnh xuất huyết là một trong những bệnh truyền nhiễm thường xuyên xây ra và gây
thiệt bại đáng kể. Nhiều báo cáo khoa học trên thế giới đã ghỉ nhận được một số tác
nhân gây bệnh chính :

- Bệnh nhiễm trùng xuất huyết do virus hay bệnh virus mùa xuân ở cá Chép,

tác nhân gây bệnh là Rhabdovirus carpio.
- Bệnh xuất huyết do virus ở cá Trắm cỏ, tác nhân gây bệnh là Reovirus sp.
- Hội chứng dịch lở loét ở cá, tác nhân gây bệnh là Rhabdovirus sp., Binavirus
sp., Aphanomyces sp., Aeromonas hydrophyla.
- Bệnh đốm đổ do vì khuẩn Aeromonas hydrophyla, Aeromonas spp va
`
Pseudomonas fluorescens.
Hiện nay các nhà khoa học trên thế giới đang tập trung nghiên cứu bệnh virus
thông qua việc ứng dụng các phương pháp chẩn đoán hiện đại trong nhân y, thú y để
1


chẩn đốn bệnh thủy sản như: phương pháp ni cấy tế bào để phân lập virus, kỹ
thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbert Assay), kỹ thuật kháng thể huỳnh
quang, Dot blot, Western blot, phẩn ứng trung hòa trên tế bào, kỹ thuật PCR
(Polymerase Chain Reaction).

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào cá tuy ra đời và phát triển sau kỹ thuật nuôi cấy các
loại tế bào động vật khác nhưng lĩnh vực này ngày càng phát triển vì cân thiết cho

việc phân lập và nghiên cứu virus trên đối tượng nuôi thủy sẵn, đặc biệt virus gây
bệnh trên cá. Năm 1962, dòng tế bào cá đầu tiên được thiết lập, đến nay đã có 159
đồng. Bên cạnh những lồi cá đã được ni cấy để tạo dịng tế bào, một số lồi

khác vẫn chưa được nghiên cứu đến, nhất là đối với những loài cá nước ấm của từng
vùng. Cá Tra và cá Bống Tượng là một trong những loại cá có giá trị kinh tế cao,
nhưng việc nghiên cứu về bệnh truyền nhiễm do virus của các loại cá này vẫn cồn

bổ ngỏ, ở Việt Nam những năm trước đây nhiều tác giả nghiên cứu chỉ mới dừng ở

mức phân lập tác nhân gây bệnh vi khuẩn. Đây cũng chính là lý do thúc đẩy chúng

tôi tiến hành để tài: ”Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ ni cấy tế bào tạo dịng tế

bào cá làm nguyên liệu phân lập virus” nhằm mục đích tạo đồng tế bào cá từ ba
lồi cá Trê, cá Tra và cá Bống Tượng và ứng dụng phân lập virus gây bệnh trên cá,

từ đó xác định được loại virus gây bệnh xuất huyết để có biện pháp phòng bệnh hữu
hiệu.


PHAN 2. TONG QUAN
2.1. NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VAT

2.1.1. Lịch sử ni cấy và phát triển dịng tế bào cá

Những nghiên cứu về nuôi cấy tế bào cá đầu tiên được mô tấ vào năm 1956

bởi Grutzner tai vién Roberts, R.J. Koch ở Đức (Wolf, K., 1988). Dòng tế bào cá đầu

tiên có nguồn gốc từ cơ quan sinh dục của cá Hồi, kỹ thuật trypsin hóa được dùng để
phân tách mô tế bào và môi trường nuôi cấy của tế bào động vật có vú được sử
dụng để nuôi cấy tế bào cá (Wolf, K. et al., 1960). Dòng này được Wolf, K. và
Quimby, M.C. (1962) tạo ra và đặt tên là RTG-2. Nhìn chung, việc nghiên cứu nuôi

cấy tế bào cá phát triển là nên tảng cần thiết để phân lập và nghiên cứu virus cá.

Năm 1980, có 61 đồng tế bào cá đã được tạo thành từ 36 loài thuộc"17 họ và

17 loại virus cá đã được phân lập (Wolf, K. and Mamn, J.A., 1980). Hơn 30 dịng tế

bào mới tiếp theo được cơng bố chỉ trong khoảng thời gian

6 năm sau đó (Chen,

S.N.; Kou, G.H., 1988; Lụ, Y.C.N. et al., 1990; Tung et al., 1991; Fernandez, R.D. et

al., 1993). Mục tiêu trước hết của các nhóm tác giả trong việc phát triển dịng tế bào

là để nghiên cứu virus và đã tạo được 29 trên 30 dòng nhạy cầm với nhiều loại virus
cá, duy chỉ có một dịng có nguồn gốc từ cá Chạch, Afisgunus anguillicaudatus, là
khơng nhạy cảm với tồn bộ 10 loại virus cá thử nghiệm (Chen, S.N. and Kou, G.H.,

1988). Năm 1994, các nhà nghiên cứu đã tạo được 159 dòng tế bào cá có nguồn gốc

từ 74 lồi cá thuộc 34 họ (Fryer, J.L. and Lannan, C.N., 1994). Hiện nay các dòng tế

bào đã được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu bao gồm độc chất học, di
truyền học, sinh học tế bào, sinh lý học, ung thư học và miễn dịch học (Nicholson,
B.L.,

1989;

Bols,

N.C.,

1991; Bols,

N.C.

and

Lee,

L.E.J.,

1991;

Babich

and

Borenfreund, 1991).
`
Những nghiên cứu gần đây cho thấy vào năm 1996, Somkiat Kanchanakhan
đã tạo thành công 2 dòng tế bào từ cá trê lai. Dòng thứ nhất được tạo thành từ mô
thận gọi là HCK (hybrid catfish kidney). Dòng tế bào thứ hai (hybrid catfish tail -

HCT) có nguồn gốc từ đi cá Trê lai. HCK và HCT đã được cấy chuyển 42 lần kể

từ khi bắt đầu nuôi cấy vào năm 1991 và 1992, Không có sự tạp nhiễm virus, vi

khuẩn hay ký sinh trùng trong cả hai dòng tế bào. Khả năng chịu được nhiệt độ cao

được thấy ở hầu hết các dòng tế bào cá nước ấm (Nicholson, B.L., 1989), dòng tế

bào mọc tốt nhất ở 26 - 28°C nhưng bị thoái hoá nhanh chóng ở 37C. Cả hai dịng

đều phát triển trên môi trường EMEM bổ sung 5 - 20% huyết thanh.
Các nhà nghiên cứu cũng đã tạo được dòng tế bào có ngn gốc từ thận cá

biển là cá Chẽm Lates calcarifer Bloch. Té bào thận cá Chẽm Sea bass kidney (SK)

được nuôi cấy trong ba loại môi trường khác nhau với nỗng độ muối thay đổi. Kết
quả cho thấy tế bao SK moc tốt trên môi trường Leibovitz-15 chứa 8.000 mg/1 NaCl
3


bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê ở nhiệt độ. thích hợp nhất từ 25— 30%C. Trong
thời gian khoảng 26 tháng, SK được cấy chuyển hơn 75 lần. Tế bào có đạng biểu
mơ, khơng bị nhiễm khuẩn, nấm, ký sinh trùng. Dòng tế bào SK thúc đẩy sự sinh sôi
của Sea bass iridovirus (SIV) được phân lập từ những con cá bệnh (Frerich, G.N.;
Rodger, H.D; Peric Z., 1996).

Một hệ thống nuôi cấy tế bào từ mô buông trứng của cá Trê Phi châu
(Clarias gariepinus) cũng đã được phát triển. Tế bào được nuôi cấy trong môi trường
Leibovitz-15 (L-15) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bê, dịch chiết cơ cá (10%),
dịch chiết cơ tôm (10%), lectin (0,02ng/m)), lipopolysaccharide (0, 02ng/mÌ), glucose

D (0,2 mg/ml), dich chiết trứng (0,5%) và máu tơm (0,5%). Các tế bào có thể cấy

chuyển được 15 lần, sau đó ngừng phân chia và chết đi. Giữa những lần cấy chuyển,
có thể giữ 12 — 15 ngày không cân thay đổi môi trường nuôi (Kumar, G.S. et al.,
2000).

Dịng tế bào liên tục (GF-1) có nguồn gốc từ mô vây cá Mú, Epinephelus

coioides, đã được tạo và kiểm tra đặc tính. Tế bào được ni trong mơi trường L-15
chứa 5% huyết thanh bào thai bê (FBS) ở 28°C đã được cấy chuyển hơn 160 lần kể
từ năm 1995. Phần lớn các tế bào GF-1 có dạng giống nguyên sợi bào và một số ít
giống tế bào biểu mơ. Tác động bệnh lý tế bào (CPE) có thể quan sát ở những tế
bào GF-1 sau khi gay nhiém pancreatic necrosis virus (PNV), hard clam, T€OViTUS
(HCRV),

eel herpes

virus Formosa

(EHVF)

va

(grouper

nervous

necrosis virus)

GNNV từ 3 — 5 ngay. Két quả thí nghiệm cho thấy GF-I có thể tăng sinh hiệu quả
nodavirus cá và là công cụ đầy hứa hẹn cho việc nghiên cứu nodavirus cá sau này
(Chi, S.C., 1999).

Bang I: Các dòng tế bào cá nhạy cẩm với một số loại virus gây bệnh trên cá
Các loại virus
Đồng tế bào

BF-2

BGV,IHN, IPN
CCV, CRV, GSV, IPN, PFR, SGV, SVC
BGV, CSV, IHN, IPN, LV, SGV, SVC

ccoO

CCV,CRV

AS
BB

CHSE - 214
EQ - 2/EO —5
EPC
FHM

CSV, GSV, Hs, IHN, IPN, OMV, SGV, VHS
EVE, EVEX, IPN
CSV, IHN, PFR, SGV, SVC
EHN, GSV, IHN, IPN, PFG, SGV, SVC, VHS

KO-~6

CSV,OMV

PG

IPN, PFR,

RTF-1
RTG-2

-

SVC, VHS

Hs, IHN, IPN, VHS
BGV, EHN, EVE, EVEX, Hs, IHN, IHP, OMV, PFR,
SGV, SVC, VHS


RTH -149
STE -137
TO - 2
HCK
HCT

THN,
CSV,
EVE,
SGV,
SGV,

IPN
IHN, IPN, VHS
EVEX, IPN
IPN, GSV, CRV, UDR, CCV
IPN, GSV, UDR, CCV

- virus cá mang xanh; CCV-

BGV

virus cá trê sông; CRV-

reovirus cá tré; CSV-

virus cá hôi trắng; EHN- bệnh hoại tử cơ quan tạo máu; EVE- virus cá cHình châu

Âu:

EVEX

- virus cá chình

châu

Âu

nhóm

X;

GSV-

virus cá sáng vàng;

Hs —

Herpesvirus sabmonis, IHN- hoại tử cơ quan tạo máu; IPN - hoại tử gan truyền
nhiễm; LV- virus hệ bạch huyết, OMV- virus Oncorhyncus masou, PFR rhabdovirus cá mang

con; SGV

~ virus cá bống cát, SVC

-— virus mùa xuân ở cá

chép; VH§S - virus gây nhiễm trùng máu xuất huyết.
2.1.2. Môi trường nuôi cấy tế bào

Dịng tế bào có thể được nhận từ thận, gan, lách, não, tim, mang, cơ, màng

ruột...

của cá khỏe. Trong nuôi cấy mô, thường người ta dùng những con cá nhỏ,

phôi hoặc trứng cá để làm nguyên liệu nuôi cấy. Tế bào cá có thể tăng trưởng bình

thường trên hệ thống ni cấy tế bào động vật có vú, môi trường nuôi cấy, huyết
thanh, kháng sinh, dung dịch đệm... mà khơng cần có sự thay đổi nào ngoại trừ cần
phải thêm sodium chloride vao môi trường nuôi cấy đối với những đòng tế bào cá
nước mặn (Wolf, K. and Ahne, W., 1982). Môi trường được dùng phổ biến nhất trong

nuôi cấy tế bào cá là Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), Leibovitz 15
(L-15) va môi trường 199 (M -199). Muối Hank's va Earle’s là hệ dung dịch đệm có

thể được sử dụng rộng rãi và pH thích hợp nhất đối với tế bào cá là 7.3 - 7.4. Môi
trường nuôi cấy được bổ sung 10% huyết thanh, 100 units/ml penicillin, 100 ug/ml

streptomycin va 25 units/ml nystatin c6 thé được dùng trong ni cấy tế bào thơng
thường. Các dịng tế bào tăng trưởng rất tốt trong tử ủ áp suất và mơi trường ni

cấy khơng được thay đổi trong q trình cấy chuyển (Kanchanakhan, S., 1996).

2.2. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU BỆNH VIRUS CÁ

Vào năm 1914 Weissenberg R., người Đức, lần đầu tiên công bố nghiên cứu
của ông trên bệnh u bạch cầu và nhanh chóng nhận thấy những đặc điểm của virus
trong những tế bào cá bị nhiễm bệnh. Ông lý giải rằng virus là nguyên nhân làm các
tế bào bạch cầu phình ra một cách đặc biệt. Mãi đến 50 năm sau đó người ta mới
tầm được những chứng cớ rõ ràng về sự có mặt của virus trong tế bào bạch cầu.

Thử nghiệm quan trọng thứ hai về bệnh cá được công bố vào năm 1924 bởi
Plehn M.. Trong cuốn “Practice of Fish Disease” ba da cho rằng cả hai bệnh u bạch
cầu và thủy đậu đều có liên quan đến virus. Vào năm 1938, Schaperclaus W. đã mô
tả một căn bệnh nghiêm trọng ở Đức, mơ đích của bệnh là thận cá Hỗi - rainbow
trout (Salmo gairdneri). Thuật ngữ đầu tiên được dùng cho bệnh này là “bệnh sưng


thận”, sau đó đổi thành bệnh “sưng thận và thối hóa gan do nhiễm trùng”, và cuối
cùng được gọi là bệnh nhiễm trùng máu đo virus (Viral Hemorrhagic Septicemia VHS).

Vào năm 1939, Dogiel V. A. và cộng sự đã thu thập được những mẫu bệnh
của bệnh phù do nhiễm trùng và bệnh rubella của cá Chép (Cyprinus carpio), nhưng
thời gian này virus vẫn chưa phân lập được. Lyaiman E.M. trong “A course in
Diseases of Fish” (1949) đã nói về bệnh phù do nhiễm trùng và u bạch cầu cấp tính
và tóm lại trong một bài viết ngắn nói vềể căn bệnh mà hiện nay được biết đến

nhiều: bệnh nhiễm trùng mầu do virus. Năm 1954, trong lần xuất bản thứ 3 của tạp

chí Fish Disease, số lượng bệnh do virus hay bệnh được cho là do virus đã tăng đến 5

bệnh. Bài báo đầu tiên về bệnh virus ra đời vào năm 1952 trong đó Nigrelli R.F. kết
luận có ít nhất 6 bệnh virus. Tuy nhiên tác nhân virus gây bệnh hoại tử tuyến tụy do
nhiém tring (infectious pancreatic necrosis) vẫn chưa được chứng minh.
Đầu năm

1953, những đợt dịch bệnh nghiêm trọng đã được ghi nhận trên cá

Hỏi bột (Oncorhynchus nerka) ở vùng tây bắc Thái Bình Dương. Mặc dù- chưa đủ
khả năng để phân lập virus, những bằng chứng nhận được từ Watson S.W. (1954)

cho thấy virus đã gây chết những con cá Hồi bột. Ít nhất vài năm sau đó những dấu

hiệu bệnh tích này được biết là "bệnh virus cá Hổi đỏ" hay "bệnh cá Hồi đỏ

Oregon”. Khi xem xét lại những bệnh virus cá năm 1954, ông đã mô tả § bệnh - 5

trong số chúng cho đến nay được biết là bệnh do virus.

Việc áp dụng các phương pháp nuôi cấy tế bào và nuôi cấy mô đã tạo những
bước tiến triển nhanh trong nghiên cứu virus cá. Mặc dầu nuôi cấy mô đã được bắt
đầu vào đầu những năm 1900, kỹ thuật này được các nhà giải phẫu học và phôi thai

học ứng dụng rất rộng rãi nhưng vẫn chưa được áp dụng trong lĩnh vực virus học.
Những bước tiến quan trọng đã được thực hiện trong những năm 50 khi virus dude
ghi nhận có thể nhân lên trong ni cấy mơ động vật. Đáng ngạc nhiên hơn nữa đó
là một loại virus của động vật có vú, tác nhân gây bệnh viêm não và cột sống ở
ngựa, là virus đầu tiên nhân lên được trên mô cá trong nuôi cấy phôi của Gambusia

sp.(Sanderr and Soret, 1954).

Năm 1955, việc kiểm tra mô học ở cá Hổi bột với những biểu hiện lâm sàng

của bệnh viêm ruột cấp tính cho thấy ngun nhân khơng phải do ký sinh trùng và
cũng không do vi khuẩn, nhưng cho thấy hình thái học của tuyến tụy bị hoại tử tương
tự như bị virus. Nghiên cứu này của Wood E.W. và cộng sự đã tạo nên nền tầng cho

việc nghiên cứu căn bệnh mà ngày nay chúng ta biết là bệnh hoại tử tuyến tụy do
nhiễm trùng.
Mặc dầu không tìm thấy virus, những ứng dụng đâu tiên của việc ni cấy

mơ cá để thăm dị bệnh virus cá đã được thực hiện vào khoảng giữa những năm 50.


6 Mỹ, vào năm 1956 Wolf, K. đã tiêm cho những mô tế bào cá Hồi nuôi cấy dung
.
dich blue ~ sac để tiến hành thăm đò khả năng virus có thể gây bệnh.
Ở viện Robert Koch của Đức, Grutzner L. vào năm 1956 đã nuôi cấy mô để
fim hiểu bệnh u bạch cầu và thủy đậu ở cá. Bà đã được ca ngợi một cách xứng đáng
vì là người đầu tiên gắn việc nuôi cấy mô cá với bệnh virus cá. Hai năm sau đó, bà
đã ghi lại những sự kiện đầu tiên trong nuôi cấy tế bào cá lớp đơn. Điều này có
nghĩa virus hoại tử tuyến tụy do nhiễm trùng đã được phân lập ở Mỹ (WoIf, K. et al.
1959; Wolf, K., Snieszko, et al. 1960).

Vào giữa những năm 1950 đến giữa những năm 1960, thêm 3 thử nghiệm nữa
về bệnh virus cá được thực hiện. Trong năm 1960, Ross A.J. va các cộng tác viên đã
ghi nhận cá Hồi bột vua (Oncorhynchus tshawyischa) là vật chủ của những bệnh dịch
do những tác nhân rất bé gây nên. Hai năm sau, một cuốn sách nhỏ viết bằng tiếng
Ý do Ghittino P. viết về bệnh cá nói về 7 bệnh virus, trong đó có bài viết mới nói về

bệnh virus cá Hồi Chinook, thậm chí cịn ghi rõ bệnh này gây ra bởi cùng loại
rhabdovirus gây bệnh trên cá Hồi đỏ. Đến đâu những năm 1980, những bệnh này đã
được biết là bệnh hoại huyết do nhiém tring (infectious hematopoietic necrosis).
Việc nuôi cấy mô cá tuy bữu dụng nhưng lại tốn quá nhiễu thời gian, vì vậy

các nhà nghiên cứu sau đó đã chuyển sang cách khác là nuôi cấy tế bào lớp đơn.

Hiệu quả của những kỹ thuật mới này đã sớm được chứng minh: tại Đan mạch,
Jensen M. (1963, 1965) đã phân lập được Egtved virus, tác nhân gây bệnh mà ngày
nay ta gọi là bệnh nhiễm trùng máu do virus (VHS); Clem L.W. va CTV. (1965) da
mơ tả một loại virus ở một lồi cá biển vùng Bắc Mỹ (tuy nhiên đặc tính virus của
những phần tử phân lập được vẫn chưa được xác định); và virus gây bệnh ở cá Héi
đỏ cũng đã được phân lập bởi Fryer J.L. (1965).
Vào cuối những năm 1960, nhiều sự kiện đáng chú ý đã xảy ra trong lĩnh vực
nghiên cứu virus học ở cá. Năm 1968, Fiiian N. đã tìm hiểu về những bệnh dịch trên
c4 nheo nhé (Ictalurus punctatus) và đề cập đến điểu mà sau đó sớm được khẳng
định là virus cá nheo — Channel catfish virus (Fijan, N. et al., 1971).

Vào năm 1969, những khối u ở miệng cá chình hay cịn gọi là bệnh “nở hoa”

đã được Pfitzner L ở viện Robert Korch tìm hiểu. Bà đã phân lập được một loại virus

có 20 mặt. Đây là virus đầu tiên trong số nhiều virus được phân lập từ cá chình,

nhưng nó vẫn chưa được xem là tác nhân gây tổn thương mơ ngồi một cách kỳ đị
như vậy (“nở hoa”). Cùng thời gian đó, Hoffman G.L. et al. (1969) đã phân lập được
một virus từ cá Mang xanh (Lepomis macrochirus) và mô tả một căn bệnh mới gọi là
bệnh u mơ ngồi với sự có mặt của những vi sinh vật có vỏ bao - đặc điểm đầu tiên
được nhận biết ở cá bệnh.

Vào cuối những năm 1960, một chương mới trong lịch sử nghiên cứu virus cá
gây
được mở ra. Khởi nguồn từ những nghiên cứu truyễn thống về vật chủ, tác nhân


bệnh và môi trường, những nhà nghiên cứu đã bắt đầu tập trung chú ý về mặt sinh lý
học của tác nhân gây bệnh, và đã sớm xuất hiện những công bố về mặt sinh học
phân tử của virus cá. Những virus gây u bạch cẫu và gây hoại tử tuyến tụy do nhiễm
trùng sớm được chú ý, nhưng trong suốt những năm 1970, các nhà nghiên cứu đã
nhận ra rằng nguồn thông tin mới phong phú này nằm trong nhóm rhabdovirus cá.

1

Rhabdovirus là nhóm có số lượng lớn nhất trong các nhóm virus cá và những
hiểu biết về sinh học phân tử của chúng đã tiến triển rất nhanh. Lenoir G. (1973) đã

tìm hiểu những nghiên cứu về tác nhân gây bệnh virus mùa xuân ở cá Chép và xác
định cấu trúc protein của virus, kích cỡ và số lượng peplid; Clark H.F. và Soriano
E.Z. (1974) thấy rằng Egtved virus và những tác nhân gây bệnh virus mùa xuân ở cá
Chép và bệnh hoại huyết do nhiễm trùng có thể nhân bản nhờ tế bào của bò sát và
tế bào động vật có vú cũng như tế bào cá, nhưng điểu đáng chú ý nhất là các virus
và tế bào khác nhau có nhiệt độ phát triển thích hợp khác nhau.
Nuôi cấy tế bào và nuôi cấy mô cá phát triển đã thúc đẩy những bước tiến
trong quá trình nghiên cứu virus cá. Việc nuôi cấy mô cá đã được bắt đầu từ rất sớm
cùng với sự phát triển của kỹ thuật ni cấy mơ, nhưng nó chỉ thực sự phát triển khi
ngành virus học phát triển vào những năm 1950 là thời điểm kỹ thuật nuôi cấy mô

động vật trở nên thịnh vượng.
Tốc độ của việc khám phá virus cá đã gia tăng vào những năm 1970. Vào đầu
những năm 1980, những công bố về các loại virus mới trở nên thường xuyên hơn.

Một số tác nhân chỉ được biết thơng qua kính hiển vi điện tử, một số khác được phân
đã
lập và biết được đặc tính. Bảng liệt kê tất cả các tác nhân virus cho thấy 17 virus
được phân lập và 15 virus khác được biết từ hình chụp điện tử (Wolf, K. and Mamn,

J.A. 1980).

Vào năm 1980, những chuyên gia về sức khỏe cá đã thành lập hiệp hội xuất
bản tạp chi mdi, Bulletin of the European Association of fish pathologists. Hiép héi
đã nhanh chóng lôi cuốn được những thành viên ở những nơi khác trên thế giới. Vào
giữa những năm 1980, tập san này đã đóng vai trị chính trong việc khuyến khích
những, nghiên cứu và nhận thức mới về bệnh virus cá.

2.3. TÌNH HÌNH CHUNG vi DICH BENH VA NHUNG TON THAT DO DICH
BỆNH GAY RA TREN THE GIOI VA VIETNAM

Dich bệnh xuất huyết gây tổn thất rất lớn cho nghề nuôi trồng thủy sản trên
thịt với
thế giới. Bệnh. gây chết hàng loạt ở các giai đoạn tuổi từ cá giống đến cá
mắt lỗi, hậu
bệnh tích chung: cá kém ăn hoặc bỏ ăn, bơi lội nhào lộn bất thường,
rõ nhất ở hậu
môn đỏ, vành mơi xoang miệng, các vây có đốm xuất huyết biểu hiện
bên trong cho
môn và vây đuôi, tỷ lệ chết 70- 80%, có khi lên đến 90%, bệnh tích
L.M.,
thấy cơ quan nội tạng: gan, thận, ruột đều xuất huyết (Crane, M.T; Eaton,
1997).

Bệnh

xuất

huyết

có

thể

biểu

hiện

ở

nhiều

đạng

như

xuất

huyết

(haemorrhage), đốm đồ (red spot) hay triệu chứng lở loét (ulceration) và bệnh có thể

gây ra do nhiều

tác nhân:

virus, vi khuẩn,

nấm,

Campbell, B.; MacRae, I.H., 1994).
Dịch bệnh EUS (Epizootic ulcerative syndrome)

ký

sinh trùng

(Roberts, RJ;

: bệnh đầu tiên bộc phát vào

năm 1970 ở miễn Đơng nam châu Á sau đó chuyển dần xuống các khu vực phía bắc
đến đơng và nam và tiếp tục lan truyền sang nhiều khu vực khác. Bệnh này được
miêu tả như là một bệnh dịch trên cá nước ngọt và nước ấm xảy ra theo mùa, bệnh

kết hợp giữa nấm Aphanomyces và triệu chứng hoại tử đặc biệt là các nốt lở loét
trên cơ thể. EUS được báo cáo xuất hiện trên 16 nước : Việt Nam, Papua New
Guinea,

Indonesia,

Malaysia,

Thái Lan,

Campuchia,

Myanniar,

Lào, Philippin.

Sỉ

Lanka, Bangladesh, Ấn Độ, Nepal, Bhutan, Đông Nam Trung quốc, và Singapore và

vẫn còn tiếp tục xảy ra vào các năm sau đó. Ảnh hưởng của bệnh truyền nhiễm ở
mức độ cao gây ra cho cá ruộng ở châu Á tác động rất lớn đến tiểm năng kinh tế xã
hội. Người ta ước tính chỉ riêng đợt dịch bệnh

1982 -1983 ở Thái Lan đã làm thiệt

hại khoảng 8,7 triệu đô la Mỹ (Tonguthai, 1985), dot dich nam 1988 — 1989 ở
Băngladesh gây thiệt hại đến 5.6 triệu đôla Mỹ, Srilanka thiệt hại khoảng 25.000
déla, 6 trong số 39 huyện thuộc Ẩn độ thiệt hại trên 250.000đôla Mỹ (Prasad và
Sinha, 1990). Tỷ lệ chết cao hoặc mức độ nghiêm trọng nhận thấy rõ vào những năm

đâu tiên xảy ra dịch bệnh ở mỗi nước, tuy nhiên mức độ nghiêm trọng giảm dẫn vào
những năm sau đó. Vào năm

1996 một căn bệnh tương tự như EUS

xuất hiện đầu

tiên trên các loài cá nước ấm

ở Pakistan và Rhabdovirus là một trong những nhóm

tác nhân thường gặp nhất có liên quan đến bệnh EUS.
Bệnh nhiễm trùng xuất huyết do virus (Viral Hemorrhagic Septicemia - VHS)
được biết đến lần đâu vào những năm 50. Căn bệnh này gây tổn thất nặng về kinh
tế đối với những người nuôi cá Hồi (Oncorhynchus mykiss) ở châu Âu. Những đợt

địch bệnh nghiêm trọng khác cũng xảy ra khi nuôi cá mật độ cao ở các nơi trên thế

giới như vùng Bắc Phi và Á châu. Tổn thất về kinh tế do bệnh VHS ước khoảng £40

triệu trong một năm (N.J. Olesen, Arhus, 1997), lượng cá chết ước tính từ 20 đến 30

ngàn tấn mỗi năm (đe Kinkelin, P. et al., 1985). Dịch bệnh VHS cũng làm mất trắng

£600.000 ở các nông trại nuôi cá Hồi thuộc vùng Gigha - Argyll vào năm 1994.
Castric va de Kinkelin đã ghi lại một trận dịch xẩy ra làm chết 80% cá Hồi nuôi bè
vào năm 1980. VHS virus cũng rất nhạy cẩm với những cá khác thuộc họ cá Hồi và
với những loài cá nước ngọt khác ở Đức và Thụy Sĩ, đặc biệt ở cá con (Reichenbach
— Klinke, H. 1959, Ahne, W. and Thomsen, I., 1985; Meier, W. et al., 1994).


Bệnh virus mùa xuân ở cA Chép (Spring viraemia of carp -SVC) va mot sé loai

khác gây chết khoảng 30% và trong vài trường hợp có thể tăng lên đến 70% (Crane,
M.1.; Eaton, L.M., 1997). Bệnh đốm đồ ở cá Trim cỏ (red spot disease of grass carp)

xuất hiện ở phía Nam Trung Quốc đã gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá Trắm cỏ
nhất là cá Trắm cỏ giống. Qua điều tra một số cá Trắm cỏ giống bị bệnh xuất huyết,

các nhà khoa học ở Đông Âu và Nga đã điều tra nghiên cứu và cho rằng bệnh có thể
gây ra do virus. Bệnh này lẫn đầu tiên được ghi nhận ở cá Trắm cổ, cá Chép và cá
Mè trắng vào đâu năm 1962, kể từ đó bệnh lan rộng khắp các tỉnh phía bắc Việt
Nam. Từ năm 1986 đến năm 1994, căn bệnh này đã ảnh hưởng đến cá Trắm cỏ nuôi
lồng bè và cá nudi ao hé. Đây là bệnh gây trở ngại lớn nhất trong nghề nuôi cá nước
ngọt ở Việt Nam. Những đợt điểu tra gần đây về bệnh đốm đỏ ở bắc Việt Nam cho
thấy bệnh xuất hiện theo mùa và thường xảy ra vào giữa tháng 3 - 4 và tháng 10 —

11. Thường
hiện nhiều
, nuôi thuộc
khoảng 30

vào cuối xuân đầu hè thu khi
và gây chết cá hàng loại. Vào
8 tỉnh phía Bắc cho thấy 80 —
— 100% cá bị chết vì bệnh này

nhiệt độ nước tăng từ 24-30°C, bệnh xuất
năm 1997, một cuộc điểu tra tại 150 điểm
90% ao nuôi cá Trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ,
(Te, B. Q, 1997b). Ngoài ra bệnh còn gặp

ở cá Diếc, cá Mè trắng, Mè hoa, cá Nheo hương, tỷ lệ chết cao hơn 90% (Fijan N. et

al:, 1984).

28 SBME RFR NER

AER RINGSIS BEBE

xử a“ 2 pom

1971 (MG)

.
2D

998
PARISTAN

“

PHILIPPINES
l0

ee

`

Santa

PAPUAXe

Figure 1.1 Geographical spread and year of firstappearance of BUS in Asia-Pacific region.. MG and RSD are

similar ulcerative disease condition to EUS and are afso indicated.

10

.

—


2.4. VAL NET VE TAC NHAN GAY BENH LO LOET Ở CÁ

(Epizootic

ulcerative syndrome — EUS)

2.4.1. Vi khuẩn

Trong vòng vài năm sau khi địch bệnh đầu tiên xây ra ở Thái Lan, nhiễu nhà

nghiên cứu đã ghi nhận Aeromonas hydrophiia là tác nhân vì khuẩn thường gặp nhất

khi phân lập từ vùng tổn thương của cá bệnh. Những vi khuẩn khác cũng phân lập

được nhưng gặp ít thường xuyên hơn bao gồm Aeromonas sorbia, Flavobacterium
sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas sp., Edwardsiella tarda, Vibrio
parahaemolyticus va Streptococcus sp. (Tonguthai, K. 1985; Boonyaratpalin S. et al.,
1983). A. hydrophila cũng được ghỉ nhận có chiếm uu thé hon hẳn khi phân lập từ

những

con cá bị nhiễm

(Llobrera,

A.T.

and

bệnh ở những

Gacutan,

R.Q.

,

vùng
1987),

địa lý khác
Indonesia

nhau

như ở Philppin

(Supriyadi,

H.

,

1988;

Karunasagar, I. et al., 1995) va Sri Lanca (Subasinghe, R.P. et al., 1990). Vi khudn,

đặc biệt là A. hydrophila được biết là một trong những nguyên nhân gây bệnh xuất
huyết ở cá (Roberts, 1993). Các tác giả cho rằng Aeromonas spp là tác nhân gây

bệnh thứ cấp nhưng có thể góp phần quan trọng trong việc gây chết ở những con cá
bệnh (Kanchanakhan, S., 1996).
2.4.2. Virus

Vào năm 1963, Jensen M. đã phân lập được một loại virus lấy từ mẫu bệnh
phẩm VHS. Ong đã gây cảm nhiễm ngược và ghỉ nhận được những biểu hiện đặc

trưng của bệnh này, hơn nữa tác nhân gây bệnh cũng đã phân lập được từ những con
cá thí nghiệm. Quan sát đưới kính biển vi điện tử cho thấy virus này là một loại
rhabdovirus. Ngày nay, các đặc tính sinh học cũng như cấu trúc phân tử của virus

này đã được nghiên cứu rất nhiễu. Bệnh phổ biến ở cá hổi 3 tuổi và gây chết cao.
Các nhà nghiên cứu cho rằng cá có thể ủ bệnh trong vịng vài tháng (Wolf, K. 1988).
Vào năm

1971, Fijan N. và cộng sự đã phân lập được một loại rhabdovirus

gây bệnh phù cấp tính ở cá Chép (acufe infectious dropsy of carp — IDC) va dat tén
là Rhabdovirus carpio. Bệnh này sau đó được gọi là bệnh virus mùa xuân ở cá Chép
(Spring viremia of carp — SCV). Bệnh thường xẩy ra vào mùa xuân, xuất hiện ở cá

Chép và gây chết đối với cả cá con và cá lớn. SCV được ni cấy phân lập trên
nhiều địng tế bào khác nhau và cho đến nay đã được biết rõ về đặc tính sinh học
cũng như về mặt cấu trúc.
,

Đối với bệnh đốm đỏ do virus, tác nhân gây bệnh là Reovirus. Khi bệnh nặng,

cá có thể bị xuất huyết tồn thân và các cơ quan nội tạng. Virus này có thể gây xuất

huyết cấp tính và làm chết cá con hoặc cá một năm tuổi (Fijian et al., 1984).
Năm 1985, một loại rhabdovirus và một birnavirus được phân lập đầu tiên từ
những con cá bệnh EUS ở vùng Đông Nam A (Wattanavijiarn W. et al., 1986), sau
đó khơng lâu, 6 chủng rhabđovirus khác cũng được phát hiện từ những con cá bệnh ở

1


Đông Nam và Nam A (Frerichs G.N. et al., 1986, 1989) và 2 birnavirus khác ở Thái
Lan (Saitanu K. et al., 1986; Hedrick, R.P. et al., 1986). Vào đâu những năm 1990, 3

loại virus khác đã được phân lập từ cá lóc - 1 birmavirus phân lập ở Singapore
(Subramaniam S. et al., 1993) va 1 rhabdovirus, 1 reovirus ở Thái Lan (Roberts R.].

et al., 1994). Rhabdovirus là một trong những nhóm tác nhân thường gặp nhất có én
quan đến bệnh EUS. Tuy nhiên rất khó phân lập virus từ cá bị bệnh EUS tự nhiên

đo virus chỉ có thể được phân lập ở giai đoạn sớm 1 -~ 2 tuân đầu của 6 dich
(Kanchanakhan, S., 1996).

2.4.3. Ký sinh trùng
Ký sinh trùng cũng được xem là có liên quan với cá bị bệnh EUS nhưng nói
chung chúng khơng phải là tác nhân gây bệnh chính. Tuy nhiên, ?richodina và
Đactylogyrus thường được thấy ở snakeskin gourami, Trichogaster pectoralis, trong
thời gian dịch bệnh kéo dài vào nam 1982 -1983 (Tangtrongpiros et al., 1983a) va
Gyrodactylus, Dactylogyrus, Epistylis, Henneguya va Lernaea

thường thấy ở cá

bống tượng bị bệnh, Oxyeleotris marmoratus, nuôi
sinh trùng thường thấy nhất được ghỉ nhận ở những
bùng phát dịch bệnh đầu tiên ở Ấn Độ vào năm
Trichodina, Epistylis, Gyrodactylus va Dactylogyrus

bè (Supamataya et al., 1983). Ky
con cá bệnh EUS trong thời gian
1988 bao gồm /chhyophthririus,
(Boonyaratpalin, 1989b).

2.4.4. Nấm
Mặc dù nấm thuộc nhóm Saprolegniaceae là nấm phổ biến có liên quan đến
bệnh lở loét ở cá, nhưng có thể lồi nấm Achiya sp là nấm gây cho cá bị bệnh EUS ở
Thai lan (Pichyangkura va Bodhalamilk, 1983) va Sri Lanka (Subasinghe et al.,
1990). Tuy nhiên khó có thể phân lập được nấm từ cá mới có những dấu hiệu sớm

của bệnh hoặc ở vết thương đang lành. Vì vậy có thể kết luận rằng Achiya sp không

phải là tác nhân ban đầu, nhưng hầu như nó là tác nhân gây chết cho cá bệnh. Năm
1992, Aphanomyces được phân lập từ mơ cơ ở cá lóc bệnh EUS ở Thái Lan và thực
nghiệm cho thấy đây là một tác nhân gây bệnh. Aphanomyces cũng được xem là tác
nhân gây bệnh chính đóng vai trị quan trọng trong mô tổn thương ở cá bệnh EUS
(Roberts et al., 1994) và được gọi là Aphanomyces invaderis sp. (Willoughby et al.,
1995). Tuy nhiên A. ¿mvađeris chỉ xâm nhập vào cá khi có tác nhân virus hoặc những

yếu tố gây stress khác và là một trong những tác nhân gây bệnh.

2.5. MỘT SỐ BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ DO VIRUS ĐÃ ĐƯỢC

NGHIÊN CỨU

2.5.1. Bệnh hoại tử gan tụy
IPNV (Infectious Pancreatic Necrosis Virus) là căn bệnh nguy hiểm trên cá

gây bởi virus đạng hình khối gồm 29 mặt. Có đường kính 60nm và khơng có vỏ bọc,

kháng nhiệt và acid (Whipple và Rohovec, 1994). Virus cũng kháng với các chất xử

lý khác và chloroform và sự để kháng có thể thay đổi trong điểu kiện lạnh đông.
12


Virus có khả năng gây nhiễm ở trong nước trong 6 tháng ở 102C và nhiều tuần ở

nước sông không xử lý (Ahne,

1982). Bộ gen của IPNV gồm một cặp RNA chia

thành 2 phần.
IPNV được tìm thấy khắp nơi trên thế giới, IPNV đầu tiên được mô tả trên cá
hồi suối bột bởi MiGonigle vào năm 1941 và loài cá này vẫn được xem như là loài
mẫn cảm nhất. Bệnh này có tính-đặc hiệu thấp và khơng giới hạn ở các lồi cá hồi
hoặc các lồi cá

khác. IPNV có thể phân lập được trên các lồi động vật khơng có

xương sống (nhuyễn thể và các loài giáp xác) và các động vật này được xem như là
vật mang mâm bệnh. IPN được xác định là có mặt trên 50 lồi động vật thuỷ sẵn

(Mortensen et al., 1992). Cá mắc bệnh với tỷ lệ chết cao. Vào năm 1953 Snieszko et
el đã chứng minh sự nhiễm bệnh trong nhiên nhiên thông qua đồng nước. Wolf et al
đưa thơng tin về lồi virus này vào năm 1960 khi ông thực hiện một cuộc thí nghiệm

có liên quan đến sự vơ khuẩn trên cá hồi nhiễm bệnh.

Cá mắc bệnh với các triệu chứng bên ngoài như da sậm đen chiếm 1⁄3 cơ thể

và đầu sưng to,

lỗi mắt, và bơi không định hướng. Xuất huyết phẩn bụng, vây và

khu vực hậu môn. Mang tái (là kết quả sự tổn thương cơ quan gan tụy). Bên trong,
IPNV gây mất máu và trải rộng ra nhiều cơ quan và mô, tụy là cơ quan bị tác động
chính. Mơ

máu của thận và lách cũng bị nguy hại. Ở cá bị nhiễm bệnh, những cơ

quan này thường tái nhợt và có nhiều đốm xuất huyết có thể nhìn thấy ở môn vị, và

các mô mỡ. Virus phá vỡ hệ thống tiêu hóa, bao tử khơng tiêu hóa được thức ăn

nhưng thay vào đó là các chất nhày như sữa. Xét nghiệm mô học thấy tế bào hạch
tụy và tế bào máu trong thận bị thoái hoá và trong suốt. Ở giai đoạn cá bột, sự gây

nhiễm bắt đầu từ giai đoạn tuần thứ ba sau khi cá không cịn nỗn hồng. Việc bộc

phát bệnh ít khí xảy ra sau 20 tuần nuôi dưỡng và ở cá bột đôi khi khơng thấy dấu
hiệu lâm

sàng rõ ràng nhưng vẫn có thể là vật mang virus.

Bệnh truyễển theo chiéu đọc và chiều ngang : truyền từ cha mẹ sang con, từ

phân của cá nhiễm bệnh thải ra môi trường đến những

cá mẫn cảm với chúng và từ

cá thể này sang cá thể khác. Thức ăn cá và các dụng cụ dùng trong ni cá cũng có

thể là vật lây nhiễm. IPNV gây thiệt hại cho nến kinh tế 60 triệu USD mỗi năm

(Christie, 1997), gây chết hầu hết trên cá hổi bột khi cá bắt đâu biết ăn thức ăn và

trong suốt năm đầu (Christie, 1997). Cá còn sống qua đợt dịch có thể là vật mang
mầm bệnh và vẫn cịn giữ trong suốt cuộc sống của chúng. Những con cá này khơng
có dấu hiệu của bệnh nhưng vẫn tiếp tục thải virus ra ngoài theo phân và nước tiểu
của chúng.

-

Virus có thể thâm nhập vào những cá thể mẫn cảm với chúng bằng con đường
mang và đường tiêu hóa. Thời gian ủ bệnh ngắn, nhưng phụ thuộc vào nhiễu tác

nhân khác như độ tuổi, nhiệt độ và pH của nước cũng như loài cá. Cá hổi con nhỏ

nhiễm IPNV bắt đầu chết trong vòng 4 ngày. Giai đoạn này kéo dài khoảng 8-10
13

ngày ở cá hôi con lớn và cá giống. Tỷ lệ chết cao, gây chết 80%. Cá chết kéo đài từ
3-4 tuần. Giai đoạn từ khi nhiễm bệnh đến khi bộc phát bệnh lân đầu tiên có thể là
nhiễu năm.
2.5.2. Bệnh virus mùa xuân ở cá Chép (SVC)

Do Rhabdovirus cá Chép. Đây là loại virus có họ hàng gần với loại virus gây
bệnh xuất huyết mùa xuân (VHS) và bệnh hoại huyết do nhiễm trùng (HN) trên cá
hồi. Các loài mẫn cảm với bệnh như cá Chép (đặc biệt là cá chép mùa hè), cá Mè,
cá đa trơn, cá Diếc. Cá trắm cỏ, cá măng và cá khổng tước (cá cảnh) cũng mẫn cảm
với loại virus này. Bệnh thường xây ra vào mùa xuân nhiệt độ dưới 15°C. Nhiệt độ
trên 20C không xảy ra dịch bệnh. Bệnh SVC không xây ra ở các nước có khí hậu

ấm. Khơng xảy ra ở cá chép nuôi quảng canh. Cá bệnh với các đấu hiệu lâm sàng
tương tự như bệnh VHS, cá phân chia đàn, bị lỗi và nổ mắt, bụng trướng có thể bị
áp xe, chứa dịch trong khoang bụng, xuất huyết trên da, mang, phần tích mỡ dưới
bụng, bơi lội lờ đờ, xuất huyết cơ quan nội tạng. Tỷ lệ gây chết 30% tùy điều kiện

mơi trường và tình trạng sức khỏe cá (D.J. Alderman, 1995).Tỷ lệ chết giảm khi nuôi
theo hình thức quảng canh. Bệnh có thể từ nước nhiễm SVC đi vào mang cá, hoặc từ
các dụng cụ bị lây nhiễm và từ trứng ký sinh trùng như Argulus hoặc Piscicola cũng
có thể là vật truyễển bệnh từ cá này sang cá khác. Tình trạng siress ở cá (nhiệt độ

thay đổi, sự vận chuyển cá, mật độ ni) có thể ảnh hưởng đến sức khỏe đàn.
2.5.3. Bệnh hoại huyết do nhiễm trùng (THN) trên cá hỗi :

Tác nhân là một Rhabdovirus tương tự như nhóm virus gây bệnh xuất huyết

(VHS) và virus mùa xuân ở cá chép (SVC). Bệnh do IHN đầu tiên được phát hiện

trên cá hổi Thái bình Dương ở Canada và ở miễn đơng nước Mỹ vào thập niên 1950
sau đó lan truyển sang các khu vực khác của nước Mỹ

và Canada, các nước khác

như Pháp, Ý, Đức, Switzerland, Nhật Bản, Đài Loan và Trung Quốc. Hầu hết cá hôi
đều mẫn cảm với bệnh và tỷ lệ chết cao, đặc biệt là cá hổi Thái Bình Dương. Tuy
nhiên cá măng, cá hổi nâu, cá hổi bạc, cá thyman kháng với bệnh này nhưng có thể
là vật mang mầm bệnh.

IHN là gây bệnh ở tất cả các giai đoạn ở cá từ lúc cịn nỗn hồng, cá bột, cá

giống và cá thịt. Virus gây bệnh cho cá nước ngọt và cá biển. Chỉ

với mật độ thấp

có thể gây nên bệnh. Cá có thể truyền bệnh qua trứng và tỉnh trùng. IHN nhạy cảm

với iod do đó có thể sử dụng iod để ngăn ngừa sự phát triển của virus. Tuy nhiên
với trường hợp virus ở bên trong trứng thì khơng thể ngăn chặn bằng iod . Để ngăn

chặn bệnh IHN chỉ có một cách là kiểm tra và phát hiện [HN trong đàn bố mẹ.
Bệnh xảy ra vào mùa xuân và mùa thu. Cá mắc bệnh bỏ ăn, hỗn mê, bơi trên tầng

mặt và sát bờ hô. Cá sắp chết thường bơi nhanh và bơi xoay

vòng. Mang, thận và

lách tái. Xuất huyết điểm hoặc hạt ở mang, màng ruột và gan. Thận thường sưng to,

ruột khơng có thức ăn và bị nhiễm trùng.

14


Ở cá hổi rang và cá hổi bột

khi mắc bệnh cá bị xuất huyết nỗn hồng, đa

sim mau, xuất huyết bụng và xung quanh mắt. Đôi khi mắt lỗi và sưng, trướng bụng
(apxe, chứa nhiễu dịch), chảy mủ trắng từ hậu môn, chẩy máu phân đuôi, xuất

huyết cơ quan nội tạng, xuất huyết mô mỡ đôi khi xuất huyết mô cơ. Bao tử và ruột

khơng có thức ăn, chứa đẩy dịch. Trong trường bệnh cấp tính cá chết ngay, những
dấu hiệu lâm sàng không thấy được. Đặc điểm xuất huyết hoại tử chỉ thấy được khi

kiểm tra mô bệnh học trên bộ phận thận trước và lách của cá. Tỷ lệ chết cao ở nhiệt

độ từ 10 ~ 12C, tỷ lệ cá chết lên đến 80-90% trong vòng từ 8- 15 ngày. Ở cá một
năm tuổi thì tỷ lệ chết khoảng 10%. Tỷ chết cao thường gặp ở cá có trọng lượng

khoảng 100g, cá có trọng lượng trên 100g thì bệnh có tính chất mãn tính và tỷ lệ
hao hụt sau một giai đoạn dài chỉ từ 10 -20%. Sự lan truyền bệnh theo nước đi vào
mang, từ cá mang bệnh, chim ăn cá, dụng cụ nhiễm, nước nhiễm bệnh, trứng và ký
sinh trùng.

2.5.4. Bệnh xuất huyết mùa xuân (VHS)
Viral Haemorrhagic Septicaemia là căn bệnh nguy hiểm nhất do virus gây nên

trên cá hồi ở châu Au và gây thiệt hại đáng kể về nền kinh tế ở một số nước thuộc
châu Âu. Virus gây bệnh xuất huyết mùa xuân là một Rhabdovirus, một thành viên

lớn nhất trong họ virus gây bệnh trên cá và cũng có quan hệ với virus gây hoại

huyết do nhiễm trùng (HN) và xuất huyết mùa xuan 6 cA Chép (SVC). Virus có khả
năng gây hoại tử thận đặc biệt là đầu thận. Cá hổi ráng, cá măng nhỏ, cá thyman, cá
hồi trắng, các loại cá biển như cá thu và cá tuyết cũng nhạy cầm với bệnh này. Cá
hồi nâu chỉ có một vài chủng nhưng ít thấy rõ dấu hiệu lâm sàng. Khi nhiệt độ từ 7 -

11°C là nhiệt độ thích hợp cho bệnh xảy ra. Mùa chính xảy ra bệnh là mùa xuân đôi
khi cũng xảy ra vào mùa thu. Ở nhiệt độ từ 14-16°C dấu hiệu lâm sàng khó quan sát
được. Bệnh không xảy ra ở nhiệt độ trên 16°C. Tỷ lệ chết phụ thuộc vào type virus,

tình trạng sức khỏe cá và điều kiện môi trường. Tỷ lệ chết nằm trong khoảng từ 10 —
50% có trường hợp lên đến 80%. Sự truyền lây truyền qua nước từ những vật mang

mam bệnh, chỉm ăn thịt, dụng cụ và nguồn bị lây nhiễm, trứng cá nhiễm bệnh, ký
sinh trùng. Cá bị stress như: ăn quá nhiễu, tác động của cá bệnh, mật độ ni dày,

nhiệt độ nước thay đổi có thể dẫn đến bùng phát bệnh.

2.6. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CÁC LOÀI CÁ:
2.6.1. Đặc điểm sinh học cá Trê
Phân loại:

Bộ: Siurformes
Ho: Clariidae

Giéng: Clarius (Scopoli, 1977)

Loai tré phi: C. gariepinus
Tré vang: C. macrocephalus (Gunther, 1864)

15


Phân bố :

“

Trê vàng C. macrocephalus (Gunther, 1864) phân bố Thai lan, Campuchia và
Việt nam
Trê Phi C. gariepinus (C. lazera) được du nhập vào Việt Nam

_từ 1975 từ châu

Phi

Trê lai : đực trê phi x cái trê vàng

Đặc điểm sinh học :
Cá trê phi là loài ăn tạp thiên về động vật nhờ có lược mang dày. Cá có khả

năng chịu sự thay đổi nhiệt độ rất lớn: 9,5 — 41°C, pH: 4,5 — 10. Thích hợp nhất: 6,5 —
8,0.

Nhờ có cơ quan hơ hấp phụ nên cá có thể sống trong mơi trường có hàm lượng

O; thấp (gần bằng 0 mg/I). Nếu thuần hóa cá có thể sống trong mơi trường có độ

mặn 10 %e. Trong tự nhiên cá thành thục sau hai năm khi đạt trọng lượng 200 - 300
gr. Trong ao nuôi cá thành thục sau 8 tháng tuổi. Mùa vụ sinh san trong tự nhiên khi

bắt đầu mùa mưa, cá thường để một lần trong năm. Trong ao cá có thể để quanh

năm. Sức sinh sản: 10.000 — 16.000 w/con cái nặng 200 — 600 gr. Thời gian tái phát
dục: 30 — 40 ngày.
Cá trê vàng
Cá trê vàng là lồi cá bản địa có ở Miễn Nam Việt Nam. Trong tự nhiên cá

phân bố khá rộng trong hầu hết các thủy vực nước ngọt. Cá sống được ở nhiệt độ 12
~ 30°C nhưng thích hợp nhất là 25 — 26°C, pH: 4,0 — 10 thích hợp ở pH 7,5 - 8,6 ; có

thể sống được trong mơi trường có hàm lượng O; hịa tan thấp và ở độ mặn 0 - 10%.
Cá thành thục sau 6 tháng tuổi trọng lượng trung bình 150 —- 300gr. Cá có thể

để quanh năm nhưng mùa vụ chính từ tháng 6 đến tháng 10. Sức sinh sẵn: 5.000 —
10.000 w/con cái 300gr. Thời gian tái phát dục: 55 ngày.

Cá trê vàng có tốc độ tăng trưởng chậm. Ở giai đoạn cá hương, cá giếng phát

triển khá nhanh nhưng giai đoạn cá thịt thì phát triển chậm. Cá ni một năm đạt
200 - 400 gr/con.

Cá Trê lai

Năm 1988 Cục Nuôi trồng Thủy sản Hồng gia Thái Lan đã thành cơng trong
việc tạo ra con lai giữa hai cá thể bố mẹ (bố trê phi và mẹ trê vàng) (Kamonporn
Tonguthai,

1993). Cá có khả năng chịu đựng được điều kiện khắc nghiệt của mơi

trường. Cá có khả năng thích ứng nhiệt độ 11 - 39°C, pH thích hợp từ 6,5 — 8,0, sống

được trong ao nước tù, chịu dựng được hàm lượng O¿ xuống thấp do có cơ quan hơ

hấp phụ. Thức ăn sau khi nổ 2-3 ngày trở đi cá ăn động vật phù du như : Moina, giáp
xác nhỏ, trùng chỉ. Khi trưởng thành cá ăn tạp nghiêng về động vật, cá có thể ăn các
phụ phẩm các nhà máy chế biến : đầu vỗ tôm, ruột da mực và thức ăn khác như bột
cám, gạo, bắp...Cá trê lai có tốc độ sinh trưởng trung gian giữa cá trê phi và cá trê

16


vàng. Cá cỡ 2 - 3 cm sau 2,5 - 3 tháng đạt trọng lượng trung bình từ 200 — 300

gr/con.

2.6.2. Đặc điểm sinh học cá tra (Pangasianodon hypophthamus)/

Vi tri phan loai:
B6: Siluriformes.
Ho: Schibeidae

Phânbế

Giống: Pangasianodon
.

Phân bố ở Thái Lan, Campuchia, Lào và Việt Nam.

Đặc điểm sinh học

Là loại ăn tạp, trong thủy vực tính ăn của cá Tra thiên về động vật. Tuy
nhiên trong điểu kiện ni đưỡng cá có khả năng thích nghỉ với nhiều loại thức ăn

tạp có hàm lượng protein thấp do con người cung cấp. Cá tăng trưởng nhanh, sau 1
năm có thể đạt 0.8 — 1 kg, sau 2 năm đạt 1.5 - 2 kg. Trọng lượng trung bình của bố

mẹ ở tuổi thành thục lân đầu tiên là 3 — 3,5kg. Mùa vụ sinh sản tự nhiên vào đầu

tháng 5âm lịch. Cá Tra chỉ để 1 lần trong năm. Sức sinh sản khoảng 100.000 —
200.000 trứng/kg cá cái. Cá Tra có khả năng chịu đựng được ở thủy vực có oxy thấp
và ni được mật độ dày. Ngưỡng oxy và tiêu hao oxy của cá tra thấp hơn nhiều loài
cá khác.

2.6.3. Đặc điểm sinh học cá Bống tượng
Vị trí phân loại

Cá Bống tượng (Sand Goby) thuộc:
Bộ : Percformes.

Ho : Eleotridae.

Giống : Oxyeleotris.
Loài : Oxyeleotris Marmoratus.

Phân bố

Từ Indonesia, Malaysia, Thái lan, Lào, Campuchia và Việt Nam.

Đặc điểm sinh học
Trong tự nhiên cá sống trong các thủy vực nước ngọt như sơng ngịi, kênh
rạch, ao, đìa, ... thích nơi nước ấm, nhiều rong, có hang hốc. Cá hoạt động bắt môi

về ban đêm, ban ngày vùi mình trong bùn đất. Khi sinh sản, chúng chọn nơi có nước
chẩy hoặc nước lưu thơng. Cá có thể sống được ở những vùng nhiễm phèn, có độ pH
=5,5 và nơi có độ mặn khơng

vượt q

13%„, hàm lượng oxy hịa tan khơng được

thap qua 1 mg/l. Cá có thể sống trong khoảng nhiệt độ từ 15 - 41,5°C. Nhiệt độ thích

hợp là từ 26 — 32°C. Nhiệt độ thích hợp cho giai đoạn phát triển của phôi trứng sau
khi để là từ 27 — 30°C. Ở giai đoạn phát triển phôi, nếu nhiệt độ lớn hơn 33°C, phôi
sẽ bị chết. Cá Bống tượng có độ tăng trưởng tế bào chậm. Cá thành thục sinh dục và
17