Tóm tắt: Xây dựng mô hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Ngơ Thị Hải Yến

XÂY DỰNG MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY
IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO
CƠ TIM H9C2 CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT TỰ NHIÊN
Chuyên ngành: Sinh lý người và động vật
Mã số: 9420101.04

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2023


Cơng trình được hồn thành tại:
Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - ĐHQGHN

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Vũ Thị Thu

Phản biện: PGS.TS. Đỡ Thị Thảo
Phản biện: PGS.TS. Hồng Văn Tởng
Phản biện: TS. Phạm Ngọc Tồn

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ
họp tại Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - ĐHQGHN vào
hồi
giờ
ngày
tháng

năm 2023

Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Thư viện Quốc gia Việt Nam
- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội


MỞ ĐẦU
Thiếu máu cục bộ (TMCB) cơ tim là một trong các nguyên nhân
gây tử vong hàng đầu trong các bệnh tim mạch. Ở Việt Nam, bệnh
TMCB có xu hướng ngày càng tăng, trẻ hóa và gây tử vong với tỉ lệ
11,8% (theo số liệu năm 2019) [122]. Ngoài việc ảnh hưởng tới sức
khỏe, tàn tật và tử vong, chi phí chăm sóc người bệnh cùng với năng
suất lao động mất đi hằng năm tạo áp lực và gánh nặng cho sự phát
triển kinh tế - xã hội. Do vậy, ngồi nỡ lực giảm thiểu các yếu tố nguy
cơ thì việc áp dụng các biện pháp kết hợp trong điều trị bệnh là một
trong những ưu tiên y tế hàng đầu.
Đối với bệnh lý TMCB cơ tim, thời điểm tái thơng dịng máu cho
vùng mơ bị thiếu máu và thuốc điều trị là những yếu tố quyết định sự
thành công trong việc điều trị cho người bệnh. Tuy nhiên việc tái tưới
máu (TTM) cũng có thể làm trầm trọng hơn những tởn thương trước
đó trong giai đoạn TMCB. Các tởn thương này được gọi là tổn thương
thiếu máu cục bộ-tái tưới máu (TMCB-TTM) hay tổn thương thiếu
oxy-tái cung cấp oxy (HR) [59]. Song song với sự phát triển các kỹ
thuật lâm sàng nhằm tái thơng dịng sớm, việc tìm kiếm thuốc mới với
hiệu quả tốt hơn, ít gây tác dụng phụ và giúp giảm thiểu tổn thương
gây ra do TMCB-TTM cơ tim là hướng nghiên cứu luôn nhận được sự
quan tâm của các nhà khoa học [102]. Việc nghiên cứu cơ chế sinh
bệnh cũng như tìm kiếm các chất có tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim
trong tổn thương TMCB-TTM thường được thực hiện trên các mơ

hình thực nghiệm in vivo, ex vivo và in vitro. Trong đó, mơ hình
TMCB-TTM in vitro còn được gọi là mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp
oxy in vitro là phương pháp hiệu quả để nghiên cứu sàng lọc bước đầu
các hoạt chất tiềm năng và là bước cơ sở tiền đề cần thiết cho các bước
nghiên cứu tiếp theo để phát triển thuốc cũng như điều trị bệnh lý [58,
1


162]. Mơ hình HR khá phở biến trên thế giới, tuy nhiên tại Việt Nam
các nghiên cứu sử dụng mô hình này còn chưa nhiều. Do đó, việc
nghiên cứu xây dựng mơ hình HR in vitro sẽ cung cấp thêm một cơng
cụ có thể sử dụng trong giai đầu của nghiên cứu khảo sát và đánh giá
tác động của các hợp chất đối với tế bào cơ tim trong mô hình bệnh lý.
Mơ hình HR in vitro có thể phân tích trên tế bào phân lập từ mơ
cơ tim hoặc các dịng tế bào cơ tim ni cấy [58, 139]. Trong số đó,
dịng tế bào H9C2 được tách từ mơ tâm thất tim phôi chuột BDX1 bởi
Kimes và Brandt [76] sinh trưởng tương đối tốt, cho phép nuôi cấy
khá dễ dàng. Đồng thời, dòng tế bào này cũng thể hiện nhiều đặc điểm
giống với các tế bào cơ tim phân lập về sự chuyển hóa năng lượng, sự
nhạy cảm với nồng độ oxy. Vì vậy, H9C2 thường được lựa chọn ứng
dụng nhiều trong các nghiên cứu bệnh lý tim như phì đại cơ tim,
TMCB-TTM, sự chuyển hóa vật chất của tế bào hoặc phân tích độc
tính của các thuốc điều trị [76, 153]. Tuy nhiên, nghiên cứu thực
nghiệm bệnh lý TMCB cơ tim sử dụng tế bào H9C2 là còn khá mới ở
Việt Nam. Do vậy, việc ứng dụng tế bào H9C2 trong nghiên cứu thực
nghiệm bệnh TMCB-TTM hứa hẹn sẽ tạo ra hướng đi và cách tiếp cận
mới đối với bệnh lý này ở Việt Nam.
Bên cạnh đó, nghiên cứu cho thấy tởn thương trong TMCB-TTM
cơ tim có liên quan mật thiết đến sự thay đổi cấu trúc và chức năng
bào quan ti thể [20, 81]; do vậy, nghiên cứu đánh giá vai trò của thuốc

trong điều trị TMCB-TTM cơ tim dựa trên phân tích ti thể là lựa chọn
phù hợp [8, 148]. Trên thực tế, công việc phân tích các hoạt chất có
tác dụng bảo vệ cơ tim hướng đích ti thể đã đạt được một số thành tựu
đáng kể [130]; và cũng vẫn cần tiếp tục được mở rộng với hi vọng
mang lại thêm sự lựa chọn cũng như tối ưu hóa điều kiện sử dụng các
thuốc có sẵn.
2


Nguồn dược liệu nước ta phong phú, có tiềm năng lớn về số lượng
và chất lượng các chất có hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm và
chống ung thư [65, 142]. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm
sàng lọc, phân tích và tìm hiểu vai trị của các thành phần của cây
thuốc trong điều trị bệnh [4, 65]. Tuy nhiên, tại Việt Nam, nghiên cứu
về vai trò của các hoạt chất có tiềm năng trong điều trị bệnh lý TMCBTTM cơ tim hướng đích ti thể vẫn cịn khá mới. Vì vậy, việc nghiên
cứu sàng lọc hoạt chất có tiềm năng hướng đích ti thể là vấn đề cấp
thiết, có ý nghĩa về lý luận và thực tiễn. Trên cơ sở đó, đề tài “Xây
dựng mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in vitro và đánh giá tác
dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của một số hợp chất tự nhiên” được
thực hiện nhằm mục tiêu:
- Thiết lập và hồn thiện được mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in
vitro trên tế bào cơ tim H9C2;
- Đánh giá được tác dụng bảo vệ của một số hoạt chất tiềm năng đối
với tế bào cơ tim H9C2 trong mô hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in
vitro.
1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN
Để thực hiện được mục tiêu của đề tài, nội dung triển khai nghiên cứu
gồm:
1.1. Thiết lập và hồn thiện mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy trên
tế bào H9C2

- Thiết lập buồng thiếu oxy và hoàn thiện mơ hình thiếu oxy-tái cung
cấp oxy;
- Đánh giá hiệu quả mơ hình thiết lập trên tế bào H9C2 với đối chứng
dương.
1.2. Đánh giá tác dụng bảo vệ của một số hoạt chất đối với tế bào
H9C2 trong mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in vitro:
3


- Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của Naringin (từ Trần
bì) trong mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy;
- Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của Liquiritin (từ rễ
cây Cam thảo) trong mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy;
- Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của cao Sâm Ngọc
Linh và Majonoside R2 (từ Sâm Ngọc Linh) trong mơ hình thiếu oxytái cung cấp oxy;
- Đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim H9C2 của cao Sâm Vũ Diệp
và Araloside A Methyl Ester (từ Sâm Vũ Diệp) trong mơ hình thiếu
oxy-tái cung cấp oxy.
2. TÍNH MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ
TÀI LUẬN ÁN
2.1. Tính mới của đề tài luận án
- Đề tài luận án là nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam cung cấp dữ liệu
về việc thiết lập buồng thiếu oxy và hồn thiện mơ hình bệnh thiếu
oxy-tái cung cấp oxy sử dụng tế bào cơ tim H9C2.
- Đề tài luận án là nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam cung cấp dữ liệu
về tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim chuột H9C2 hướng đích ti thể trong
mơ hình bệnh thiếu oxy-tái cung cấp oxy của một số cao chiết và hoạt
chất thiên nhiên như: Naringin, Liquiritin, cao butanol Sâm Ngọc
Linh, cao butanol Sâm Vũ Diệp, Majonoside R2 và Araloside A
Methyl Ester.

2.2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
- Kết quả của luận án đã thiết lập được buồng thiếu oxy, xây dựng và
hồn thiện được mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy sử dụng tế bào cơ
tim H9C2.
- Kết quả của luận án đã cung cấp dữ liệu về tác dụng bảo vệ tế bào cơ
tim của một số cao, hoạt chất tách chiết từ thảo dược Việt Nam trong
4


mơ hình bệnh in vitro. Đây là cơ sở cho các nghiên cứu sàng lọc và
phát triển thuốc, tìm kiếm chất có tác dụng bảo vệ tim trong tởn thương
thiếu oxy-tái cung cấp oxy.
- Kết quả của luận án đã cung cấp dữ liệu khoa học góp phần nâng cao
giá trị sinh học của thảo dược tại Việt Nam.
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. BỆNH THIẾU MÁU CỤC BỘ CƠ TIM
Thiếu máu cục bộ (TMCB) là hiện tượng bệnh lý gây ra do sự
giảm lưu lượng máu cung cấp đến vùng mô, cơ quan [72]. Ở tim,
TMCB thường được gọi là nhồi máu cơ tim hay TMCB cơ tim.
Nguyên tắc chung trong điều trị bệnh TMCB cơ tim là nhanh chóng
tái thơng dòng máu để giảm thiểu tái tổn thương cho mô cơ tim. Tuy
nhiên, điều này có thể làm các tởn thương gây ra trong giai đoạn
TMCB trở nên trầm trọng hơn. Đây là tổn thương thiếu máu cục bộtái tưới máu (TMCB-TTM) hay tổn thương thiếu oxy-tái cung cấp
oxy (khi xét về yếu tố tác động là do sự thay đởi nồng độ oxy).
1.2. TÁI TƯỚI MÁU VÀ TỞN THƯƠNG TÁI TƯỚI MÁU
Các tổn thương TMCB-TTM bao gồm việc sản sinh các gốc tự do
oxy hóa, sự bám dính của bạch cầu vào tế bào nội mạc, sự kết tụ bạch
cầu - tiểu cầu,… [44].
1.3. TI THỂ TRONG TỔN THƯƠNG THIẾU MÁU CỤC BỘ-TÁI
TƯỚI MÁU CƠ TIM

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vai trò quan trọng của ti thể trong cơ
chế bệnh TMCB-TTM cơ tim [81, 125].
1.4. CON ĐƯỜNG TÍN HIỆU TRONG TỔN THƯƠNG THIẾU
MÁU CỤC BỘ-TÁI TƯỚI MÁU CƠ TIM
Các con đường tín hiệu liên quan tới điều hòa hoạt động chức
năng cũng như sự sinh mới ti thể là đích hướng tới trong các nghiên
5


cứu tìm kiếm thuốc/chất có tác dụng bảo vệ bào quan này trước tởn
thương TMCB-TTM.
1.5. MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU THIẾU MÁU CỤC BỘ-TÁI TƯỚI
MÁU CƠ TIM
Trong các mơ hình nghiên cứu TMCB-TTM, mơ hình in vitro,
còn được gọi là mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy (Hypoxiareoxygenation, HR) thường được sử dụng phổ biến trong giai đoạn
đầu của các nghiên cứu sàng lọc thuốc, chất thử có tác dụng bảo vệ.
1.6. TẾ BÀO CƠ TIM H9C2
Dòng tế bào cơ tim H9C2 là một nhánh của dịng tế bào có nguồn
gốc từ mô phôi chuột BD1X, Rattus norvegicus.
1.7. NGHIÊN CỨU HOẠT CHẤT CĨ TIỀM NĂNG BẢO VỆ TIM
CHỐNG LẠI TỞN THƯƠNG THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY
Nội dung nghiên cứu của luận án tập trung vào việc phân tích sàng
lọc các hoạt chất chiết từ dược liệu có tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim
trong TMCB-TTM. Các hoạt chất được phân tích gồm: Naringin,
Liquiritin, cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2, cao Sâm Vũ Diệp
và Araloside A Methyl Ester.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU
2.1.1. Đối tượng
Mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy in vitro; Tác dụng bảo vệ tế

bào H9C2 trong tổn thương thiếu oxy-tái cung cấp oxy của một số
hoạt chất tự nhiên.
2.1.2. Vật liệu
- Tế bào cơ tim chuột H9C2 (ATCC® CRL-1446™, Mỹ) được tặng
bởi Trung tâm nghiên cứu bệnh chuyển hóa tim mạch, Trường Đại học
Inje, Hàn Quốc.
6


- Một số hợp chất và cao chiết dược liệu sử dụng trong nghiên cứu
được liệt kê trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Cao chiết dược liệu, tinh chất
Tên chất
Naringin (từ Trần bì, Pericarpium
Citri Reticulatae)
Liquiritin (từ rễ Cam thảo,
Radix Glycyrrhizae)
Cao Butanol Sâm Ngọc Linh
(Panax vietnamensis)
Cao Butanol Sâm Vũ Diệp
(Panax bipinnatifidus Seem)
Majonoside R2
(từ Panax vietnamensis)
Araloside A Methyl Ester
(từ Panax bipinnatifidus Seem)

Công thức,
KLPT
C27H32O14,
580,5 g/mol

C21H22O9,
418,4 g/mol

Độ
tinh
Nơi cung cấp
khiết
95,7% Viện Dược liệu
96,13% Viện Dược liệu
Đại học Phenikaa
Đại học Phenikaa

C41H70O14,
787,0 g/mol
C48H76O18,
941,1 g/mol

95%

Đại học Phenikaa

95%

Đại học Phenikaa

2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Kế hoạch triển khai nghiên cứu
Kế hoạch triển khai nghiên cứu được khái qt hóa trong Hình
2.1.

Hình 2.1. Sơ đồ khái
qt hóa kế hoạch
triển khai nghiên cứu

7


2.3.2. Ch̉n bị mơi trường, hóa chất
2.3.3. Ni tế bào H9C2
2.3.4. Đánh giá ảnh hưởng của DMSO lên khả năng sống của tế bào
2.3.5. Gây mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy
2.3.5.1. Gây mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy bằng CoCl2
2.3.5.2. Thiết kế, tạo và thử nghiệm buồng thiếu oxy (hypoxia)

Hình 2.4. Sơ đồ nguyên lý
hoạt động buồng hypoxia
2.3.6. Phân tích độc tính của cao dược liệu, hợp chất đối với tế bào
H9C2 trong điều kiện bình thường
2.3.7. Thử tác dụng sản phẩm chiết từ dược liệu đối với tế bào H9C2
trong giai đoạn tái cung cấp oxy
2.3.8. Phân tích tỉ lệ tế bào sống
2.3.9. Phân tích hàm lượng cardiolipin màng trong ti thể
2.3.10. Phân tích điện thế màng ti thể
2.3.11. Phân tích lượng gốc oxy phản ứng
2.3.12. Phân tích lượng Ca2+ ti thể
2.3.13. Phân tích mức độ biểu hiện protein bằng western blot
2.3.14. Chụp ảnh tế bào
2.3.15. Xác định tín hiệu huỳnh quang bằng máy đếm tế bào theo dòng
chảy

2.3.16. Xác định tín hiệu huỳnh quang bằng máy đo huỳnh quang đĩa
96 giếng
2.3.17. Phân tích số liệu
8


CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. KẾT QUẢ THIẾT LẬP MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG
CẤP OXY
3.1.1. Kết quả ni và nồng độ DMSO phù hợp đối với tế bào
H9C2
Tế bào H9C2 được nuôi trong môi trường DMEM 4,5g/l glucose,
10% FBS, 1% PS, 370C, 5% CO2. Nồng độ DMSO nhỏ hơn 0,5% là
phù hợp với tế bào H9C2 trong các thí nghiệm thử tác dụng của hoạt
chất.
3.1.2. Kết quả thiết lập mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy
3.1.2.1. Kết quả hoàn thiện mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy sử dụng
CoCl2
Với mục tiêu thiết lập điều kiện ni có mức độ gây chết 30-40%
tế bào, CoCl2 ở nồng độ 300 µM được chọn dùng trong nghiên cứu.
3.1.2.2. Kết quả thiết lập và hoàn thiện mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp
oxy sử dụng buồng hypoxia
Buồng hypoxia hoạt động hiệu quả và được dùng để thiết lập mơ
hình HR (6 giờ thiếu oxy, 24 giờ tái cung cấp oxy).
Hình 3.7. Ảnh chụp mơ phỏng các giai
đoạn sử dụng buồng hypoxia

3.1.2.3. Hiệu quả hoạt động của mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy
với đới chứng dương
Tỉ lệ sống của tế bào H9C2 trong điều kiện mơ hình bệnh có sử dụng

chất đới chứng dương NecroX-5
9


Nhóm HR+DMSO và HR-CoCl2+DMSO, có tỉ lệ tế bào sống
giảm mạnh với giá trị lần lượt là 67,78±3,33% và 64,41±1,10% (so
với 100% ĐC, p<0,01). NEC làm tăng đáng kể tỉ lệ này.
Kết quả phân tích ti thể tế bào trong mơ hình bệnh có sử dụng đới
chứng dương NecroX-5
Lượng cardiolipin (Hình 3.14) và điện thế màng ti thể (ΔΨm-Hình
3.15) giảm mạnh; stress oxy hóa và lượng Ca2+ ti thể tăng đáng kể ở
nhóm mơ hình bệnh và NEC có tác dụng hạn chế các tởn thương này.
Hình 3.14. Ảnh
chụp tín hiệu và
biểu đồ phân tích
mật

độ

huỳnh

quang NAO của tế
bào H9C2 trong
mơ hình HR và
HR-CoCl2 có đối
chứng dương

Hình 3.15. Ảnh
chụp tín hiệu và
kết quả phân tích

mật độ huỳnh
quang TMRE của
tế bào H9C2 trong
mơ hình HR và
HR-CoCl2 có đối
chứng dương
10


3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO H9C2
TRONG MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY
3.2.1. Kết quả phân tích tác dụng bảo vệ của Naringin trong mơ
hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy (mơ hình HR)
3.2.1.1. Tác dụng của Naringin đối với tỉ lệ sống của tế bào trong điều
kiện ni bình thường
Nar (1,6-320 µM) khơng thể hiện độc tính với tế bào H9C2. Do
vậy, Nar ở dải nồng độ này được chọn dùng trong trong nghiên cứu.
3.2.1.2. Tác dụng của Naringin đối với tỉ lệ sống của tế bào trong điều
kiện bệnh lý
Trong các nhóm tế bào bị gây mơ hình bệnh, nhóm được bở sung
Nar (80, 160 µM) có tỉ lệ sống cao nhất. Do vậy, Nar ở hai nồng độ
này được chọn dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2.1.3. Tác dụng của Naringin đới với ti thể trong mơ hình HR
a. Tác dụng của Naringin đới với cardiolipin màng trong ti thể
Nar có tác dụng bảo toàn hàm lượng CL thể hiện qua việc làm
tăng tín hiệu huỳnh quang NAO (màu xanh) trong nhóm tế bào được
xử lý với hoạt chất này so với nhóm HR+DMSO (p<0,05).
b. Tác dụng của Naringin đới với ΔΨm
Nhóm HR+DMSO có tín hiệu huỳnh quang TMRE giảm mạnh
(đạt 68,12±2,78% so với 100% ĐC, p<0,05). So với nhóm

HR+DMSO, nhóm HR+ Nar 80 và nhóm HR+Nar 160 có ΔΨm tăng
rõ rệt, với các giá trị là 84,32±1,49% và 80,60±2,19% (p<0,05).
c. Tác dụng của Naringin đới với stress oxy hóa ti thể
Trong HR, tín hiệu CM-H2DCFDA và MitoSOX Red tăng mạnh.
Tín hiệu này trong nhóm HR+NEC và nhóm HR+Nar 80 giảm đáng
kể so với nhóm HR+DMSO (p<0,05).
d. Tác dụng của Naringin đới với lượng Ca2+ ti thể
11


Tín hiệu huỳnh quang Rhod 2AM (phản ánh lượng Ca2+ ti thể)
trong nhóm tế bào bị gây mơ hình bệnh được bở sung Nar 80 µM
khơng có sự khác biệt so với nhóm HR+DMSO (p>0,05).
3.2.2. Kết quả phân tích tác dụng bảo vệ của Liquiritin trong mơ
hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy (mơ hình HR)
3.2.2.1. Tác dụng của Liquiritin đới với tỉ lệ sống của tế bào trong điều
kiện nuôi bình thường
Ở dải nồng độ 1,2-300 µM, LIQ khơng gây độc tế bào. Do vậy,
dải liều này của LIQ được sử dụng trong phân tích tiếp theo.
3.2.2.2. Tác dụng của Liquiritin đối với tỉ lệ sống của tế bào trong điều
kiện bệnh lý
Nhóm HR+LIQ 60 (nồng độ LIQ 60 µM) có tỉ lệ tế bào sống cao
nhất (đạt 92,16±4,66% đối chứng) và tỉ lệ này khá tương đồng với
nhóm HR+NEC (p>0,05). Do vậy, LIQ ở nồng độ 60 µM tiếp tục được
lựa chọn để phân tích tác dụng hướng đích ti thể.
3.2.2.3. Tác dụng của Liquiritin đối với ti thể trong mơ hình HR
a. Tác dụng của Liquiritin đới với lượng ti thể trong tế bào H9C2
Tín hiệu huỳnh quang Mitotraker Green và Mitotracker Red trong
nhóm tế bào bị gây bệnh có bở sung LIQ 60 cao hơn đáng kể so với
nhóm HR+DMSO (p<0,05).

Hình 3.30. Ảnh chụp tín
hiệu và biểu đồ phân tích
giá trị mật độ Mitotracker
Red trong điều kiện HR có
bở sung Liquiritin.

12


b. Tác dụng của Liquiritin đối với lượng cardiolipin màng ti thể
Kết quả thu được cho thấy nhóm HR+DMSO có mật độ huỳnh
quang NAO thấp với giá trị là 63,77±1,63% so với nhóm ĐC (p<0,01).
Tỉ lệ này của nhóm HR+NEC và HR+LIQ 60 lần lượt là 83,12±1,30%
và 82,21±5,71% (p<0,05 so với HR+DMSO).
c. Tác dụng của Liquiritin đối với với ΔΨm
Kết quả thu được cho thấy nhóm HR+DMSO có mật độ huỳnh
quang TMRE thấp nhất với giá trị là 62,92±3,36% so với nhóm ĐC
(p<0,01). Tỉ lệ mật độ huỳnh quang TMRE của nhóm HR+NEC và
HR+LIQ 60 lần lượt là 84,94±1,85% và 84,57±4,22%.
d. Tác dụng của Liquiritin đới với stress oxy hóa ti thể
Ở nhóm HR+DMSO, tín hiệu CM-H2DCFDA tăng lên
132,11±2,12% so với ĐC (p<0,05). Tỉ lệ này giảm xuống còn
110,88±4,02% ở nhóm HR+NEC và 112,47±6,50% ở nhóm HR+LIQ
60 (p<0,05 so với HR+DMSO). MitoSOX Red ở nhóm HR+DMSO
tăng mạnh so với ĐC (p<0,01). So với HR+DMSO, tỉ lệ này giảm rõ
rệt ở HR+NEC và ở HR+LIQ 60, với các giá trị là 166,60±16,17% và
149,51±16,03% (p<0,05).
e. Tác dụng của Liquiritin đối với lượng Ca2+ ti thể
So với HR+DMSO, nhóm HR+NEC và HR+LIQ 60 có mật độ
huỳnh quang chỉ thị cho Ca2+ ti thể giảm mạnh, với các giá trị tương

ứng là 113,04±5,81% và 114,12±5,21%. Sự khác biệt về giá trị này
giữa HR+NEC và HR+LIQ 60 là khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05).
3.2.3. Kết quả phân tích tác dụng bảo vệ của cao Sâm Ngọc Linh
và Majonoside R2 trong mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy (mơ
hình HR)
3.2.3.1. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 đối với
tỉ lệ sống của tế bào trong điều kiện ni bình thường
13


Cao SNL (1-500 µg/ml) và MR2 (1-1000 µM) khơng thể hiện độc
tính đối với tế bào H9C2 (p>0,05 so với đối chứng).
3.2.3.2. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 đối với
tỉ lệ sống của tế bào trong điều kiện bệnh lý
a. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh đối với tỉ lệ sống của tế bào
trong HR
Trong các nhóm mơ hình bệnh, nhóm chứa cao SNL 100 µg/ml
có tỉ lệ sống cao nhất. Do vậy cao SNL 100 µg/ml được lựa chọn cho
các thí nghiệm phân tích tiếp theo.
b. Tác dụng của Majonoside R2 đối với tỉ lệ sớng của tế bào trong
HR
Trong các nhóm mơ hình bệnh, nhóm được bở sung MR2 (9 µM)
có tỉ lệ sống cao nhất. Do vậy, MR2 9 µM được lựa chọn cho các thí
nghiệm phân tích tiếp theo.
3.2.3.3. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 đối với
ti thể trong mơ hình HR
a. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 đối với lượng
cardiolipin màng ti thể
So với HR+DMSO, nhóm HR+NEC, HR+SNL và HR+MR2 đều
có tín hiệu huỳnh quang mạnh hơn đáng kể (p<0,05, Hình 3.39).

Hình 3.39. Ảnh chụp tín
hiệu và biểu đồ phân tích
giá trị mật độ NAO trong
HR có bở sung cao Sâm
Ngọc Linh, Majonoside
R2.
14


b. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 đối với ΔΨm
Tỉ lệ mật độ huỳnh quang TMRE của nhóm HR+DMSO giảm
xuống còn 62,92±3,36% so với đối chứng (p<0,01). So với
HR+DMSO, nhóm HR+NEC, HR+SNL và HR+MR2 đều có tỉ lệ tín
hiệu quang tăng lên đáng kể, với các giá trị lần lượt là 84,94±1,85%,
83,34±5,17% và 85,48±1,42% (p<0,01, Hình 3.40).
c. Tác dụng của cao cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 đới với
stress oxy hóa ti thể
Ở nhóm HR+DMSO, tỉ lệ mật độ huỳnh quang CM-H2DCFDA
và MitoSOX Red tăng cao với giá trị là 123,10±2,33% và
269,32±8,00% so với đối chứng (p<0,05). Giá trị này ở nhóm
HR+NEC, HR+SNL và HR+MR2 giảm đáng kể so với HR+DMSO
(p<0,05).
d. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 đối với Ca2+
ti thể
Tỉ lệ mật độ Rhod 2AM trong nhóm HR+DMSO, HR+NEC,
HR+SNL và HR+MR2 lần lượt là 230,86±15,30%, 172,39±24,57%,
150,70±20,72% và 170,67±22,67% (p<0,05 so với ĐC). Sự khác biệt
về tỉ lệ mật độ huỳnh quang của các nhóm HR+SNL và HR+MR2 có
ý nghĩa thống kê so với nhóm HR+DMSO (p<0,05).
3.2.3.4. Kết quả phân tích tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và

Majonoside R2 đối với mức biểu hiện protein liên quan con đường tín
hiệu nội bào
a. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 đối với mức
biểu hiện của protein PGC-1α
Tỉ lệ biểu hiện của protein PGC-1α trong nhóm HR+DMSO giảm
cịn 80,82±2,39% so với đối chứng (p<0,05, Hình 3.44). Tỉ lệ này ở
15


nhóm được bở sung SNL hoặc MR2 tăng lên lần lượt là 92,40±1,65%
và 88,67±3,35% (p<0,05 so với nhóm HR+DMSO).

Hình 3.44. Mức biểu hiện của
protein PGC-1α trong HR có bở
sung

cao

Sâm

Ngọc

Linh,

Majonoside R2.

b. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 lên mức biểu
hiện của protein SOD2
Tỉ lệ mức biểu hiện của protein SOD2 trong nhóm HR+DMSO
giảm mạnh và chỉ đạt 75,50±3,10% so với đối chứng (p<0,01). Tỉ lệ

này trong các nhóm được bở sung SNL và MR2 tăng, giá trị lần lượt
là

111,06±3,10%

và

102,49±9,81% (p<0,05 so với
nhóm HR+DMSO, Hình 3.45).
Hình 3.45. Mức biểu hiện của
protein SOD2 trong HR có bở
sung cao Sâm Ngọc Linh,
Majonoside R2.
c. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 đới với pJNK/JNK
Tỉ lệ p-JNK/JNK trong nhóm HR có cao SNL và MR2 là
119,48±9,25 và 125,92±5,62% (so với 100% đối chứng). So với nhóm
16


HR+DMSO, HR+SNL và MR2 có tỉ lệ p-JNK/JNK khác biệt có ý
nghĩa thống kê (p<0,05).
d. Tác dụng của cao Sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 lên mức biểu
hiện protein p53
Tỉ lệ mức biểu hiện của protein p53 trong nhóm HR+DMSO tăng
cao (220,08±16,84% so với đối chứng, p<0,05). Tỉ lệ này trong
HR+SNL giảm mạnh và cịn 134,14±41,39% (p<0,05 so với nhóm
HR+DMSO). Nhóm HR+MR2 có mức biểu hiện p53 là
232,95±19,68% và khơng có sự khác biệt thống kê so với HR+DMSO
(p>0,05).
3.2.4. Kết quả phân tích tác dụng của cao Sâm Vũ Diệp và

Araloside A Methyl Ester trong mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp
oxy (mơ hình HR-CoCl2)
3.2.4.1. Tác dụng của cao Sâm Vũ Diệp và Araloside A Methyl Ester
đối với tế bào H9C2 trong điều kiện ni bình thường
Cao SVD (1-100 µg/ml) và AAME (1-100 µM) khơng gây độc
đối với tế bào (p>0,05 so với đối chứng).
3.2.4.2. Tác dụng của cao Sâm Vũ Diệp và Araloside A Methyl Ester
đối với tỉ lệ sống của tế bào trong điều kiện bệnh lý
Trong các nhóm mơ hình gây bởi CoCl2, nhóm mẫu được bở sung
cao SVD (31,25 µg/ml) và AAME (10 µM) có tỉ lệ sống cao nhất.
3.2.4.3. Kết quả phân tích tác dụng của cao sâm Vũ Diệp và Araloside
A Methyl Ester đối với ti thể trong HR-CoCl2
a. Tác dụng của cao Sâm Vũ Diệp và Araloside A Methyl Ester đối
với lượng cardiolipin màng ti thể
Nhóm HR-CoCl2+DMSO có tỉ lệ mật độ huỳnh quang NAO giảm
mạnh còn 71,06±2,80% (so với 100% đối chứng, p<0,05). Tỉ lệ này
17


trong các nhóm được bở sung NEC, cao SVD và AAME tăng lên đáng
kể so với nhóm HR-CoCl2+DMSO, p<0,05).
Hình 3.51. Ảnh chụp tín
hiệu và biểu đồ phân tích
mật độ huỳnh quang
NAO của tế bào H9C2
trong HR-CoCl2 có bở
sung cao Sâm Vũ Diệp,
Araloside

A

Methyl

Ester.
b. Tác dụng của cao Sâm Vũ Diệp và Araloside A Methyl Ester đới

với ΔΨm
Nhóm HR-CoCl2+DMSO có giá trị tỉ lệ mật độ huỳnh quang
TMRE giảm còn 61,77±3,49% (so với 100% đối chứng). Tỉ lệ này
trong nhóm mơ hình có NEC, cao SVD và AAME tăng lên đáng kể,
với các giá trị lần lượt là 85,99±5,49%, 80,59±7,07% và 79,63±7,17%
(p=0,015; 0,02; 0,03 so với HR-CoCl2+DMSO).
c. Tác dụng của cao Sâm Vũ Diệp và Araloside A Methyl Ester đối
với stress oxy hóa ti thể
Tỉ lệ mật độ huỳnh quang CM-H2DCFDA của nhóm tế bào bị gây
mơ hình bởi CoCl2 tăng lên 166,03±5,49% so với đối chứng (p<0,05).
NEC, cao SVD và AAME làm tỉ lệ này giảm mạnh còn 120,69±8,16%,
137,09±9,31% và 141,65±8,82%. Sự khác biệt là có ý nghĩa thống kê
so với nhóm HR- CoCl2+DMSO (p <0,001; p=0,003; 0,005).
Tín hiệu huỳnh quang MitoSOX Red trong nhóm HRCoCl2+DMSO tăng lên 228,55±23,55% so với đối chứng (p<0,05).
NEC, cao SVD (31,25 µg/ml) và AAME (10 µM) làm giảm tỉ lệ này
18


xuống còn lần lượt là 144,25±31,98% hoặc 152,91±4,54% hoặc
171,47±20,18% (p<0,05 so với HR-CoCl2+DMSO).
d. Tác dụng của cao Sâm Vũ Diệp và Araloside A Methyl Ester đối
với Ca2+ ti thể
Tỉ lệ mật độ huỳnh quang Rhod 2AM của nhóm HRCoCl2+DMSO tăng lên 248,03±29,00% so với đối chứng (p<0,05).
Việc bổ sung NEC, cao SVD hoặc AAME trong giai đoạn tái cung cấp

oxy làm tỉ lệ này giảm xuống còn lần lượt là 176,79±29,13%,
156,98±30,51% và 194,47±43,50%. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
chỉ quan sát thấy được ở nhóm NEC và cao SVD so với nhóm HRCoCl2+DMSO (p<0,05).
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1. MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG CẤP OXY SỬ DỤNG TẾ
BÀO H9C2
4.1.1. Nồng độ DMSO phù hợp đối với tế bào H9C2
Nồng độ DMSO nhỏ hơn 0,5% là phù hợp với tế bào H9C2
4.1.2. Mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy thiết lập sử dụng tế bào
H9C2 hoạt động hiệu quả
4.1.2.1 Mô hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy sử dụng CoCl2
Kết quả thu được trong nghiên cứu này phù hợp với một số nghiên
cứu trước đây về việc sử dụng CoCl2 ở nồng độ 300 µM để mơ phỏng
mơ hình HR [16, 34]. Do vậy, nồng độ này được lựa chọn sử dụng cho
các thí nghiệm tiếp theo của nghiên cứu.
4.1.2.2. Buồng thiếu oxy thiết kế đáp ứng được các tiêu chí đề ra và
đủ điều kiện để sử dụng trong nghiên cứu
Kết quả nghiên cứu cho thấy buồng hypoxia được thiết lập đáp
ứng được tiêu chí vật lý (kích thước, độ kín) và sinh học (mức độ tởn
thương tế bào) mà đề tài luận án đề ra, có khả năng ứng dụng trong
19


việc mơ phỏng mơ hình bệnh HR in vitro. Mặt khác, khoảng thời gian
gây thiếu oxy-tái cung cấp oxy 6/24 giờ được lựa chọn để thực hiện
các nội dung nghiên cứu liên quan như đã đề cập trong luận án.
4.1.2.3. Hiệu quả hoạt động của mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy
thiết lập với đới chứng dương
Mơ hình HR cơ tim sử dụng sử dụng buồng thiếu oxy thiết kế và
CoCl2 hoạt động tương tự nhau trong việc gây tổn thương, chết tế bào

thông qua việc làm rối loạn chức năng ti thể. Do vậy, cả hai mơ hình
này đều có thể sử dụng trong giai đoạn đầu của các nghiên cứu sàng
lọc và tìm kếm các chất có tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim hướng đích
ti thể. Đồng thời NEC sẽ được sử dụng làm đối chứng dương cho các
thí nghiệm.
4.2. TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO H9C2 HƯỚNG ĐÍCH TI THỂ
CỦA HOẠT CHẤT TRONG MƠ HÌNH THIẾU OXY-TÁI CUNG
CẤP OXY IN VITRO
4.2.1. Naringin có khả năng bảo vệ tế bào H9C2 trong mơ hình
thiếu oxy-tái cung cấp oxy thơng qua việc bảo tồn cấu trúc và
chức năng ti thể

Hình 3.56. Giả thiết về cơ chế bảo vệ
hướng đích ti thể của Naringin đối với
tế bào H9C2 trong mơ hình HR
Trong nghiên cứu này, Nar được lựa
chọn phân tích dựa trên cơ sở về hoạt
tính chống viêm và chống oxy hóa của nó [23]. Các kết quả trong luận
án đã bước đầu khẳng định vai trò bảo vệ của Nar đối với tế bào H9C2
20


trong HR gây bằng buồng hypoxia thông qua việc bảo tồn hàm lượng
CL, ởn định ΔΨm và ức chế sự hình thành gốc ROS (Hình 3.56).
4.2.2. Liquiritin có khả năng bảo vệ tế bào H9C2 trong mơ hình
HR thơng qua việc bảo toàn hàm lượng và điện thế màng ti thể;
ức chế sự stress oxy hóa và quá tải ion Ca2+ ti thể
Kết quả thu được cho thấy LIQ thể hiện vai trò bảo vệ H9C2 trong
HR nhờ khả năng điều hòa sự ổn định số lượng, cấu trúc và chức năng
ti thể (Hình 3.57) có thể do khả năng chống oxy hóa của hợp chất này

như đã được cơng bố trước đây [119, 133]. Điều này gợi ý LIQ là hoạt
chất tiềm năng trong bảo vệ tế bào cơ tim chống lại tởn thương gây
bởi HR và có thể là đối tượng lựa chọn cho các nghiên cứu in vitro và
in vivo.

Hình 3.57. Giả thiết về cơ chế
bảo vệ hướng đích ti thể của
Liquiritin đối với tế bào H9C2
trong mơ hình HR
4.2.3. Cao sâm Ngọc Linh và Majonoside R2 có khả năng bảo vệ
tế bào H9C2 thơng qua bảo tồn ti thể và điều hịa mức biểu hiện
của protein tín hiệu
Kết quả thu được cho thấy, cao SNL và MR2 đều thể hiện khả
năng bảo vệ tế bào trong HR thông qua việc ổn định chức năng ti thể.
Kết quả này giúp củng cố thêm tác dụng chống oxy hóa của Sâm Ngọc
Linh ghi nhận được trước đây [33, 58]. Bên cạnh đó, đề tài luận án
cũng đã khảo sát sơ bộ được tác dụng của cao SNL và MR2 trong điều
hòa mức biểu hiện protein JNK, PGC-1α và SOD2; từ đó ức chế sự
21


sinh ROS, giảm tổn thương và chết tế bào. Sự tăng biểu hiện p53 trong
tế bào cơ tim tăng trong HR dẫn đến tăng sản sinh ROS [98] hoặc kích
hoạt apoptosis [82]. Điều thú vị là trong nghiên cứu này, cao SNL còn
thể hiện khả năng ức chế biểu hiện protein p53 trong khi MR2 không
thể hiện tác dụng này. Hình 3.58 thể hiện sơ đồ khái qt hóa vai trò
và giả thiết về cơ chế tác động của sản phẩm chiết từ Sâm Việt Nam
đối với tế bào H9C2 trong mơ hình bệnh lý HR.
Hình 3.58. Khái qt
tác dụng bảo vệ của

cao Sâm Ngọc Linh và
Majonoside R2 đối với
tế bào H9C2 hướng
đích ti thể trong mơ
hình HR.
4.2.4. Cao Sâm Vũ Diệp và Araloside A Methyl ester bảo vệ tế bào
trong mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy gây bởi CoCl2
Nghiên cứu về SVD tập trung chủ yếu vào việc phân lập, xác định
thành phần của sản phẩm chiết và đánh giá khả năng chống kết tập tiểu
cầu. Nghiên cứu luận án lần đầu cung cấp dữ liệu về tác dụng bảo vệ
hướng đích ti thể của Sâm Vũ Diệp và saponin Araloside A Methyl
Ester đối với tế bào cơ tim H9C2 trong tởn thương HR gây bởi CoCl2
(Hình 3.59).
Hình 3.59. Giả thiết về cơ
chế bảo vệ hướng đích ti
thể của cao Sâm Vũ Diệp
và Araloside A Methyl
Ester đối với tế bào H9C2
trong mơ hình HR-CoCl2
22


4.2.5. Cao dược liệu và hợp chất có tác dụng bảo vệ tế bào cơ tim
chống lại tổn thương HR hướng đích điều hịa ti thể
Xét về độc tính đới với tế bào H9C2, có thể sắp xếp theo mức độ
giảm dần từ cao SVD, AAME, Nar, LIQ, cao SNL, MR2. Xét về tác
dụng đối với khả năng sống của tế bào trong điều kiện bệnh lý, so với
Nar, LIQ thể hiện khả năng bảo vệ tế bào H9C2 mạnh hơn. Cao SNL
và SVD đều thể hiện tác dụng bảo vệ mạnh hơn MR2 và AAME. Xét
về tác dụng của các chất thử đối với rối loạn chức năng ti thể tế bào

H9C2 trong tổn thương HR. So với Nar 80 µM, LIQ 60 µM thể hiện
tác dụng ởn định ΔΨm mạnh hơn, ức chế ROS ti thể tốt hơn. Cao SNL
và cao SVD đều có khả năng hạn chế rối loạn cấu trúc, chức năng ti
thể. Điều đặc biệt là tác dụng của cao SNL và cao SVD trong nghiên
cứu này dường như là do MR2 và AAME.
KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu được, một số kết luận được đưa ra như sau:
1. Đã thiết lập được mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy trên tế bào
H9C2:
- Đã thiết lập và thử nghiệm thành công buồng thiếu oxy từ các vật
liệu đơn giản với chi phí hợp lý;
- Đã xây dựng và khẳng định được hiệu quả của mô hình thiếu oxy-tái
cung cấp oxy in vitro trên tế bào H9C2 thể hiện thông qua:
+ Làm tỉ lệ tế bào sống giảm xuống còn 60-70%;
+ Gây rối loạn cấu trúc, chức năng ti thể: giảm lượng cardiolipin và
giá trị điện thế màng ti thể; tăng stress oxy hóa; gây quá tải lượng ion
Ca2+ ti thể.
2. Đã đánh giá được tác dụng bảo vệ của một số hoạt chất đối với
tế bào H9C2 trong mơ hình thiếu oxy-tái cung cấp oxy:

23