Nghiên cứu tác dụng cộng hợp của cao chiết trùng thảo (cordyceps militaris) và huperzine a trong định hướng điều trị bệnh alzheimer

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

ĐẶNG NHẬT MINH

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỘNG HỢP CỦA CAO CHIẾT
TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) VÀ HUPERZINE A
TRONG ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Hà Nội - 2023


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC

ĐẶNG NHẬT MINH

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỘNG HỢP CỦA CAO CHIẾT
TRÙNG THẢO (CORDYCEPS MILITARIS) VÀ HUPERZINE A
TRONG ĐỊNH HƯỚNG ĐIỀU TRỊ BỆNH ALZHEIMER

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa
Người hướng dẫn 1
Người hướng dẫn 2

: QH.2018.Y
: TS. Hồ Ngọc Anh

: PGS.TS Bùi Thanh Tùng

Hà Nội - 2023


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập, rèn luyện của em tại Trường
Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội và quá trình nghiên cứu, thực hành tại
Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam. Trong q
trình nghiên cứu và hồn thành khóa luận này, em đã nhận được nhiều sự giúp đỡ
quý báu từ các thầy, cô, anh, chị tại Viện Công nghệ sinh học và các thầy cô của
trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Trước hết, em xin chân thành cảm ơn TS. Hồ Ngọc Anh, người Thầy đã tin
tưởng giao đề tài cho em. Thầy đã hết lòng tận tình, chỉ bảo trong q trình làm khóa
luận. Những chia sẻ, kinh nghiệm quý báu của Thầy là hành trang giúp em hồn thành
khóa luận và phát triển trong sự nghiệp sau này. Đề tài này nằm trong khuôn khổ dự án
“Phát triển sản phẩm hỗ trợ phòng, điều trị bệnh sa sút trí tuệ với thành phần chính là
hoạt chất huperzine A và cao chiết Trùng thảo” cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công
nghệ Việt Nam do ThS. Hồ Thị Thương làm chủ nhiệm dự án.
Em xin cảm ơn PGS.TS Bùi Thanh Tùng¸ chủ nhiệm bộ mơn Dược lý,
trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội. Thầy đã hết lịng giúp đỡ, chỉnh
sửa tận tình để em hồn thành khóa luận này. Thầy cũng chia sẻ rất nhiều kiến thức
bổ ích trong q trình học tập và làm khóa luận của em.
Em cũng xin chân thành cảm ơn các anh chị tại viện Công nghệ Sinh học,
Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tơi trong q trình thực
hiện khóa luận.
Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trường Đại học Y Dược, Đại học
Quốc gia Hà Nội, bộ môn Dược lý và các thầy cô trường Đại học Y Dược, Đại học
Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện cho tơi được thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ

em trong quá trình học tập cũng như làm đề tài tốt nghiệp.
Trong q trình làm khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót, em rất mong nhận
được sự góp ý của các Thầy cơ để khóa luận của em được tốt hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng 5 năm 2023
Sinh viên
Đặng Nhật Minh


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
6-OHDA

6-hydroxydopamine

A

Độ hấp thụ

A+C

Hỗn hợp adenosine + Cordycepin

ACh

Acetylcholine

AChE

Acetylcholinesterase

ACN

Acetonitrile

AcOH

Acid acetic

AcONH4

Amoni acetate

ACTI

acetylthiocholine iodid

AD

Bệnh Alzheimer

AMPA

α-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazol-propionate

ATP

Adenosine triphosphate

Aβ

Beta-amiloid

BuChE

Butyrylcholinesterase

CAT

Catalase

ChAT

Choline acetyltransferase

CI

Mơ hình chỉ số kết hợp

CNS

Hệ thống thần kinh trung ương

DMSO

Dimetyl sulfoxide

DRG

Hạch rễ bất tử

ĐTHT

Đông trùng hạ thảo

DTNB

acid 5-5’- dithiobis-2-nitrobenzoic

HCS

Sàng lọc hàm lượng cao

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HSA

Highest Single Agent (Tác nhân đơn cao nhất)

HTS

Ống nghiệm xét nghiệm sàng lọc

HupA

Huperzine A

IC50

Nồng độ ức chế 50%

IC50

Nồng độ ức chế 50%

IR

Phổ hấp thụ hồng ngoại

LD50

Liều gây chết 50%

LDL

Cholesterol tỉ trọng thấp

MIC

Nồng độ ức chế tối thiểu


NGF

Yếu tố tăng trưởng thần kinh

NMDA

N-methyl-D-aspartate

NSAID

Thuốc giảm đau chống viêm khơng steroid

PBS

Phosphate-bufered saline

ROS

Phản ứng oxi hóa

SI

Chỉ số chọn lọc

SOD
SSTT

superoxide dismutase
Sa sút trí tuệ

TBTK

Tế bào thần kinh

UV

Phổ hấp thụ tử ngoại

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cơng thức hóa học của một số nucleotide trong trùng thảo .......................6
Hình 1.2. Cấu trúc của Huperzine A ........................................................................11
Hình 1.3. Mơ hình HSA để đánh giá tác dụng cộng hợp của thuốc .........................19
Hình 2.1. Sắc ký đồ chuẩn mix adenosine và cordycepin ........................................24
Hình 2.2. Sơ đồ phản ứng tạo màu trong phương pháp đo quang sử dụng thuốc thử
Ellman .......................................................................................................................25
Hình 3.1. Đồ thị đường chuẩn adenosine .................................................................29
Hình 3.2. Đồ thị đường chuẩn cordycepin ...............................................................30
Hình 3.3. Phổ UV của mẫu HupA ............................................................................30
Hình 3.4. Sắc ký đồ của mẫu HupA .........................................................................31
Hình 3.5. Phổ UV của chất chuẩn huperzine A........................................................31
Hình 3.6. Hoạt tính gây độc tế bào của 6-OHDA ....................................................34
Hình 3.7. Hoạt tính bảo vệ TBTK của các mẫu thử .................................................35


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Chương trình rửa giải Gradient HPLC định lượng adenosine và
cordycepin .................................................................................................................23
Bảng 2.2. Chương trình chạy gradient HPLC đối với HupA ...................................24
Bảng 2.3. Các tỷ lệ phối hợp giữa chất sạch Huperzine A và hỗn hợp A + C .........27
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE của chất sạch Huperzine
A, hỗn hợp A + C, donepezil ....................................................................................32


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN.....................................................................................3
1.1. Tổng quan về trùng thảo ...................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm hình thái, phân loại, tác dụng ............................................................3
1.1.2. Thành phần hóa học của trùng thảo ..................................................................4
1.1.3. Tác dụng dược lý của trùng thảo.......................................................................8
1.2. Tổng quan về huperzine A ..............................................................................10
1.2.1. Lịch sử huperzine A ........................................................................................10
1.2.2. Cấu trúc huperzine A ......................................................................................10
1.2.3. Tác dụng dược lý của huperzine A .................................................................11
1.3. Acetylcholine, enzym acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ
cholinergic đối với bệnh Alzheimer .......................................................................13
1.3.1. Acetylcholine ..................................................................................................13
1.3.2. Enzym Acetylcholinesterase ...........................................................................14
1.3.3. Giả thuyết về vai trị hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer .........................14
1.4. Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh ..................................................................15
1.5. Tác dụng cộng hợp của các chất .....................................................................16
1.5.1. Định nghĩa .......................................................................................................16
1.5.2. Ý nghĩa của tác dụng cộng hợp giữa các thuốc ..............................................17
1.5.3. Mô hình đánh giá tác dụng cộng hợp giữa các thuốc .....................................18
1.5.4. Phương pháp ô bàn cờ tổ hợp..........................................................................20
CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................22
2.1. Đối tượng nghiên cứu .......................................................................................22
2.2. Hóa chất và vật tư ............................................................................................22
2.3. Thiết bị ..............................................................................................................23
2.4. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................23
2.4.1. Phương pháp định lượng adenosine và cordycepin trong Trùng thảo ............23

2.4.2. Phương pháp xác định độ tinh sạch của huperzine A bằng HPLC .................24
2.4.3. Phương pháp đánh giá khả năng ức chế enzym acetylcholinesterase .............25
2.4.4. Phương pháp đánh giá tác dụng cộng hợp của hỗn hợp adenosine +
cordycepin (A+C) và chất sạch huperzine A ............................................................26
2.4.5. Phương pháp đánh giá hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh ...............................27
CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ .........................................................................................29
3.1. Kết quả định lượng adenosine và cordycepin từ cao chiết trùng thảo .......29
3.2. Đánh giá độ tinh sạch của HupA ....................................................................30
3.3. Đánh giá hoạt tính ức chế enzym AChE, xác định tác dụng cộng hợp của
các tỷ lệ phối trộn hỗn hợp A+C và chất sạch huperzine A ................................32
3.4. Đánh giá hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh ...................................................33
CHƯƠNG 4- BÀN LUẬN ......................................................................................37
4.1. Về phương pháp đánh giá tác dụng cộng hợp của các hợp chất .................37
4.2. Về kết quả đánh giá hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh ................................39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ....................................................................................42
Kết luận ....................................................................................................................42
Đề xuất ......................................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO


MỞ ĐẦU
Sa sút trí tuệ (SSTT) là bệnh liên quan đến các rối loạn não, có ảnh hưởng đến
khả năng suy nghĩ hoặc ghi nhớ của một người, dẫn đến sự suy giảm khả năng nhận
thức đủ nghiêm trọng để cản trở cuộc sống hàng ngày. Trong đó, Alzheimer (AD) là
dạng sa sút trí tuệ phổ biến nhất, chiếm 60%-80% nguyên nhân sa sút trí tuệ.
AD là nguyên nhân thứ 6 gây tử vong nói chung và là nguyên nhân thứ 5 gây
tử vong ở người trên 65 tuổi. Các đánh giá gần đây ước tính rằng trên tồn cầu có
gần 8 triệu người phát triển chứng SSTT mỗi năm, sau mỗi bốn giây thì có thêm 1

trường hợp mắc chứng SSTT. Năm 2015, chứng SSTT đã ảnh hưởng đến hơn 47
triệu người trên toàn thế giới, một con số ước tính sẽ tăng lên 76 triệu người vào
năm 2030 và 145 triệu người vào năm 2050. Năm 2010, chi phí chăm sóc người
SSTT trên tồn cầu là ước tính là 604 tỷ đô la Mỹ, chiếm 1% tổng sản phẩm quốc
nội tồn cầu. Đến năm 2030, chi phí chăm sóc cho những người mắc chứng SSTT
trên tồn thế giới ước tính khoảng 1200 tỷ đơ la Mỹ hoặc hơn, tổng số có thể làm
suy yếu sự phát triển kinh tế và xã hội trên tồn cầu.
Việt Nam chính thức bước vào giai đoạn già hóa dân số từ năm 2011 khi có
11% số dân là những người trên 60 tuổi. Năm 2001, Viện Sức khỏe Tâm thần Quốc
gia nghiên cứu ở Thái Nguyên cho biết tỷ lệ hiện mắc sa sút trí tuệ là 7,9%. Năm
2005, Phạm Thắng và cộng sự cho thấy ở Ba Vì, tỷ lệ hiện mắc suy giảm nhận thức
nhẹ là 1,4% và SSTT là 4,63% [1, 2]. Theo điều tra dân số năm 2017, cả nước có 11
triệu người trên 60 tuổi chiếm khoảng 11,95% dân số, trong đó có khoảng gần 2
triệu người từ 80 tuổi trở lên.
Hiện nay trên thị trường các nhóm thuốc điều trị và hỗ trợ điều trị Alzheimer
và các bệnh SSTT chỉ nhắm vào 2 cơ chế chính là ức chế enzym thủy phân
Acetylcholinesrase (AChE) và thuốc ngăn chặn N-methyl-D-aspartate (NMDA).
Trong đó hiệu quả nhất là sử dụng phối hợp cả 2 cơ chế với hỗn hợp thuốc là
donepezil và memantine, nhưng sự phối kết hợp này vẫn có rất nhiều tác dụng phụ,
nguy hiểm đối với người sử dụng. Ở Việt Nam, phần lớn thuốc điều trị bệnh SSTT
và AD là biệt dược ngoại nhập với giá thành cao và có một số tác dụng phụ.
Việt Nam là một trong những nước có mức độ đa dạng sinh học cao, nền y
học cổ truyền Việt Nam có rất nhiều bài thuốc sử dụng các cây dược liệu để cải
thiện và điều trị các bệnh về suy giảm trí nhớ, tăng tuần hồn máu não, giúp an
1


thần.... Huperzine A (HupA) đang được sử dụng như một chất hỗ trợ điều trị các
bệnh SSTT và AD mà không đem lại các tác dụng phụ như các chất đang được lưu
hành [3]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng 58% bệnh nhân Alzheimer cải thiện đáng

kể cả chức năng nhận thức và trí nhớ khi dùng 200µg HupA mỗi ngày. Mặc dù
HupA có cơ chế tác động là ức chế enzym thủy phân acetylcholinesrase để hỗ trợ
phòng và điều trị bệnh AD nhưng hướng nghiên cứu này vẫn tồn tại vài nhược điểm
đó là khả năng bảo vệ các tế bào thần kinh khỏi sự tổn thương và chết [4]. Đông
trùng hạ thảo (Trùng thảo, ĐTHT) là loại nấm dược liệu tự nhiên nổi tiếng và truyền
thống có tác dụng bồi bổ sức khỏe, trong đó trùng thảo cũng được báo cáo về hoạt
tính bảo vệ tế bào thần kinh [5]. Tuy nhiên, những nghiên cứu về phối kết hợp của
chúng trong tăng cường trí nhớ, hỗ trợ phịng và điều trị bệnh sa sút trí tuệ và
Alzheimer chưa hề được quan tâm nghiên cứu tại Việt Nam. Trong khi đó, tại Hàn
Quốc, châu Âu, các quốc gia Mỹ la tinh, rất nhiều loại thực phẩm chức năng đã
được phát triển giúp tăng cường trí nhớ và hỗ trợ phòng và điều trị các bệnh này.
Dựa trên các cơ sở phân tích tài liệu nghiên cứu đã cơng bố về tác dụng của
huperzine A và trùng thảo trong việc bảo vệ tế bào thần kinh, tăng cường trí nhớ, hỗ
trợ phịng và điều trị bệnh sa sút trí tuệ và Alzheimer, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng cộng của cao chiết Trùng thảo và huperzine A
trong định hướng điều trị bệnh Alzheimer” với các mục tiêu sau:
- Nghiên cứu tác dụng hiệp đồng cộng của huperzine A và hỗn hợp chất
chuẩn adenosine, cordycepin bằng phương pháp ơ bàn cờ.
- Nghiên cứu hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh của hỗn hợp huperzine A và
cao chiết Trùng thảo.

2


CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về trùng thảo
1.1.1. Đặc điểm hình thái, phân loại, tác dụng

Trùng thảo là một loại nấm dược liệu quý truyền thống nổi tiếng có nguồn
gốc từ Trung Quốc, tên tiếng anh là Cordyceps. Không chỉ ở Trung Quốc, một số

loài Cordyceps đã được sử dụng làm thuốc ở Nhật Bản, Hàn Quốc và một số nước
Đông Á nhờ tác dụng của những thành phần như adenosine, cordycepin,
exopolysacharide (EPS). Người Tây Tạng gọi là yarsa gumba, người Trung Quốc
gọi là dong chong xia cao, có nghĩa là mùa đông là sâu, mùa hè là cây cỏ. Lồi nấm
này cịn được người Ấn Độ gọi là “Keera Jhar” (nghĩa là thảo mộc côn trùng)/
Keeda ghass/Jeevan buti/Chyou kira/Sanjeevani buti hay cịn được ví như Viagra
của dãy Himalaya [6]. Người Bhutia thường sử dụng 1 mẩu trùng thảo với cùng 1
cốc rượu, ngâm trong 1giờ sau đó uống mỗi buổi sáng để bồi bổ. Trùng thảo có tác
dụng kéo dài tuổi thọ, rối loạn cương dương, cải thiện chứng suy nhược cơ thể,
kháng khối u, tốt cho những người bệnh gan, thận,… [6]. Trùng thảo có thể được
dùng đơn độc như một vị thuốc hoặc phối hợp với các loại thảo dược khác.
Trùng thảo không phải sâu, cũng khơng phải cây cỏ. Bản chất của nó là dạng
ký sinh của lồi nấm Cordyceps sinensis thuộc nhóm nấm Ascomycetes trên cơ thể
ấu trùng của một vài loài bướm thuộc chi Thitarodes. Loài nấm này nhiễm vào cơ
thể sâu bướm qua đường miệng, bào tử của chúng nảy mầm và sử dụng cơ thể sâu
bướm như là môi trường dinh dưỡng cho hệ sợi nấm phát triển. Khi sợi nấm lan
toàn cơ thể, con sâu bướm chết đi, và trùng thảo giữ nguyên hình dạng như một con
sâu trong mùa đơng. Mùa hè trên cao ngun đến mang theo khí hâụ nóng ẩm, lồi
nấm này tiến hành phát tán bào tử sinh sản để phát triển nòi giống của chúng bằng
cách mọc quả thể (quả thể được biết như là các mũ nấm để nấu ăn). Tuy nhiên quả
thể của trùng thảo khơng có dạng tán hình nấm, mà quả thể của chúng là dạng sợi
mảnh, hình trụ, trơng giống như chiếc sừng.
Hai loài Cordyceps được biết đến nhiều nhất là Cordyceps sinensis và
Cordyceps militaris. Cordyceps sinensis nổi tiếng hơn cả bởi nó đã được sử dụng
khoảng 2000 năm ở Trung Quốc nhưng tài liệu đầu tiên ghi chép về C. sinensis
được tìm thấy vào thời nhà Thanh (Trung Quốc) vào năm 1757.
C. sinensis thường ký sinh trên vật chủ là ấu trùng thuộc họ Hepialidae và
xác ấu trùng, cơ thể giống con tằm, dài từ 3 – 5cm với đường kính khoảng 3 – 8mm,
3

màu vàng đậm đến nâu vàng với khoảng 20 – 30 vằn khía, vằn khía ở gần đầu nhỏ
hơn và có 8 đơi chân, nhưng 4 đơi ở trung tâm là rõ nhất. C. sinensis ký sinh vật chủ
và phát triển một quả thể duy nhất mọc trên đầu vật chủ trông giống chiếc sừng, dài
4 – 7cm và đường kính khoảng 3mm.
Trong khi đó C. militaris phát triển quả thể màu vàng cam đến màu đỏ cam,
dài khoảng 5cm, dẹt và hơi cong.
Vật chủ trong tự nhiên của C. militaris gồm ấu trùng (sâu bướm) và nhộng
của lepidopteran (Euprepia caja, Bombyx mori, Cymatophora duplaris, Cocytodes
coerulea,…), các loại côn trùng như coleoptera (Lachnosterna quercina, Ips
sexdentatus, Tenebrio molitor), hymenoptera (Cimbex similis), diptera (Tipula
paludosa). Nhờ khả năng ký sinh trên một phổ rộng vật chủ mà các vùng phân bố
địa lý của C. militaris rất đa dạng trên khắp thế giới. Người ta đã tìm thấy C.
militaris từ các vùng có độ cao so với mặt nước biển từ 0 – 2000m. Trong khi đó C.
sinensis chỉ được tìm thấy ở những khu vực có độ cao từ 3540 – 5050m so với mặt
nước biển (Nepal), từ 3200 – 4200m ở Ấn Độ, từ 4200 – 5200 ở Bhutan, từ 3000 –
5000m ở Tibet.
Trong nuôi cấy, vật chủ thường được sử dụng cho C. militaris thường là tằm
Bombyx mori, hoặc Antherea pernyi, Mamestra brassicae. Với tỷ lệ nuôi cấy thành
công ở nhộng tằm cao hơn so với ấu trùng của nó. Tuy nhiên nhược điểm của việc
sử dụng cơn trùng là khó xử lý và dễ bị nhiễm vi sinh vật, do vậy mà ngày nay
người ta đã sử dụng các giá thể hữu cơ như bột đậu, gạo,… để thay thế trong sản
xuất thương mại.
1.1.2. Thành phần hóa học của trùng thảo

1.1.2.1. Nghiên cứu trên thế giới
Theo số liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của thể quả nấm C.militaris
cho thấy loài nấm này chứa các thành phần như protein chiếm 40,69%; các loại
vitamin: vitamin A (34,7 mg/gam), vitamin B1 (13,0 mg/gam), vitamin B6 (62,2
mg/gam), vitamin B12 (70,3 mg/gam), vitamin B3 (42,9 mg/gam); các nguyên tố

khoáng: Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm); hợp chất hóa học chất
quan trọng [7].
Acid amin
Năm 2008, một nghiên cứu của Huyn cho thấy trong quả thể nấm C.militaris có
chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32 mg/g trong quả thể
4


và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm). Khối lượng acid amin mỗi loại trong quả thể và
sinh khối nấm cũng có sự chênh lệch, dao động từ 1,15 - 15,06 mg/g (đối với quả thể)
và 0,36 - 2,99 mg/g (đối với sinh khối). Thành phần acid amin của mỗi loại trong quả
thể bao gồm: lysine (15,06 mg/g), acid glutamic (8,79 mg/g), proline (6,68 mg/g),
threonine (5,99 mg/g), arginine (5,29 mg/g), và alanine (5,18 mg/g) [8]. Nghiên cứu
của Chang và cộng sự thực hiện năm 2001 cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa
acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) [9].
Acid béo
Năm 2008, Hur đã thực hiện một nghiên cứu và cho thấy rằng quả thể nấm
C. militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó
lượng acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối. Lượng
acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong
sinh khối [10].
Adenosine và cordycepin
Adenosine và cordycepin được biết đến là hai hợp chất có giá trị dược liệu cao
trong trùng thảo. Hoạt chất chính trong C.sinensis là adenosine trong khi hoạt chất
chính trong C.militaris là cordycepin. Báo cáo của nhóm nghiên cứu của Liu năm 2015
cho biết C.sinensis khi ni trồng nhân tạo có thành phần cordycepin thấp dưới ngưỡng
phát hiện [11]. Năm 2017, nghiên cứu của Xia và cộng sự chỉ ra rằng gen tổng hợp
cordycepin có tên Cns1-Cns4 khơng có ở C.sinensis nhưng có ở C.militaris [12]. Trên
cây phát sinh chủng loại, 2 loài này thuộc hai nhánh khác nhau.
Polysaccharide

Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 được tách chiết nấm Cordyceps militaris
cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccharide: mannose
và galactose. Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loại polysaccharide này có khả năng
phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng
chiết xuất. Một số monosaccharide có trong nấm đơng trùng hạ thảo như rhamnose,
ribose, arabinose, glucose, mannitol, fructose…
Các nucleotide
Nucleotide là một trong những thành phần có hoạt tính trong nấm trùng thảo,
trong đó các hoạt chất adenosine, cordycepin được sử dụng là các hoạt chất để đánh
giá chất lượng của trùng thảo. Ngồi ra trong trùng thảo cịn nhiều loại nucleotide
khác như uridin, 2’-3’ – dideoxyadenosine (cấu trúc này được đưa vào các hợp chất
5


có hoạt tính antiretrovirus điều trị cho bệnh nhân đã bị nhiễm HIV như didanosin,
hydroxyethyladenosin, guanidin, deoxyguanidin…, những hoạt chất này chưa tìm
thấy được ở trong các dược liệu khác trong tự nhiên.

Cơng thức hóa học của cordycepin

Cơng thức hóa học của adenosine

Cơng thức hóa học của guanosine

Cơng thức hóa học của cytidine

Cơng thức hóa học của thymidine

Cơng thức hóa học của uridine

Hình 1.1. Cơng thức hóa học của một số nucleotide trong trùng thảo
Các sterol
Các phytosterol trong trùng thảo (cholesterol, campesterol, β sitosterol) đóng
vai trị quan trọng trong điều trị, phòng chống ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt và
ung thư trực tràng [13].
Các nhóm hoạt chất khác
Trùng thảo có chứa các loại acid amin thiết yếu như acid glutamic, acid aspartic,
arginine…và các hợp chất kiểu polyamine là cadaverine, spermidine, spermine…, các
6


cyclodipeptide như cordycedipeptide A. Các hợp chất này có hoạt tính chống viêm,
chống nhiễm khuẩn, kháng virus và vi khuẩn. Theo kết quả nghiên cứu của Filipa và
các cộng sự vào năm 2013, chiết xuất methanol của C. militaris đã được thử nghiệm về
tính chất chống oxy hố, kháng khuẩn, chống nấm và chống tăng sinh ở các dòng tế
bào khối u ở người [14]. Mannitol (2,01 g/100 g) và trehalose (24,71g/100g) là các loại
đường tự do trong C. militaris. Các acid béo khơng bão hịa (68,87%) chiếm ưu thế
hơn các acid béo bão hòa (23,40%) và δ-tocopherol là dạng duy nhất của vitamin E
được phát hiện (55,86 μg/100 g). Các acid hữu cơ được tìm thấy trong nấm này là acid
oxalic, citric và fumaric (lần lượt là 0,33, 7,97 và 0,13 g/100 g). Chiết xuất methanol
của C. militaris đã ức chế lipid peroxidation, làm giảm sự phát triển của các gốc tự do.
Chiết xuất này cũng cho thấy tính kháng khuẩn và chống nấm mạnh. Cuối cùng, chất
chiết xuất từ C. militaris có thể ức chế sự gia tăng các tế bào ung thư biểu mô tế bào
ung thư người (MCF-7, ung thư vú), NCI-H460 (non-small lung), HCT-15 (đại tràng)
và heLa (cổ tử cung).
1.1.2.2. Tại Việt Nam
Theo Đỗ Tất Lợi, trùng thảo chứa 25-32% chất protide. Khi thủy phân bởi
các enzym trong cơ thể sẽ cho ra các loại acid amin khác nhau như glutamic,
proline, histidine, valine, oxyvaline, arginine, phenyllalanine, analine,... Ngồi ra,
cịn có 8,4% chất béo trong đó acid béo no chiếm 13%, axit không no chiếm 82,2%.

Người ta cịn chiết được acid cordycepic chứng minh là có D-mannitol. Từ
Cordyceps militaris (ĐTHT nuôi dưỡng trong môi trường), người ta còn chiết được
cordycepin 3’ deoxyadenosine (C10H13O3N5) [15].
Theo Đái Duy Ban và Lưu Tham Mưu, hoạt chất sinh học 2’3’deoxyadenosin có vai trị tương tự như thuốc tổng hợp hóa học acryclorvir trong
điều trị các bệnh virus, nhiễm khuẩn và ung thư [16].
Các phân tích hóa học cũng cho thấy trong sinh khối của trùng thảo có 17
acid amin khác nhau, có D-mannitol, có lipid, có nhiều nguyên tố vi lượng (Al, Si,
K, Na…). Quan trọng hơn là trong sinh khối trùng thảo có nhiều hoạt chất sinh học
có giá trị dược liệu thần kỳ, trong đó phải kể đến acid cordiceptic, cordycepin,
adenosine, hydroxyethyl-adenosine, đáng chú ý hơn là nhóm hoạt chất HEAA
(Hydroxy-Ethyl-Adenosine-Analogs).
Bên cạnh đó, trùng thảo cịn chứa 28 acid béo bão hịa và khơng bão hịa,
chất dẫn xuất của chúng và các acid hữu cơ khác (oleic, linoleic, palmitic và acid
7


stearic); các loại vitamin như B1, B2, B12, E, và K và các chất vô cơ như K, Na,
Ca, Mg, Fe, Cu, Mn, Zn, Pi, Se, Al, Si, Ni, Sr, Ti, Cr, Ga, V và Zr, đặc biệt là Selen
(Se)-một chất có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, giúp ngăn ngừa ung thư. Ngoài
ra, nghiên cứu cũng cho thấy, các polysaccharid trong trùng thảo có tác dụng hiệu
quả trong điều tiết đường trong máu và hiệu quả chống ung thư; chống di căn và
tăng cường miễn dịch.
Các nghiên cứu cũng cho thấy một số hợp loại sterol trong trùng thảo như
ergosterol, Delta- 3 ergosterol, ergosterol peroxid, 3-sitosterol, daucosterol và
campassterol… có liên quan đến steroid chống rối loạn tình dục [16].
1.1.3. Tác dụng dược lý của trùng thảo

1.1.3.1. Theo Y học cổ truyền [15]
- Trùng thảo Trung Quốc là một loại thuốc được ghi nhận trong Bản thảo
cương mục thập di (năm 1765).

- Trùng thảo Trung Quốc có vị ngọt, tính ơn, quy vào kinh phế và thận.
- Có tác dụng ích phế, thận, bổ tinh tủy, cầm máu, hóa đờm, chữa hư lao sinh
ho, ho ra máu, liệt dương, lưng gối đau mỏi, di tinh.
1.1.3.2. Theo y học hiện đại
a. Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hợp chất từ C.militaris có thể làm giảm
tác dụng gây độc thần kinh của các mảng beta-amyloid (Aβ), đặc trưng của bệnh
Alzheimer. Năm 2010, Chen và cộng sự đã thực hiện nghiên cứu cho thấy các lồi
trùng thảo có thể làm giảm đáng kể quá trình sản xuất các loại oxy phản ứng (ROS)
do Aβ gây ra, được biết là gây ra stress oxy hóa và tổn thương tế bào thần kinh [17].
C.militaris có thể làm giảm biểu hiện của các cytokine gây viêm, được biết là góp
phần gây viêm thần kinh và thối hóa thần kinh. Ngồi ra, trùng thảo cũng được
chứng minh là có tác dụng tăng cường nhận thức. Nghiên cứu cho thấy C.militaris
có thể tăng cường hoạt động của choline acetyltransferase (ChAT) và tăng nồng độ
acetylcholine (ACh) trong não. Thêm vào đó, lồi trùng thảo cịn được chứng minh
là có tác dụng chống viêm và chống oxy hóa, có thể bảo vệ tế bào thần kinh khỏi bị
hư hại bằng cách ức chế sản xuất các cytokine gây viêm, chẳng hạn như interleukin6 (IL-6) và yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-α) và tăng hoạt động của các enzym
chống oxy hóa, chẳng hạn như superoxide dismutase (SOD) và catalase (CAT) [18].

8


Những phát hiện này cho thấy trùng thảo có tiềm năng được sử dụng như một tác
nhân điều trị cho một loạt các rối loạn thối hóa thần kinh.
b. Ức chế sự phát triển của khối u
Thí nghiệm trong ống nghiệm chứng minh rằng trùng thảo có khả năng ức
chế sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư ở người, bao gồm ung thư phổi, đại
tràng, gan và ung thư da [19-21]. Ở các thí nghiệm trên chuột cũng cho thấy trùng
thảo có tác dụng chống khối u đối với ung thư hạch, u ác tính và ung thư phổi [2224]. Công dụng làm chậm sự phát triển các khối u của trùng thảo là yếu tố quan
trọng giúp hỗ trợ điều trị bệnh liên quan đến phương pháp hóa trị, xạ trị và tăng tốc

độ hồi phục hậu phẫu thuật.
c. Cải thiện hoạt động thể chất
Trùng thảo được cho là làm tăng cơ thể sản xuất phân tử adenosine
triphosphate (ATP), chất cần thiết để cung cấp năng lượng cho cơ bắp. Điều này có
thể cải thiện cách cơ thể sử dụng oxi, đặc biệt khi hoạt động thể chất [25].
d. Điều hịa đường huyết
ĐTHT có thể giữ cho lượng đường trong máu ở mức khỏe mạnh bằng cách
bắt chước hoạt động của insulin. Trong một số nghiên cứu trên chuột mắc bệnh tiểu
đường, ĐTHT đã được chứng minh là làm giảm lượng đường trong máu [26-28].
Một số bằng chứng cho thấy rằng chúng cũng có thể bảo vệ chống lại bệnh thận,
một biến chứng phổ biến của bệnh tiểu đường. Trong một đánh giá của 22 nghiên
cứu bao gồm 1.746 người bị bệnh thận mãn tính, những người dùng bổ sung
Cordyceps đã cải thiện chức năng thận [29].
e. Lợi ích đối với sức khỏe tim mạch
Khi nghiên cứu nổi lên về tác dụng của trùng thảo đối với sức khỏe tim
mạch, lợi ích của nấm ngày càng trở nên rõ ràng. Trên thực tế, trùng thảo được chấp
thuận ở Trung Quốc để điều trị chứng loạn nhịp tim, một tình trạng nhịp tim quá
chậm, quá nhanh hoặc không đều. Một nghiên cứu cho thấy trùng thảo làm giảm
đáng kể chấn thương tim ở chuột mắc bệnh thận mãn tính. Tổn thương tim do bệnh
thận mãn tính được cho là làm tăng nguy cơ suy tim, vì vậy giảm những tổn thương
này có thể giúp tránh được kết quả này [30]. Các nhà nghiên cứu cho rằng những
phát hiện này là do hàm lượng adenosine của trùng thảo. Adenosine là một hợp chất
tự nhiên có tác dụng bảo vệ tim [31]. Trùng thảo cũng có thể có tác dụng có lợi đối
với mức cholesterol. Nghiên cứu trên động vật đã chỉ ra rằng trùng thảo làm giảm
9


cholesterol tỉ trọng thấp (LDL) “có hại”. LDL có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh
tim bằng cách dẫn đến sự tích tụ cholesterol trong động mạch của bạn. Tương tự,
Cordyceps đã được chứng minh là làm giảm mức chất béo trung tính ở chuột [32,

33].
1.2. Tổng quan về huperzine A
1.2.1. Lịch sử huperzine A

Cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata) và các cây khác cùng chi được
sử dụng để trị bệnh sa sút trí tuệ và tâm thần phân liệt ở Trung Quốc. Đầu những
năm 1980, các nhà khoa học Trung Quốc đã tìm kiếm các loại thuốc mới để điều trị
bệnh nhược cơ. Lycopodium alkaloid chiết xuất từ các loài Lycopodium (sl) là mục
tiêu thuốc dẫn đầu dựa trên việc sử dụng truyền thống các loại dược liệu có chứa
chúng [34]. Các nghiên cứu dược lý in vitro và in vivo đã chứng minh rằng
Lycopodium alkaloid tạo ra tác dụng nhất định trong điều trị các bệnh ảnh hưởng
đến hệ thống tim mạch hoặc thần kinh cơ, hoặc có liên quan đến hoạt động của
enzym cholinesterase. Những alkaloid này đã được chứng minh là có tác dụng tích
cực đối với học tập và trí nhớ [35, 36]. Trong số này, huperzine A (HupA), được
phân lập từ cây Huperzia serrata của nhà khoa học Trung Quốc Liu và các đồng
nghiệp là hợp được biết đến nhiều nhất và có hiệu quả nhất. HupA đã được đánh giá
rộng rãi bởi người Trung Quốc về hoạt tính sinh học, đặc biệt là đối với hoạt động
đối với các cholinesterase và điều trị bệnh Alzheimer (AD).
1.2.2. Cấu trúc huperzine A

Phân tử huperzine A cấu tạo gồm: Một tetrahydroquinolinon, cầu 3 carbon,
exocyclic ethyliden, và nhóm amino. Cơng thức phân tử C15H18N2O, trọng lượng
phân tử 242, đồng phân quang học trong cây (-)-HupA là có hoạt tính. HupA có độ
hấp thu UV cực đại ở bước sóng 231 nm và 313 nm; Phổ IR có các đỉnh hấp thu
3180, 1650, 1615, 1550 cm-1. HupA là Lycopodium alkaloid loại lycodin với vòng
C mở và mất 1 nguyên tố carbon [35]. Có hơn 200 loại Lycopodium alkaloid đã
được báo cáo, tuy nhiên chúng hoặc là không có hoạt tính kháng AChE hoặc có
nhưng kém hơn HupA [35].

10

Hình 1.2. Cấu trúc của Huperzine A
Các lồi trong họ Thạch tùng đã được cơng bố cũng có khả năng cung cấp
nguồn HupA là [37]:
• Huperzia aqualupiana (Spring) Rothm.
• Huperzia carinata (Desv.ex Poir.) Trevis.
• Huperzia elmeri (Herter) Holub.
• Huperzia mirabilis (Willd.) Holub.
• Huperzia ovalifolia Ching.
• Huperzia phlegmaria (L.) Rothm.
• Huperzia phlegmarioides (Gaudich.) Rothm.
• Huperzia squarrosa (Forst.) Trevis.
• Huperzia tetrasticha (Kunze) Holub.
• Huperzia varia (R.Br.) Trevis.
• Huperzia vrieseana (Spring) Rothm
1.2.3. Tác dụng dược lý của huperzine A

a. Ức chế enzym acetylcholinesterase
Huperzine A là một chất ức chế mạnh và chọn lọc acetylcholinesterase.
Nồng độ ức chế 50% (IC50) của HupA chống lại acetylcholinesterase ở vỏ não chuột
in vitro được xác định là khoảng 82 nM [38]. Giá trị này lớn hơn so với (±)donepezil (10 nM) và ít hơn so với tacrine (93 nM). Qua so sánh, huperzine A có
tác dụng ức chế chọn lọc gấp 900 lần đối với AChE so với Butyrylcholinesterase
(BuChE). Đối với donepezil và tacrin thì tính chọn lọc này thấp hơn HupA. Sự chọn

11


lọc theo hướng AChE hơn BuChE hcó thể giúp làm giảm bớt tác dụng phụ không
mong muốn của hiệu ứng liên quan đến hoạt động ức chế BuChE [39].

Phân tích của Lineweaver-Burk cho thấy huperzine A là một chất ức chế
cạnh tranh của AChE. Dạng (-) HupA là dạng ức chế chủ yếu AChE và có tác dụng
mạnh hơn ít nhất 50 lần so với các đồng phân (+) HupA [40]. Cấu trúc AChE tạo
phức với HupA, trong đó có một sự tương tác mạnh mẽ tích cực giữa nhóm amin
của HupA và vòng thơm của Trp84 và Phe330 trong các vị trí hoạt động. Ái lực cao
của (-)-HupA đối với acetylcholinesterase là cơ sở đề xuất cho việc sử dụng nó
trong điều trị AD và như là một thuốc xử lý ngộ độc thần kinh do lân hữu cơ [39].
Mặc dù nguyên nhân chính xác của AD vẫn chưa được biết nhưng các triệu
chứng AD có liên quan đến việc thiếu hụt acetylcholine [41], do vậy HupA đã được
tiến hành nghiên cứu trong điều trị AD. Từ năm 1996, HupA đã được chấp thuận
cho điều trị AD mức độ nhẹ đến trung bình ở Trung Quốc. HupA phổ biến trong thị
trường thực phẩm chức năng ở Mỹ [41-43].
b. Tác dụng bảo vệ thần kinh do phospho hữu cơ gây ra
Chất độc thần kinh phospho hữu cơ như soman và sarin được phân loại theo
Liên Hợp Quốc là vũ khí phá hủy hàng loạt. Cơ chế gây độc của nó thơng qua việc
phosphoryl hóa AChE khơng đảo ngược, các triệu chứng ngộ độc từ nhẹ đến nặng
gồm từ suy hô hấp, tăng tiết đến các triệu chứng nghiêm trọng hơn bao gồm co giật
và mất sức, ở liều cao hơn gây tử vong. Chất có tác dụng ức chế AChE dùng giải
độc trong trường hợp này như pyridostigmin. Pyridostigmin phản ứng với AChE tạo
thành cabamoyl enzym tạo ổn định tạm thời. Trong vài giờ, tương tác này được đảo
ngược để giải phóng AChE, việc đảo ngược này cung cấp một cơ chế để bảo vệ
AChE trong khi các tác nhân thần kinh được chuyển hóa. Tuy nhiên, pyridostigmin
khơng thể vượt qua hàng rào máu não do đó nó chỉ tác dụng đối với AChE ngoại
biên. Trong khi đó một hợp chất tương tự là physostigmin thì có thể vượt qua hàng
rào máu não. Tuy nhiên, physostigmin gây ra tác dụng không mong muốn như buồn
nôn, nôn, tiêu chảy và chán ăn. Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá tiềm năng dự
phịng HupA chống lại phospho hữu cơ. Trong đó, một nghiên cứu liên quan đến
xác định giá trị gây chết 50% (LD50) của soman cho chuột (tiêm dưới da) và thử
nghiệm với HupA (500 mg/kg, tiêm trong phúc mạc) và physostigmin (100 mg/kg,
tiêm bắp). Kết quả là HupA bảo vệ gấp 2 lần trong vịng 6 giờ, trong khi đó tiền xử

lý với physostigmin chỉ bảo vệ 1,5 lần trong 2 giờ [44-46].

12


c. Suy giảm độc tính β-amyloid
Mảng già ngoại bào là một dấu hiệu mô học trong não của bệnh nhân AD.
Các thành phần chính của mảng già là mảnh β-amyloid (Aβ) chứa các peptide ngắn
gồm 36 - 43 acid amin. Mảnh β-amyloid (Aβ) được hình thành bởi sự phân giải
protein màng liên kết với tiền chất protein amyloid (APP). APP bị phân tách theo
hai con đường. Thứ nhất là α-secretase tạo mảnh α-APP hịa tan, mảnh này có tác
dụng dinh dưỡng thần kinh và bảo vệ thần kinh. Thứ hai là β / γ-secretase tạo mảnh
Aβ khơng hịa tan. Chính Aβ đã được báo cáo gây apoptosis dẫn đến chết tế bào. Do
đó, nhiều khả năng việc chữa trị AD là tìm cách sửa đổi con đường chuyển hóa thứ
hai β/ γ-secretase [47, 48].
d. Chống lại tác dụng độc thần kinh bởi glutamat
Các thụ thể glutamat quan trọng trong việc góp phần vào các hoạt động của
synap và đóng vai trị quan trọng trong việc hình thành trí nhớ và học tập. Hai thụ
thể chính, tên được đặt theo chất chủ vận liên kết với nó, là AMPA (α-amino-3hydroxyl-5-methyl-4-isoxazol-propionate) và NMDA. Gần đây, NMDA được chú ý
nhiều do người ta cho rằng việc q kích thích nó có liên quan đến nhiều bệnh thối
hóa thần kinh như động kinh và AD. Một lượng lớn bằng chứng gợi ý rằng ức chế
thụ thể NMDA hiệu quả trong sự suy giảm các bệnh này. Sự kích thích quá mức các
thụ thể NMDA dẫn đến sự xâm nhập của dòng ion calci, dòng calci tăng lên kèm
theo một chuỗi các quá trình suy thoái tế bào, cuối cùng dẫn đến chết tế bào thần
kinh và làm tiến triển của một số bệnh thoái hóa thần kinh. Tác dụng đối kháng thụ
thể NMDA của HupA đã được nghiên cứu và chứng minh tính hiệu quả của nó.
Trong một nghiên cứu khác, HupA được chứng minh là có hiệu quả trước và sau
điều trị chống co giật do NMDA gây ra. Do đó, hoạt động đối kháng NMDA của
HupA là độc lập với hoạt động ức chế AChE [39, 49, 50].
1.3. Acetylcholine, enzym acetylcholinesterase và giả thuyết về vai trò của hệ

cholinergic đối với bệnh Alzheimer
1.3.1. Acetylcholine

Acetylcholine (ACh) là chất trung gian hóa học có mặt trong phần lớn các
khe synap thần kinh trung ương, thần kinh thực vật, thần kinh-cơ. Acetylcholine tìm
thấy ở hành não, cầu não, thân não, não trung gian, thể vân và vỏ não mới (nhiều
nhất ở vùng vận động). Trong tủy sống, các hạch thần kinh thực vật, các tận cùng
thần kinh tiếp xúc với cơ quan ngoại vi đều chứa ACh.
13


ACh được tổng hợp từ cholin và acetyl Coenzym A do enzym choline acetyl
transferase xúc tác phản ứng, sau đó, được lưu giữ ở vị trí cuối dây thần kinh, trong
các túi. Các chất trong túi được giải phóng khi vị trí cuối dây thần kinh bị khử cực
và khi đó ACh được giải phóng vào khe synap và gắn với thụ thể. ACh sau khi
được giải phóng có thời gian bán thải rất ngắn vì sự có mặt của enzym AChE. Đây
là enzym thủy phân dây nối este trong phân tử ACh tạo ra choline và acid acetic.
Choline sau đó được thu nhận lại vào tế bào thần kinh để tổng hợp ACh. Do đó,
những chất có tác dụng ức chế AChE sẽ kéo dài thời gian tồn tại và thời gian tác
dụng của ACh [51, 52].
Trong những năm gần đây, ACh được thấy có liên quan tới nhiều chức năng
khác bên cạnh chức năng dẫn truyền thần kinh. Trong đó, ACh được xem là có liên
quan đến sự tiến triển của bệnh viêm dây thần kinh và quá trình sản sinh sợi
amyloid, những đặc điểm điển hình được thấy trong tế bào não của bệnh nhân mắc
bệnh Alzheimer [53].
1.3.2. Enzym Acetylcholinesterase

AChE, với vai trò thủy phân ACh, là một protêin có hình elip chứa một rãnh
sâu, được gọi là hẻm. Quá trình thủy phân ACh được xúc tác bởi AChE diễn ra ở đáy
của hẻm enzym theo cơ chế khá phức tạp. Ở đáy của hẻm, nơi xảy ra sự thủy phân cơ

chất ACh, có 4 vị trí hoạt động chính là vị trí este hóa, vị trí oxy-anion, vị trí anion và
túi acyl [54]. AChE là một trong những enzym thủy phân nhanh nhất. Hoạt tính của nó
mạnh gấp khoảng 10 lần so với serin protease hoặc BuChE (enzym thủy phân ACh chủ
yếu ở tế bào thần kinh đệm) ở cùng điều kiện nhiệt độ và pH [55].
1.3.3. Giả thuyết về vai trò hệ cholinergic đối với bệnh Alzheimer

AChE chủ yếu có mặt trong hệ thần kinh trung ương, xúc tác thủy phân chất
dẫn truyền ACh. Quá trình này cần thiết để chuyển tế bào thần kinh hệ cholinergic
từ trạng thái hoạt động sang tình trạng nghỉ [52, 54]. Ở bệnh nhân Alzheimer thấy
có sự giảm trầm trọng nồng độ chất dẫn truyền thần kinh ACh. Tình trạng này gây
suy giảm khả năng nhận thức đối với người bệnh. Giả thuyết về vai trò của hệ
cholinergic trong bệnh Alzheimer được đưa ra lần đầu tiên vào năm 1982 bởi tác
giả Whitehouse và cộng sự. Sau đó, giả thuyết này nhanh chóng trở thành động lực
cho q trình nghiên cứu theo hướng cải thiện chức năng hệ cholinergic trên bệnh
nhân mắc bệnh Alzheimer. Theo giả thuyết này, những chất ức chế sự hoạt động

14


của AChE làm tăng nồng độ và thời gian hoạt động của ACh ở synap thần kinh từ
đó cải thiện triệu chứng bệnh [53].
1.4. Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh
Hoạt tính bảo vệ tế bào thần kinh (neuroprotectivity) đóng một vai trị tiềm
năng chiến lược trong sàng lọc các chất cho phòng và điều trị các bệnh SSTT và
Alzheimer [56]. Hoạt tính này có mục tiêu là một số dòng tế bào thần kinh, được
thiết kế để giảm tính dễ bị tổn thương của các tế bào này đối với các bệnh thối hóa
thần kinh xảy ra khi mắc các bệnh SSTT và Alzheimer’s (AD). Các liệu pháp tiềm
năng nhằm giảm sự tích tụ của amyloid [57] hoặc các quá trình viêm [58, 59] đã
được thử nghiệm nhưng vẫn chưa mang lại kết quả rõ rệt. Khả năng bảo vệ tế bào
thần kinh có thể dẫn đến việc trì hỗn khởi phát hoặc làm chậm tiến triển của AD.

Sự khởi phát muộn của suy giảm triệu chứng trong phần lớn các trường hợp AD tạo
ra một phản ứng đặc biệt cao, tạo cơ hội cho các chiến lược bảo vệ các tế bào thần
kinh đạt được sự trì hỗn kéo dài khởi phát bệnh.
Đã có rất nhiều bằng chứng cho thấy rằng sự tích tụ beta amyloid (βA) là
một yếu tố chính ngay trong giai đoạn sớm của q trình mắc bệnh AD, có thể lập
luận rằng phương pháp điều trị giảm mức độ hoặc sự nồng độ sẵn có của các chất
độc hại các dạng βA sẽ tạo thành ưu tiên cao, trở thành mục tiêu đầu tiên trong các
chiến lược sàng lọc các chất cho phòng và điều trị AD. Các phương pháp tiếp cận
đầy hứa hẹn để giảm mức βA bao gồm ức chế tạo βA, giảm hòa tan cấp độ βA và
nâng cao sự đào thải βA từ hệ thống thần kinh trung ương (CNS) [57, 60].
Thêm vào đó, những cơn đau thần kinh (Neuropathic pain) xuất hiện thường
từ nguyên nhân chấn thương hoặc bệnh tật ảnh hưởng đến thần kinh trung ương
hoặc ngoại vi hệ thống. Hiện tượng này được đặc trưng bởi cơn đau tự phát được
tạo ra bởi các kích thích không gây đau đớn (chứng loạn cảm) hoặc một phản ứng
quá mức đối với các kích thích gây đau đớn (hyperalgesia). Đồng thời sự rút ngắn
của các sợi liên kết thần kinh (neurite) cũng được xác định là nguyên nhân dẫn đến
những cơn đau thần kinh [61]. Nhiều căn nguyên, bao gồm bệnh tiểu đường, nghiện
rượu, bệnh di truyền, bệnh chuyển hóa hoặc nhiễm trùng liên quan đến cơ chế bệnh
sinh của hội chứng này [62], cùng với các tác dụng phụ gây bệnh của một số thuốc
trên tế bào thần kinh cảm giác ngoại vi. Những tác động bất lợi này bao gồm một
trong những giới hạn liều lượng tác dụng phụ của nhiều loại thuốc kháng virus và
kháng u [63, 64]. Những loại thuốc này gây ra thoái hóa tế bào thần kinh trong các
dây thần kinh cảm giác dẫn đến sự phát triển của bàn tay và bàn chân rối loạn cảm
15


giác, bao gồm tê và đau thần kinh thường bắt đầu ở các chi xa trong sự phân bố
găng tay và tất [65]. Thuốc giảm đau thông thường thuốc, chẳng hạn như opioid
hoặc thuốc chống viêm không steroid (NSAID), không đủ để giảm đau do thần kinh
và giảm đau do bệnh thần kinh gây ra vẫn là một phương pháp y tế cần vì thiếu

thuốc giảm đau hiệu quả để điều trị tình trạng bệnh lý này. Do đó, các loại thuốc
như thuốc chống co giật (ví dụ: pregabalin hoặc gabapentin), serotonin cụ thể
Thuốc ức chế tái hấp thu và thuốc chống trầm cảm ba vòng đang được kê đơn để
điều trị điều kiện này, mặc dù tất cả đều kém hiệu quả [66]. Trong một nghiên cứu
trước đây, chúng tơi đã phát triển một thơng lượng cao kiểu hình sơ cấp mới trong
ống nghiệm xét nghiệm sàng lọc (HTS) dựa trên khả năng giảm kích thích gây ra
bởi các chất trung gian gây viêm trong dây thần kinh cảm giác trên dòng tế bào F11,
một tế bào thần kinh của hạch rễ bất tử (DRG). Sử dụng phương pháp này, chúng
tôi đã phát hiện ra 5 lần truy cập (protriptyline, nicardipine, nimodipine, felodipine
và nitrendipine) từ thư viện Prestwick [67]. Ở đây, chúng tôi hướng đến việc phát
triển một xét nghiệm in vitro kiểu hình, trong trường hợp này là xét nghiệm thứ cấp
sàng lọc hàm lượng cao (HCS) để đánh giá ảnh hưởng của thuốc đối với tác dụng
ngoại ý gây bệnh (rút ngắn tế bào thần kinh) của thuốc kháng vi-rút và các chất
chống khối u trên dòng tế bào DRG bất tử F11. Rilpivirine kháng vi rút và tác nhân
chống khối u vincristine đã được lựa chọn vì chúng là thuốc nguyên mẫu sản xuất
thuốc điều trị thần kinh nỗi đau ở con người [68].
Để đánh giá các đặc tính bảo vệ tế bào thần kinh (TBTK), phương pháp thực
hiện cần phải rõ ràng về độc tính tế bào của nó trong yếu tố tăng trưởng thần kinh
(NGF) với dòng tế bào PC12 hoặc F11. Mẫu thử nghiệm được thêm vào tế bào và ủ
trong 6 giờ. Khả năng tồn tại của tế bào là được đánh giá bằng xét nghiệm WST-8
(bộ kit thử sức sống của tế bào bằng so màu và các tế bào có khả năng sống sót là
80% được xem xét cho các thí nghiệm tiếp theo. Sau đó, bước tiếp theo là kiểm tra
tác dụng bảo vệ thần kinh bằng cách ủ tế bào PC12 hoặc F11 bằng chất độc thần
kinh, 6-OHDA (6-hydroxydopamine) (300 mM), trong 24 giờ đầu tiên và sau đó
với cùng các chất chiết xuất ở cùng nồng độ. Sau đó hiệu quả của chất có tác dụng
bảo vệ được tính bằng phân số của khả năng tồn tại tế bào của 2 kết quả thử trên
(mẫu thử và mẫu đã ủ chất gây độc tế bào).
1.5. Tác dụng cộng hợp của các chất
1.5.1. Định nghĩa

Trong y học hiện đại, việc điều trị các bệnh và tình trạng phức tạp thường đòi
16