Luận văn thạc sĩ sinh học đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh (panax vietnamensis ha grushv

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----o0o----

NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

Th

ai

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH

N

n

ye

gu

(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

Hà Nội - 2018

ity

rs

ve

ni

U
LUẬN VĂN THẠC SĨ


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----o0o----

NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

Th

ai

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH

ye

gu

N

(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

n

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

ve

ni

U

Mã số: 8 42 01 14

ity

rs

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Nguyễn Thị Phương Trang

Hà Nội - 2018


LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hồn thành tại phịng Hệ thống học phân tử và Di
truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tận tình
của TS. Nguyễn Thị Phương Trang. Tác giả xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc
tới sự hướng dẫn của cơ.
Trong q trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tác giả
đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình về nhiều mặt của Ban lãnh
đạo Viện ST & TNSV,cán bộ phụ trách đào tạo của Viện, của TS. Đặng Tất

ai

Th

Thế, trưởng phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn.
Chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè đồng nghiệp, ThS. Nguyễn

N

gu

Giang Sơn, TS. Hồ Thị Loan, TS. Phạm Thế Cường, ThS. Lê Thị Mai Linh
lĩnh vực nghiên cứu khoa học.

n

ye

đã ln nhiệt tình giúp đỡ, quan tâm, chỉ bảo những bước đi ban đầu trong

U

ni

Cuối cùng, tác giả cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới những

ity

rs

q trình hồn thành luận văn.

ve

người thân trong gia đình đã ln bên cạnh động viên và giúp đỡ trong suốt

Luận văn được hoàn thành từ nguồn kinh phí hỗ trợ từ đề tài hợp tác song
phương của Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam do TS. Nguyễn Thị
Phương Trang làm chủ nhiệm, mã số VAST.HTQT.Nga.10/15-16.
Tác giả xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài này là do chính tơi thực hiện, các số liệu thu
thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất
kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Những thơng tin tham khảo trong khóa
luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng.
Ngày

tháng

năm 2018

Học viên thực hiện
( Ký và ghi rõ họ tên)

ai

Th
n

ye

gu

N

Nguyễn Thị Hồng Mai

ity

rs

ve

ni

U


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................ii
MỤC LỤC ........................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU ................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................vii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3

1.1.Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.) .................................................................. 3

Th

1.2. Tổng quan về sâm ngọc linh......................................................................... 3

ai

1.2.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3

N

gu

1.2.2. Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh ................................................ 5

ye

1.2.3. Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh.............. 5

n

1.2.4. Cơng trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh ....................................... 7

ni

U

1.2.5. Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam....................................... 9
1.3. Phương pháp luận và cách tiếp cận........................................................... 10

ve

rs

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP

ity

NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 16

2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 16
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................................. 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 16
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số ....................................................................... 16
2.3.2. Lựa chọn mồi SSR.................................................................................... 17
2.3.3. Phân tích số liệu SSR ........................................................................... 18
2.3.4. Thiết kế mồi đọc trình tự .................................................................... 19
2.3.5. PCR khuếch đại gen ........................................................................... 20
2.3.6. Điện di trên gel agarose...................................................................... 21
2.3.7. Kiểm tra khả năng bắt cặp bằng BLAST .......................................... 21


2.3.8. Đọc trình tự gen .................................................................................. 21
2.3.9. Xây dựng cây phát sinh chủng loại ................................................... 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 23
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ............................................................. 23
3.2. Lựa chọn mồi SSR .................................................................................... 23
3.3. Kết quả phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh .... 25
3.4. Kết quả khuếch đại gen từ các cặp mồi đặc hiệu ................................ 30

3.5. Kết quả phân tích trình tự gen – đặc điểm phân tử của các vùng gen
rbcL, rpoB, ITS và 18S của lồi sâm ngọc linh. .............................................. 32
3.6. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số

Th

lồi trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự hai vùng gen rbcL, ITS -

ai

sơ đồ mối quan hệ di truyền của chúng. ........................................................... 47

N

gu

3.7. Kết quả so sánh khả năng phân loại sâm ngọc linh đối với các loài chi

ye

Panax khác của ba vùng gen nghiên cứu. ....................................................... 50

n

3.8. Kết quả đăng ký mã số các vùng gen nghiên cứu trên ngân hàng gen .. 55

U

KẾT LUẬN......................................................................................................... 56

ni

ve

KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 57

rs

DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN

ity

CỦA TÁC GIẢ .................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 59
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 65


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU
AFLP

Đa hình độ dài các đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified

Fragment Length Polymorphism)
base pair

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CBOL

Consortium for the Barcode of Life

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

ME

Phương pháp Minimum Evolution Method

MP

Phương pháp Maximum Parasimony Method

NJ

Phương pháp Neighbor Joining

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

RAPD

Đa hình các đoạn DNA khuyếch đại ngẫu nhiên (Random

ai

Th

bp

n

ye

gu

N

U

RFLP

ve

ni

Amplified Polymorphic DNA)

Đa hình độ dài các đoạn DNA giới hạn (Restriction Fragment

ity

rs

Length Polymorphism)
SSR

Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats)

UPGMA

Unweighted Pair Group Method Analysis

VQG

Vườn Quốc Gia


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích đa dạng di truyền ...... 17
Bảng 2.2. Bảng trình tự 5 cặp mồi dùng trong khuếch đại và đọc trình tự gen. 20
Bảng 2.3: Danh sách các loài/thứ trên Genbank sử dụng trong nghiên cứu. .... 22
Bảng 3.1: Thơng số đa dạng di truyền lồi sâm ngọc linh dựa trên phân
tích 4 chỉ thị SSR.............................................................................................. 26
Bảng 3.2. Kết quả so sánh các Nu sai khác trên vùng gen rbcL (gồm rbcLa và
rbcLc) giữa sâm ngọc linh và các loài khác thuộc chi Panax. ....................... 37

Th

Bảng 3.3. Khoảng cách di truyền gen rbcL giữa loài sâm ngọc linh (phía trên

ai

bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 lồi

gu

N

/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax. ........................................................... 44
Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền gen rpoB giữa loài sâm ngọc linh ( phía trên

ye

bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 lồi

n

U

/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax ............................................................ 44

ve

ni

Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền vùng gen ITS giữa lồi sâm ngọc linh ......... 45

rs

(phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh

ity

với 9 lồi /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax ........................................... 45
Bảng 3.6. Khoảng cách di truyền mồi 18S giữa lồi sâm ngọc linh (phía trên
bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 lồi

/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax. ........................................................... 46


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh

4

Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín

4

Hình 2.1. Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh

15

Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1%

22

Hình 3.2. Một số hình ảnh alen ghi nhận khi phân tích SSR của 4
mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481

23

Hình 3.3: Kiểm tra sản phẩm PCR gen ITS; rpoB; 18S bằng điện di
trên gel agarose 1%

30

Th

30

ai

Hình 3.4: Kiểm tra sản phẩm PCR gen rbcLa; rbcLc bằng điện di
trên gel agarose 1%.

N

31

Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLa với các lồi
Panax trên ngân hàng gen.

35

Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLc với các lồi
Panax trên ngân hàng gen.

36

n

ye

gu

Hình 3.5. Ví dụ về hình ảnh các peak trong giải trình tự

ve

ni

U

39

Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen ITS với các lồi
Panax trên ngân hàng gen

41

Hình 3.10: Sơ đồ hình cây (NJ) mối quan hệ di truyền của sâm ngọc
linh với 9 loài khác trong chi Panax dựa trên phân tích trình tự vùng
gen ITS và rbcL

48

Hình 3.11. Thứ tự ghép nối các đoạn gen nghiên cứu

50

Hình 3.12. Kết quả so sánh phân loại chín lồi chi Panax dựa trên so
sánh từng vùng gen (rpoB, rbcL, ITS) và sự kết hợp của chúng.

53

Hình 3.13. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của chín lồi thuộc chi

Panax phân tích dựa trên sự kết hợp trình tự gen rbcL và ITS.

54

ity

rs

Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rpoB với các lồi
Panax trên ngân hàng gen


MỞ ĐẦU
Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) đã được xác định
là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen, được
xếp vào một trong bốn cây sâm quý nhất trên thế giới do có chứa nhiều
thành phần saponin, hàm lượng acid amin, các chất khống vi lượng hơn
hẳn những lồi sâm khác. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức và phá hủy
vùng phân bố tự nhiên đã dẫn đến sự tuyệt chủng ngoài tự nhiên của sâm
ngọc linh. Hiện loài này chỉ còn tồn tại ở một số vườn trồng tại các khu bảo
tồn của tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Sâm ngọc linh đã được đưa vào sách
đỏ Việt Nam, danh lục của IUCN và Nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chính
phủ. Ngành Y tế đã hướng chọn sâm ngọc linh làm cây thuốc xây dựng sản

Th

phẩm quốc gia về dược liệu. Ngày 18/7/2012, chính phủ đã có Quyết định số

ai

936/QĐ-TT phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển kinh tế - xã hội vùng

N

gu

Tây Nguyên đến năm 2020, trong đó phát triển cây sâm ngọc linh trở thành

ye

cây đặc sản quốc gia. Những nghiên cứu về di truyền quần thể giúp các nhà

n

khoa học và các nhà chiến lược có cái nhìn tổng thể về thực trạng di truyền

ni

U

của các quần thể sâm ngọc linh, từ đó có những chiến lược hợp lý trong
việc bảo tồn và phát triển bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam.

ve

Các nghiên cứu ở cấp độ phân tử còn giúp xác định được những sai khác về

rs

ity

mặt di truyền của loài sâm ngọc linh so với các loài Panax khác, làm cơ sở
cho việc phân loại và giám định các mẫu sâm ngọc linh.
Xuất phát từ tình hình thực tế này, luận văn tập trung nghiên cứu đặc
điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại Quảng Nam và Kon
Tum, đồng thời kiểm tra sự sai khác di truyền của bốn vùng gen gồm hai
vùng gen nhân: 18S, ITS và hai vùng gen lục lạp: rbcL và rpoB của mẫu
sâm ngọc linh, so sánh với một số loài Panax khác.
Mục tiêu cụ thể:
- Xác định đặc điểm di truyền quần thể của hai quần thể sâm ngọc linh thu
tại tỉnh Quảng Nam và Kon Tum.
- Đánh giá mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số loài Panax
1


khác trên cơ sở giải mã trình tự vùng gen rbcL, rpoB, 18S và ITS, đặc điểm
phân tử của các vùng gen này, đồng thời so sánh khả năng phân loại của
bốn vùng gen nói trên trong việc phân biệt loài sâm ngọc linh với một số
loài Panax khác.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật
thông tin về hiện trạng di truyền của quần thể sâm ngọc linh tại Quảng
Nam và Kon Tum.
Kết quả của luận văn là cơ sở khoa học giúp cho công tác bảo tồn và
chọn giống có những chiến lược hợp lý trong cơng tác bảo tồn và phát triển

Th

bền vững lồi sâm quý hiếm này của Việt Nam.

ai

Kết quả của luận văn góp phần chọn lọc được vùng gen hữu hiệu
ngọc linh của Việt Nam.

n

Nội dung nghiên cứu

ye

gu

N

(chỉ thị phân tử) cho cơng tác nghiên cứu khoa học và phân loại lồi sâm

ni

U

- Lựa chọn mồi SSR phù hợp với loài sâm ngọc linh của Việt Nam.

ve

- Đánh giá đặc điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại

rs

tỉnh Quảng Nam và Kon Tum bằng kỹ thuật SSR.

ity

- Kiểm tra đặc điểm phân tử của bốn vùng gen rpoB, ITS, rbcL và
18S, so sánh khả năng phân loại của bốn vùng gen này trong việc phân biệt
loài sâm ngọc linh của Việt Nam; đăng ký số hiệu genbank.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.)
Chi sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Tồn
bộ chi sâm (Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới loài
(thứ -var.) [21]. Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới cho thấy chúng chỉ
xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đơng của
Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2 lồi Panax
quinquefolius và Panax trifoliatus). Vùng Đơng Bắc Á có 2 loài Panax
ginseng và Panax japonica. Trung tâm phân bố của chi Panax L. có thể từ
vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực

Th

chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và

ai

Lào Cai (Việt Nam). Ở đây đang có tới 7 lồi và thứ (dưới loài) mọc hoàn

N

gu

toàn tự nhiên. Hai loài nhập trồng là Panax notoginseng nhập từ Bắc Mỹ và

ye

Panax pseudoginseng (khơng tìm thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có

n

nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 lồi

ni

U

gần gũi nào đó). Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi sâm (Panax L.)

ve

của thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 lồi (Panax notoginseng; Panax

rs

quinquefolius và Panax trifoliatus). Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi

ity

Panax L. là lồi sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) ở miền Trung của Việt

Nam, tại 14°15’ vĩ độ Bắc. Chính vì vậy sâm ngọc linh được coi là loài đặc
hữu hẹp của miền Trung Việt Nam [12].
1.2. Tổng quan về sâm ngọc linh
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)[36] là cây thân thảo,
sống nhiều năm. Thân rễ có đường kính 3.5cm, khơng có rễ phụ dày dự trữ,
đơi khi ở một số cây phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến
5cm. Thân cao từ 40 cm – 60 cm, rỗng, lá mọc vịng, thường có 4 (ít khi 3, 5,
6). Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7 – 12 cm (ít khi 15 cm). Lá
3


chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 – 14 cm, rộng 3 – 5
cm, đầu lá thường nhọn, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép lá có
răng cưa nhỏ đều [12], [14], [25] (Hình 1.1).

Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh

Th

(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)

ai

ye

gu

N

Sinh thái: Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với
nhiệt độ ban ngày từ 20 - 25°C, ban đêm 15 - 18°C, sâm ngọc linh có thể
sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm [25].

n

Công dụng: Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngồi ra
cũng có thể dùng lá và rễ con [25].

U

ity

rs

ve

ni

Sinh học: Vào đầu tháng giêng hàng năm, cây sâm xuất hiện chồi mới sau
mùa ngủ đơng, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành, từ tháng
4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả, tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài
đến tháng 9. Khi quả chín, vỏ quả chuyển từ màu xanh sang vàng lục rồi đỏ
cam với chấm đen lớn chiếm 1/4 đến 1/5 xuất hiện ở đỉnh quả (Hình 1.2).

Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín
(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac - ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)
4

Vào khoảng cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại
một vết sẹo ở đầu củ sâm và bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12. Ngay
trong quá trình tàn lụi, từ đầu mầm thân rễ nằm sát hoặc dưới mặt đất hình
thành một chồi thân mới. Các chồi này tồn tại dưới dạng chồi ngủ trong suốt
3-4 tháng mùa đông và sẽ mọc lên vào mùa xuân năm sau để tiếp tục một
chu trình sinh trưởng phát triển mới. Căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mà
người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi. Phải ít nhất từ 3 năm tuổi
tức trên củ có một sẹo mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi
[2], [12]. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm.
1.2.2. Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh

Th

Cho đến nay, sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên trung

ai

phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có và quan trọng nhất là núi

N

Ngọc Linh. Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã

ye

gu

Mường Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà
Cang, Trà Linh, Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam) [12]. Cây

n

sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm

U

ni

1970 cũng là sâm ngọc linh. Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của

rs

ve

nó thì sâm ngọc linh đã có mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằng
thuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc Linh và Lang Biang). Cả 2 khối núi này

ity

đều có độ cao trên 1.500 m. Điểm phát hiện có sâm ngọc linh mọc tự nhiên
đều vào khoảng 1.800 - 2.200 m [5], [25], [21].
1.2.3. Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh
1.2.3.1. Tầm quan trọng và giá trị của sâm ngọc linh
Tất cả những lồi thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài
của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm
vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như nhân
sâm (Panax ginseng); giả nhân sâm (Panax pseudoginseng); tam thất
(Panax notoginseng) và sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)
[6], [3], [9], [21]. Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống
5

Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng
Nam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thần
dược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm
nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu
vết thương,… [2], [3], [6], [11], [21]. Theo quan điểm hóa phân loại và
dược lý học, những cơng trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế
giới đã chia các loài thuộc chi Panax thành 2 nhóm chính:
Nhóm 1: gồm các lồi hiện đã được phát triển trồng trọt gồm: nhân sâm
(Panax ginseng), sâm mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax
notoginseng),… có bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển
và chứa các Saponin có khung thuộc nhóm dammaran.

Th

Nhóm 2: gồm các lồi mọc hoang như Panax japonicas, Panax

ai

zingiberensis, Panax stipuleanatus,… với bộ phận thân rễ dưới đất phát triển

N

gu

theo hướng nằm ngang, chứa Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [3].

ye

Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả,

n

đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy sâm ngọc linh

ni

U

có 52 hợp chất saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu

ve

trúc hồn tồn mới, lần đầu tiên được cơng bố. Khi so sánh với nhóm sâm

rs

trồng (nhóm 1) có giá trị trên thế giới như nhân sâm (Panax ginseng), sâm

ity

mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax notoginseng),… thì thành phần
saponin của sâm ngọc linh rất giống với 3 lồi nói trên, nhưng hàm lượng
lại cao hơn nhiều [3], [11].
1.2.3.2. Thành phần hóa học của sâm ngọc linh
Từ năm 1974 – 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu nhân
sâm Việt Nam, so sánh với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng), nhân sâm
Nhật Bản (Panax japonicus) và nhân sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolium).
Kết quả là bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong

Panax vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu
sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng [13]. Chi tiết hơn
nữa, trong Panax vietnamensis có hàm lượng cao nhất saponin kiểu damarane
6


(7.58%), trong đó saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏ
saponin của axit oleanolic[13]. Điều này trái với quy luật chung là thông
thường các cây nhân sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin
của axit oleanolic và saponin nhóm damarane [8], [11]. Cũng là lần đầu tiên
trên thế giới, người ta chiết được một lượng lớn majonozit R2 và ocotillol
saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai chất này đã chiếm 4.34%)
gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol saponin cao nhất có trong các
lồi chi Panax [16]. Ocotillol saponin đã trở thành một hợp chất cần chú ý có
thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học vì nó có thể ảnh hưởng đến một
số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis. Sự có mặt của
damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn làm cho sâm ngọc linh khác với

Th

nhân sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta chưa tìm thấy ocotillol trong

ai

nhân sâm Triều Tiên. Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh nhân

gu

N

sâm của Việt Nam có hàm lượng saponin damarane cao nhất (12 - 15%) so
với nhân sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với

ye

26% trong nhân sâm triều tiên [9]. Ngồi những saponin nói trên, trong nhân

n

ve

ni

dầu và một số yếu tố vi lượng [11].

U

sâm của Việt Nam còn chứa các polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh
Như vậy, sâm ngọc linh không những đặc biệt về mặt phân bố (là lồi duy

rs

ity

nhất có phấn bố tại 14°15’ vĩ độ Bắc, giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi
Panax L.) mà còn độc đáo về cấu tạo hố học bởi tuy là lồi sâm thuộc nhóm
2 với bộ phận thân rễ thuộc dạng khí sinh, phát triển theo hướng nằm ngang
nhưng thành phần hoá học lại chứa các saponin chủ yếu thuộc nhóm
dammaran (giống các lồi sâm của nhóm 1), đặc biệt hơn lại có chứa một số
saponin đặc trưng mà các loài sâm khác trên thế giới khơng có.

1.2.4. Cơng trình nghiên cứu của lồi sâm ngọc linh
Ở Việt Nam, cho đến nay, các cơng trình khoa học nghiên cứu về sâm
ngọc linh khá đa dạng, ngoài những nghiên cúu cơ bản tập trung vào điều
tra, phân loại, xác định vùng phân bố thì cũng đã có nhiều nghiên cứu về

7


thành phần hố học, thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan, giải mã hệ gen lục
lạp…có thể liệt kê một số các cơng trình đáng chú ý như sau:
- Trần Lê Quân và cs (2002): tách chiết, majonoside R2, Triterpen
Saponin từ cây sâm việt nam (Panax vietnamensis) và thử nghiệm hoạt tính
bảo vệ gan. Nghiên cứu cho thấy cao chiết MeOH của củ sâm việt nam có
hoạt tính bảo vệ gan in vitro trên mơ hình gây độc cho tế bào gan bằng Dgalactosamine (D-GaLN)/yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-anpha) .
Nguyễn Thị Thu Hương và cs (1999): nghiên cứu về tác dụng dược lý của
sâm việt nam, trong đó tập trung vào tác dụng kích thích miễn dịch chống
căng thẳng, trầm cảm [48], [5], [11], [18].

Th

- Nguyễn Thới Nhâm và cs (1993) Nghiên cứu về dược liệu học và

ai

hoá học cây sâm Việt Nam [16].

gu

N

- Loạt cơng trình của PGS.TS. Dương Tấn Nhựt (2010, 2011, 2014,
2015) về nhân giống vơ tính Sâm ngọc linh [13], [14].

ye

- Cụm cơng trình của Viện Dược Liệu trong khn khổ chương trình

n

U

bảo tồn nguồn gen đã khoanh vùng được khu vực phân bố, đặc điểm sinh

ve

ni

thái, hình thái, lập bản đồ quy hoạch vùng trồng sâm (các tác giả, Lê Minh
Thảo [8], [18],…)

rs

ity

- Phan Kế Long và cs (2014) đã sử dụng vùng gen ITS để đánh giá sự sai
khác di truyền giữa loài sâm ngọc linh và mẫu sâm thu được tại Phong Thổ
Lai Châu, cũng dựa trên trình tự gen matK và ITS, mẫu sâm thu tại Lai Châu
đã được xác định tên khoa học là Panax vietnamensis var. fuscidiscus, là một
thứ của loài Panax vietnamensis [9, 40].
- Nguyễn Thị Phương Trang và cs (2011) đã sử dụng vùng gen ITS để

đánh gía mối quan hệ di truyền của lồi sâm việt nam, sâm lai châu với các
loài khác trong chi Panax [22]. Hay nhóm nghiên cứu của Đặng Tất Thế,
Nguyễn Thị Phương Trang (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật) thực
hiện một số hợp tác nghiên cứu với nhóm nghiên cứu của Viện sỹ Yuri
Zhuralev và TS. Galina D. Reunova (Viện Sinh học thỗ nhưỡng Viễn Đông,
8


Viện Hàn Lân khoa học Liên Bang Nga) về phân bố và di truyền của loài
sâm việt nam và sâm nga bằng kỹ thuật AFLP và SSR [34, 35].
- Trong đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền chi sâm, nhóm nghiên
cứu của Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu, và cs (2016) đã thực hiện “Đánh giá
di truyền quần thể loài tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai) bằng chỉ
thị ISSR. Nhóm nghiên cứu của GS. Nơng văn Hải (2017) (Viện nghiên cứu
hệ gen-Viện Hàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam) nghiên cứu về giải
mã hệ gen lục lạp sâm ngọc linh. Nhóm nghiên cứu của TS. Lê Hùng Lĩnh
(2017)-(Viện Di truyền Nông nghiệp) thực hiện nghiên cứu nuôi cấy mô và
xác định gen lục lạp đặc hiệu của một số loài trong chi Panax.

Th

1.2.5. Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam

ai

Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 lồi,

gu

N

trong đó có 2 lồi nhập trồng là tam thất (Panax notogineng) và nhân sâm
(Panax ginseng) [5]. Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là sâm

ye

n

vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), tam thất hoang (Panax stipuleanatus

ni

U

Tsai et Feng) và đặc biệt sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

ve

là loài đặc hữu hẹp của miền Trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các

rs

huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kom Tum), huyện Nam Trà My,

ity

huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh độ cao trên
1500 m. Tuy nhiên, hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên do
tình trạng khai thác cạn kiệt trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy
nên diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp. Hiện, sâm ngọc linh đã được đưa vào

danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các lồi hạn chế khai thác và sử
dụng vì mục đích thương mại (Nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31/03/2006
về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm), theo Sách đỏ
Việt Nam (2007), sâm ngọc linh được xếp vào hạng EN Ala, c, d, BI + 2b, c,
e [1]. Sâm ngọc linh chủ yếu tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã
Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà Linh
(xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng
9


khoảng 10 hecta [6]. Tuy nhiên, với quyết định số 936/QĐ-TT ngày
18/7/2012 của thủ tướng chính phủ thì kế hoạch đến năm 2020, diện tích trồng
sâm ngọc linh sẽ được tăng lên đến khoảng 200ha.
1.3. Phương pháp luận và cách tiếp cận
Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng
rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyền
quần thể sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích DNA, đặc
biệt đối với lĩnh vực phân loại học và di truyền phân tử. Việc sử dụng các chỉ
thị DNA để định danh loài đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập
trung nghiên cứu và đã có nhiều đóng góp, phát hiện đáng kể [10], [17], [22],

Th

[24], [27], [30], [40], [41], [42], [53]. Xác định lồi bằng chỉ thị DNA có độ

ai

chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi mà những quan sát

N

hình thái, sinh trưởng, phát triển chưa đủ cơ sở để phân biệt. Vì thế chỉ trong

gu

vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2007) của thế giới đã lưu giữ trên 70

ye

triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotide. Đây là nguồn dữ liệu có giá trị

n

trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là: (1) số liệu

U

ni

về trình tự các nucleotide rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn

ve

giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu

rs

trình tự nucleotide đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất

ity

cho bảo tồn đa dạng di truyền, nghiên cứu di truyền quần thể (population
genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể,
giữa các cá thể, giữa các cha mẹ và con cái...; (3) kết quả phân tích DNA cho
phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật khơng
cịn ngun vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần
thể địa lý…; và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ
yếu tố khách quan do môi trường hay con người gây ra [10].
Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là
công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài
mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa
dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiều loài động thực
10


vật và vi sinh vật [37]. Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đang góp
phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và
khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở
Việt Nam. Sâm ngọc linh là loài dược liệu quý có tác dụng tăng cường hệ miễn
dịch và ngăn ngừa ung thư… Đến nay quần thể sâm ngọc linh tự nhiên bị khai
thác mạnh mẽ, dẫn tới có nguy cơ cạn kiệt do nhu cầu sử dụng loại dược liệu
này ngày càng cao. Công tác bảo tồn và phát triển bền vững loại dược liệu này
ở Việt Nam trở nên cần thiết và cấp bách. Vì vậy, nghiên cứu đánh giá tính đa
dạng di truyền, làm cơ sở cho cơng tác bảo tồn nguồn gen cho loài sâm ngọc
linh cần được tập trung thực hiện. Bên cạnh đó, việc phát triển bộ mã vạch phân
tử cũng cần được nghiên cứu để giúp góp phần phân loại/giám định chính xác

Th

sâm ngọc linh và các loài sâm khác thuộc chi nhân Sâm.

ai

1.3.1 Phương pháp phân loại học phân tử

N

gu

1.3.1.1. Ưu điểm của việc ứng dụng nghiên cứu phân tử trong phân loại học

ye

Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất hiện nay trong việc xác

n

định mối quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự DNA, bởi vật liệu di truyền

U

ni

là duy nhất cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngồi của chúng và ít bị ảnh

ve

hưởng bởi tuổi, điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và

ity

rs

chế biến. DNA chiết từ bất cứ bộ phận nào đều mang cùng thông tin di truyền.
DNA chiết thì ổn định và có thể giữ ở -20°C trong thời gian dài (khoảng 3-5
năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về thời gian trong phân tích, đặc biệt chỉ cần sử
dụng một lượng ít mẫu cũng có hiệu quả [8], [12], [26].
1.3.1.2. Sử dụng hệ gen lục lạp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật
Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae),
chúng có chứa DNA riêng. DNA lục lạp có từ 102 – 104 bản sao trong mỗi tế
bào. Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyl) và là nơi thực hiện quá trình
quang hợp của cây. Hệ gen lục lạp thường được sử dụng cho phân loại ở thực
vật do đặc tính di truyền theo dịng mẹ, khơng bị tái tổ hợp di truyền cho thế
hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao. Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại
11


học phân tử đánh giá chúng là sự tích lũy của các đột biến theo thời gian, do
vậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hóa giữa các lồi. Hệ gen lục lạp (cpDNA)
thực chất là một phân tử DNA dạng vịng, sợi đơn, mỗi gen thường khơng lặp
lại. Khơng giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hóa cho các
protein cần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máy biểu hiện những protein
này. Vùng DNA khơng mã hóa trên hệ gen lục lạp là rất ít.
Hệ gen lục lạp có kích thước từ 120 kb – 220kb, kích thước này thay đổi
do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều nhau, tách hệ gen lục lạp thành
2 vùng (vùng lớn LSC và vùng nhỏ SSC). Mặc dù phần lớn DNA lục lạp đều
mang số lượng gen như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen di trú vào DNA

Th

nhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp. Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp

ai

hơn từ 4 – 5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng 3 lần so với

N

gu

DNA ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân

ye

loại [45]. Các nghiên cứu cấu trúc phân tử hệ gen lục lạp ở hầu hết các loài

n

thực vật bậc cao cho thấy tỷ lệ thay thế trong hệ gen lục lạp thấp hơn rất nhiều

ni

U

so với hệ gen nhân và chúng cũng có mức tái tổ hợp rất thấp, di truyền theo

ve

một dòng [54]. Một số vùng gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên

rs

cứu hệ thống học phân tử thực vật hiện nay bao gồm: matK, rbcL, psbA –
không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận [29].

ity

trnH, rpoB,… tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi

1.3.1.3. DNA barcoding và ứng dụng của nó
DNA barcoding là đoạn DNA ngắn (thường từ 200-500 bp) đặc trưng cho
lồi/nhóm lồi, dễ khuếch đại và bền vững. Hiện nay DNA barcoding đã được
sử dụng rất nhiều trong phân loại và giám định các loài động thực vật. Phương
pháp này dựa trên nguyên tắc so sánh các vùng trình tự DNA ngắn có tốc độ
tiến hóa nhanh để định loại các lồi. Phương pháp này có thể áp dụng cho tất
cả các đối tượng sinh vật khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật…
Ở thực vật, các vùng DNA mã vạch được sử dụng để phân loại thường là
12


các trình tự thuộc hệ gen lục lạp và hệ gen nhân…[39]; [55]; [10]. Trên thế giới
việc sử dụng phương pháp mã vạch DNA để phân biệt các loài đã phổ biến và
thông dụng từ những thập niên 90 của thế kỷ trước. Một số vùng gen nhân và
lục lạp thường dùng trong phân loại/giám định thực vật gồm ITS, 18S, matK,
rbcL, rpoB, psbA – trnH …[29]; [38], [40]; [42].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 vùng gen lục lạp gồm rbcL,
rpoB và 2 vùng gen nhân gồm 18S và ITS để đánh giá khả năng phân biệt
loài sâm ngọc linh với một số loài Panax khác.
- RbcL là vùng gen đệm trong lục lạp dài khoảng 1500 bp mã hố cho
protein Rubico. Protein này có 8 tiểu phần lớn (55 kDa) và 8 tiểu phần nhỏ

Th

(12 kDa) giống nhau. Các tiểu phần lớn được mã hóa bằng gen lục lạp

ai

(rbcL), cịn các tiểu phần nhỏ mã hóa bằng gen nhân. Riêng đối với tảo nâu

N

gu

và tảo đỏ đã phát hiện thấy gen lục lạp mã hóa cho tiểu phần nhỏ. Các gen

ye

rbcL ở thực vật bậc cao khơng có intron. Các gen này được dùng nhiều

n

trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại [29].

U

ni

- rpoB là một vùng gen nhỏ nằm trong lục lạp, đây được coi là vùng

rs

ve

gen mang nhiều vị trí Nu dễ biến đổi. Nghiên cứu của nhóm CBOL gợi ý
dùng gen rpoB cho các phân biệt ở cấp độ loài và dưới loài [29].

ity

- 18S-rDNA là vùng gen giải mã cho tiểu phần RNA ribosome, vùng gen
nằm trong nhân tế bào, có kích thước khoảng 1900 Nu. Các gen DNA
ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích
hợp để phân biệt các lồi gần gũi. Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các
đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S
và xen giữa các trình tự khơng mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers)
nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo
tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại hàng
nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể. Một trong
những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa
13


gen khơng tiến hố độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách
phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác
biệt giữa các loài khác nhau [29].
1.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể bằng kỹ thuật phân tử
Việc đánh giá ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tính đa
dạng di truyền và sinh thái ở cả hai mức độ quần thể và loài trong tự nhiên
có vai trị quan trọng góp phần đưa ra chiến lược và các giải pháp bảo tồn
loài một cách hữu hiệu. Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến mức độ suy giảm
tính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đến

quá trình phân cắt nơi sống [27]; [28]; [26]; [33]; [29]. Các tác giả này đã

Th

chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng

ai

cá thể thấp trong quần thể tại thời gian nơi sống bị phân cắt. Hệ số thụ phấn

gu

N

cao giữa các cá thể có quan hệ cận nỗn cũng là yếu tố làm suy giảm tính
đa dạng di truyền. Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi di

ye

truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau

n

giữa chúng. Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự

U

ni

phát triển mạnh mẽ, tạo ra cơng cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự

ve

sống ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng

ity

rs

được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh
vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền bảo tồn. Để nghiên cứu
đa dạng di truyền quần thể và loài bằng kỹ thuật DNA có các phương pháp
chủ yếu như RAPD, AFLP, RFLP, ISSR,...
Một trong những kỹ thuật mới nhất để nghiên cứu đa dạng di truyền ở cấp
độ loài và quần thể là kỹ thuật SSR vì các chỉ thị SSR có tính đa hình cao, đặc
hiệu cho từng lồi nghiên cứu. Kỹ thuật này đã được áp dụng nhiều trong các
nghiên cứu về trao đổi di truyền, cấu trúc di truyền và mối quan hệ sinh sản
trong các quần thể [20], [26].
Kỹ thuật SSR
Kỹ thuật SSR hay còn gọi là kỹ thuật microsatellite là những trình tự
14


nucleotide đặc biệt lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotide
ngắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh. Phương pháp truy tìm các phân đoạn
DNA đơn giản lặp lại do Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị
phân tử năm 1989 [37]. Genome sinh vật nhân thật có nhiều đoạn DNA lặp
lại, các đoạn dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài. Các chuỗi lặp lại này
thường từ 1- 6 nucleotide. Bản chất đa hình của SSR là nó có thể được sinh
ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của genome nhờ sử dụng hai mồi bổ trợ

với trình tự gần kề hai đầu vùng lặp lại. Giá trị của SSR là do nó sinh ra đa
hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp genome và có bản chất
đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Cho đến nay kỹ thuật này đang

thực vật [30].

ai

Th

được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật;

gu

N

Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thực hiện. SSR
là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao. Đây là chỉ thị

ye

n

phân tử giúp tránh được các nhầm lẫn trong phân tích genome và là một

ni

U

loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền và

ve

phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài.

như mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một lồi.

15

ity

rs

Nhược điểm của chỉ thị SSR là q trình thiết kế mồi tốn kém và hầu


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Tổng số 60 mẫu lá sâm ngọc linh thu ngẫu nhiên từ 25 cây sâm tại vườn
sâm Tăc-ngo, xã Trà Linh, tỉnh Quảng Nam và 35 mẫu sâm thu tại Măng ri,
Kon Tum (Hình 2.1). Các mẫu thu được được giữ trong phịng bì giấy và
bảo quản trong silicagel cho đến khi sử dụng.

ai

Th
n

ye

gu

N
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

ve

ni

U

Hình 2.1. Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh

rs

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và Di

ity

truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 12/2016 - 07/2018.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số
Các mẫu lá sâm ngọc linh được thu tại Quảng Nam và Kon Tum được
bảo quản trong silicagen cho đến khi thực hiện các nghiên cứu phân tử.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle và Doyle
(1987) [32], có cải tiến thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và di
truyền bảo tồn gồm các bước sau:
Bước 1: Cân 0,3g mẫu lá thu được. Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng bằng

cối chày sứ vô trùng, nghiền thành bột mịn, cho vào ống eppendorf 2ml.
16