(Luận văn thạc sĩ) Đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha Grushv.)

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----o0o----

NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH
(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hà Nội - 2018


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----o0o----

NGUYỄN THỊ HỒNG MAI

ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN QUẦN THỂ SÂM NGỌC LINH
(Panax vietnamensis Ha & Grushv.)

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. Nguyễn Thị Phương Trang

Hà Nội - 2018

LỜI CẢM ƠN
Luận văn được hoàn thành tại phòng Hệ thống học phân tử và Di
truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam, dưới sự hướng dẫn khoa học và giúp đỡ tận tình
của TS. Nguyễn Thị Phương Trang. Tác giả xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc
tới sự hướng dẫn của cô.
Trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn này, tác giả
đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ nhiệt tình về nhiều mặt của Ban lãnh
đạo Viện ST & TNSV,cán bộ phụ trách đào tạo của Viện, của TS. Đặng Tất
Thế, trưởng phòng Hệ thống học phân tử và Di truyền bảo tồn.
Chân thành cảm ơn các anh chị, bạn bè đồng nghiệp, ThS. Nguyễn
Giang Sơn, TS. Hồ Thị Loan, TS. Phạm Thế Cường, ThS. Lê Thị Mai Linh
đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, quan tâm, chỉ bảo những bước đi ban đầu trong
lĩnh vực nghiên cứu khoa học.
Cuối cùng, tác giả cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới những
người thân trong gia đình đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ trong suốt
quá trình hoàn thành luận văn.
Luận văn được hoàn thành từ nguồn kinh phí hỗ trợ từ đề tài hợp tác song
phương của Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam do TS. Nguyễn Thị
Phương Trang làm chủ nhiệm, mã số VAST.HTQT.Nga.10/15-16.
Tác giả xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài này là do chính tôi thực hiện, các số liệu thu
thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài không trùng với bất
kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Những thông tin tham khảo trong khóa

luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng.
Ngày

tháng

năm 2018

Học viên thực hiện
( Ký và ghi rõ họ tên)

Nguyễn Thị Hồng Mai


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... i
LỜI CAM ĐOAN ..................................................................................................ii
MỤC LỤC ........................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU ................................................... v
DANH MỤC CÁC BẢNG ..................................................................................vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ...................................................................................vii
MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 3

1.1.Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.) .................................................................. 3
1.2. Tổng quan về sâm ngọc linh......................................................................... 3
1.2.1. Đặc điểm hình thái .................................................................................. 3
1.2.2. Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh ................................................ 5
1.2.3. Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh.............. 5
1.2.4. Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh ....................................... 7
1.2.5. Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam....................................... 9

1.3. Phương pháp luận và cách tiếp cận........................................................... 10
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU ......................................................................................................... 16

2.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 16
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .............................................................. 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 16
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số ....................................................................... 16
2.3.2. Lựa chọn mồi SSR.................................................................................... 17
2.3.3. Phân tích số liệu SSR ........................................................................... 18
2.3.4. Thiết kế mồi đọc trình tự .................................................................... 19
2.3.5. PCR khuếch đại gen ........................................................................... 20
2.3.6. Điện di trên gel agarose...................................................................... 21
2.3.7. Kiểm tra khả năng bắt cặp bằng BLAST .......................................... 21


2.3.8. Đọc trình tự gen .................................................................................. 21
2.3.9. Xây dựng cây phát sinh chủng loại ................................................... 21
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 23
3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số ............................................................. 23
3.2. Lựa chọn mồi SSR .................................................................................... 23
3.3. Kết quả phân tích SSR – đặc điểm di truyền quần thể sâm ngọc linh .... 25
3.4. Kết quả khuếch đại gen từ các cặp mồi đặc hiệu ................................ 30
3.5. Kết quả phân tích trình tự gen – đặc điểm phân tử của các vùng gen
rbcL, rpoB, ITS và 18S của loài sâm ngọc linh. .............................................. 32
3.6. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số
loài trong chi Panax trên cơ sở phân tích trình tự hai vùng gen rbcL, ITS sơ đồ mối quan hệ di truyền của chúng. ........................................................... 47
3.7. Kết quả so sánh khả năng phân loại sâm ngọc linh đối với các loài chi
Panax khác của ba vùng gen nghiên cứu. ....................................................... 50
3.8. Kết quả đăng ký mã số các vùng gen nghiên cứu trên ngân hàng gen .. 55

KẾT LUẬN......................................................................................................... 56
KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 57
DANH MỤC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
CỦA TÁC GIẢ .................................................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 59
PHỤ LỤC ............................................................................................................ 65


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT, KÝ HIỆU
AFLP

Đa hình độ dài các đoạn DNA nhân chọn lọc (Amplified

Fragment Length Polymorphism)
bp

base pair

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CBOL

Consortium for the Barcode of Life

DNA

Deoxyribo Nucleic Acid

ME

Phương pháp Minimum Evolution Method

MP

Phương pháp Maximum Parasimony Method

NJ

Phương pháp Neighbor Joining

PCR

Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

RAPD

Đa hình các đoạn DNA khuyếch đại ngẫu nhiên (Random
Amplified Polymorphic DNA)

RFLP

Đa hình độ dài các đoạn DNA giới hạn (Restriction Fragment
Length Polymorphism)

SSR

Trình tự lặp đơn giản (Simple Sequence Repeats)

UPGMA

Unweighted Pair Group Method Analysis

VQG

Vườn Quốc Gia


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Trình tự 11 cặp mồi SSR dùng cho phân tích đa dạng di truyền ...... 17
Bảng 2.2. Bảng trình tự 5 cặp mồi dùng trong khuếch đại và đọc trình tự gen. 20
Bảng 2.3: Danh sách các loài/thứ trên Genbank sử dụng trong nghiên cứu. .... 22
Bảng 3.1: Thông số đa dạng di truyền loài sâm ngọc linh dựa trên phân
tích 4 chỉ thị SSR.............................................................................................. 26
Bảng 3.2. Kết quả so sánh các Nu sai khác trên vùng gen rbcL (gồm rbcLa và
rbcLc) giữa sâm ngọc linh và các loài khác thuộc chi Panax. ....................... 37
Bảng 3.3. Khoảng cách di truyền gen rbcL giữa loài sâm ngọc linh (phía trên
bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài
/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax. ........................................................... 44
Bảng 3.4. Khoảng cách di truyền gen rpoB giữa loài sâm ngọc linh ( phía trên
bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài
/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax ............................................................ 44
Bảng 3.5. Khoảng cách di truyền vùng gen ITS giữa loài sâm ngọc linh ......... 45
(phía trên bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh
với 9 loài /thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax ........................................... 45
Bảng 3.6. Khoảng cách di truyền mồi 18S giữa loài sâm ngọc linh (phía trên
bên trái) và số lượng nucleotide sai khác (phía dưới bên phải) so sánh với 9 loài
/thứ có quan hệ gần gũi thuộc chi Panax. ........................................................... 46

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh

4

Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín

4

Hình 2.1. Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh

15

Hình 3.1: Kiểm tra DNA tổng số bằng điện di trên gel agarose 1%

22

Hình 3.2. Một số hình ảnh alen ghi nhận khi phân tích SSR của 4
mồi PG - 29, PG - 668, PG -1419 và PG - 1481

23

Hình 3.3: Kiểm tra sản phẩm PCR gen ITS; rpoB; 18S bằng điện di
trên gel agarose 1%

30

Hình 3.4: Kiểm tra sản phẩm PCR gen rbcLa; rbcLc bằng điện di
trên gel agarose 1%.

30

Hình 3.5. Ví dụ về hình ảnh các peak trong giải trình tự

31

Hình 3.6. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLa với các loài
Panax trên ngân hàng gen.

35

Hình 3.7. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rbcLc với các loài
Panax trên ngân hàng gen.

36

Hình 3.8. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen rpoB với các loài
Panax trên ngân hàng gen

39

Hình 3.9. Kết quả so sánh trình tự nucleotide gen ITS với các loài
Panax trên ngân hàng gen

41

Hình 3.10: Sơ đồ hình cây (NJ) mối quan hệ di truyền của sâm ngọc
linh với 9 loài khác trong chi Panax dựa trên phân tích trình tự vùng
gen ITS và rbcL

48

Hình 3.11. Thứ tự ghép nối các đoạn gen nghiên cứu

50

Hình 3.12. Kết quả so sánh phân loại chín loài chi Panax dựa trên so
sánh từng vùng gen (rpoB, rbcL, ITS) và sự kết hợp của chúng.

53

Hình 3.13. Sơ đồ mối quan hệ di truyền của chín loài thuộc chi
Panax phân tích dựa trên sự kết hợp trình tự gen rbcL và ITS.

54


MỞ ĐẦU
Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.) đã được xác định
là một cây thuốc quý về giá trị sử dụng cũng như giá trị nguồn gen, được
xếp vào một trong bốn cây sâm quý nhất trên thế giới do có chứa nhiều
thành phần saponin, hàm lượng acid amin, các chất khoáng vi lượng hơn
hẳn những loài sâm khác. Tuy nhiên, việc khai thác quá mức và phá hủy
vùng phân bố tự nhiên đã dẫn đến sự tuyệt chủng ngoài tự nhiên của sâm
ngọc linh. Hiện loài này chỉ còn tồn tại ở một số vườn trồng tại các khu bảo
tồn của tỉnh Quảng Nam và Kon Tum. Sâm ngọc linh đã được đưa vào sách
đỏ Việt Nam, danh lục của IUCN và Nghị định 32/2006/NĐ-CP của Chính
phủ. Ngành Y tế đã hướng chọn sâm ngọc linh làm cây thuốc xây dựng sản
phẩm quốc gia về dược liệu. Ngày 18/7/2012, chính phủ đã có Quyết định số

936/QĐ-TT phê duyệt quy hoạch tổng thể phát triển kinh tế - xã hội vùng
Tây Nguyên đến năm 2020, trong đó phát triển cây sâm ngọc linh trở thành
cây đặc sản quốc gia. Những nghiên cứu về di truyền quần thể giúp các nhà
khoa học và các nhà chiến lược có cái nhìn tổng thể về thực trạng di truyền
của các quần thể sâm ngọc linh, từ đó có những chiến lược hợp lý trong
việc bảo tồn và phát triển bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam.
Các nghiên cứu ở cấp độ phân tử còn giúp xác định được những sai khác về
mặt di truyền của loài sâm ngọc linh so với các loài Panax khác, làm cơ sở
cho việc phân loại và giám định các mẫu sâm ngọc linh.
Xuất phát từ tình hình thực tế này, luận văn tập trung nghiên cứu đặc
điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại Quảng Nam và Kon
Tum, đồng thời kiểm tra sự sai khác di truyền của bốn vùng gen gồm hai
vùng gen nhân: 18S, ITS và hai vùng gen lục lạp: rbcL và rpoB của mẫu
sâm ngọc linh, so sánh với một số loài Panax khác.
Mục tiêu cụ thể:
- Xác định đặc điểm di truyền quần thể của hai quần thể sâm ngọc linh thu
tại tỉnh Quảng Nam và Kon Tum.
- Đánh giá mối quan hệ di truyền của sâm ngọc linh với một số loài Panax
1


khác trên cơ sở giải mã trình tự vùng gen rbcL, rpoB, 18S và ITS, đặc điểm
phân tử của các vùng gen này, đồng thời so sánh khả năng phân loại của
bốn vùng gen nói trên trong việc phân biệt loài sâm ngọc linh với một số
loài Panax khác.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Luận văn cung cấp cơ sở khoa học cho các nhà quản lý cập nhật
thông tin về hiện trạng di truyền của quần thể sâm ngọc linh tại Quảng
Nam và Kon Tum.
Kết quả của luận văn là cơ sở khoa học giúp cho công tác bảo tồn và

chọn giống có những chiến lược hợp lý trong công tác bảo tồn và phát triển
bền vững loài sâm quý hiếm này của Việt Nam.
Kết quả của luận văn góp phần chọn lọc được vùng gen hữu hiệu
(chỉ thị phân tử) cho công tác nghiên cứu khoa học và phân loại loài sâm
ngọc linh của Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
- Lựa chọn mồi SSR phù hợp với loài sâm ngọc linh của Việt Nam.
- Đánh giá đặc điểm di truyền của hai quần thể sâm ngọc linh thu tại
tỉnh Quảng Nam và Kon Tum bằng kỹ thuật SSR.
- Kiểm tra đặc điểm phân tử của bốn vùng gen rpoB, ITS, rbcL và
18S, so sánh khả năng phân loại của bốn vùng gen này trong việc phân biệt
loài sâm ngọc linh của Việt Nam; đăng ký số hiệu genbank.

2


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về chi Sâm (Panax L.)
Chi sâm (Panax L.) là một chi nhỏ trong họ Ngũ gia bì (Araliaceae). Toàn
bộ chi sâm (Panax L.) trên thế giới đã biết chắc chắn có 11 loài và 1 dưới loài
(thứ -var.) [21]. Sự phân bố của chi Panax L. trên thế giới cho thấy chúng chỉ
xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của
Bắc Mỹ bao gồm bắc Hoa Kỳ và Tây Nam Canada (có 2 loài Panax
quinquefolius và Panax trifoliatus). Vùng Đông Bắc Á có 2 loài Panax
ginseng và Panax japonica. Trung tâm phân bố của chi Panax L. có thể từ
vùng Tây Nam của Trung Quốc lan tỏa xuống phía Bắc của Việt Nam. Thực
chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và
Lào Cai (Việt Nam). Ở đây đang có tới 7 loài và thứ (dưới loài) mọc hoàn
toàn tự nhiên. Hai loài nhập trồng là Panax notoginseng nhập từ Bắc Mỹ và
Panax pseudoginseng (không tìm thấy trong hoang dại nhưng giả thiết có

nguồn gốc từ vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài
gần gũi nào đó). Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi sâm (Panax L.)
của thế giới. Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (Panax notoginseng; Panax
quinquefolius và Panax trifoliatus). Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi
Panax L. là loài sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) ở miền Trung của Việt
Nam, tại 14°15’ vĩ độ Bắc. Chính vì vậy sâm ngọc linh được coi là loài đặc
hữu hẹp của miền Trung Việt Nam [12].
1.2. Tổng quan về sâm ngọc linh
1.2.1. Đặc điểm hình thái
Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)[36] là cây thân thảo,
sống nhiều năm. Thân rễ có đường kính 3.5cm, không có rễ phụ dày dự trữ,
đôi khi ở một số cây phần cuối thân rễ có củ gần hình cầu, đường kính đến
5cm. Thân cao từ 40 cm – 60 cm, rỗng, lá mọc vòng, thường có 4 (ít khi 3, 5,
6). Lá kép chân vịt có 5 (ít khi 6, 7) lá chét, lá dài 7 – 12 cm (ít khi 15 cm). Lá
3


chét trên cùng hình trứng ngược hoặc hình mũi mác, dài 8 – 14 cm, rộng 3 – 5
cm, đầu lá thường nhọn, mũi nhọn kéo 1.5 - 2cm, góc lá hình nêm, mép lá có
răng cưa nhỏ đều [12], [14], [25] (Hình 1.1).

Hình 1.1: Hình ảnh cây sâm ngọc linh
(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)
Sinh thái: Sâm ngọc linh mọc dưới tán rừng ẩm, nhiều mùn, thích hợp với
nhiệt độ ban ngày từ 20 - 25°C, ban đêm 15 - 18°C, sâm ngọc linh có thể
sống rất lâu, thậm chí trên 100 năm, sinh trưởng khá chậm [25].
Công dụng: Bộ phận dùng làm thuốc chủ yếu là thân rễ, củ và ngoài ra
cũng có thể dùng lá và rễ con [25].
Sinh học: Vào đầu tháng giêng hàng năm, cây sâm xuất hiện chồi mới sau
mùa ngủ đông, thân khí sinh lớn dần lên thành cây sâm trưởng thành, từ tháng

4 đến tháng 6, cây nở hoa và kết quả, tháng 7 bắt đầu có quả chín và kéo dài
đến tháng 9. Khi quả chín, vỏ quả chuyển từ màu xanh sang vàng lục rồi đỏ
cam với chấm đen lớn chiếm 1/4 đến 1/5 xuất hiện ở đỉnh quả (Hình 1.2).

Hình 1.2: Hình ảnh hạt sâm ngọc linh khi chín
(Ảnh chụp tại vườn Sâm Tac - ngo, Nam Trà My, Quảng Nam - 2016)
4


Vào khoảng cuối tháng 10, phần thân khí sinh tàn lụi dần, lá rụng để lại
một vết sẹo ở đầu củ sâm và bắt đầu giai đoạn ngủ đông đến tháng 12. Ngay
trong quá trình tàn lụi, từ đầu mầm thân rễ nằm sát hoặc dưới mặt đất hình
thành một chồi thân mới. Các chồi này tồn tại dưới dạng chồi ngủ trong suốt
3-4 tháng mùa đông và sẽ mọc lên vào mùa xuân năm sau để tiếp tục một
chu trình sinh trưởng phát triển mới. Căn cứ vào vết sẹo trên đầu củ mà
người ta có thể nhận biết cây sâm bao nhiêu tuổi. Phải ít nhất từ 3 năm tuổi
tức trên củ có một sẹo mới có thể khai thác, khuyến cáo là trên 5 năm tuổi
[2], [12]. Mùa đông cũng là mùa thu hoạch tốt nhất phần thân rễ của sâm.
1.2.2. Phân bố tự nhiên của cây sâm ngọc linh
Cho đến nay, sâm ngọc linh mới chỉ phát hiện thấy ở cao nguyên trung
phần, trong đó điểm phân bố tập trung vốn có và quan trọng nhất là núi
Ngọc Linh. Cụ thể là ở các xã Tê Xăng, Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông; xã
Mường Hoong, Ngọc Linh, huyện Đăk Glei (tỉnh Kon Tum) và xã Trà
Cang, Trà Linh, Trà Nam, huyện Nam Trà My (tỉnh Quảng Nam) [12]. Cây
sâm do Phạm Hoàng Hộ phát hiện ở núi Lang Biang (tỉnh Lâm Đồng) năm
1970 cũng là sâm ngọc linh. Như vậy, nếu tính về “tính nguyên thuỷ” của
nó thì sâm ngọc linh đã có mặt ở 3 vùng núi khác nhau, tạm thời cho rằng
thuộc 2 điểm phân bố (dãy Ngọc Linh và Lang Biang). Cả 2 khối núi này
đều có độ cao trên 1.500 m. Điểm phát hiện có sâm ngọc linh mọc tự nhiên
đều vào khoảng 1.800 - 2.200 m [5], [25], [21].

1.2.3. Tầm quan trọng, giá trị, thành phần hoá học của sâm ngọc linh
1.2.3.1. Tầm quan trọng và giá trị của sâm ngọc linh
Tất cả những loài thuộc chi Panax đều có giá trị làm thuốc, một số loài
của chi này đã trở thành những cây thuốc nổi tiếng, không chỉ trong phạm
vi của nền y học cổ truyền phương Đông mà trên toàn thế giới như nhân
sâm (Panax ginseng); giả nhân sâm (Panax pseudoginseng); tam thất
(Panax notoginseng) và sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)
[6], [3], [9], [21]. Ở Việt Nam, ngay từ những năm kháng chiến chống
5


Pháp (1952 - 1953) nhiều cán bộ cách mạng hoạt động nằm vùng ở Quảng
Nam đã được đồng bào chỉ cho cây thuốc này được coi như một thứ thần
dược để phòng thân những khi đau yếu, dùng để chữa cho người đau ốm
nặng, người bị rắn cắn và các bệnh thông thường như đau bụng, cầm máu
vết thương,… [2], [3], [6], [11], [21]. Theo quan điểm hóa phân loại và
dược lý học, những công trình nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế
giới đã chia các loài thuộc chi Panax thành 2 nhóm chính:
Nhóm 1: gồm các loài hiện đã được phát triển trồng trọt gồm: nhân sâm
(Panax ginseng), sâm mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax
notoginseng),… có bộ phận dưới mặt đất là một rễ củ dạng cà rốt phát triển
và chứa các Saponin có khung thuộc nhóm dammaran.
Nhóm 2: gồm các loài mọc hoang như Panax japonicas, Panax
zingiberensis, Panax stipuleanatus,… với bộ phận thân rễ dưới đất phát triển
theo hướng nằm ngang, chứa Saponin có khung cấu tạo thuộc nhóm olean [3].
Từ năm 1985 đến năm 2000, thông qua sự hợp tác quốc tế hiệu quả,
đặc biệt với các nhà khoa học Ba Lan, Nhật Bản đã cho thấy sâm ngọc linh
có 52 hợp chất saponin, trong đó có 24 saponin đã được xác định là có cấu
trúc hoàn toàn mới, lần đầu tiên được công bố. Khi so sánh với nhóm sâm
trồng (nhóm 1) có giá trị trên thế giới như nhân sâm (Panax ginseng), sâm

mỹ (Panax quinquefolius), tam thất (Panax notoginseng),… thì thành phần
saponin của sâm ngọc linh rất giống với 3 loài nói trên, nhưng hàm lượng
lại cao hơn nhiều [3], [11].
1.2.3.2. Thành phần hóa học của sâm ngọc linh
Từ năm 1974 – 1990, Nguyễn Thới Nhâm và cộng sự đã nghiên cứu nhân
sâm Việt Nam, so sánh với nhân sâm Triều Tiên (Panax ginseng), nhân sâm
Nhật Bản (Panax japonicus) và nhân sâm Hoa Kỳ (Panax quinquefolium).
Kết quả là bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKIM) đã phát hiện trong
Panax vietnamensis 15 vết saponin có giá trị Rf (Rf: Hệ số di chuyển) và mầu
sắc tương ứng với 12 hợp chất saponin của Panax ginseng [13]. Chi tiết hơn
nữa, trong Panax vietnamensis có hàm lượng cao nhất saponin kiểu damarane
6


(7.58%), trong đó saponin thuộc diol và triol có tỷ lệ 32% và một lượng nhỏ
saponin của axit oleanolic[13]. Điều này trái với quy luật chung là thông
thường các cây nhân sâm cho thân rễ phát triển thì thường chứa lượng saponin
của axit oleanolic và saponin nhóm damarane [8], [11]. Cũng là lần đầu tiên
trên thế giới, người ta chiết được một lượng lớn majonozit R2 và ocotillol
saponin trong cùng một loại Panax (chỉ riêng hai chất này đã chiếm 4.34%)
gấp 43 lần hàm lượng majonozit và ocotillol saponin cao nhất có trong các
loài chi Panax [16]. Ocotillol saponin đã trở thành một hợp chất cần chú ý có
thể đưa thành tiêu chuẩn để phân loại hóa học vì nó có thể ảnh hưởng đến một
số tác dụng mang tính đặc thù của Panax vietnamensis. Sự có mặt của
damarane saponin kiểu ocotillol cũng còn làm cho sâm ngọc linh khác với
nhân sâm Triều Tiên vì cho tới nay người ta chưa tìm thấy ocotillol trong
nhân sâm Triều Tiên. Năm 1994, Nguyễn Minh Đức còn chứng minh nhân
sâm của Việt Nam có hàm lượng saponin damarane cao nhất (12 - 15%) so
với nhân sâm khác chỉ chứa 10% và số lượng saponin nhiều nhất (49%) so với
26% trong nhân sâm triều tiên [9]. Ngoài những saponin nói trên, trong nhân

sâm của Việt Nam còn chứa các polyacetylen, axit béo, axit amin, gluxit, tinh
dầu và một số yếu tố vi lượng [11].
Như vậy, sâm ngọc linh không những đặc biệt về mặt phân bố (là loài duy
nhất có phấn bố tại 14°15’ vĩ độ Bắc, giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi
Panax L.) mà còn độc đáo về cấu tạo hoá học bởi tuy là loài sâm thuộc nhóm
2 với bộ phận thân rễ thuộc dạng khí sinh, phát triển theo hướng nằm ngang
nhưng thành phần hoá học lại chứa các saponin chủ yếu thuộc nhóm
dammaran (giống các loài sâm của nhóm 1), đặc biệt hơn lại có chứa một số
saponin đặc trưng mà các loài sâm khác trên thế giới không có.
1.2.4. Công trình nghiên cứu của loài sâm ngọc linh
Ở Việt Nam, cho đến nay, các công trình khoa học nghiên cứu về sâm
ngọc linh khá đa dạng, ngoài những nghiên cúu cơ bản tập trung vào điều
tra, phân loại, xác định vùng phân bố thì cũng đã có nhiều nghiên cứu về

7


thành phần hoá học, thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan, giải mã hệ gen lục
lạp…có thể liệt kê một số các công trình đáng chú ý như sau:
- Trần Lê Quân và cs (2002): tách chiết, majonoside R2, Triterpen
Saponin từ cây sâm việt nam (Panax vietnamensis) và thử nghiệm hoạt tính
bảo vệ gan. Nghiên cứu cho thấy cao chiết MeOH của củ sâm việt nam có
hoạt tính bảo vệ gan in vitro trên mô hình gây độc cho tế bào gan bằng Dgalactosamine (D-GaLN)/yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-anpha) .
Nguyễn Thị Thu Hương và cs (1999): nghiên cứu về tác dụng dược lý của
sâm việt nam, trong đó tập trung vào tác dụng kích thích miễn dịch chống
căng thẳng, trầm cảm [48], [5], [11], [18].
- Nguyễn Thới Nhâm và cs (1993) Nghiên cứu về dược liệu học và
hoá học cây sâm Việt Nam [16].
- Loạt công trình của PGS.TS. Dương Tấn Nhựt (2010, 2011, 2014,
2015) về nhân giống vô tính Sâm ngọc linh [13], [14].

- Cụm công trình của Viện Dược Liệu trong khuôn khổ chương trình
bảo tồn nguồn gen đã khoanh vùng được khu vực phân bố, đặc điểm sinh
thái, hình thái, lập bản đồ quy hoạch vùng trồng sâm (các tác giả, Lê Minh
Thảo [8], [18],…)
- Phan Kế Long và cs (2014) đã sử dụng vùng gen ITS để đánh giá sự sai
khác di truyền giữa loài sâm ngọc linh và mẫu sâm thu được tại Phong Thổ
Lai Châu, cũng dựa trên trình tự gen matK và ITS, mẫu sâm thu tại Lai Châu
đã được xác định tên khoa học là Panax vietnamensis var. fuscidiscus, là một
thứ của loài Panax vietnamensis [9, 40].
- Nguyễn Thị Phương Trang và cs (2011) đã sử dụng vùng gen ITS để
đánh gía mối quan hệ di truyền của loài sâm việt nam, sâm lai châu với các
loài khác trong chi Panax [22]. Hay nhóm nghiên cứu của Đặng Tất Thế,
Nguyễn Thị Phương Trang (Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật) thực
hiện một số hợp tác nghiên cứu với nhóm nghiên cứu của Viện sỹ Yuri
Zhuralev và TS. Galina D. Reunova (Viện Sinh học thỗ nhưỡng Viễn Đông,
8


Viện Hàn Lân khoa học Liên Bang Nga) về phân bố và di truyền của loài
sâm việt nam và sâm nga bằng kỹ thuật AFLP và SSR [34, 35].
- Trong đề tài nghiên cứu về đa dạng di truyền chi sâm, nhóm nghiên
cứu của Trần Văn Tiến, Lê Ngọc Triệu, và cs (2016) đã thực hiện “Đánh giá
di truyền quần thể loài tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai) bằng chỉ
thị ISSR. Nhóm nghiên cứu của GS. Nông văn Hải (2017) (Viện nghiên cứu
hệ gen-Viện Hàn Lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam) nghiên cứu về giải
mã hệ gen lục lạp sâm ngọc linh. Nhóm nghiên cứu của TS. Lê Hùng Lĩnh
(2017)-(Viện Di truyền Nông nghiệp) thực hiện nghiên cứu nuôi cấy mô và
xác định gen lục lạp đặc hiệu của một số loài trong chi Panax.
1.2.5. Hiện trạng của loài sâm ngọc linh ở Việt Nam
Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện nay, chi Panax có chắc chắn 5 loài,

trong đó có 2 loài nhập trồng là tam thất (Panax notogineng) và nhân sâm
(Panax ginseng) [5]. Ba loài mọc tự nhiên và đang là đối tượng bảo tồn là sâm
vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.), tam thất hoang (Panax stipuleanatus
Tsai et Feng) và đặc biệt sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha & Grushv.)
là loài đặc hữu hẹp của miền Trung Việt Nam, có phân bố tự nhiên ở các
huyện Tu Mơ Rông, huyện Đăk Glei (tỉnh Kom Tum), huyện Nam Trà My,
huyện Phước Sơn (tỉnh Quảng Nam), trên vùng núi Ngọc Linh độ cao trên
1500 m. Tuy nhiên, hiện tại loài này đã trở nên cực hiếm ngoài tự nhiên do
tình trạng khai thác cạn kiệt trong nhiều năm cộng với việc đốt nương làm rẫy
nên diện tích rừng tự nhiên bị thu hẹp. Hiện, sâm ngọc linh đã được đưa vào
danh lục đỏ của IUCN (2003) và danh sách các loài hạn chế khai thác và sử
dụng vì mục đích thương mại (Nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 31/03/2006
về quản lý thực vật rừng, động vật rừng nguy cấp quý hiếm), theo Sách đỏ
Việt Nam (2007), sâm ngọc linh được xếp vào hạng EN Ala, c, d, BI + 2b, c,
e [1]. Sâm ngọc linh chủ yếu tập trung tại 2 điểm bảo tồn là Chốt Sâm (xã
Măng Ri, huyện Tu Mơ Rông, tỉnh Kon Tum) và Trạm Dược Liệu Trà Linh
(xã Trà Linh, huyện Nam Trà My, tỉnh Quảng Nam) với tổng diện tích trồng
9


khoảng 10 hecta [6]. Tuy nhiên, với quyết định số 936/QĐ-TT ngày
18/7/2012 của thủ tướng chính phủ thì kế hoạch đến năm 2020, diện tích trồng
sâm ngọc linh sẽ được tăng lên đến khoảng 200ha.
1.3. Phương pháp luận và cách tiếp cận
Trong những năm gần đây, kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng
rộng rãi, có hiệu quả trong nghiên cứu tiến hoá, phân loại và đa dạng di truyền
quần thể sinh vật. Phương pháp chủ yếu dựa trên kỹ thuật phân tích DNA, đặc
biệt đối với lĩnh vực phân loại học và di truyền phân tử. Việc sử dụng các chỉ
thị DNA để định danh loài đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập
trung nghiên cứu và đã có nhiều đóng góp, phát hiện đáng kể [10], [17], [22],

[24], [27], [30], [40], [41], [42], [53]. Xác định loài bằng chỉ thị DNA có độ
chính xác cao và đặc biệt hữu dụng với các loài gần gũi mà những quan sát
hình thái, sinh trưởng, phát triển chưa đủ cơ sở để phân biệt. Vì thế chỉ trong
vài thập kỷ, cơ sở dữ liệu gen (Genbank, 2007) của thế giới đã lưu giữ trên 70
triệu trình tự DNA với gần 90 tỷ nucleotide. Đây là nguồn dữ liệu có giá trị
trong sinh học bảo tồn (Conservation biology) vì bốn lý do chính là: (1) số liệu
về trình tự các nucleotide rất có giá trị trong việc xác định các đơn vị bảo tồn
giúp cho đánh giá sắp xếp phân loại, nhất là bậc loài và dưới loài; (2) số liệu
trình tự nucleotide đảm bảo độ chính xác cao nên tạo cơ sở khoa học tốt nhất
cho bảo tồn đa dạng di truyền, nghiên cứu di truyền quần thể (population
genetics), vì nó bộc lộ rõ các biến đổi di truyền ở trong và giữa các quần thể,
giữa các cá thể, giữa các cha mẹ và con cái...; (3) kết quả phân tích DNA cho
phép xác định chính xác loài, quần thể cho đến tận cá thể từ các mẫu vật không
còn nguyên vẹn mà vẫn xác định thấy hiện tượng tạp lai giữa các loài, các quần
thể địa lý…; và (4) kết quả nghiên cứu DNA không bị ảnh hưởng vào bất cứ
yếu tố khách quan do môi trường hay con người gây ra [10].
Vì các giá trị khoa học nêu trên, đến nay kỹ thuật sinh học phân tử đang là
công cụ hỗ trợ đắc lực cho các nhà nghiên cứu trong việc phát hiện các loài
mới, giải quyết các mối nghi ngờ về vị trí phân loại, đánh giá đầy đủ về tính đa
dạng di truyền, quan hệ chủng loại và mức độ tiến hoá của nhiều loài động thực
10


vật và vi sinh vật [37]. Các kết quả nghiên cứu ở mức độ DNA đã và đang góp
phần đánh giá tính đa dạng sinh học, định hướng khoa học cho việc bảo tồn và
khai thác một cách hợp lý nguồn tài nguyên sinh vật trên thế giới cũng như ở
Việt Nam. Sâm ngọc linh là loài dược liệu quý có tác dụng tăng cường hệ miễn
dịch và ngăn ngừa ung thư… Đến nay quần thể sâm ngọc linh tự nhiên bị khai
thác mạnh mẽ, dẫn tới có nguy cơ cạn kiệt do nhu cầu sử dụng loại dược liệu
này ngày càng cao. Công tác bảo tồn và phát triển bền vững loại dược liệu này

ở Việt Nam trở nên cần thiết và cấp bách. Vì vậy, nghiên cứu đánh giá tính đa
dạng di truyền, làm cơ sở cho công tác bảo tồn nguồn gen cho loài sâm ngọc
linh cần được tập trung thực hiện. Bên cạnh đó, việc phát triển bộ mã vạch phân
tử cũng cần được nghiên cứu để giúp góp phần phân loại/giám định chính xác
sâm ngọc linh và các loài sâm khác thuộc chi nhân Sâm.
1.3.1 Phương pháp phân loại học phân tử
1.3.1.1. Ưu điểm của việc ứng dụng nghiên cứu phân tử trong phân loại học
Một trong những phương pháp đáng tin cậy nhất hiện nay trong việc xác
định mối quan hệ giữa các loài là phân tích trình tự DNA, bởi vật liệu di truyền
là duy nhất cho mỗi cá thể bất chấp hình dạng ngoài của chúng và ít bị ảnh
hưởng bởi tuổi, điều kiện sinh lý, yếu tố môi trường, thu hoạch, bảo quản và
chế biến. DNA chiết từ bất cứ bộ phận nào đều mang cùng thông tin di truyền.
DNA chiết thì ổn định và có thể giữ ở -20°C trong thời gian dài (khoảng 3-5
năm), do đó loại bỏ sự giới hạn về thời gian trong phân tích, đặc biệt chỉ cần sử
dụng một lượng ít mẫu cũng có hiệu quả [8], [12], [26].
1.3.1.2. Sử dụng hệ gen lục lạp trong nghiên cứu phân loại ở thực vật
Lục lạp là bào quan nằm trong tế bào chất của thực vật và tảo (algae),
chúng có chứa DNA riêng. DNA lục lạp có từ 102 – 104 bản sao trong mỗi tế
bào. Lục lạp có chứa chất diệp lục (chlorophyl) và là nơi thực hiện quá trình
quang hợp của cây. Hệ gen lục lạp thường được sử dụng cho phân loại ở thực
vật do đặc tính di truyền theo dòng mẹ, không bị tái tổ hợp di truyền cho thế
hệ sau và tốc độ đột biến cũng khá cao. Hệ gen lục lạp được các nhà phân loại
11


học phân tử đánh giá chúng là sự tích lũy của các đột biến theo thời gian, do
vậy sẽ phản ánh đúng mức độ tiến hóa giữa các loài. Hệ gen lục lạp (cpDNA)
thực chất là một phân tử DNA dạng vòng, sợi đơn, mỗi gen thường không lặp
lại. Không giống như các gen nhân, các gen lục lạp chỉ mã hóa cho các
protein cần thiết cho chức năng quang hợp và bộ máy biểu hiện những protein

này. Vùng DNA không mã hóa trên hệ gen lục lạp là rất ít.
Hệ gen lục lạp có kích thước từ 120 kb – 220kb, kích thước này thay đổi
do có sự tồn tại của 2 vùng lặp lại ngược chiều nhau, tách hệ gen lục lạp thành
2 vùng (vùng lớn LSC và vùng nhỏ SSC). Mặc dù phần lớn DNA lục lạp đều
mang số lượng gen như nhau, tuy nhiên đôi khi một số gen di trú vào DNA
nhân và biến mất khỏi hệ gen lục lạp. Các gen lục lạp có tốc độ đột biến thấp
hơn từ 4 – 5 lần so với gen trong nhân, nhưng nhanh hơn khoảng 3 lần so với
DNA ty thể thực vật và thường xuyên được sử dụng trong nghiên cứu phân
loại [45]. Các nghiên cứu cấu trúc phân tử hệ gen lục lạp ở hầu hết các loài
thực vật bậc cao cho thấy tỷ lệ thay thế trong hệ gen lục lạp thấp hơn rất nhiều
so với hệ gen nhân và chúng cũng có mức tái tổ hợp rất thấp, di truyền theo
một dòng [54]. Một số vùng gen lục lạp thường được sử dụng trong nghiên
cứu hệ thống học phân tử thực vật hiện nay bao gồm: matK, rbcL, psbA –
trnH, rpoB,… tất cả các gen thuộc hệ gen lục lạp thường có mức độ biến đổi
không lớn hơn 2% giữa các loài lân cận [29].
1.3.1.3. DNA barcoding và ứng dụng của nó
DNA barcoding là đoạn DNA ngắn (thường từ 200-500 bp) đặc trưng cho
loài/nhóm loài, dễ khuếch đại và bền vững. Hiện nay DNA barcoding đã được
sử dụng rất nhiều trong phân loại và giám định các loài động thực vật. Phương
pháp này dựa trên nguyên tắc so sánh các vùng trình tự DNA ngắn có tốc độ
tiến hóa nhanh để định loại các loài. Phương pháp này có thể áp dụng cho tất
cả các đối tượng sinh vật khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật…
Ở thực vật, các vùng DNA mã vạch được sử dụng để phân loại thường là
12


các trình tự thuộc hệ gen lục lạp và hệ gen nhân…[39]; [55]; [10]. Trên thế giới
việc sử dụng phương pháp mã vạch DNA để phân biệt các loài đã phổ biến và
thông dụng từ những thập niên 90 của thế kỷ trước. Một số vùng gen nhân và
lục lạp thường dùng trong phân loại/giám định thực vật gồm ITS, 18S, matK,

rbcL, rpoB, psbA – trnH …[29]; [38], [40]; [42].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 2 vùng gen lục lạp gồm rbcL,
rpoB và 2 vùng gen nhân gồm 18S và ITS để đánh giá khả năng phân biệt
loài sâm ngọc linh với một số loài Panax khác.
- RbcL là vùng gen đệm trong lục lạp dài khoảng 1500 bp mã hoá cho
protein Rubico. Protein này có 8 tiểu phần lớn (55 kDa) và 8 tiểu phần nhỏ
(12 kDa) giống nhau. Các tiểu phần lớn được mã hóa bằng gen lục lạp
(rbcL), còn các tiểu phần nhỏ mã hóa bằng gen nhân. Riêng đối với tảo nâu
và tảo đỏ đã phát hiện thấy gen lục lạp mã hóa cho tiểu phần nhỏ. Các gen
rbcL ở thực vật bậc cao không có intron. Các gen này được dùng nhiều
trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại [29].
- rpoB là một vùng gen nhỏ nằm trong lục lạp, đây được coi là vùng
gen mang nhiều vị trí Nu dễ biến đổi. Nghiên cứu của nhóm CBOL gợi ý
dùng gen rpoB cho các phân biệt ở cấp độ loài và dưới loài [29].
- 18S-rDNA là vùng gen giải mã cho tiểu phần RNA ribosome, vùng gen
nằm trong nhân tế bào, có kích thước khoảng 1900 Nu. Các gen DNA
ribosome (rDNA) mang trình tự vừa có tính bảo thủ vừa có tính đa dạng thích
hợp để phân biệt các loài gần gũi. Trong tế bào, rDNA được sắp xếp như các
đơn vị được lặp lại ngẫu nhiên bao gồm DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S
và xen giữa các trình tự không mã hóa ITS1, ITS2 (internal transcribed spacers)
nằm ở hai bên sườn của vùng 5,8S. Vùng mã hóa của ba gen rDNA được bảo
tồn cao hơn hai vùng ITS. Nhìn chung các đơn vị rDNA được lặp lại hàng
nghìn lần và được sắp xếp tập trung tại vùng lớn trên nhiễm sắc thể. Một trong
những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa
13


gen không tiến hoá độc lập, thay vào đó tất cả các đơn vị tiến hoá một cách
phối hợp nhờ vậy mà rDNA đạt mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác
biệt giữa các loài khác nhau [29].

1.4. Nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể bằng kỹ thuật phân tử
Việc đánh giá ảnh hưởng của sự phân cắt nơi sống, điều tra tính đa
dạng di truyền và sinh thái ở cả hai mức độ quần thể và loài trong tự nhiên
có vai trò quan trọng góp phần đưa ra chiến lược và các giải pháp bảo tồn
loài một cách hữu hiệu. Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến mức độ suy giảm
tính đa dạng di truyền trong và giữa các quần thể thực vật liên quan đến
quá trình phân cắt nơi sống [27]; [28]; [26]; [33]; [29]. Các tác giả này đã
chỉ ra rằng suy giảm tính đa dạng di truyền xảy ra liên quan đến số lượng
cá thể thấp trong quần thể tại thời gian nơi sống bị phân cắt. Hệ số thụ phấn
cao giữa các cá thể có quan hệ cận noãn cũng là yếu tố làm suy giảm tính
đa dạng di truyền. Phân cắt nơi sống có thể hạn chế mức độ trao đổi di
truyền giữa các quần thể bị cô lập và làm tăng mức độ di truyền khác nhau
giữa chúng. Trong vài thập kỷ qua, các kỹ thuật sinh học phân tử đã có sự
phát triển mạnh mẽ, tạo ra công cụ hữu hiệu cho con người nghiên cứu sự
sống ở cấp độ phân tử, các kỹ thuật sinh học phân tử cũng nhanh chóng
được ứng dụng trong nghiên cứu và bảo tồn đa dạng sinh học, tạo ra lĩnh
vực khoa học mới như tiến hóa phân tử, di truyền bảo tồn. Để nghiên cứu
đa dạng di truyền quần thể và loài bằng kỹ thuật DNA có các phương pháp
chủ yếu như RAPD, AFLP, RFLP, ISSR,...
Một trong những kỹ thuật mới nhất để nghiên cứu đa dạng di truyền ở cấp
độ loài và quần thể là kỹ thuật SSR vì các chỉ thị SSR có tính đa hình cao, đặc
hiệu cho từng loài nghiên cứu. Kỹ thuật này đã được áp dụng nhiều trong các
nghiên cứu về trao đổi di truyền, cấu trúc di truyền và mối quan hệ sinh sản
trong các quần thể [20], [26].
Kỹ thuật SSR
Kỹ thuật SSR hay còn gọi là kỹ thuật microsatellite là những trình tự
14


nucleotide đặc biệt lặp lại nhiều lần từ một phân đoạn oligonucleotide

ngắn, đơn giản, còn gọi là vi vệ tinh. Phương pháp truy tìm các phân đoạn
DNA đơn giản lặp lại do Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị
phân tử năm 1989 [37]. Genome sinh vật nhân thật có nhiều đoạn DNA lặp
lại, các đoạn dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài. Các chuỗi lặp lại này
thường từ 1- 6 nucleotide. Bản chất đa hình của SSR là nó có thể được sinh
ra do sự nhân bội từ DNA tổng số của genome nhờ sử dụng hai mồi bổ trợ
với trình tự gần kề hai đầu vùng lặp lại. Giá trị của SSR là do nó sinh ra đa
hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ khắp genome và có bản chất
đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Cho đến nay kỹ thuật này đang
được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền ở động vật;
thực vật [30].
Ưu điểm của chỉ thị SSR là tương đối đơn giản, dễ thực hiện. SSR
là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện đa hình rất cao. Đây là chỉ thị
phân tử giúp tránh được các nhầm lẫn trong phân tích genome và là một
loại chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền và
phân loại các giống vật nuôi, cây trồng khác nhau trong cùng một loài.
Nhược điểm của chỉ thị SSR là quá trình thiết kế mồi tốn kém và hầu
như mỗi loại mồi lại chỉ đặc trưng cho một loài.

15


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Tổng số 60 mẫu lá sâm ngọc linh thu ngẫu nhiên từ 25 cây sâm tại vườn
sâm Tăc-ngo, xã Trà Linh, tỉnh Quảng Nam và 35 mẫu sâm thu tại Măng ri,
Kon Tum (Hình 2.1). Các mẫu thu được được giữ trong phòng bì giấy và
bảo quản trong silicagel cho đến khi sử dụng.

Hình 2.1. Bản đồ địa điểm thu mẫu sâm ngọc linh
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và Di
truyền bảo tồn, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam từ tháng 12/2016 - 07/2018.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số
Các mẫu lá sâm ngọc linh được thu tại Quảng Nam và Kon Tum được
bảo quản trong silicagen cho đến khi thực hiện các nghiên cứu phân tử.
Phương pháp tách chiết DNA tổng số theo quy trình của Doyle và Doyle
(1987) [32], có cải tiến thực hiện tại phòng Hệ thống học phân tử và di
truyền bảo tồn gồm các bước sau:
Bước 1: Cân 0,3g mẫu lá thu được. Mẫu được nghiền trong nitơ lỏng bằng
cối chày sứ vô trùng, nghiền thành bột mịn, cho vào ống eppendorf 2ml.
16