Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học san hô mềm sinularia dissecta ở việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

VŨ ANH TÚ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC SAN HƠ MỀM
SINULARIA DISSECTA Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hướng dẫn khoa học
TS. NGUYỄN HOÀI NAM

Hà Nội – 2015

Luận văn thạc sỹ Sinh học


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC SAN HÔ MỀM
SINULARIA DISSECTA Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Học viên:

Vũ Anh Tú

Cao học:

Khóa 17

Chuyên ngành:

Sinh học thực nghiệm

Mã số:

60420114

Hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Hoài Nam

Hà Nội – 2015

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Lời cảm ơn
Luận văn được hoàn thành tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học
và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hồi Nam, người
thầy đã tận tình hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong
thời gian làm luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn GS. VS Châu Văn Minh,
TS Nguyễn Văn Thanh, TS Nguyễn Xuân Cường và tập thể cán bộ phịng Dược
liệu biển, Viện Hóa sinh biển đã tạo điều kiện, giúp đỡ tơi trong q trình thực
hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ Thị Thảo và các anh
chị Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều
kiện cho tơi hồn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thử nghiệm dược
lý.
Tơi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh
vật, Trường Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên
cứu. Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên tơi trong suốt
q trình học tập nghiên cứu. Luận văn này được hỗ trợ kinh phí và thực hiện
trong khn khổ nội dung của Nhiệm vụ nhánh Hợp tác quốc tế với L.B.Nga cấp
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Nhiệm vụ Trọng điểm cấp
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, VAST.TĐ.ĐAB.02/13-15 do TS.
Nguyễn Hoài Nam làm chủ nhiệm.

Tác giả luận văn

Vũ Anh Tú

i

Luận văn thạc sỹ Sinh học

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi được thực hiện
dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Nam. Các số liệu, kết quả nêu trong
Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ cơng trình nào
khác. Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã
được cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên thực hiện Luận văn

Vũ Anh Tú

ii

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Danh mục chữ viết tắt

CC

Sắc ký cột (Collumn chromatography)

YMC

Sắc ký cột pha ngược

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatomatography)

MPLC

Sắc ký lỏng trung áp

NMR

Phổ cộng hưởng từ nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

13

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy)

1

H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance
Spectroscopy)

HMBC

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond
Connectivity)

C

HSQC

Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết (Heteronuclear Single-Quantum
Coherence)

Mp

Điểm nóng chảy (Melting point)

MTT

[3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide]

LU-1

Dòng tế bào ung thư phổi người (Lung carcinoma cell line)

MCF-7

Dòng tế bào ung thư vú người (Human breast cancer cell line)

KB

Dịng tế bào ung thư biểu mơ

HepG2

Dịng tế bào ung thư gan người

TBUT

Tế bào ung thư

iii

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2

I.1. Giới thiệu về san hơ mềm

2

I.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số lồi
san hơ mềm điển hình thuộc giống Sinularia trên thế giới

9

I.3. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học giống
Sinularia trong nước

12

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

13

II.1. Đối tượng nghiên cứu

13

II.2. Phương pháp nghiên cứu

14

II.2.1. Phương pháp thu thập mẫu sinh vật biển

14

II.2.2. Phương pháp nghiên cứu xử lý mẫu tạo dịch chiết

14

II.2.3. Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất

16

II.2.4. Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư

17

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

19

III.1. Xử lý mẫu, tạo dịch chiết phục vụ nghiên cứu

19

III.2. Phân lập các hợp chất, hằng số vật lý, dữ liệu phổ của các hợp chất

20

III.3. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào các hợp chất phân lập được

25

CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN KẾT QUẢ

28

IV.1. Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất

28

IV.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào các hợp chất phân lập được

52

KẾT LUẬN

53

Tài liệu tham khảo

55

Danh mục cơng trình cơng bố

58

PHỤ LỤC
iv

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

MỞ ĐẦU

Cùng với sự tiến hóa nhanh của văn minh nhân loại và sự phát triển vượt
bậc của khoa học kỹ thuật thì các căn bệnh nguy hiểm cũng đã gia tăng rất nhiều,
đặc biệt có thể thấy sự gia tăng ngày một lớn của căn bệnh ung thư quái ác, thuộc
tứ chứng nan y trong y học. Nó đã gây ra nỗi ám ảnh đáng sợ cho lồi người. Và
các biệt dược phục vụ cơng tác chữa bệnh, các thực phẩm chức năng hỗ trợ phục
hồi sức khỏe giúp người bệnh có thể chống lại bệnh tật tốt nhất đang được các nhà
khoa học rất chú trọng nghiên cứu.
Các sinh vật biển có thể đã có rất nhiều người biết đến như Hải sâm, Sao
biển, Cá ngựa, cầu gai, san hô, bọt biển… hay gần gũi hơn nữa là các thực phẩm
giàu dinh dưỡng trong bữa ăn như các lồi ốc, sị, cá, cua, sứa biển … đang được
nghiên cứu rất nhiều theo hướng thực phẩm hoặc thực phẩm chức năng. Nghiên
cứu về nguồn hợp chất thiên nhiên biển đã được bắt đầu từ những năm 50 của thế
kỷ trước và đang ngày càng nhận được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế
giới. Những nghiên cứu về nguồn dược liệu biển trong thời gian gần đây tăng cả
về chất lượng và số lượng và đã đạt được những thành quả rất đáng chú ý. Đã có
nhiều hợp chất có nguồn gốc biển trở thành các loại thuốc quan trọng trong các
lĩnh vực của cuộc sống loài người. Các sinh vật biển trở thành tâm điểm cho nhiều
cơng trình nghiên cứu có ý nghĩa to lớn cho sức khỏe và đời sống. Các nguồn dược
liệu từ sinh vật biển có thể bổ sung, hỗ trợ và cịn có thể điều trị các căn bệnh nguy
hiểm ngày càng gia tăng trong xã hội phát triển.
Nghiên cứu về thành phần hóa học và các hoạt tính sinh học trong các lồi
san hơ sẽ góp phần chuyển những sinh vật khơng có giá trị về mặt hải sản trở thành
những sinh vật biển có giá trị trong nghiên cứu y dược. Chính vì vậy, hiện này
đang có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào tìm kiếm các hợp chất từ san hô mềm
và nghiên cứu hoạt tính sinh học các hợp chất phát hiện được.

1

Luận văn thạc sỹ Sinh học

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
I.1. Giới thiệu về san hơ mềm
San hơ là lồi sinh vật biển thuộc lớp Anthozoa, lớp Anthozoa được chia
thành hai phân lớp tùy theo số xúc tu, hoặc các đường đối xứng và một loạt các bộ
phận tương ứng với kiểu xương ngồi và bao gồm phân lớp san hơ có tám xúc tu
được gọi là san hơ tám ngăn Octocorallia, và phân lớp san hơ có số xúc tu lớn hơn
tám và là bội số của sáu được gọi là san hô sáu ngăn Hexacorallia. Các san hô
mềm, san hơ sừng và bút chì biển thuộc phân lớp san hô Octocorallia, san hô cứng
nằm trong phân lớp Hexacorallia. Theo thống kê trên thế giới, phân lớp
Octocorallia có khoảng 2000 lồi chia làm 310 giống và 45 họ.
San hơ là những sinh vật rất đơn giản, chúng tồn tại ở khắp các vùng biển,
nông cũng như sâu và là những cá thể hình trụ rất nhỏ có hàng xúc tu ở đỉnh, được
sử dụng để bắt mồi trong môi trường nước. Mặc dù trông giống như cây, san hô
thực sự là những động vật và cấu tạo tương tự như con sứa và hải q, chúng thuộc
vào nhóm động vật biển có các trâm gây ngứa (thích ty bào). Có đến hàng trăm
kiểu san hô khác nhau nhưng tất cả đều do các cá thể nhỏ bé, còn gọi là polyp tạo
nên. Các cá thể này tiết ra canxi cacbonat để tạo bộ xương cứng, xây nên các rạn
san hô tại các vùng biển nhiệt đới. Trên thế giới, rạn san hơ ngầm ước tính bao
phủ trên 284.300 km2, chủ yếu ở vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương (91,9%).
Các rạn san hô mềm phân bố rộng rãi trên đại dương thế giới và có vai trị quan
trọng trong hệ sinh thái rạn san hô, chúng tạo ra nguồn vật chất hữu cơ, habitat,
tham gia tạo rạn. Cuộc sống cộng sinh của san hơ mềm với các lồi tảo biển đã tạo
nên đặc điểm sinh học vô cùng thú vị của san hô mềm. Rất nhiều hợp chất thứ cấp
như các ditecpen dạng cembranoid, các steroids … từ san hơ mềm có thể được
sinh ra từ những mối tương tác với môi trường sinh thái như vậy [1]

Tuy một đầu san hô trông như một cơ thể sống, nhưng nó thực ra là đầu của
nhiều cá thể giống nhau hồn tồn về di truyền, đó là các polip. Các polip là các
sinh vật đa bào với nguồn thức ăn là nhiều loại sinh vật nhỏ hơn, từ sinh vật phù
du tới các loài cá nhỏ.

2

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Polip thường có đường kính một vài milimet, cấu tạo bởi một lớp biểu
mơ bên ngồi và một lớp mô bên trong giống như sứa được gọi là ngoại chất. Polip
có hình dạng đối xứng trục với các xúc tu mọc quanh một cái miệng ở giữa - cửa
duy nhất tới xoang vị (hay dạ dày), cả thức ăn và bã thải đều đi qua cái miệng này.
Dạ dày đóng kín tại đáy polip, nơi biểu mơ tạo một bộ xương ngồi được
gọi là đĩa nền. Bộ xương này được hình thành bởi một vành hình khuyên chứa
canxi ngày càng dày thêm. Các cấu trúc này phát triển theo chiều thẳng đứng và
thành một dạng ống từ đáy polip, cho phép nó co vào trong bộ xương ngoài khi
cần trú ẩn.
Polip mọc bằng cách phát triển khoang hình cốc (calices) theo chiều dọc,
đơi khi chia thành vách ngăn để tạo một đĩa nền mới cao hơn. Qua nhiều thế hệ,
kiểu phát triển này tạo nên các cấu trúc san hô lớn chứa canxi, và lâu dài tạo thành
các rạn san hơ.
Sự hình thành bộ xương ngồi chứa canxi là kết quả của việc polip kết lắng
aragonit khoáng từ các ion canxi thu được từ trong nước biển. Tuy khác nhau tùy
theo lồi và điều kiện mơi trường, tốc độ kết lắng có thể đạt mức 10 g/m²

polip/ngày. Điều này phụ thuộc mức độ ánh sáng, sản lượng ban đêm thấp hơn
90% so với giữa trưa.
Các xúc tu của polip bẫy mồi bằng cách sử dụng các tế bào châm được gọi
là nematocyst. Đây là các tế bào chuyên bắt và làm tê liệt các con mồi như sinh
vật phù du, khi có tiếp xúc, nó phản ứng rất nhanh bằng cách tiêm chất độc vào
con mồi. Các chất độc này thường yếu, nhưng ở san hô lửa, nó đủ mạnh để gây
tổn thương cho con người. Các lồi sứa và hải quỳ cũng có nematocyst. Chất độc
mà nematocyst tiêm vào con mồi có tác dụng làm tê liệt hoặc giết chết con mồi,
sau đó các xúc tu kéo con mồi vào trong dạ dày của polip bằng một dải biểu mô
co giãn được gọi là hầu.
Các polip kết nối với nhau qua một hệ thống phức tạp gồm các kênh hơ hấp
tiêu hóa cho phép chúng chia sẻ đáng kể các chất dinh dưỡng và các sinh vật cộng
sinh. Đối với các lồi san hơ mềm, các kênh này có đường kính khoảng 50-500μm
3

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

và cho phép vận chuyển cả các chất của quá trình trao đổi chất và các thành phần
tế bào.
Ngoài việc dùng sinh vật phù du làm thức ăn, nhiều lồi san hơ, cũng như
các nhóm Thích ti (Cnidaria) khác như hải quỳ (ví dụ giống Aiptasia), hình thành
một quan hệ cộng sinh với nhóm tảo vàng đơn bào thuộc chi Symbiodinium. Thông
thường, một polip sẽ sống cùng một loại tảo cụ thể. Thông qua quang hợp, tảo
cung cấp năng lượng cho san hô và giúp san hơ trong q trình canxi hóa. Tảo
hưởng lợi từ một mơi trường an tồn, và sử dụng điơxít cacbon và các chất chứa

nitơ mà polip thải ra.

Hình I.1a. Cận cảnh các polip và tế bào châm ( Nguồn internet)

Sinh sản Hữu tính
San hơ chủ yếu sinh sản hữu tính, với 25% san hô phụ thuộc tảo (san hô đá)
tạo thành các quần thể đơn tính trong khi phần cịn lại là lưỡng tính. Khoảng 75%
san hơ phụ thuộc tảo "phát tán con giống" bằng cách phóng các giao
tử (trứng và tinh trùng) vào trong nước để phát tán các quần thể san hô ra xa. Các
giao tử kết hợp với nhau khi thụ tinh để hình thành một ấu trùng rất nhỏ gọi
là planula, thường có màu hồng và hình ôvan; một quần thể san hô cỡ trung bình
mỗi năm có thể tạo vài nghìn ấu trùng này để vượt qua xác suất rất nhỏ của việc
ấu trùng tạo được một quần thể mới.

4

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Ấu trùng planula bơi về phía ánh sáng, thể hiện quang xu hướng tính dương,
lên đến vùng nước bề mặt nơi chúng trôi dạt và phát triển một thời gian trước khi
bơi trở lại xuống phía đáy biển để tìm một bề mặt mà nó có thể bám vào đó và xây
dựng một quần thể mới. Nhiều giai đoạn của q trình này có tỷ lệ thất bại lớn, và
mặc dù mỗi quần thể san hô phát tán hàng triệu giao tử, chỉ có rất ít quần thể mới
được hình thành. Thời gian từ khi phóng giao tử cho đến khi ấu trùng định cư
thường là 2 hoặc 3 ngày, nhưng có thể kéo dài đến 2 tháng. Ấu trùng san hô phát

triển thành một polip san hô và cuối cùng trở thành một đầu san hơ bằng cách sinh
sản vơ tính tạo các polip mới.
Hầu hết các lồi san hơ, mà khơng phải san hơ đá, đều khơng phát tán giao
tử. Các lồi này phóng tinh trùng nhưng giữ trứng, cho phép phát triển các ấu trùng
planula lớn hơn để sau này khi thả ra sẽ đủ sẵn sàng để lắng xuống. Ấu trùng phát
triển thành polip san hô và cuối cùng trở thành đầu san hơ bằng mọc chồi vơ tính
và phát triển để tạo ra các polip mới.
Việc phóng giao tử đồng bộ thường xảy ra và rất điển hình tại các rạn san
hơ, ngay cả khi tại rạn có nhiều lồi, tất cả san hơ trên rạn phóng giao tử vào cùng
một đêm. Sự đồng bộ này rất thiết yêu để các giao tử đực và cái có thể gặp nhau
để tạo thành ấu trùng planula. Những dấu hiệu hướng dẫn cho việc phóng giao tử
rất phức tạp, nhưng xét thời gian ngắn, nó bao gồm các thay đổi về mặt trăng, thời
gian mặt trời lặn, và có thể cả tín hiệu hóa học. Việc phóng giao tử đồng thời có
thể tạo ra kết quả là sự hình thành các dạng san hơ lai, có lẽ tham gia vào q
trình tạo lồi san hô mới. Tại một số nơi, hiện tượng san hơ phóng giao tử có thể
rất nổi bật, thường xảy ra vào ban đêm, nước biển vốn trong trở nên mờ đục bởi
các "đám mây" giao tử.
San hô phải phụ thuộc vào các dấu hiệu môi trường, tùy theo từng loại, để
xác định thời gian chính xác để giải phóng các giao tử vào trong nước. Có hai
phương pháp mà san hơ dùng để sinh sản hữu tính, chúng khác nhau ở chỗ giao tử
cái có được giải phóng hay không:
San hô gieo rắc, phần lớn trong chúng sinh sản hàng loạt, phụ thuộc nặng
nề vào các dấu hiệu môi trường, do ngược lại với san hô ấp trứng, chúng giải
5

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

phóng cả tinh trùng lẫn trứng vào trong nước. San hô sử dụng các dấu hiệu dài hạn
như độ dài thời gian ban ngày, nhiệt độ nước, và/hoặc tốc độ thay đổi nhiệt độ; và
dấu hiệu ngắn hạn thông thường nhất là chu kỳ trăng, với lúc mặt trời lặn điều
khiển thời gian giải phóng. Khoảng 75% các lồi san hơ là san hơ gieo rắc, phần
lớn trong chúng là phụ thuộc tảo vàng đơn bào hay san hô tạo rạn. Các giao tử với
sức nổi dương trơi nổi về phía bề mặt nơi sự thụ tinh diễn ra để tạo thành các ấu
trùng planula. Các ấu trùng planula bơi về phía ánh sáng bề mặt để đi vào các dòng
chảy, nơi chúng ở lại khoảng 2 ngày, nhưng có thể tới 3 tuần, và trong một trường
hợp đã biết là 2 tháng, sau đó chúng chìm xuống và biến hóa thành các polip và
tạo thành các quần thể mới.
San hô ấp trứng thông thường nhất là không phụ thuộc tảo vàng đơn bào
(không tạo rạn), hoặc một số san hô phụ thuộc tảo vàng đơn bào trong các khu vực
có tác động của sóng hay luồng chảy mạnh. San hơ ấp trứng chỉ giải phóng tinh
trùng, với sức nổi âm, và có thể lưu trữ trứng đã thụ tinh trong vài tuần, giảm bớt
nhu cầu đối với các sự kiện sinh sản đồng bộ hàng loạt, nhưng nó vẫn có thể xảy
ra. Sau khi thụ tinh thì san hơ giải phóng các ấu trùng planula đã sẵn sàng chìm
lắng xuống.

Hình I.1b. Các khoang hình cốc (đĩa nền) của Orbicella annularis cho thấy 2 phương pháp
nhân giống: mọc chồi (khoang nhỏ ở giữa) và phân chia (khoang đôi lớn). (Nguồn internet)

6

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Sinh sản Vơ tính
Tại các đầu san hô, các polip giống hệt nhau về di truyền sinh sản vơ tính để
phát triển quần thể. Điều này được thực hiện bằng nảy mầm hay mọc chồi (khi
một polip mới mọc ra từ một polip trưởng thành), hoặc phân chia (thành 2 polip
lớn bằng polip ban đầu), cả hai được minh họa trong hình về Orbicella annularis.
Mọc chồi: Mở rộng kích thước của quần thể san hơ. Nó diễn ra khi corallite
mới mọc ra từ polip trưởng thành. Khi polip mới phát triển nó sinh ra xoang vị (dạ
dày), tua cảm và miệng. Khoảng cách giữa các polip mới và trưởng thành tăng lên,
và cùng với nó là coenosarc (cơ thể chung của quần thể; xem hình minh họa tại
phần cấu tạo). Việc mọc chồi có thể diễn ra theo các cách sau:
Phân chia theo chiều dọc bắt đầu với mở rộng polip ra, sau đó phân chia
xoang vị. Miệng phân chia và các tua cảm mới hình thành. Khác biệt với điều này
là mỗi polip phải hoàn thiện phần bị mất của mình về cơ thể và bộ xương ngồi.


Mọc chồi nội tua cảm hình thành từ các đĩa miệng của polip, nghĩa là cả hai
polip có cùng kích thước và nằm trong cùng một vịng tua cảm.




Mọc chồi ngoại tua cảm tạo thành từ đáy của polip, và các polip mới là nhỏ

hơn.
Phân chia theo chiều ngang diễn ra khi các polip và bộ xương ngoài phân
chia theo chiều ngang thành hai phần. Điều này có nghĩa là một polip có đĩa nền
(đáy) cịn polip kia có đĩa miệng (đỉnh). Hai polip mới cũng phải tự hồn thiện các
phần bị mất.



Phân đơi diễn ra ở một số san hơ, trong đó quần thể có khả năng tự tách
thành 2 hay nhiều quần thể trong các giai đoạn đầu của sự phát triển của chúng.


Cả quần thể san hơ có thể sinh sản vơ tính qua sự phân mảnh hay thốt ra
ngồi, khi một mảnh vỡ từ một đầu san hơ được sóng đem đi nơi khác có thể tiếp
tục phát triển tại địa điểm mới.
Polip thốt ra ngoài diễn ra khi một polip từ bỏ quần thể và tái thiết lập trên
một nền mới để tạo ra quần thể trưởng thành mới.


7

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Phân mảnh, trên thực tế có thể coi như là một kiểu của phân đôi, với các cá
thể bị vỡ ra khỏi quần thể do bão hay trong các tình huống khác mà việc vỡ ra này
có thể xảy ra. Các cá thể tách biệt có thể bắt đầu cho các quần thể mới.


Các rạn san hô Việt Nam nằm trên vùng nước nông, mặc dù khơng có các
rạn san hơ cực lớn nhưng các rạn san hơ Việt Nam có đặc tính đa dạng cao và có
đặc tính khu vực về sinh thái rõ rệt, điều này chỉ ra sự tồn tại của các phần dị

dưỡng bên trong của các loài. Trong số khoảng gần 400 lồi san hơ (thuộc về 80
giống lồi và 17 họ khác nhau) có mặt ở Việt Nam, theo một số tài liệu báo cáo
thì hiện nay nước ta có khoảng 55 lồi san hơ mềm và 29 giống lồi. Kết quả phân
tích các rạn san hơ ở vùng biển Hạ Long, quần đảo Long Châu (Quảng Ninh), đảo
Cồn Cỏ (Quảng Trị), bán đảo Sơn Trà (Đà Nẵng) và vùng bờ biển Hải Vân (Thừa
Thiên Huế) trong nhiều năm qua phát hiện có 46 lồi san hơ mềm, thuộc 10 họ,
24 giống lồi, trong đó đảo Cồn Cỏ là nơi có độ phủ san hơ mềm cao nhất, hai chi
Lobophytum và Sinularia phát triển mạnh, tạo thành từng đám lớn, có nơi phủ dày
đặc hàng chục mét vng. Theo báo cáo kết quả đánh giá độ đa dạng sinh học của
Khu bảo tồn biển vịnh Nha trang do Viện Hải dương học thực hiện năm 2005 cho
thấy mức độ giàu có, phong phú và duy trì ổn định của san hơ ở khu vực này. Điển
hình, ở khu Đơng hịn tre có khoảng 150 lồi, ở Tây Nam Hịn Mun có khoảng
120 lồi, trong đó có chi Sinularia, Lobophytum, Sarcophyton... [1, 2].

San hơ cứng (hard coral)

San hơ mềm (Soft coral)

Hình I.1c. Hình ảnh của một số lồi san hơ mềm do nhóm nghiên cứu chụp được trong
chuyến khảo sát vùng biển Việt Nam trên tàu Akademic oparin( Chương trình hợp tác với liên
bang Nga )
8

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

San hô mềm Sinularia dissecta Tixier-Durivault, 1945 thuộc ngành Cnidaria,
lớp Anthozoa, phân lớp Octocorallia, bộ Alcynoceae, họ Alcyoniidae, giống
Sinularia. Sinularia dissecta Tixier-Durivault là một loài san hô mềm sinh sống
trong vùng nước biển mặn, tập trung nhiều và đa dạng ở độ sâu khoảng 15-20m,
quanh các rạn san hô của các đảo hay các bãi đá ngầm. Lồi san hơ mềm này được
phân bố rải rác dọc bờ biển Việt Nam như đảo Phú Quốc, Thổ Chu, Nam Du (Kiên
Giang), Côn Đảo (Bà Rịa-Vũng Tàu), bãi đá ngầm, Phú Quý (Bình Thuận), quần
đảo Trường Sa, vịnh Vân Phong (Khánh Hòa),đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi), Cù lao
Xanh (Bình Định), Cù lao Chàm, bán đảo Sơn Trà, quần đảo Hồng Sa (Đà Nẵng),
đảo Cát Bà, Cơ tơ, Vịnh Hạ Long (Quảng Ninh) …và một số vùng bờ biển, đảo
khác đã được khảo sát ở biển Đông Việt Nam.
I.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số lồi san hơ
mềm điển hình thuộc giống Sinularia trên thế giới
Những nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học từ san hơ mềm thuộc
giống Sinularia thực sự khởi phát từ những nghiên cứu khảo sát tác dụng chữa ung
thư vòm họng các dịch chiết của các lồi san hơ mềm như S. grandilobata, S.
parva, S. triangula, S. scabra, S. nanolobata và S. gibberosa đã được tiến hành
với mơ hình sử dụng dịng tế bào SCC25 và dòng tế bào HaCaT, kết quả nghiên
cứu trên mơ hình trên cho thấy dịch chiết của các lồi nêu trên có tác dụng gây
chết các tế bào SCC25 và HaCaT theo chương trình, kết quả này cũng mở ra một
hướng nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất có khả năng điều trị bệnh ung thư vịm
họng từ lồi san hô mềm Sinularia [3]. Trong khuôn khổ của luận văn, tổng quan
này chỉ đề cập những nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học điển hình của một
số lồi san hơ mềm thuộc giống Sinularia, những lồi này được nghiên cứu nhiều
và có những kết quả hoạt tính rất đáng quan tâm [4-8]. Năm 2012, các hợp chất
mới như 9,11-secosteroid (1), 8α 3β,11-dihydroxy-5α,6α-expoxy-24-methylene9,11-secocholestan-9-one (2), granosolide A (3), cùng với một số steroid đã biết
như 3β,11-dihydroxy-5β,6β-expoxy-24-methylene-9,11-secocholestan-9-one (4)
đã được phát hiện từ dịch chiết EtOAc của san hô mềm Sinularia granosa, các thử
nghiệm sinh học cho thấy các hợp chất mới phân lập được từ loài S. granosa thể
9

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

hiện hoạt tính diệt tế bào ung thư trên một số dòng tế bào [9]. Cùng tại thời điểm
đó, các hợp chất thuộc nhóm norcembranoidal diterpene như 5-episinuleptolide
acetate (5), scabrolide D (6) được phân lập từ lồi Sinularia sp ở khu vực biển
Đơng, hợp chất 5-episinuleptolide acetate có kết quả gây độc tế bào đối với một
số dòng tế bào gây u, các đánh giá về hoạt tính trên in vitro, in vivo hợp chất này
cho thấy đây là một hợp chất tiềm năng trong việc bao vây tế bào gây u và gây
chết tế bào này theo chương trình [9-10]. Tiếp tục hướng nghiên cứu các chất gây
độc tế bào từ san hô mềm, các nhà khoa học đã tìm ra 7 hợp chất mới thuộc nhóm
diterpenoid như flexibilisolides C-G (7-11), flexibilisin C (12), và một hợp chất
có khung mới 11,12-secoflexibillin (13) từ san hơ mềm Sinularia flexibilis. Hợp
chất mới Flexibilisin C (12), và chất có khung mới 11,12-secoflexibillin (13) có
kết quả gây độc tế bào trên hai dịng tế bào HeLa, B16. Ngồi ra, flexibilisin C
(12) được coi là hoạt chất có tác dụng gây độc tế bào tiềm năng trên hai dòng tế
bào SK-Hep1 và B16 [11]. Các tác giả Shi Shen và cộng sự còn phân lập được
năm hợp chất thuộc khung cembrane mới, các hợp chất này được đặt tên lần lượt
là pavidolides A (13)–E (17), đây là lần đầu tiên các hợp chất này được phân lập
từ lồi san hơ mềm Sinularia pavida, cùng với sarcophytin (18) và chatancin (19)
[12]. Cùng với các nghiên cứu về cấu trúc, nghiên cứu về hoạt tính gây độc tế bào
cho thấy pavidolides B (14) và C (15) thể hiện khả năng ức chế khá mạnh dòng
tế bào ung thư máu người HL-60 [13]. Năm 2013, một hợp chất dạng diterpenoid
mới, hợp chất leptoclalin A (20), cùng với một số hợp chất cũ thuộc
norcembranoid diterpene, được phân lập từ lồi san hơ mềm nhân tạo Sinularia

leptoclados. Hợp chất leptoclalin A (20) rất hiếm gặp trong các lồi san hơ mềm,
hợp chất này có khả năng ức chế một số dòng tế bào ung thư như dòng T-47 D và
K-562 [11]. Gần đây nhất, hợp chất 5-Episinuleptolide acetate (21), một hợp chất
có tác dụng gây độc tế bào được phân lập từ san hô mềm Sinularia sp, hợp chất
này có tác dụng ức chết các dòng tế bào K562, Molt 4 và HL 60. Những nghiên
cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học hợp chất 5-Episinuleptolide acetate (21) cho
thấy (21) có tác dụng gây độc tế bào rất nhạy đối với dòng tế bào ung thư máu
người HL 60 [14].

10

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học từ lồi San hơ mềm Sinularia
dissecta Tixier-Durivault cũng thu hút được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới.
Năm 1999, các nhà khoa học Ấn Độ cũng đã phân lập được 5 hợp chất dạng
steroids từ lồi san hơ mềm Sinularia dissecta Tixier-Durivault trong đó có 4 hợp
chất mới dạng polyhydroxy steroids là 1,3,6,11-tetraacetate-cholestan1β,3β,5α,6β,11α-pentol (22), 24-Methylene-1,3,6,11-tetraacetate-cholestan1β,3β,5α,6β,11α-pentol (23), 24-Methylene-1,3,6,11-tetraacetate-cholestan1β,3β,5α,6α,11α-pentol
(24),
24(R)-Methyl-11α,12α
-epoxy-1,3,6triacetatecholestan-1α,3β,6β -triol (25) [15]
OAc
OAc

OAc

OAc

OAc

22
OH

OAc

23

OAc

OH
OAc

O

O Ac
O Ac

OAc

24

OA c

25

OAc

OH
OA c

OAc

Cũng từ lồi Sinularia dissecta Tixier-Durivault, năm 2005 nhóm tác giả
Pengfei Jin và cộng sự cũng đã phân lập được 15 hợp chất dạng polyhydroxylated
steroids trong đó có 6 chất mới là 3β-acetoxy-1α,11α-dihydroxygorgost-5-en-18oic acid (26), gorgost-5-en-1 α,3β,11α,18-tetrol (27), 18-acetoxy-1α,3β,11αtrihydroxygorgost-5-ene(28), 24(S)-3β-acetoxy-1α, 11α-dihydroxyergost-5-en18-oic acid (29), 24(S)-ergost-5-en-1α,3β,11α,18-tetrol (30), dissectolide (31) và
9 hợp chất đã biết được mơ tả ở [16]. Một ví dụ khá điển hình là hoạt chất
Sinuflexlin, một hoạt chất kiểu biscembranoid, hoạt chất này được tìm thấy dưới
dạng khung biscembranoid mới, có hoạt tính gây độc tế bào mạnh phân lập được
từ lồi san hơ mềm Sinularia flexibilis [17], hoạt chất này hiện đang được thử lâm
sàng giai đoạn I với định hướng dung làm thuốc chữa ung thư [18]. Năm 2003,
trong chương trình nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ san hơ mềm do
nhóm nghiên cứu của Atallah và cộng sự, các hoạt chất dạng Norditerpene thể
hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dịng tế bào ung thư người KB và Hepa đã được
tìm thấy
11

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

I.3. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học giống Sinularia
trong nước
San hơ mềm thuộc giống Sinularia chưa có nhiều nghiên cứu ở Việt Nam.

Nghiên cứu ở Việt Nam đầu tiến đối với lồi San hơ mềm thuộc giống Sinularia
được bắt đầu trên loài Sinularia maxima với việc phân lập và xác định cấu trúc được 19 hợp
chất trong đó có 11 hợp chất mới như 12-hydroxy-scabrolide A (33), 13-epi-scabrolide
C (34), sinumaximol A (35)–I(43), cùng với 8 hợp chất đã biết như scabrolide A
(44), yonarolide (45), 5-epi-norcembrene (46), ineleganolide (47), norcembrene-5
(48), sethukarailin (49), (1S,2E,4S,6E,8S,11R)-2,6,12(20)-cembratriene-4,8,11triol (50) và isomandapamate (51). Các hợp chất này hiện đã được nghiên cứu về
hoạt tính kháng viêm, trong số các hợp chất nêu trên, các hợp chất 13-episcabrolide C (34), sinumaximol B (36), C(37), và yonarolide (45) thể hiện tiềm
năng hoạt tính kháng viêm [19-21]. Năm 2013, một nhóm tiếp tục nghiên cứu lồi
Sinularia dissecta Tixier-Durivault, đã phân lập được một steroid mới là hợp chất
dissesterol, hợp chất dissesterol và các hợp chất phân lập được đã được nghiên
cứu hoạt tính kháng viêm và một số hoạt tính khác, kết quả cho thấy hợp chất
dissesterol thể hiện hoạt tính kháng viêm với giá trị IC50 là 4.0 ± 0.1 μM [22].
Trên cơ sở đó, luận văn với tiêu đề “Nghiên cứu thành phần hóa học và
khảo sát hoạt tính sinh học san hơ mềm Sinularia dissecta ở Việt Nam” được
thực hiện. Luận văn có mục tiêu phân lập được một số hợp chất steroid trong lồi
san hơ mềm Sinularia dissecta ở Việt Nam, khảo sát hoạt tính sinh học gây độc tế
bào của chúng nhằm tìm kiếm những hợp chất có hoạt tính tốt, tạo cơ sở cho những
nghiên cứu tiếp theo trong hướng nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ san
hơ mềm ở Việt Nam.
NỘI DUNG CỦA LUẬN VĂN GỒM:
1. Phân lập một số hợp chất hóa học từ san hơ mềm Sinularia dissecta.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.
3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đó theo hướng hoạt tính gây

độc tế bào.
12

Luận văn thạc sỹ Sinh học

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
II.1. Đối tượng nghiên cứu
Địa điểm khảo sát và thu thập mẫu tại Hải Vân-Sơn Chà ( TP.Huế ). Mẫu được
thu thập vào tháng 4 năm 2014 ( Ký hiệu là Mẫu số 02 ). Đối tượng mẫu được PGS.
TS Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển Hải phịng định lồi. Mẫu
được chia làm 2 phần, một phần làm nghiên cứu hóa học và sinh học, một phần nhỏ
để làm tiêu bản định loài (chụp hình tiêu bản, và dùng cho các giám định cần thiết).
Tiêu bản được lưu tại Viện Tài nguyên và Môi trường biển, và lưu tại Viện Hóa
sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.

Hình II.1. Ảnh mẫu và ảnh tiêu bản Sinularia dissecta Tixier-Durivault, 1945

Kết quả phân tích mẫu cho thấy mẫu Sinularia dissecta Tixier-Durivault,
1945 có những thơng tin như sau:
Kích thước tập đồn: Kích thước rộng của các tập đồn đã gặp có những
cụm khoảng vài trăm cm2 nhưng cũng có bắt gặp những cụm khoảng 1 m2. Chiều
cao từ chân đế lên tới đỉnh của các tập đoàn khoảng 5 - 7 cm. Các thùy cao từ 2 –
5 cm, dày từ 0,5-1,5 cm

13

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Hình thái tập đồn:Tập đồn dạng phiến với các thùy nhơ lên có dạng mào
gà. Các thùy mỏng,dẹt, thấp, thẳng, sắp xếp theo chiều dọc, chiều cao nhất khoảng
50 mm sắp xếp tương đối dày trên phiến của tập đoàn.
Màu sắc:Màu sắc ngoài tự nhiên của tập đoàn là màu nâu, ngả vàng. Sau
khi qua quá trình xử lý và bảo quản thì đa số các tập đồn có màu trắng.
Polyp: Trong điều kiện tự nhiên các polyp nhơ ra quan sát thấy kích thước
khoảng 1 mm.
II.2. Phương pháp nghiên cứu
II.2.1. Phương pháp thu thập mẫu sinh vật biển
a. Phương pháp khảo sát, thu mẫu ngoài thực địa
Phương pháp điều tra thành phần lồi: san hơ mềm được thu mẫu bằng
phương pháp lặn SCUBA. Mẫu san hô mềm được cố định trong dung dịch nước
biển – Formalin 4% sau 18 – 22 tiếng, rửa sạch bằng nước biển, bảo quản bằng
Ethanol 70 %.
b. Phương pháp phân tích mẫu vật và số liệu trong phịng thí nghiệm và
giám định tên khoa học
Bước 1: Sử dụng dung dịch NaOCl làm tan lớp mô, thu vi xương tại các vị
trí khác nhau trên tập đồn san hơ mềm.
Bước 2: Sử dụng kính hiển vi quang học và điện tử, phần mềm chụp ảnh đo
độ dài NIS – Elements F 3.0 quan sát và đo, chụp vi xương.
Bước 3: Phân loại theo phương pháp hình thái học vi xương san hô mềm
(Nutting, C.C., 1910; Verseveldt, J., 1980a, b, 1982; Grasshoff, M., 1999; Fabricus
& Alderslade, 2001; Utinomi).
II.2.2. Phương pháp nghiên cứu xử lý mẫu, tạo dịch chiết
a.Phương pháp xử lý mẫu
Việc xử lý các mẫu sinh vật biển được thực hiện theo quy trình thống nhất
đã được xây dựng qua các nhiệm vụ khoa học của Viện Hóa sinh biển, cụ thể:
14

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Bước 1. Mẫu san hô mềm sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh âm sâu được tiến hành
rã đơng bằng cách để trên bệ rửa thí nghiệm, cho nước sạch chảy đều trên bề mặt
của mẫu nghiên cứu, các lớp đá bao quang mẫu san hô mềm được tan từ từ để lộ
phần thân của mẫu san hô mềm. Mẫu được ngâm trong nước lạnh trong thời gian
từ 2-3 tiếng nhằm loại bỏ từ từ hàm lượng muối vô cơ.
Bước 2. Sau khi mẫu san hô mềm đã được rã đông, loại bỏ các phần túi
nylon và các thành phần sinh vật biển khác bám trên bề mặt của mẫu san hô mềm.
Lưu lại tiêu bản mẫu, để mẫu sinh vật biển lên mặt bàn thí nghiệm và chụp ảnh để
lưu phần mẫu trước khi xử lý.
Bước 3. Sau khi mẫu san hô mềm đã được loại bỏ các thành phần nylon và
các thành phần khác, mẫu được để trên túi lưới ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô
hết bề mặt của phần thân mẫu san hô mềm. Mẫu được cân để thu được khối lượng
thực tế trước khi tiến hành xử lý.
Bước 4. Mẫu được cắt nhỏ thành từ phiến, chiều rộng và dài của phiến tùy
theo độ cứng của mẫu san hô mềm. Các phiến càng mỏng thì khả năng làm khơ
mẫu và say mẫu càng thuận lợi.
Bước 5. Sấy và làm khô các mẫu san hô mềm. Các mẫu san hô mềm sau khi
đã được cắt thành các phiến nhỏ được chuyển vào túi lưới và tiến hành làm khô
sơ bộ bằng phương pháp sấy khô trên thiết bị tủ sấy chân khơng hoặc phơi dưới
điều kiện ánh sáng mặt trời (có tránh tia tử ngoại). Trong quá trình sấy mẫu này,
khối lượng mẫu san hô mềm giảm xuống rất nhanh.
Bước 6. Làm khô mẫu trên thiết bị đông khô

Bước 7. Nghiên mẫu thành bột mịn bằng thiết bị nghiên mẫu.
b. Phương pháp nghiên cứu tạo dịch chiết phân đoạn
Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử: Các mẫu san hô mềm được lấy lượng 5 mg mẫu
khơ, cho vào bình định mức 10 ml.
Bước 2. Đánh số thứ tự và ký hiệu các bình chiết mẫu. Thêm dung mơi theo
thứ tự tăng dần độ phân cực, dung môi được thêm đến vạch định mức.
15

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Bước 3. Tồn bộ các bình chiết được cho lên máy lắc ngang, lắc đều cho
dung môi thấm đều trên bột san hô mềm. Để lắng trong khoảng 1-2 giờ.
Bước 4. Lọc mẫu, phần dịch lọc được cất loại dung môi trên thiết bị cấy
quay, dịch thô thu được cho vào lọ nhỏ phục vụ cho việc kiểm tra lượng vết chất
và khả năng hoàn tan mẫu nghiên cứu.
Bước 5. Sử dụng sắc ký bảng mỏng TLC và hệ dung mơi CHCl3: MeOH
với tỷ lệ thích hợp để đánh giá các mẫu thô thu được.
II.2.3. Phương pháp nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hoá học
a. Phương pháp phân lập chất
Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng
tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện
chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là
dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khơ rồi hơ nóng trên bếp
điện từ từ đến khi hiện màu.
Sắc ký lớp mỏng điều chế: Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản

mỏng tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất
bằng đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để
phun thuốc thử là dung dịch H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại
bản mỏng như cũ để xác định vùng chất, sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp
phụ bằng dung mơi thích hợp.
Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel
pha thường và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical
Ltd.).
Hệ thống sắc ký lỏng trung áp (MPLC): Hệ thống bao gồm Detector UVvis bước sóng từ 200-900 nm, bộ lấy mẫu tự đồng (fraction collector) kèm theo
với các dãy ống nghiệm kích thước thay đổi tuy theo lượng mẫu, hệ thống bơm
(pump) với khả năng điều chỉnh áp từ 1 đến 10 bar, tốc độ dòng từ 1 ml/phút đến
16

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

200 ml/phút; Cột tách SNAP loại C8, C18 với dung lượng từ 100 g đến 450g mẫu
đầu vào.
Hệ thống lấy mẫu tự động (Fraction collector-DC1200). Mẫu được đưa qua
cột sắc ký bằng thủy tinh với pha tĩnh là silicagel pha thường hoặc pha đảo. Cơ
chế phân tách dựa trên sự tương tác giữa chất và pha tĩnh, dung môi với tỷ lệ phù
hợp. Mẫu được thu thập thông qua máy lấy mẫu tự động.
Các thiết bị sử dụng nêu trên thuộc viện Hóa sinh biển.
b. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Sử dụng kết hợp nhiều phương pháp phổ hiện đại như: Điểm nóng chảy
(Mp) đo trên máy Thermo Mel Temp 3.0.; Độ quay cực []D đo trên máy JASCO

P-2000 polarimeter; Phổ khối lượng (ESI-MS): Phổ khối lượng phun mù điện tử
(Electron Spray Ionization mass spectra) được đo trên máy AGILENT 1100
HPLCD Trap. Thiết bị của viện Hóa sinh biển.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR
(500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR
Spectrometer. Thiết bị của viện Hóa học.
Phổ tử ngoại đo trên máy JASCO V630 của viện Hóa sinh biển.
II.2.4.Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa
Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn
nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt
TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện bởi anti-proliferation KIT
theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất (Promega). Phép thử được thực hiện trong
điều kiện cụ thể như sau:
Bước 1: Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của
khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Chất thử có hoạt tính được xác
định IC50 nhờ dải nồng độ 100 g/ml; 20 g/ml; 4 g/ml; 0.8 g/ml.

17

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

Bước 2:Tế bào hỗn dịch được đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho
phù hợp với thí nghiệm.
Bước 3:Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l

môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3 ngày.
Bước 4:Một khay 96 giếng khác khơng có chất thử nhưng có TBUT (200 l)
sẽ được sử dụng làm đối chứng âm.
Bước 5:Thêm 20l dung dịch cơ chất MTS. Ủ ở 37oC trong 1-4 giờ. Sau đó
đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader
(Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515nm
hoặc 540nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định
thông qua công thức sau:
[OD(chất thử) – OD(mơi trường trắng)] x 100
% sống sót =
OD(đối chứng âm) - OD(môi trường trắng)
% ức chế = 100% - % sống sót
Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine
(Sigma) ln được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở
các nồng độ 10 g/ml; 2 g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml.
DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức
chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve.
Chất thử nào có IC50 < 20 g/ml (với chất chiết thơ, hoặc với phân đoạn hóa học)
hoặc IC50  4 g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc
tế bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt TBUT.

18

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh Tú

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
III.1. Xử lý mẫu, tạo dịch chiết phục vụ nghiên cứu
Việc xử lý các mẫu sinh vật biển được thực hiện theo quy trình thống nhất
đã được xây dựng qua các nhiệm vụ khoa học của Viện Hóa sinh biển, cụ thể:
Bước 1. Mẫu san hô mềm sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh âm sâu được tiến hành
rã đông bằng cách để trên bệ rửa thí nghiệm, cho nước sạch chảy đều trên bề mặt
của mẫu nghiên cứu. Mẫu được ngâm trong nước lạnh trong thời gian từ 2-3 tiếng
nhằm loại bỏ từ từ hàm lượng muối vô cơ.
Bước 2. Sau khi mẫu san hô mềm đã được rã đông, loại bỏ các phần túi
nylon và các thành phần sinh vật biển khác bám trên bề mặt của mẫu san hô mềm.
Lưu lại tiêu bản mẫu, để mẫu sinh vật biển lên mặt bàn thí nghiệm và chụp ảnh để
lưu phần mẫu trước khi xử lý.
Bước 3. Sau khi mẫu san hô mềm đã được loại bỏ các thành phần nylon và
các thành phần khác, mẫu được để trên túi lưới ở nhiệt độ phịng cho đến khi khơ
hết bề mặt của phần thân mẫu san hô mềm. Mẫu được cân để thu được khối lượng
thực tế trước khi tiến hành xử lý.
Bước 4. Mẫu được cắt nhỏ thành từ phiến, chiều rộng và dài của phiến tùy
theo độ cứng của mẫu san hô mềm. Các phiến càng mỏng thì khả năng làm khơ
mẫu và say mẫu càng thuận lợi.
Bước 5. Sấy và làm khô các mẫu san hô mềm. Các mẫu san hô mềm sau khi
đã được cắt thành các phiến nhỏ được chuyển vào túi lưới và tiến hành làm khô
sơ bộ bằng phương pháp sấy khô trên thiết bị tủ sấy chân không hoặc phơi dưới
điều kiện ánh sáng mặt trời (có tránh tia tử ngoại). Trong q trình sấy mẫu này,
khối lượng mẫu san hơ mềm giảm xuống rất nhanh.
Bước 6. Làm khô mẫu trên thiết bị đông khô. Trên cở sở các bước nghiên
cứu này từ mẫu san hô mềm Sinularia dissecta Tixier-Durivault tươi (1.5 kg) đã
được xử lý để tạo ra mẫu khô phục vụ cho các nghiên cứu về phân lập các hợp
chất.
19

Luận văn thạc sỹ Sinh học