Luận văn thạc sĩ sinh học nghiên cứu tinh sạch pullulan và tạo nano bạc pu agnps có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------------------

Nguyễn Mai Linh

“NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PULLULAN VÀ TẠO NANO BẠC
Pu-AgNPs CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH”

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

Hà Nội – 2021

Luận văn thạc sỹ Sinh học


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------------------

Nguyễn Mai Linh

“NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PULLULAN VÀ TẠO NANO BẠC
Pu-AgNPs CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH”

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
Hƣớng dẫn 1: TS. Đỗ Hữu Nghị

Hƣớng dẫn 2: PGS.TS Ngô Kim Chi

Hà Nội - 2021

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Lời cam đoan
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dƣới sự
hƣớng dẫn của PGS.TS Ngô Kim Chi và TS. Đỗ Hữu Nghị và không trùng
lặp với bất kỳ cơng trình khoa học nào khác. Các số liệu và kết quả nghiên
cứu nêu trong luận án là trung thực, chƣa đƣợc sử dụng để bảo vệ một học vị
nào, chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ một cơng trình nào khác.
Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2021

Tác giả

Nguyễn Mai Linh

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Lời cảm ơn
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới PGS.TS Ngô Kim Chi và TS. Đỗ Hữu Nghị
đang công tác và làm việc tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình chỉ bảo, động viên tơi
trong suốt q trình thực hiện luận văn.
Tơi xin cảm ơn Học Viện Khoa Học và Cơng nghệ, phịng Đào tạo, các
thầy giáo, cô giáo và cán bộ thuộc Khoa Công nghệ Sinh học tại Học Viện
Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
đã nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ tơi trong q trình học tập tại học viện.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tồn thể các anh chị nhân viên phịng thí
nghiệm đã giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình nghiên cứu.
Cuối cùng tơi xin gửi lời cảm ơn tới những ngƣời thân trong gia đình
đã ln là điểm tựa tinh thần vững chắc, chăm lo, động viên tôi, và tồn thể
bạn bè đã cộng tác giúp đỡ tơi trong thời gian thực hiện luận văn này.
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2021

Học viên

Nguyễn Mai Linh

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt
AgNPs: Các hạt nano bạc
Pu-AgNPs: Các hạt nano bạc sử dụng pullulan làm chất khử/chất ổn định

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Danh mục các bảng
Bảng 1.1: Tính chất điển hình của pullulan ...................................................... 9
Bảng 2.1: Tỷ lệ pha loãng đƣờng glucose…………………………………...39
Bảng 2.2: Pha dung dịch Pullulan ở các nồng độ khác nhau .......................... 41
Bảng 3.1: So sánh quá trình thu hồi sản phẩm rắn bằng…………………….52
Bảng 3.2: Khả năng thu hồi pullulan bởi các dung môi khác nhau ................ 53
Bảng 3.3: Kết quả đo độ nhớt của dung dịch pullulan 10% ........................... 54
Bảng 3.4: Kết quả đo độ hấp thụ quang của ................................................... 55
Bảng 3.5: So sánh phổ FT-IR của mẫu thử nghiệm và mẫu chuẩn ................ 57
Bảng 3.6: So sánh phổ FT-IR của mẫu thử nghiệm với mẫu chuẩn và các
nghiên cứu khác .............................................................................................. 62
Bảng 3.7: Kết quả đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của nano bạc PuAgNPs ............................................................................................................. 64

Luận văn thạc sỹ Sinh học


Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1.1: Sản phẩm pullulan dạng bột.............................................................. 7
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học đơn giản của pullulan............................................ 8
Hình 1.3: Các sản phẩm thực phẩm có sử dụng pullulan ............................... 10
Hình 1.4: Vỏ bao thuốc sử dụng pullulan ....................................................... 11
Hình 1.5: Nấm Aureobasidium pullulans trên đĩa thạch (ảnh phải) và hình ảnh
hiển vi điện tử quét (SEM) của khuẩn ty và bào tử nấm (ảnh trái)................. 14
Hình 1.6: Cơ chế sinh tổng hợp pullulan giả định từ nghiên cứu của ............ 15
Hình 1.7: Sơ đồ khối quy trình tinh sạch và thu nhận pullulan ...................... 18
Hình 1.8: Cơ chế kháng khuẩn của vật liệu nano bạc ..................................... 21
Hình 2.1: Giới hạn của định luật Beer về sự hấp thụ quang…………………36
Hình 2.2: Đƣờng chuẩn của pullulan .............................................................. 42
Hình 2.3: Hệ đo độ nhớt bằng nhớt kế ............................................................ 43
Hình 2.4:Mơ tả thí nghiệm .............................................................................. 45
Hình 3.1: Sản phẩm thu đƣợc sau quá trình lên men………………………..49
Hình 3.2: Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đối với quá trình tẩy màu ............. 50
Hình 3.3: Ảnh hƣởng của nồng độ H2O2 đối với quá trình tẩy màu ............... 51
Hình 3.4: Hiệu suất thu nhận pullulan khi sử dụng 2 dung mơi khác nhau .... 53
Hình 3.5: Mẫu giấy chạy sắc ký ...................................................................... 54
Hình 3.6: Phổ hồng ngoại FT-IR của pulluulan tinh sạch .............................. 56
Hình 3.7: Phổ hồng ngoại FT-IR của pullulan tiêu chuẩn .............................. 56
Hình 3.8: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau phản ứng ở các ................. 58
Hình 3.9: Ảnh hƣởng của nồng độ pullulan tới quá trình tổng hợp Pu-AgNP58
Hình 3.10: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau phản ứng ở các ............... 59

Luận văn thạc sỹ Sinh học

Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nồng độ AgNO3 tới quá trình tổng hợp Pu-AgNP
......................................................................................................................... 59
Hình 3.12: Sự thay đổi màu sắc của dung dịch sau phản ứng ở các ............... 60
Hình 3.13: Ảnh hƣởng của thời gian tới quá trình tổng hợp Pu-AgNP .......... 60
Hình 3.14: Kích thƣớc hạt nano Pu-AgNPs .................................................... 61
Hình 3.15: Kết quả phân tích phổ FT-IR của nano bạc Pu-AgNPs ................ 62

Luận văn thạc sỹ Sinh học


1

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 5
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 7
1.1. TỔNG QUAN VỀ PULLULAN............................................................ 7
1.1.1. Cấu trúc hóa học của pullulan ..................................................... 7
1.1.2. Tính chất của pullulan .................................................................. 8
1.1.3. Ứng dụng của pullulan ............................................................... 10
1.1.3.1. Ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm ........................ 10
1.1.3.2. Ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm, y học ............ 11
1.1.3.3. Ứng dụng trong một số ngành công nghiệp khác ...................... 12
1.2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT PULLULAN TRÊN THẾ GIỚI ............. 13
1.2.1. Tình hình sản xuất pullulan trên thế giới ................................. 13
1.2.2. Giới thiệu chủng giống Aureobasidium pullulans..................... 13
1.2.3. Cơ chế lên men sinh tổng hợp pullulan..................................... 15
1.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch và thu hồi pullulan.............................. 17
1.3. TỔNG QUAN VỀ NANO BẠC .......................................................... 19
1.3.1. Tính chất của nano bạc............................................................... 19

1.3.2. Nano bạc đối với sức khỏe con ngƣời. ....................................... 22
1.3.3. Ứng dụng của nano bạc .............................................................. 23
1.3.3.1. Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm ................................... 24
1.3.3.2. Ứng dụng trong đồ gia dụng, sản xuất hàng tiêu dùng ............. 24
1.3.3.3. Ứng dụng trong y tế ................................................................... 24
1.4. GIỚI THIỆU VỀ CÁC PHƢƠNG PHÁP TẠO NANO...................... 25
1.4.1. Các phƣơng pháp tạo hạt nano từ polysaccharide .................. 25
1.4.1.1. Tổng hợp hạt nano từ sự hóa keo các giọt nhũ tương ............... 25

Luận văn thạc sỹ Sinh học


2

1.4.1.2. Tổng hợp hạt nano nhờ liên kết cộng hóa trị ............................. 26
1.4.1.3. Tổng hợp hạt nano nhờ liên kết ion ........................................... 27
1.4.2. Các phƣơng pháp chế tạo nano bạc .......................................... 27
1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ LỰA CHỌN
PHƢƠNG PHÁP CỦA ĐỀ TÀI ................................................................. 28
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 32
2.1. VẬT LIỆU ........................................................................................... 32
2.1.1. Nguyên liệu sử dụng .................................................................... 32
2.1.2. Hóa chất ....................................................................................... 32
2.1.3. Trang thiết bị sử dụng ................................................................ 32
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 33
2.2.1. Phƣơng pháp tinh sạch pullulan ................................................ 33
2.2.2. Phƣơng pháp tẩy màu sản phẩm của quá trình lên men ........ 34
2.2.3. Phƣơng pháp kết tủa thu hồi sản phẩm .................................... 37
2.2.4. Phƣơng pháp xác định đƣờng sót bằng DNS ........................... 38

2.2.5. Phƣơng pháp xác định và kiểm tra chất lƣợng pullulan......... 40
2.2.5.1. Xác định pullulan theo phương pháp enzyme đặc hiệu
pullulanase .............................................................................................. 40
2.2.5.2. Định lượng pullulan theo phương pháp phenol sulfuric axit .... 41
2.2.5.3. Xác định độ nhớt bằng nhớt kế .................................................. 42
2.2.5.4. Định lượng đường Mono-, di-, và oligosaccharide theo phương
pháp anthrone-sulfuric axit ..................................................................... 43
2.2.5.5. Xác định khối lượng pullulan bằng phương pháp sấy ............... 44
2.2.6. Phƣơng pháp tạo nano bạc Pu-AgNPs ...................................... 45
2.2.7. Phƣơng pháp xác định sản phẩm .............................................. 46

Luận văn thạc sỹ Sinh học


3
2.2.7.1. Phương pháp xác định cấu trúc đặc trưng của sản phẩm bằng
phổ hấp thụ hồng ngoại FT-IR ................................................................ 46
2.2.7.2. Phương pháp xác định kích thước hạt nano bạc Pu-AgNPs bằng
phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) ................................................ 46
2.2.8. Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật ................. 46
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 49
3.1. KẾT QUẢ TINH SẠCH, THU NHẬN, XÁC ĐỊNH VÀ KIỂM TRA
CHẤT LƢỢNG PULLULAN .................................................................... 49
3.1.1. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tẩy màu
sản phẩm lên men .................................................................................. 49
3.1.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đối với quá trình tẩy màu......... 49
3.1.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đối với quá trình tẩy màu .......... 50
3.1.2. Kết quả lựa chọn dung môi thu nhận pullulan ........................ 52
3.1.3. Kết quả kiểm tra chất lƣợng pullulan ....................................... 54
3.1.3.1. Kết quả phân tích định tính ........................................................ 54

3.1.3.2. Kết quả xác định độ nhớt ........................................................... 54
3.1.3.3. Xác định hàm lượng pullulan..................................................... 55
3.1.3.4. Kết quả phân tích cấu trúc phổ hồng ngoại FT-IR của pullulan
................................................................................................................. 56
3.2. KẾT QUẢ TẠO NANO BẠC Pu-AgNPs ........................................... 57
3.2.1. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nồng độ pullulan tới quá
trình tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs .................................................... 57
3.2.2. Kết quả xác định ảnh hƣởng của nồng độ AgNO3 tới quá trình
tổng hợp nano bạc Pu-AgNPs .............................................................. 59
3.2.3. Kết quả xác định ảnh hƣởng của thời gian tới phản ứng tạo
nano bạc Pu-AgNPs............................................................................... 60
3.2.4. Kết quả xác định kích thƣớc hạt nano bạc Pu-AgNPs ............ 61

Luận văn thạc sỹ Sinh học


4
3.2.5. Kết quả xác định cấu trúc của hạt nano bạc Pu-AgNPs ......... 62
3.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA
NANO BẠC Pu-AgNPs .............................................................................. 63
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 65
4.1. KẾT LUẬN .......................................................................................... 65
4.2. KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 66
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 67

Luận văn thạc sỹ Sinh học


5
MỞ ĐẦU

Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng
các công nghệ hiện đại để đáp ứng nhu cầu của con ngƣời ngày càng đƣợc
nâng cao. Các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên dần đƣợc thay thế cho các
hợp chất có nguồn gốc hóa học. Theo tổ chức y tế thế giới, nhu cầu sử dụng
các hợp chất từ thiên nhiên trong công nghệ thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm
là một xu thế tất yếu, đặc biệt là các hợp chất tự nhiên đƣợc tổng hợp từ vi
sinh vật đang là điểm đến của các nhà nghiên cứu.
Bên cạnh đó, cơng nghệ nano hiện nay đang trở thành một công nghệ
mới nổi và đang tạo ra một cuộc cách mạng trong những ứng dụng y sinh học
nhờ vào khả năng giúp con ngƣời can thiệp tại kích thƣớc nano đƣợc sử dụng
trong chẩn đoán và điều trị bệnh. Các nhà khoa học mong muốn có đƣợc sự
giao thoa giữa cơng nghệ sinh học và công nghệ nano bởi lẽ công nghệ nano
mang lại cho sinh học những công cụ mới trong khi sinh học cho phép công
nghệ nano đạt đƣợc các hệ thống có chức năng mới.
Bạc từ lâu đã thể hiện tính chất kháng khuẩn và đƣợc ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực của đời sống, tuy nhiên khi ở trạng thái phân tán với kích
thƣớc nano thì tính kháng khuẩn lại thể hiện mạnh mẽ hơn. Việc tổng hợp các
hạt có kích thƣớc nano từ trƣớc đến nay đều đƣợc thực hiện theo các phƣơng
pháp vật lý, hóa học truyền thống độc hại, chi phí cao, khơng thân thiện với
mơi trƣờng. Bên cạnh đó, các polysaccharide đƣợc nấm bài tiết dƣới dạng các
chất polyme tái tạo là các hợp chất sinh học an tồn, thân thiện với mơi
trƣờng đƣợc chứng minh là có tính khử và ổn định các hạt nano đƣợc tổng
hợp. Các phƣơng pháp tƣơng thích sinh học này đã đƣợc nghiên cứu ở một số
nơi trên thế giới, tuy nhiên ở Việt Nam chƣa có nhiều nghiên cứu theo hƣớng
này.
Xuất phát từ những yêu cầu thực tế cấp thiết đặt ra, tôi nghiên cứu và
thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tinh sạch pullulan và tạo nano bạc Pu-AgNPs
có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định”. Nghiên cứu đƣợc thực hiện với
các nội dung chính sau:

Luận văn thạc sỹ Sinh học


6
1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tinh sạch và thu nhận
pullulan đƣợc lên men sinh tổng hợp từ chủng nấm Aureobasidium pullulans.
2. Nghiên cứu tổng hợp các hạt nano bạc sử dụng pullulan làm chất
khử/chất ổn định và các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tạo nano bạc PuAgNPs.
3. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của nano bạc Pu-AgNPs tổng
hợp đƣợc.

Luận văn thạc sỹ Sinh học


7
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ PULLULAN
Pullulan là một polymer sinh học phân tử lƣợng lớn, có cơng thức hóa
học (C6H10O5)n sản xuất bằng lên men hiếu khí từ tinh bột, đƣờng với chủng
nấm Aureobasidium pullulans [1]. Pullulan có khả năng tạo liên kết sợi, tạo
màng mỏng phân hủy tốt. Pullulan tan tốt trong nƣớc lạnh, tạo dịch keo nhớt,
độ dính cao, trong suốt, chịu mơi trƣờng pH dao động từ 2-12. Màng pullulan
ngăn khơng khí thâm nhập, phủ bên ngồi sản phẩm chống oxy hóa, chống
chảy nƣớc, tăng cƣờng khả năng chống mất màu của sản phẩm, sản xuất
màng bao gói kẹo, bánh, thực phẩm. Trong cơng nghệ mỹ phẩm, với khả năng
kết dính cao pullulan đƣợc ứng dụng trong sản xuất dầu gội đầu, làm chất tạo
sợi, tạo bọt. Pullulan đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm, và
các ngành công nghiệp dƣợc phẩm, và đang đƣợc ứng dụng trong y sinh học
nhƣ trong cơng nghệ chuyển gen, dẫn thuốc tới đích, kỹ thuật mơ, kỹ thuật
hình ảnh, làm vỏ thuốc, làm chất cân bằng áp suất trong máu [2]…

Hình 1.1: Sản phẩm pullulan dạng bột
1.1.1. Cấu trúc hóa học của pullulan
Pullulan là một polysaccharide mạch thẳng đƣợc cấu tạo bởi chủ yếu
các đơn vị maltotriose và một phần nhỏ các đơn vị maltotetraose theo liên kết

Luận văn thạc sỹ Sinh học


8
α-1,6 glucoside. Các đơn vị này đƣợc cấu tạo từ các đơn vị glucose theo liên
kết α-1,4 glucoside [3].
Polysaccharide ngoại bào của chủng nấm A. pullulans có hai dạng sản
phẩm: polysaccharide dị hình và glucan trung hịa. Glucan trung hịa đƣợc gọi
là pullulan, chứa liên kết α-1,6 glucoside và α-1,4 glucoside. Pullulan đƣợc
xác định dựa trên cơ sở quay cực, thủy phân axit fomic, phổ hồng ngoại,
phƣơng pháp phân tích methyl hóa. Ngƣời ta đã đƣa ra tỷ lệ liên kết α-1,4 : α1,6 glucoside trong phân tử pullulan là 3:2 dựa trên phƣơng pháp methyl hóa
và oxy hóa [4].

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học đơn giản của pullulan
Khối lƣợng phân tử của pullulan dao động trong khoảng 2,5.105 –
4,5.105 dalton tùy thuộc vào thời gian lên men, pH và nồng độ photphat [4].
1.1.2. Tính chất của pullulan
Pullulan bị phá hủy ở nhiệt độ cao 250-280oC. Pullulan không mùi,
không vị, hịa tan trong nƣớc, khơng hịa tan trong dung mơi hữu cơ trừ
dimethylfocmandehide và dimethylsulfoxide [2]. Dung dịch pullulan nhớt
nhƣng không tạo gel và ổn định. Độ nhớt của pullulan phụ thuộc vào khối
lƣợng phân tử của pullulan. Pullulan có khả năng hình thành 1 màng film
trong suốt. Dung dịch pullulan có sức căng bề mặt cao và ổn định tốt, độ nhớt
của nó khơng thay đổi khi có mặt các ion kim loại khác nhau có trong dung

dịch. Với khả năng kết dính cao nên có thể nén trực tiếp dƣới nhiệt có ẩm.

Luận văn thạc sỹ Sinh học


9

Pullulan có thể tạo thành các loại vật liệu có hình dạng khác nhau. Pullulan
tạo thành màng có tính chất ngăn ngừa, khơng cho khơng khí thấm qua [5].
Nhiều viên nang đƣợc làm từ pullulan đƣợc sử dụng thay cho gelatin
phù hợp cho bệnh nhân tiểu đƣờng và bệnh nhân có chế độ ăn hạn chế,
Pullulan tan rất cao trong nƣớc do đó đƣợc sử dụng nhƣ một chất mang thuốc
và giúp kiểm soát nồng độ trong huyết tƣơng. Pullulan đã đƣợc nghiên cứu
nhƣ là chất nền tảng để xây dựng chế phẩm keo phân phối thuốc nhạy cảm
với pH, tạo hạt nano, quá trình khớp nối lắp ráp với các hợp chất sinh học
phân phối thuốc chống ung thƣ. Hiện nay việc ứng dụng pullulan trong lĩnh
vực y sinh học đang gia tăng nhờ có tính khơng độc hại, khơng kích thích
miễn dịch, tƣơng thích sinh học và có tính trơ tự nhiên. So với dextran, tốc độ
phân huỷ của pullulan trong huyết thanh nhanh hơn so với dextran [5].
Bảng 1.1: Tính chất điển hình của pullulan [4]
Tính chất

Giá trị

Trạng thái

Dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng

Sự hòa tan trong nƣớc (25oC)

Dễ tan

Độ ẩm

< 6%

Chất tro

< 3%

Protein

< 0,5%

Kim loại nặng

< 5pp

Arenic

< 2ppm

Độ nhớt của dung dịch 10% ở 30oC

132-179 mm2/s

Trọng lƣợng phân tử

10-3000 kDa

Luận văn thạc sỹ Sinh học


10
1.1.3. Ứng dụng của pullulan
1.1.3.1. Ứng dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm
Với tính chất tạo đƣợc màng mỏng, ngăn cản đƣợc sự tiếp xúc của oxy
với sản phẩm, pullulan đƣợc coi là chất lý tƣởng để bao gói bảo quản, phủ
bên ngoài hoàn hảo cho các sản phẩm thực phẩm chống oxy hóa nhất là các
sản phẩm có dầu, làm nổi trội màu và tăng cƣờng khả năng chống mất màu
của sản phẩm. Do có khả năng ngăn cản khơng khí thấm qua nên màng
pullulan cịn đƣợc dùng nhiều trong việc giữ hƣơng, làm giảm mất mùi vị của
sản phẩm và đồng thời tránh đƣợc sự oxy hóa chất béo và các chất dầu có
trong thực phẩm, làm tăng thời hạn sử dụng. Ngoài ra do màng pullulan giữ
đƣợc hình dạng trong suốt nên cịn đƣợc ứng dụng để trang trí, vẽ tranh lên
sản phẩm nhất là trong cơng nghiệp sản xuất bánh kẹo. Dịch pullulan không
màu, không mùi, có thể tạo lớp áo bóng, đẹp, bền màu cho sản phẩm. Pullulan
tiêu hóa chậm khơng làm tăng glucoza trong máu khi ăn, ít calo có thể sử
dụng khi pha chế làm thực phẩm cho ngƣời bị bệnh tiểu đƣờng. Khả năng kết
dính cao nên dùng để giữ hình dạng khác nhau của các sản phẩm: viên thịt,
viên cá trong chế biến đồ hộp, thức ăn nhanh, xúc xích. Pullulan dùng cho đồ
uống, cream, nƣớc sốt làm tăng độ nhớt, độ ổn định, ức chế nấm phát triển và
là nguyên liệu tuyệt vời cho bảo quản thực phẩm [6].

Hình 1.3: Các sản phẩm thực phẩm có sử dụng pullulan

Luận văn thạc sỹ Sinh học


11

1.1.3.2. Ứng dụng trong ngành công nghiệp dược phẩm, y học

Hình 1.4: Vỏ bao thuốc sử dụng pullulan
Ứng dụng trong kỹ thuật mô và cấy ghép: Heparin kết hợp với pullulan
ức chế sự tăng sinh của các tế bào cơ trơn và do đó có thể đƣợc sử dụng nhằm
mục đích gia tăng các tế bào nội mơ mạch máu và ức chế sự tăng sinh của các
tế bào cơ trơn [7].
Pullulan được coi như một vật liệu để phân phối thuốc: Các hydrogel
pullulan nhƣ các hệ thống phân phối thuốc, đặc biệt ở dạng gel nhỏ và gel
nano. Lợi ích điều trị đạt đƣợc bằng cách phân phối thuốc chậm vào huyết
tƣơng, và do đó làm thay đổi nồng độ các cấu hình thuốc. Hạt nano hydrogel
của liên kết chéo giữa pullulan với glutaraldehyde đã đƣợc nghiên cứu tổng
hợp để phát triển một hệ thống vận chuyển DNA tƣơng thích sinh học và sự
ổn định. Đặc biệt, pullulan amphiphilic thu đƣợc từ cholesteryl, acetyl hoặc
chloroacetyl ghép với nhóm hydroxyl tạo thành nanogel có khả năng bẫy các
phân tử kị nƣớc, các protein hoặc các peptide và axit nucleic [7].
Thuốc chống ung thư dựa vào pullulan: Các hợp chất sinh học đƣợc
tổng hợp bởi các dẫn xuất pullulan với doxorubicin hoặc doxorubicin với axit
folic. Những phát hiện này cho thấy rằng các hợp chất sinh học doxorubicinpullulan phù hợp cho mục đích tiêu khối u thụ động. [7].

Luận văn thạc sỹ Sinh học


12
Ứng dụng của pullulan trong chuyển gen [7]: Liệu pháp gen là một
lĩnh vực mà các ứng dụng của pullulan đang đƣợc nghiên cứu. Chuyển gen
thƣờng đƣợc chuyển trung gian qua đƣờng nội bào. Những cố gắng sử dụng
liệu pháp gen virus đã đƣợc thực hiện nhƣng nhƣợc điểm lớn mà virus đƣợc
biết đến nhƣ là miễn dịch, gây bệnh và có thể nguy hiểm.Vì vậy, cố gắng để
phát triển vectơ không virus đƣợc thực hiện và các dẫn xuất của các cation

polyme tự nhiên đã đƣợc nghiên cứu. Pullulan trở thành chất sinh học thích
hợp và khơng độc hại đƣợc nghiên cứu để áp dụng chuyển gen. Dẫn xuất
pullulan trong đó có dƣ lƣợng kim loại và trộn với một DNA plasmid trong
dung dịch chứa các ion Zn2+ để có đƣợc sự kết hợp của dẫn xuất pullulan và
DNA plasmid phối hợp với Zn2+.
Ngoài ra, trong y học Pullulan cịn đƣợc sử dụng để duy trì áp suất
thẩm thấu ở trong máu và mơ tế bào và có thể làm tăng cung cấp huyết tƣơng.
Nó đƣợc tạo ra bằng cách hịa tan pullulan có phân tử lƣợng từ 3000-9000
trong dung dịch muối sinh lý để tạo nên dịch pullulan 4-10%. Sau đó đem tiệt
trùng, dung dịch này đƣợc tiêm vào tĩnh mạch một cách lặp đi lặp lại với sự
an tồn tuyệt đối. Pullulan có thể đƣợc chuyển hóa và bài tiết hoàn toàn.
Gần đây, aureobasidins là những chất kháng sinh tự nhiên đƣợc tách ra
từ dịch lên men của chủng A. pullulans R106 đƣợc phân lập từ lá cây của
Nhật Bản. Aureobasidins có hoạt tính chống mốc cao, chống lại bệnh nấm
Candida albicans [8].
1.1.3.3. Ứng dụng trong một số ngành công nghiệp khác
Các dẫn xuất của pullulan đƣợc este hóa có thể đƣợc sử dụng trong
cơng nghiệp sản xuất hồ dán, sử dụng làm chất nền cho các loại giấy khác
nhau. Giấy pullulan có tính thấm cao nên phù hợp cho việc in ấn và viết. Ứng
dụng cụ thể nhƣ sau:
- Trong công nghiệp dệt: là tác nhân hồ vải.
- Trong cơng nghiệp sản xuất chất kết dính: Pullulan có trong chất dán
khơ và chất dán giữ ẩm cho các nhãn hàng, tem thƣ, phong bì…

Luận văn thạc sỹ Sinh học


13
- Trong cơng nghiệp sản xuất sơn: Pullulan có trong sơn nƣớc tạo với
sự tạo thành các màng có thể tơ màu, trang trí.

- Trong cơng nghiệp sản xuất in ấn: Pullulan có trong thành phần thấm
nƣớc.
1.2. CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT PULLULAN TRÊN THẾ GIỚI

1.2.1. Tình hình sản xuất pullulan trên thế giới [4]
Năm 1938, R.Bauer là ngƣời đầu tiên nghiên cứu về pullulans. Có
nhiều nƣớc sử dụng chủng A. pullulans để sinh tổng hợp pullulan.
Năm 1977, Nhật Bản sử dụng chủng A. pullulans IFO 4464 để sinh
tổng hợp pullulan, nguồn cacbon sử dụng là siro glucose DE 45, lên men
trong 4 ngày thu đƣợc dịch pullulan 6%.
Năm 1987, Hàn Quốc cũng sử dụng chủng trên nhƣng với nguồn
cacbon là saccaroza 5%, nhiệt độ lên men 28oC, lắc 200 vòng/phút thì chỉ thu
đƣợc lƣợng pullulan là 27,5 g/l.
Năm 2003, các nhà khoa học tại trƣờng Đại học Ege – 35000 Bernova
Izmin – Turkey sử dụng chủng A. pullulans P56 với nguồn cacbon là 50 g/l
saccaroza, lắc 200 vịng/phút thì thu đƣợc lƣợng pullulan là 21,4 g/l.
Năm 2009, tại Ấn Độ sử dụng chủng A. pullulans MTCC 2195 với
nguồn nguyên liệu là nƣớc dừa, sau 6 ngày lên men lƣợng pullulan thu đƣợc
là 58 g/l.
1.2.2. Giới thiệu chủng giống Aureobasidium pullulans
Aureobasidium pullulans thuộc ngành nấm túi Ascomycota nhƣng hình
thái giống với nấm men, có màu đen và có thể đƣợc phân lập ở các vùng ôn
đới, vùng nhiệt đới và vùng khô cằn, ở các môi trƣờng khác nhau: nƣớc bẩn,
không khí, biển và các loại đất khác nhau. Trong tự nhiên, chúng đƣợc biết là
những loại nội ký sinh của nhiều cây thực vật (nhƣ táo, nho, dƣa chuột, đậu
đỗ, bắp cải) mà không gây ra bất kỳ triệu chứng nào của bệnh. A. pullulans có
những thuộc tính của nấm nhƣ sự sắp xếp bào tử đính, ngƣời ta đã thấy nó có
hình dạng, cấu tạo giống với Ascomycotina.

Luận văn thạc sỹ Sinh học

14
A. pullulans là loại hiếu khí bắt buộc, ƣa ấm, sinh bào tử, sinh sản hữu
tính bằng bào tử. Thay đổi kiểu hình của lồi này cũng rất đáng chú ý. Hình
thái khuẩn lạc có thể bị ảnh hƣởng bởi nguồn cacbon, tuổi của khuẩn lạc,
nhiệt độ, ánh sáng và cơ chất với các khuẩn lạc thay đổi từ đồng nhất đến
phân cụm. Bên cạnh đó những hình thái của chúng cũng thích nghi với điều
kiện mơi trƣờng khắc nghiệt nhƣ: khoảng pH rộng, độ muối cao, axit và kiềm,
nhiệt độ thấp và nghèo dinh dƣỡng, lƣợng tia UV cao. Do đó chúng đƣợc coi
là lồi có khả năng chịu đa điều kiện khắc nghiệt.

Hình 1.5: Nấm Aureobasidium pullulans trên đĩa thạch (ảnh phải) và hình ảnh
hiển vi điện tử quét (SEM) của khuẩn ty và bào tử nấm (ảnh trái) [9]

Luận văn thạc sỹ Sinh học


15
1.2.3. Cơ chế lên men sinh tổng hợp pullulan

Glucose 6-phosphate

Fructose 1,6diphosphate

Glucose 1-phosphate

UDP-Glucose

Fructose 6-phosphate

LPh

UDP
Fructose 1-phosphate

LPh-Glc
UDPG

Fructose

UDP
LPh-Glc-(6 1)-Glc
(isomaltosyl)

Monosaccharide

LPh-Glc-(6 1)-Glc-(4
(isopanosyl)

Polysaccharide

Pullulan

UDPG : uridin diphosphate glucose
UDP : uridin diphosphate
Hình 1.6: Cơ chế sinh tổng hợp pullulan giả định từ nghiên cứu của
Catley và cộng sự [10]

Luận văn thạc sỹ Sinh học

1)-Glc


16
Con đƣờng sinh tổng hợp pullulan vẫn chƣa đƣợc giải thích rõ ràng.
Các nhà nghiên cứu đƣa ra giả thuyết rằng chất vận chuyển – lipid có liên
quan tới sự sinh tổng hợp pullulan. Catley và cộng sự, những ngƣời đã tách
đƣợc glycolipid từ A. pullulans đã mở rộng giả thuyết cơ chế tạo thành
pullulan từ chủng giống này và đƣa ra giả thuyết để tạo thành pullulan cần có
chất mang lipid - phosphate. Glycolipid liên kết với glucose và các
oligosaccharide khác nhƣ isomaltose, panose, isopanose bởi liên kết
pyrophosphate. Do vậy, để tạo thành mạch polysaccharide, A.pullulans
không phải chỉ tạo liên kết α-1,4 và α-1,6-glucoside để đơn giản nối các
monome lại với nhau. Giai đoạn đầu nhờ có lipid – phosphate sẽ biến đổi cơ
chất thành lipid – pyrophosphate – isopanose và lipid – pyrophosphate –
panose. Sau đó chất mang đƣợc tách ra và tạo thành panose và isopanose, hai
chất này đƣợc trùng hợp tạo oligosaccharide trong phân tử pullulan. Ông đã
chứng minh những chất đó là chất trung gian để sinh tổng hợp pullulan [11].
Có thể dự đốn rằng lipid kỵ nƣớc giúp vận chuyển các chất qua màng
tế bào chất, đây là yêu cầu cơ bản cho các polysaccharide ngoại bào. Tuy
nhiên, nơi sinh tổng hợp pullulan là ở trong màng tế bào chất hay bên ngoài
màng tế bào và tầm quan trọng của thành tế bào vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ.
Thêm nữa, enzyme liên quan đến sự sinh tổng hợp pullulan vẫn chƣa
đƣợc biết đến dù rằng chắc chắn chúng có tồn tại. Việc nghiên cứu về cơ chế
sinh tổng hợp pullulan vẫn đang tiếp tục. Nếu có thể làm sáng tỏ cơ chế đó sẽ
đƣa việc sản xuất pullulan lên một bƣớc tiến cao hơn, tăng độ tinh sạch của
pullulan và loại trừ vấn đề nhiễm bẩn melanin.
Catley và cộng sự cho rằng sự tạo thành pullulan ở bên trong hay bên
ngoài tế bào chất trong quá trình tổng hợp là chƣa rõ ràng. Tuy nhiên họ

khẳng định sự tạo thành pullulan phụ thuộc nhiều vào thành tế bào vì sản
phẩm đƣợc tạo ra bởi chủng A.pullulans ở trong thành tế bào nhiều hơn.
Nhƣng Frinkleman và Vardanis thì cho rằng thể nguyên sinh và cả tế bào có
thể tổng hợp nên pullulan mặc dù kích thƣớc phân tử khác nhau [12].

Luận văn thạc sỹ Sinh học


17
1.2.4. Phƣơng pháp tinh sạch và thu hồi pullulan [11]
Một số tác giả sử dụng phƣơng pháp sau để thu hồi pullulan sau quá
trình lên men bởi chủng A.pullulans: Dịch lên men nhận đƣợc chứa pullulan
đƣợc ly tâm để tách tế bào nấm mốc, tẩy màu. Sau đó pullulan đƣợc tách ra
bằng phƣơng pháp kết tủa pullulan bởi dung môi methanol, etanol, axeton.
Tuy nhiên với phƣơng pháp này pullulan nhận đƣợc vẫn chứa 40-60%
nƣớc, thậm chí cả dung mơi bổ sung vào, ngồi ra cịn chứa một lƣợng tạp
chất đƣờng, tri-, di-, monosaccharide, các chất vô cơ, protein, chất màu. Các
chất này tồn tại trong kết tủa pullulan khó tách ra và làm sạch, đặc biệt lƣợng
nƣớc lớn nằm trong khối bầy nhầy, rất khó để xử lý nhiệt. Các phƣơng pháp
này đòi hỏi bổ sung một lƣợng rất lớn các dung môi hữu cơ, thƣờng gấp từ
hai đến ba lần thể tích dịch lên men. Mặc dù các dung mơi có thể thu hồi bằng
chƣng cất nhƣng đó vẫn là một bất lợi trong chi phí sản xuất. Việc bổ sung
methanol gấp khoảng ba lần thể tích dịch lên men cho kết tủa pullulan dễ
dàng và gần nhƣ hoàn toàn đƣợc ghi nhận.
Các sắc tố hiện diện trong dung dịch lên men đƣợc hấp phụ vào và kết
tủa với pullulan gây khó khăn cho việc tẩy màu pullulan này. Hơn nữa, ngay
cả bổ sung than hoạt tính hoặc H2O2 để tẩy màu trƣớc khi lọc cũng rất khó vì
dịch lên men có độ nhớt cao, do đó địi hỏi phải pha lỗng đến mức độ nào
đó. Hiện nay chƣa có tài liệu nào nói về tỷ lệ than hoạt tính hoặc H2O2 cần
thiết trong q trình tẩy màu. Tuy nhiên trong sản xuất maltodextrin, có

nguồn gốc từ tinh bột nhƣ pullulan thì đều đƣợc tẩy màu bằng than hoạt tính
hoặc H2O2 ở 800C, thời gian từ 20-30 phút. Dịch đƣờng fructose thu hồi đƣợc
sau q trình đƣờng hóa đƣợc tẩy màu bằng than hoạt tính hoặc H2O2 ở 800C
trong thời gian 30 phút rồi lọc bằng máy lọc chân không là các kinh nghiệm
tốt khi áp dụng trong việc tinh sạch và thu nhận pullulan.
Hình 1.7 sau đây thể hiện quy trình tinh sạch và thu nhận pullulan của
dự án SXTN “Hồn thiện cơng nghệ sản xuất pullulan và ứng dụng trong
sản xuất một số sản phẩm thực phẩm” của Viện Hóa học các hợp chất thiên
nhiên – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Luận văn thạc sỹ Sinh học