Luận văn thạc sĩ sinh học thực nghiệm nghiên cứu sử dụng chỉ thị its để đánh giá quan hệ di truyền và nhận dạng một số mẫu giống cây óc chó thu thập tại các tỉnh miền núi phía bắc

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

ận

Lu
vă

n

Nguyễn Thị Thu Thủy

th

ạc

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHỈ THỊ ITS ĐỂ ĐÁNH GIÁ QUAN HỆ
DI TRUYỀN VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ MẪU GIỐNG CÂY
ÓC CHÓ THU THẬP TẠI CÁC TỈNH MIỀN NÚI PHÍA BẮC

sỹ

nh

Si

c

Hà Nội – 2019

họ

LUẬ N VĂ N THẠ C SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

ận

Lu
vă

Nguyễn Thị Thu Thủy

n
ạc

th

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG CHỈ THỊ ITS ĐỂ ĐÁNH GIÁ QUAN HỆ
DI TRUYỀN VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ MẪU GIỐNG CÂY
ÓC CHÓ THU THẬP TẠI CÁC TỈNH MIỀN NÚI PHÍA BẮC

sỹ
: Sinh học thực nghiệm

Mã số

: 8420114

Hướng dẫn 1: PGS.TS. Khuất Hữu Trung
Hướng dẫn 2: PGS.TS. Đồng Văn Quyền

Hà Nội - 2019

c

NGƯỜI HƯỚNG DẪ N KHOA HỌC

họ

LUẬ N VĂ N THẠ C SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

nh

Si

Chuyên ngành

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân
tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Khuất Hữu Trung và PGS.TS. Đồng
Văn Quyền. Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung
thực. Kết quả nghiên cứu này khơng trùng với bất cứ cơng trình nào đã được
cơng bố trước đó.
Tơi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình.

ận

Lu

tháng

Hà Nội,

năm 2019

Tác giả

n

vă
th

ạc

Nguyễn Thị Thu Thủy

sỹ
nh

Si
c

họ


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Học viện Khoa học và Công
nghệ, Viện Di truyền Nông nghiêp, các thầy giáo, cô giáo đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tơi được học tập và hồn thành khóa học này.

Lu

Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Khuất Hữu Trung –
Phó viện trưởng – Viện Di truyền Nông nghiệp và PGS.TS Đồng Văn Quyền
– Phó viện trưởng – Viện Cơng nghệ Sinh học, người đã tận tình giúp đỡ,
hướng dẫn tơi hồn thành luận văn này.

ận

Tôi xin được cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện
Di truyền Nông nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về
cơ sở vật chất - trang thiết bị để tơi có thể hồn thành luận văn này.

vă

n

Luận văn được sử dụng một phần số liệu và kết quả thuộc đề tài: “Khai
thác và Phát triển nguồn gen cây Óc chó (Juglans regia Linn) tại Lai Châu và
một số tỉnh miền núi phía Bắc”, mã số NVQG-2016/15 do TS. Nguyễn Tồn
Thắng làm chủ nhiệm. Tơi xin chân thành cám ơn.

ạc

th

sỹ

Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn vơ cùng sâu sắc tới gia đình, bạn
bè, đồng nghiệp những người đã ln bên cạnh, động viên, góp ý cho tơi
trong suốt q trình học tập.

Si

Hà Nội,

tháng

nh

Tác giả

năm 2019

c

họ
Nguyễn Thị Thu Thủy


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AFLP

Amplified Fragments Length Polymorphism

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid
CTAB

Cetyl trimethyl ammonium bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

Lu

dNTPs Deoxynucleoside triphosphates

ận

DMSO Dimethyl sulfoxide (CH3 ) 2 SO

n

vă

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
Ethidium Bromide

ISSR

Inter simple sequence repeat

ITS

Internal Transcribed Spacer

PCR

Phản ứng nhân theo chuỗi

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

rDNA

Ribosomal deoxyribonucleic acid

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA

Ribonucleic acid

SSR

Simple sequence repeats

SCAR

Sequence Characterised Amplification Regions

ạc

th

EtBr

sỹ
nh

Si
c

họ


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Sơ đồ vùng ITS của các gen rDNA vùng nhân và vị trí của các mồi
ITS........................................................................................................... 20
Hình 3.1:DNA tổng số của 26 mẫu Ĩc chó ................................................ 29
Hình 3.2: Phổ điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên 26 mẫu Ĩc
chó (M1KB: Marker ladder 1Kb; H2O: Đ/c âm) ........................................ 30

Lu

Hình 3.3: Một đoạn giản đồ có các đỉnh với 4 màu sắc khác nhau tương ứng

ận

với 4 loại nucleotid của mẫu Ĩc chó HG02, HG05 và HG18 ...................... 32
Hình 3.4: Kết quả gióng hàng, gióng cột 26 trình tự ITS1-5,8SrRNA-ITS2

vă

của 26 mẫu Ĩc chó và mẫu tham chiếu AF399876.1 .................................. 42

n

Hình 3.5: Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 26 mẫu nghiên cứu và

ạc

th

mẫu tham chiếu AF399876.1..................................................................... 46

sỹ
nh

Si
c

họ


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Các hợp chất của cây Óc chó Anh (Juglans regia) ........................ 9
Bảng 2. 1: Danh sách 26 mẫu Ĩc chó ........................................................ 23
Bảng 2. 2: Danh sách các mồi ITS (White và cộng sự, 1990) ...................... 25
Bảng 2. 3: Thành phần phản ứng PCR ....................................................... 26
Bảng 2. 4: Chu trình phản ứng PCR........................................................... 27

Lu

Bảng 3. 1: Độ dài các trình tự thuộc 26 mẫu Ĩc chó nghiên cứu và mẫu tham

ận

chiếu AF399876.1 .................................................................................... 33
Bảng 3. 2: Thành phần bốn loại nucleotide của 26 mẫu nghiên cứu và mẫu

vă

tham chiếu AF399876.1 ............................................................................ 34

n

Bảng 3. 3: Hệ số tương đồng di truyền giữa 26 mẫu nghiên cứu và mẫu tham

ạc

th

chiếu AF399876.1 vào trình tự vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 ....................... 44

sỹ
nh

Si
c

họ


1

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH ẢNH
DANH MỤC BẢNG

Lu

MỤC LỤC ................................................................................................ 1

ận

MỞ ĐẦU................................................................................................... 3

vă

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................... 6
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ÓC CHÓ ...................................................... 6

n

1.1.1. Nguồn gốc và phạm vi phân bố của cây Ĩc chó........................... 6

ạc

th

1.1.2. Đặc điểm thực vật học và thành phần hóa học trong hạt của cây óc
chó ..................................................................................................... 8
1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phạm vi phân bố ..................................... 11

sỹ

1.1.4. Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế . .............................................. 13

Si

1.2. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỀ PHÂN LOẠI
THỰC VẬT ......................................................................................... 14

nh

1.2.1. Các phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái ............ 14
1.2.2. Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử ................................. 15

họ

1.2.2.1. Các Marker phân tử dựa trên DNA..................................... 15

1.3. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN ÓC CHÓ .......... 21
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............ 23
2.1. VẬT LIỆU..................................................................................... 23
2.2. HÓA CHẤT................................................................................... 25
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................... 25
2.3.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................... 25

c

1.2.2.2. Sử dụng các trình tự DNA bảo tồn cao trong phân tích quan hệ
phát sinh ở thực vật ....................................................................... 17


2
2.3.2. Thành phần của 1 phản ứng PCR .............................................. 26
2.3.3. Chương trình chạy PCR ........................................................... 26
2.3.4. Phương pháp điện di trên agarose ............................................. 27
2.3.5. Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen ....................................... 27
2.3.6. Giải trình tự ............................................................................. 28
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 29
3.1. KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA...................................................... 29

Lu

3.2. KẾT QỦA PCR VÀ TINH SẠCH CÁC SẢN PHẨM KHUẾCH ĐẠI .. 30

ận

3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT VÙNG TRÌNH TỰ ITS1-5,8SrRNA-ITS2 Ở
CÁC MẪU NGHIÊN CỨU................................................................... 30

vă

3.4. KẾT QỦA SO SÁNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÙNG ITS1
5,8SrRNA - ITS2 CỦA CÁC MẪU NGHIÊN CỨU......................... 36

n

3.5. KẾT QUẢ XÂY DỰNG CÂY QUAN HỆ PHÁT SINH GIỮA 26 MẪU
NGHIÊN CỨU...................................................................................... 43

th

ạc

3.6. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ PHÂN BIỆT 26 MẪU
ÓC CHÓ NGHIÊN CỨU ...................................................................... 49

sỹ

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................... 55
4.1. KẾT LUẬN ................................................................................... 55

nh

Si

4.2. KIẾN NGHỊ................................................................................... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................... 56
PHỤ LỤC: TRÌNH TỰ 26 MẪU ĨC CHÓ NGHIÊN CỨU................... 62

c

họ


3

MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây Ĩc chó có tên khoa học là Juglans regia Linn, phân bố rộng rãi
trên khắp thế giới, được trồng thương mại khắp miền Nam châu Âu, Bắc
Phi, Mỹ, Tây Nam Mỹ và Đông Á như một cây cho nhiên liệu điezen sinh
học. Trên thế giới, ngành sản xuất hạt Ĩc chó có doanh thu ước tính gần 10
tỷ USD trong năm 2011 (tính theo số lượng của FAO với giá là 4 USD/kg).

Lu

Hoa Kỳ là nước xuất khẩu lớn nhất thế giới trong khi Trung Quốc nổi lên là
một nước quan trọng về cả sản xuất và tiêu dùng. Tính từ năm 2000, tổng

ận

sản lượng hạt óc chó tồn cầu đã tăng đều đặn về khối lượng. Tới năm 2010,
sản lượng đạt 2,55 (triệu tấn), gần gấp đôi 1,29 (triệu tấn) sản lượng năm

vă

2000. Tại Việt Nam, năm 2011 có 22.000 tấn hạt óc chó được tiêu thụ và

n

chủ yếu từ nhập khẩu.[1]

th

Cây Óc chó được ưa chuộng bởi nó đem giá trị thương mại, thẩm mỹ

ạc

và quan trọng hơn hết là nó đem lại giá trị dinh dưỡng cho con người. Quả
óc chó và các sản phẩm từ óc chó có tính phổ biến cao như một siêu thực

sỹ

phẩm có lợi cho sức khỏe vì chúng chứa chất chống oxy hóa, hàm lượng
chất béo, protein, vitamin và khống chất cao. Quả óc chó có tác dụng giảm

Si

nguy cơ tim mạch, bệnh tim mạch vành, điều trị đái tháo đường tuýp II,

nh

phòng ngừa và điều trị một số bệnh ung thư, và giảm các triệu chứng do rối
loạn thần kinh và tuổi tác. Ngồi ra, cây Ĩc cho tăng cường sự phát triển trí

họ

thơng minh của não bộ, phịng và hỗ trợ bệnh ung thư, phịng chống lỗng
đường huyết, giảm cholesterol trong máu. Các bộ phận của cây đều được sử

c

xương, giảm stress, giảm mất ngủ, tăng cường chất lượng tinh trùng, ổn định
dụng như một vị thuốc trong y học cổ truyền, điển hình như lá được sử dụng
để điều trị đau thấp khớp, sốt, tiểu đường, bệnh ngoài da và hoa được sử
dụng để điều trị đau thấp khớp và sốt rét. Gỗ của một số lồi óc chó được
đánh giá cao về màu sắc, độ cứng và độ bền cao nên được sử dụng làm đồ
nội thất, sàn nhà và nhiều vật dụng đặc biệt khác như súng săn ...

Việc nghiên cứu, phát triển và trồng cây Ĩc chó khơng chỉ cải tạo môi


4
trường mà còn đem lại giá trị kinh tế cho vùng cao, cây Ĩc chó có thể được
khuyến khích trồng xen trong các hệ thống nông lâm kết hợp để giải quyết
những thách thức của du canh và độc canh cây lương thực ngắn ngày tại
miền núi phía Bắc. Vì vậy, để góp phần nghiên cứu bảo tồn và phát triển cây
óc chó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sử dụng chỉ thị
ITS để đánh giá quan hệ di truyền và nhận dạng một số m ẫu giống cây Óc
chó thu thập tại các tỉnh miền núi phía Bắc”.
2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Lu

- Đối tượng nghiên cứu là 26 mẫu giống cây Óc chó được thu thập tại

ận

các tỉnh miền núi phía Bắc: huyện Đồng Văn, tỉnh Hà Giang; huyện Sa Pa,
tỉnh Lào Cai; huyện Sỉn Hồ và huyện Phong Thổ tỉnh Lai Châu do Viện

n

vă

Nghiên cứu Lâm sinh cung cấp.

- Thời gian thu mẫu: tháng 8/2018

th

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2018 đến tháng 2/2019.

ạc

- Địa điểm nghiên cứu: thực hiện các thí nghiệm phân tử tại Bộ mơn
3. Cơ sở khoa học và tính thực tiễn của đề tài

nh

Si

Ý nghĩa khoa học

sỹ

Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp.

Hiểu biết về đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của các mẫu cây Óc chó

họ

thu được, là cơ sở để phân loại, tuyển chọn những nguồn gen ưu tú phục vụ cho
công tác chọn và lai tạo giống mới. Các marker phân tử nhận biết chính xác một
cơng tác nhân giống và kiểm soát cây con giống ở giai đoạn sớm.
Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài góp phần thu thập các nguồn gen Óc chó thu thập tại các tỉnh
miền núi phía Bắc.
Kết quả đề tài góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen Óc chó
của Việt Nam, phục vụ cho công tác chọn tạo giống mới, chuẩn hóa nguồn

c

số nguồn gen Óc chó quý được sử dụng để xác định tính đúng giống phục vụ


5
cây giống góp phần nâng cao thương hiệu cho sản phẩm Óc chó của Việt
Nam ở khu vực và trên thế giới.
Kết quả của luận văn là nguồn tài liệu tham khảo hữu ích phục vụ cho
nghiên cứu và giảng dạy.
4. Mục đích nghiên cứu
Xác định được quan hệ di truyền, mức độ đa dạng của cây Ĩc chó thu
thập tại các tỉnh miền núi phía Bắc.

Lu

Xác định được các đặc trưng trình tự ITS của một số mẫu cây Ĩc chó

ận

phục vụ cơng tác tuyển chọn và lai tạo giống.

n

vă
ạc

th
sỹ
nh

Si
c

họ


6

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÂY ÓC CHÓ
1.1.1. Nguồn gốc và phạm vi phân bố của cây Ĩc chó
Cây óc chó có tên khoa học là Juglans regia, tên tiếng anh là Walnut, tên

Latinh là Gallica. Đây là một lồi cây có giá trị cao về chất lượng gỗ và hạt.
: Fagales (Bộ Cử )

Họ

: Juglandaceae (Họ Óc chó, Họ Hồ Đào )

Lu

Bộ

ận

Chi : Juglans ( Óc chó hay Hồ đào, Hạch đào)
Lồi : J.regia

vă

Cây óc chó thuộc chi Juglans, là lồi phân bố lớn nhất và rộng rãi nhất

n

trong tám chi thuộc họ Juglandaceae. Chi Juglans bao gồm khoảng 21 loài

th

ạc

phân bố ở châu Á, Nam Âu, Bắc Mỹ, Trung Mỹ, Tây Nam Mỹ và Tây Ấn
(Manning, 1978[2]; Stanford và cộng sự, 2000 [3]). Loài Juglans có dạng

sỹ

lưỡng bội, với dạng karyotype 2n = 2x = 32 (Woodworth,1930[4]; Komanich,
I. G., 1982 [5]). Óc chó là một trong những loài sản xuất hạt được trồng lâu

nh

Si

đời nhất trong lịch sử loài người và được trồng ở hầu hết các phần ơn đới
của bán cầu bắc. Có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về nguồn gốc của cây
Ĩc chó, nhưng các nhà nghiên cứu cho rằng óc chó có nguồn gốc từ Hy Lạp
và bán đảo Balkan (Polunin, 1977 [6]).

tiên này đã được lai tạo thành các giống tốt hơn và kể từ đó nó được gây
trồng rộng rãi trên khắp châu Âu và Bắc Phi. Sau đó vào thời kỳ Trung cổ
những giống này lại được mang về trồng tại Thổ Nhĩ Kỳ. Một số nguồn gen
óc chó được cho là du nhập và gây trồng tại Trung Quốc cách đây 2000 năm
và hiện nay tại một số vùng nó được xem như là phân bố tự nhiên tại đây.
Bên cạnh đó Ĩc chó được cho là du nhập và gây trồng tại châu Mỹ vào thế
kỷ 17. Những nước gây trồng phổ biến Ĩc chó hiện nay bao gồm Pháp,

c

họ

Vào thế kỷ thứ IV trước cơng ngun, Ĩc chó có nguồn gốc từ Iran và
vùng Trung Á đã được gây trồng tại Nam Tư và Hy Lạp. Những giống đầu

7

Serbia, Hy lạp, Rumani, Hungari, Trung Quốc, Mỹ, Chi Lê, New Zealand và
miền Đông Nam châu Úc. Như vậy, hiện nay Ĩc chó đã được gây trồng từ
30° - 50° vùng Bắc bán cầu và 30° - 40° vùng Nam bán cầu bao gồm rất
nhiều giống khác nhau cho hạt to và vỏ hạt mỏng, chịu được các điều kiện
khắc nghiệt, thích nghi với điều kiện tự nhiên, đất đai thổ nhưỡng tại các
khu vực gây trồng.
Cây Ĩc chó có hai lồi phổ biến nhất chi đó là óc chó Ba Tư (Juglans
regia) và óc chó Đen (Juglans nigra). Óc chó Ba Tư hay cịn gọi là óc chó

Lu

ận

Anh Quốc là loài nổi tiếng và được biết đến nhiều. Loài này có nguồn gốc từ
vùng Balkan ở Đơng Nam Châu Âu, Tây Nam và Trung Á đến dãy

vă

Himalaya và Tây Nam Trung Quốc và được mở rộng sang Hoa Kỳ bởi
những người định cư Anh. Ngồi ra, Óc chó Anh Quốc cũng được tìm thấy

n

rải rác ở khắp Châu Âu và Châu Á, chúng được trồng rộng rãi để sản xuất
các loại hạt có chất lượng tốt. Óc chó Đen là một lồi phổ biến ở miền đơng

th

ạc

Bắc Mỹ và cũng được trồng rộng rãi ở một số nơi khác. Cả hai đều là cây
rụng lá (lá rụng khi ngủ đông) và sống hơn một thế kỷ và được trồng trên

sỹ

toàn thế giới để lấy hạt và gỗ chất lượng cao, được sử dụng rộng rãi trong
nội thất, nội thất xe hơi, cửa ra vào và ngành công nghiệp súng. Tuy nhiên,

nh

Si

chúng ta có thể nói rằng quả óc chó Anh được trồng nhiều hơn cho các loại
hạt và cho gỗ ít hơn. Mặc dù hạt óc chó Đen có thể ăn được, nhưng hạt nhân
nhỏ và vỏ cứng vì thế chúng khơng được trồng để sản xuất hạt. Vì vậy, trồng

thập kỷ sau khi trồng cây). Óc chó Đen cho gỗ tốt màu tối và cứng nên loài
này được đánh giá cao về khả năng đem lại giá trị kinh tế. Óc chó Anh và óc

c

họ

cây Ĩc chó đen để lấy gỗ rất phổ biến ở Mỹ và các nước khác và được coi là
một lựa chọn đầu tư sẽ mang lại lợi nhuận lớn trong dài hạn (hai hoặc ba

chó Đen đều đem lại giá trị thương mại; óc chó Anh cho gỗ và các loại hạt,

óc chó Đen cho gỗ. Ĩc chó đen có thể đạt chiều cao 100-120 feet (30-37
mét), trong khi Ĩc chó Anh trung bình đạt chiều cao 80 feet (25 mét) khi
trưởng thành. Cây Óc chó đen và Óc chó Anh đều sản sinh các hóa chất độc
hại cho nhiều loại cây (cà chua, khoai tây, cỏ linh lăng, quả việt quất, táo và
nhiều loại khác).


8
Mặc dù cây Ĩc chó (Carya tongkinensis) khơng có nguồn gốc từ Việt
Nam nhưng theo ông Vũ Văn Dũng, một chuyên gia trong thụ mọc học,
chúng có thể được tái sinh tự nhiên tại các khu vực miền núi phía Bắc của
Việt Nam như Cao Bằng, Sa Pa (Lào Cai) và Hà Giang. Điều này được cho
thấy quả óc chó tại Việt Nam là thuộc giống tương tự như óc chó Anh phát
triển trong khu vực Himalaya và Tây Nam của Trung Quốc.

ận

Lu

1.1.2. Đặc điểm thực vật học và thành phần hóa học trong hạt của
cây óc chó
Cây Ĩc chó thuộc dạng cây lớn, cây trưởng thành có thể đạt độ cao
25–35m, bán kính thân cây có thể lên đến 2m, thân cây mập, ngắn nhưng tán
cây thì rất rộng để giành được lợi thế cạnh tranh về ánh sáng trong các khu
rừng. Cây trưởng thành đặc trưng có thân dài, thường khơng có nhánh thấp.
Vỏ cây óc chó có màu nâu xanh và mịn khi cây còn non, trở nên xám và
xuất hiện vết nứt khi cây già đi. Cây óc chó có rễ to và sâu tạo ra chất gọi là
juglones ngăn chặn sự phát triển của các cây khác ở gần.
Tùy thuộc vào vĩ độ, hoa óc chó thường bắt đầu xuất hiện vào khoảng
giữa tháng 4 cho đến đầu tháng 6. Sự ra hoa và ra lá xảy ra gần như cùng lúc

và luôn đủ sớm để tránh thiệt hại bởi sương giá cuối mùa xuân. Lá óc chó to
hình lơng chim dài tới 40cm, kép lơng sẻ, thường có từ 7 đến 9 lá chét,
khơng cuống, hình trứng thn hoặc trịn dẹt một phía, khi vị ra có mùi
hăng đặc biệt. Hoa đơn tính, màu lục nhạt, hoa đực xếp thành đi sóc thõng
xuống, hoa cái xếp 2 đến 5 cái ở cuối các nhánh. Hoa đực phát triển từ các
chồi không lá từ năm trước, chúng có chiều dài khoảng 10 cm (3,9 inch) và
có nhiều hoa nhỏ. Hoa cái xuất hiện trong một cụm ở đỉnh của các chồi lá
vào năm sau.
Quả chín ăn được vào tháng 9 hoặc tháng 10 cùng năm và giảm ngay
sau khi lá rụng. Quả của cây óc chó có hình trịn, khi chín sẽ tự động khơ lại
và nứt ra để lộ hạt bên trong, mỗi quả óc chó chỉ cho 1 hạt duy nhất. Quả
hạch to có vỏ ngồi màu lục và nạc, dễ hố đen khi chà xát, vỏ quả bên trong
hay vỏ của hạch rất cứng, có 2 van bao lấy hạt với 2 lá mầm to, chia thuỳ và
nhăn nheo như nếp của óc động vật.

n

vă

ạc

th

sỹ

nh

Si

c

họ


9
Tùy thuộc vào các yếu tố khác nhau như vị trí địa lý, nhiệt độ, thời
gian và các yếu tố khác, mỗi cây Ĩc chó có thành phần hóa học khác nhau ở
các quốc gia khác nhau. Ngày nay, các bộ phận khác nhau của cây Ĩc chó
như lá, vỏ cây và trái cây đều được sử dụng trên thế giới. Các nhà nghiên
cứu cho rằng các hợp chất hóa học được tìm thấy trong quả óc chó là khác
nhau ở các vùng khí hậu khác nhau. Các hợp chất hóa học của các phần khác
nhau của quả óc chó được thể hiện trong Bảng 1.1 .
Bảng 1.1: Các hợp chất của cây Óc chó Anh (Juglans regia)

Lu

Bộ phận

ận

Lá

Hợp chất

Phenolic acids, tannins, esential faty acids, ascorbic

vă

acid, flavonoids, caffeic acid, paracomaric acid,

Emulsion, glucose, organic materials such as citric

th

Vỏ xanh của quả

n

juglone.

Fatty acids, tocopherols, phytosterols, total phenolic
(tannin).

sỹ

Quả Óc chó

ạc

acid, malic acid, phosphate và calcium oxalate.

Si

Zahoo báo cáo rằng 17 hợp chất đã được xác định trong lá óc chó; 9
myricetin-3-o-pantocid,

aesculetin,

taxifolin-pantocid,

nh

trong số đó là epicatechin, syringetin-o-hexoside, myricetin-3-o-glucoside,
quercetin

họ

glucuronide, kaempferol loại cây này có chứa axit phenolic, tannin, axit béo
và axit paracomaric. Các flavonoid quan trọng nhất trong lá óc chó bao gồm

các dẫn xuất quercetin galactoside và quercetin pantocid, quercetin
arabinoside, quercetin xyloside và quercetin rhamnoside. Ngoài ra, Shah và
các cộng sự cũng sàng lọc phytochemical của chiết xuất lá thơ có sự hiện
diện của carbohydrate, glycoside tim, phenolics, flavonoid, alkaloids,
protein, steroid và tannin. Amaral và cộng sự đã nghiên cứu có các hợp chất
phenolic

bao gồm

axit 3-

và 5-caffeoylquinic,

axit 3-

và 5-p-

c

thiết yếu (axit linoleic là axit béo chính), axit ascobic, flavonoid, axit caffeic

10
coumaroylquinic, quercetin 3-galactoside, dẫn xuất quercetin 3-pantocide,
quercetin 3-arabinoside, quercetin-quercetin và quercetin 3-rhamonocide
trong lá óc chó. Quercetin 3-galactoside là thành phần chính trong số các
hợp chất được đề cập. Ngồi ra, đã có nghiên cứu cho rằng lá của cây Ĩc
chó có chứa dẫn xuất naphthalene, đặc biệt là 5- hydroxy-1-4naphthoquinone. Juglone (5-hydroxy-1, 4-naphthoquinone) là một hợp chất
naphthoquinone được tìm thấy trong lá tươi và vỏ xanh của quả óc
chó. Juglone là thành phần rõ ràng nhất trong các cơ quan khác nhau của cây

Lu

Ĩc chó, với trọng lượng phân tử là 174,16 và công thức C10 H5 O2 -(OH), tiền

ận

chất là một glycoside được tìm thấy như một hợp chất trong các bộ phận trên
không của cây, đặc biệt là lá, sau đó được chuyển thành juglone thơng qua

vă

q trình thủy phân. Juglone là một chất kiềm được hòa tan nhẹ trong nước
nóng và vừa phải trong rượu; do đó, nó có thể là một trong những hợp chất

n

hiệu quả trong lá óc chó vì các chất khác trong lá của quả óc chó thường tan

th

trong nước hoặc tan trong chất béo. Vỏ xanh của quả óc chó có nhũ tương,

ạc

glucose và các vật liệu hữu cơ như axit citric, axit malic, phốt phát và canxi
oxalate. Hợp chất Juglone và phenolic là những hợp chất quan trọng nhất

sỹ

được tìm thấy trong lá và vỏ xanh của quả óc chó. Juglone, là một hợp chất

Si

độc hại, chỉ được tìm thấy trong quả óc chó tươi và xanh. Vỏ xanh quả óc

nh

chó có sản phẩm phụ với ít cơng dụng.

Quả óc chó có chứa các thành phần hóa học đa dạng, bao gồm
quinones,

polyphenol,

flavon

và

terpenes. Các

họ

diarylheptanoids,

diarylheptanoids và quinones có hoạt tính chống ung thư đáng chú ý, cung
động giảm đau, chống oxy hóa, kháng khuẩn và chống ung thư mạnh của các

loại cây này là đáng kể. Hơn thế nữa là quả óc chó chứa hàm lượng dinh
dưỡng cao như Omega-3, protein quả óc chó chứa 24% protein, 12% –16%
carbohydrate, 1,5% –2,0% cellulose, và 1,7% –2,0% khoáng chất, chất xơ,
Photpho, Kali, Magie, Canxi, Sắt và Các Vitamin, đặc biệt là hàm lượng
Omega-3 cao gấp 5 lần cá hồi.

c

cấp các hợp chất chì mới để điều chế các thuốc chống ung thư. Các hoạt


11
1.1.3. Đặc điểm sinh thái và phạm vi phân bố
Cây óc cho phù hợp trồng ở độ cao từ 1,000 đến 2,000m so với mực
nước biển. Cây óc chó là một loại cây rất kén đất và yêu cầu điều kiện khí
hậu phải phù hợp. Cây óc chó phát triển tốt nhất ở những vùng có khí hậu ơn
hịa, khơng quá nóng và điều kiện thổ nhưỡng phải tốt, gần nguồn nước để
đảm bảo cho ra chất lượng hạt đồng đều cả về kích thước lẫn dinh dưỡng.
- Khí hậu, nhiệt độ: Cây Ĩc chó thích hướng về ánh nắng mặt trời,

Lu

khí hậu ấm áp, có thể chịu nhiệt độ thấp trong thời gian ngắn. Nhiệt độ sinh
trưởng thích hợp là 20 – 30 o C. Trong mùa sinh trưởng cần phải cung cấp

ận

nhiệt độ ấm áp cho cây với ít nhất 6 tháng có nhiệt độ trung bình hơn 10 o C.
Cây Ĩc chó rất nhạy cảm với thời tiết quá nóng và quá lạnh vào mùa hè và

vă

mùa đơng. Ĩc chó rất nhạy cảm với mùa đơng và sương giá của mùa xuân.

n

Cành non và hoa dễ dàng bị hư hại do sương giá mùa xuân ở nhiệt độ 1o C;

th

sương giá trong mùa thu có thể ảnh hưởng đến các chồi chưa phát triển. Tuy
nhiên, trong thời kì ngủ đơng, cây Ĩc chó có thể chịu được thời tiết lạnh -11o C.

ạc

- Đất đai, thở nhưỡng: Ĩc chó địi hỏi đất sâu và phong phú

sỹ

(Jacamon, 1987[7]), và để phát triển tốt, loài này phải được trồng trong đất
sâu hơn 80-100 cm (Becquey,1997 [8]). Các loại đất tốt nhất cho Ĩc chó canh

Si

tác là loams (đất sét> 25%, phù sa 30- 50% và cát 30-50 %). Hàm lượng đất

nh

sét lý tưởng nhất phải nhỏ hơn 35% và lưu lượng mưa càng nhiều, lượng đất
sét càng ít dung nạp (Giannini và Mercurrio, 1997 [9]). Ở miền trung nước Ý

họ

sự gia tăng diện tích cơ bản tốt nhất cho các lồi đã được tìm thấy trong đất
1996

[10]).

Ĩc chó khơng thích đất ngập nước, đất nơng và đất có canxi tự do

(Boudru,1989[11]). Giá trị pH đất lý tưởng nằm trong khoảng từ 6,5 đến 7,5
(Becquey, 1997[8]) hoặc theo các tác giả khác trong khoảng từ 6 đến 7.5
(Giannini và Mercurrio, 1997[9]). Để tránh nhiễm clo , Becquey (1997)
khuyên trồng cây Óc chó trên đất bề mặt có độ pH cao (8.0-8.5). Vị trí nên
tránh là đất cát nhẹ và đất nặng (Klemp , 1979 [12]), đất than bùn.
- Nước: Yêu cầu lượng mưa trung bình trong năm khoảng 700-

c

có hàm lượng sét nằm trong khoảng từ 15 đến 25% (Fratteggiani và cộng sự,

12
800mm/năm và được phân phối đều trong cả năm (Becquey, 1997
[13]

Bergougnoux and Grospierre, 1981

[8]

;

). Tuy nhiên, cây vẫn có thể chịu

được một khoảng thời gian hạn hán với lượng mưa tối thiểu là 100-150mm
trong thời gian phát triển của cây (Giannini and Mercurio, 1997 [9]).
- Ánh sáng: Ĩc chó là một loài cây ưa sáng. Ánh sáng là yếu tố cần
thiết cho sự phát triển của cây. Chỉ có ở dạng cây con và trong đất giàu nitơ,
cây chịu được bóng râm. Cây non có thể sinh trưởng trong một thời gian

ngắn ở điều kiện thiếu ánh sáng, nhưng nếu kéo dài khi cây trưởng thành sẽ

Lu

xuất hiện các biến dạng không mong muốn. Khi cây trưởng thành cần điều

ận

kiện ánh sáng đầy đủ để tránh phát triển thân cây quanh co, dẫn đầu đến sự
phát triển của gỗ căng hoặc giảm thân cây (Winter, 1982[14] ).

vă

Với những điều kiện trên, tại Việt Nam, cây óc chó chỉ có thể trồng và

n

phát triển tốt nhất ở một số vùng núi sát biên giới phía Bắc như Sa Pa (Lào

th

Cai), Phó Bảng, Đồng Văn (Hà Giang), Cao Bằng. Hiện nhiều dự án nghiên
cứu trồng thử nghiệm cây Ĩc chó cũng chủ yếu được tiến hành ở vùng này.

ạc

Trong cuốn “Cẩm nang ngành Lâm nghiệp, chương Lâm sản ngồi gỗ” của

sỹ

Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn thì cây Ĩc chó mọc ở độ cao từ 500
- 800 m, có phân bố rải rác từ Thanh Hoá đến Lai Châu, Hà Giang, Lào Cai.

Si

Lê Sỹ Doanh và Trần Quang Bảo (2012) [15] khi nghiên cứu kỹ thuật trồng

nh

cây Ĩc chó thấy lồi này có thể trồng được ở Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang
(Phó Bảng, Đồng Văn) và Cao Bằng. Nghiên cứu đặc điểm sinh thái cây Ĩc

họ

chó Viện Điều tra Quy hoạch rừng và Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam
cho thấy lồi cây này ít khi mọc thuần lồi, mà thường mọc hỗn giao, rải rác

mỡ và thoát nước tốt với một số loài như Sấu (Dracontomelum
duperreanum), Sâng (Pometia pinnata),....
Theo Lê Mộng Chân (2000)[16], họ óc chó ở Việt Nam có 5 chi và 8 9 lồi. Trong đó lồi óc chó có tên khoa học là Juglans regia có đặc điểm
nhận biết: Lõi cành xếp ngang. Lá kép lông chim lẻ, mép lá nguyên. Quả
hạch, không cánh.

c

trong rừng lá rộng thường xanh hay nửa rụng lá trên đất ẩm, tầng dầy, màu


13
Khi nghiên cứu về các loài cây lâm sản ngoài gỗ có giá trị trong tài
liệu “Cẩm nang ngành Lâm nghiệp, chương Lâm sản ngồi gỗ” năm 2006
thì cây óc chó lại có tên gọi khác là Carya annamocarya.
Theo Hồng Thị Lụa và cộng sự (2014)

[1]

khi nghiên cứu về thị

trường phát triển cây Ĩc chó tại vùng Tây Bắc Việt Nam. Tác giả đưa ra tên
gọi khác cho lồi óc chó là Carya tonkinensis.
Như vậy, có thể thấy tên khoa học cho lồi Ĩc chó ở Việt Nam chưa

Lu

được thống nhất giữa các tài liệu. Một số tài liệu vẫn cịn nhầm lẫn tên khoa
học của cây Ĩc chó với các lồi khác cùng họ Hồ đào (Juglandaceae). Do

ận

đó, cần có nghiên cứu làm sáng tỏ tên khoa học của lồi Ĩc chó tại Việt
Nam để tránh nhầm lẫn.

vă

1.1.4. Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế .

n

Cây Óc chó là một loại cây quan trọng vì mọi bộ phận của cây đều có

th

lợi ích vì vậy óc chó có vị trí đặc biệt trong nền kinh tế xã hội. Quả Ĩc chó

ạc

rất giàu chất béo, protein, khống chất, vitamin và một lượng đáng kể các
chất xơ. Dầu của hạt óc chó chứa các axit béo chính, như axit oleic, axit

sỹ

linoleic và axit linolenic, được sử dụng rộng rãi trong mỹ phẩm cơng nghiệp

Si

vì nó chứa các đặc tính giữ ẩm và chống oxy hóa. Nồng độ omega-3-fatty

nh

acids trong quả óc chó có nhiều lợi ích sức khỏe tiềm năng từ bảo vệ tim
mạch đến việc thúc đẩy chức năng nhận thức tốt hơn, lợi ích chống viêm,

họ

hữu ích trong hen suyễn, viêm khớp dạng thấp và bệnh viêm ngồi da như

eczema và bệnh vẩy nến. Quả óc chó còn được sử dụng để điều trị ho, bệnh
thân gỗ thuộc bộ dẻ và gỗ của cây Ĩc chó được dùng đa dạng để chế tác
những sản phẩm nội thất. Hiện thị trường hiện giờ rất chuộng những sản
phẩm được tạo ra trong khoảng gỗ óc chó như giường, tủ, ghế và các nội thất
gỗ óc chó khác nữa. Hiện các sản phẩm nội thất được tạo ra từ cây Óc chó
với giá khá cao so với các sản phẩm gỗ khác. Điều đó mang lại nguồn thu

mang giá trị kinh tế cao cho người trồng cây Ĩc chó cuối mỗi quá trình thu
hoạch. Chưa kể là nhiều năm cho thu hoạch trái đem đến nguồn thu đều đặn

c

dạ dày và ung thư ở châu Á và các nước châu Âu. Cây Ĩc chó là một cái cây


14

thường xun cho người trồng cây Ĩc chó. Khơng những phần thân gỗ của
cây Ĩc chó có giá trị kinh tế mà phần lá của cây Ĩc chó hứa hẹn cũng mang
lại nguồn thu cho người nông dân trồng. Hiện lá cây Ĩc chó sử dụng phổ
biến trong lĩnh vực cơng nghiệp hóa mỹ phẩm, tồn bộ các chế phẩm được
chế tạo trong khoảng lá cây Ĩc chó. Trong đơng y người ta cũng biết đến lá
cây óc chó như một vị thuốc chữa bệnh suy tim và hở van tim.
Sản lượng hạt Óc chó đã phát triển nhanh chóng trong mười năm qua
do ngày càng nhiều người nhận thấy giá trị dinh dưỡng của nó. Ngành sản

Lu

xuất hạt Óc chó có doanh thu ước tính gần 10 tỷ USD trong năm 2011 (tính

ận

theo số lượng của FAO với giá là 4 USD/kg). Hoa Kỳ là nước xuất khẩu lớn
nhất thế giới trong khi Trung Quốc nổi lên là một nước quan trọng về cả sản

vă

xuất tiêu dùng. Tính từ năm 2000, tổng sản lượng hạt Ĩc chó tồn cầu đã

n

tăng đều đặn về khối lượng. Tới năm 2010, sản lượng đạt 2,55 (triệu tấn),

th

gần gấp đôi 1,29 (triệu tấn) của năm 2000. Tốc độ tăng trưởng trung bình từ
2000 - 2005 là 6,2%, và từ 2006 - 2010 là 10,8%. Sáu nước sản xuất hàng

ạc

đầu trong năm 2010,xếp theo khối lượng giảm dần là Trung Quốc,Hoa Kỳ,

sỹ

Iran, Thổ Nhĩ Kỳ, Ukraine và Mexico. Các quốc gia này vẫn giữ vị trí đứng
đầu với sản lượng và chiếm hơn 80% sản lượng tồn cầu. Hoa Kỳ và Trung

Si

Quốc có sản lượng hạt Ĩc chó liên tục tăng.Tổng sản lượng của hai nước

nh

tăng từ 47% tổng nguồn cung toàn cầu năm 2005 lên khoảng 60% trong năm
2010. Sản lượng của Trung Quốc đã tăng gấp đôi từ 2005 - 2010. Trung

họ

Quốc đã đạt được tốc độ tăng trung bình giai đoạn 2005 - 2010 là 16,3% cao
hơn so với nước sản xuất thứ 2 và thứ 3 là Hoa Kỳ 7,3%, và Iran 9,7%.[1]

c

1.2. TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VỀ PHÂN LOẠI
THỰC VẬT
1.2.1. Các phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái

Phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái có ngun tắc cơ
bản là hai đơn vị phân loại (taxon) có nhiều đặc điểm chung, càng giống
chúng càng có quan hệ gần gũi với nhau. Nhưng khơng phải đặc điểm nào
cũng có thể là đặc điểm để phân loại. Các taxon bậc cao thường có đặc điểm


15
phân loại ổn định, biến đổi chậm, liên quan đến những cấu trúc ít biến của
cơ thể. Cịn taxon bậc thấp thì biến đổi nhanh hoặc liên quan đến cơ chế
cách ly sinh sản. Do vậy, để tăng độ tin cậy cho phân loại hình thái thì người
ta kết hợp nhiều đặc điểm lại với nhau.
Ưu điểm của phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái là rất
kinh tế, nhanh chóng và tiện lợi nhưng lại địi hỏi các nhà phân loại học phải
có kiến thức chuyên sâu, có kinh nghiệm và sự khéo léo. Khơng những thế
phương pháp này cịn thiếu độ chính xác vì có hiện tượng đồng quy tính

Lu

trạng và khơng phân biệt được các loại đồng hình, mặt khác bởi hình thái

ận

chính là kết quả nhau thì của biểu hiện gen trong một điều kiện ngoại cảnh
nhất định nên việc hoàn toàn dựa vào hình thái đơi khi dẫn đến các kết quả

vă

khơng xác thực, nhất là đối với các taxon thực vật có mức độ thường biến

n

cao. Các marker hình thái có nhiều điểm hạn chế như: các biến đổi hình thái

th

khơng phát hiện được ở một số loài; các nghiên cứu sử dụng đặc điểm hình
thái nói chung thường giới hạn trong một hay một vài locus; nhiều đặc điểm

ạc

hình thái chỉ có thể quan sát được vào cuối chu kỳ sống; nhiều đặc tính hình

sỹ

thái khơng riêng biệt mà mang tính liên tục và chồng lấp giữa các loài gây
trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa dạng di truyền của quần thể.

nh

1.2.2.1. Các Marker phân tử dựa trên DNA

Si

1.2.2. Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử

họ

Các marker phân tử được sử dụng để đánh giá đa hình DNA được

phân thành hai loại: marker dựa trên cơ sở lai phân tử và marker dựa trên cơ

thể nhận ra thông qua việc lai các đoạn DNA được cắt giới hạn bằng
enzymes phân giải với các DNA thăm dò (probe) được đánh dấu vốn là các
đoạn DNA có nguồn gốc hoặc trình tự đã biết. Marker trên cơ sở PCR bao
gồm việc khuếch đại in vitro những trình tự DNA hay locus đặc trưng bằng
cách sử dụng những trình tự olygonucleotide trong vai trò là các mồi đặc
hiệu hay ngẫu nhiên và một enzyme DNA polymerase bền nhiệt. Các đoạn
được khuếch đại được tách ra trên điện di và tạo các đặc trưng hình thành

c

sở phản ứng chuỗi polymer hóa (PCR). Về mặt định dạng, đặc tính DNA có


16
băng, các đặc trưng này vốn được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác
nhau như nhuộm hay ghi phóng xạ tự động. Những marker phân tử thường
được sử dụng bao gồm:
Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn [Restriction Fragment Length
Polymorphism (RFLP)]
RFLP là một kỹ thuật áp dụng để phân biệt các sinh vật với nhau bằng
cách phân tích các kiểu dẫn xuất hình thành từ việc cắt nhỏ DNA của chúng.

Lu

RFLP có thể ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng và phát sinh loài trên dải
đối tượng từ các cá thể đến quần thể, từ trong loài đến các lồi có quan hệ họ

ận

hàng gần. RFLP được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu lập bản đồ gen

bởi tính phong phú cao của chúng trên bộ gen, khả năng ứng dụng rộng của

vă

các enzym cắt giới hạn khác nhau và sự phân bố ngẫu nhiên suốt bộ gen của

n

các RFLP (Neale & Williams 1991) [17]. RFLP cũng được sử dụng trong

th

nghiên cứu khảo sát mối quan hệ giữa các bậc phân loại gần, hoặc sử dụng
như một công cụ làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA (DNA

ạc

fingerprinting), trong nghiên cứu về đa dạng di truyền lai, chuyển gen quan

sỹ

tâm vào sinh vật và bao gồm cả những nghiên cứu về dòng gene hay phân bố
gen giữa các cây trồng. Các marker RFLP cũng được sử dụng lần đầu trong

Si

việc xây dựng bản đồ di truyền bởi Botstein và cộng sự năm 1980, từ đó một
một bản đồ chi tiết ở rau diếp (Landry và cộng sự, 1987) [18].

nh

bộ các marker RFLP phát hiện được đã tạo nhiều cơ hội cho việc phát triển

họ
c

DNA Đa hình khuếch đại ngẫu nhiên [Random Amplified
Polymorphic DNA (RAPD)]
RAPD là một kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR. Phương pháp được dựa
trên cơ sở sự khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu hay ngẫu nhiên dưới tác
động của enzyme với các mồi tùy chọn, kỹ thuật này được Welsh và

McClelland phát triển năm 1991. Trong phản ứng RAPD, một chủng loại
mồi đơn sẽ gắn vào DNA bộ gen ở hai vị trí khác nhau trên hai mạch bổ
sung của DNA khuôn mẫu. Trung bình, mỗi mồi sẽ dẫn đến việc khuếch đại
một vài locus riêng rẽ trên bộ gen, đó là cơ sở cho sự hữu dụng của RAPD


17
cho việc sàng lọc một cách hiệu quả các đa hình trình tự nucleotide giữa các
cá thể. Tuy nhiên, vì tính ngẫu nhiên một cách tự nhiên trong việc khuếch
đại DNA với các mồi có trình tự ngẫu nhiên, điều quan trọng là phải tối ưu
hóa và duy trì điều kiện phản ứng cho việc nhân mạch đôi DNA.
RAPD đã được sử dụng với nhiều mục đích, từ nghiên cứu ở mức độ
cá thể (như xác định đa dạng di truyền) đến nghiên cứu liên quan đến những
loài họ hàng gần nhau. RAPD cũng đã và đang được ứng dụng vào việc
nghiên cứu lập bản đồ gen để lấp đầy những lỗ hổng mà các markers khác

Lu

chưa thực hiện được (Hadrys và cộng sự, 1992) [19] .

ận

Vi vệ tinh hay Trình tự lặp đơn giản [Microsatellites or Simple
sequence Repeat (SSR)]

vă

Microsatellite đặc biệt thích hợp để phân biệt các kiểu gen có quan hệ

n

họ hàng gần; bởi mức độ biến động cao của chúng, vì thế chúng được ưa

th

thích khi sử dụng trong các nghiên cứu về quần thể và cho việc nhận dạng

ạc

các chủng giống nơng nghiệp có quan hệ gần. Microsatellite thể hiện một
tính đa hình cao nên chúng là những marker có thể được sử dụng trong nhiều

sỹ

nghiên cứu về di truyền quần thể cũng như các nghiên cứu quan hệ phát sinh
từ mức độ cá thể (như nhân dịng vơ tính và xác định các dịng) đến mức độ

Si

những lồi có quan hệ họ hàng gần. Ngược lại, tỷ lệ đột biến cao của chúng

nh

làm cho chúng khơng thích hợp trong nghiên cứu phân biệt các taxon có
quan hệ phát sinh xa nhau. Microsatellite được xem là các marker lý tưởng

họ

trong nghiên cứu lập bản đồ gen (Jarne & Lagoda 1996) [19] . Marker SSR đã
chọn lọc các sinh vật.
1.2.2.2. Sử dụng các trình tự DNA bảo tồn cao trong phân tích quan hệ
phát sinh ở thực vật

Hệ thống hóa là q trình thăm dị, mơ tả và giải thích tính đa dạng
của thế giới sinh vật. Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân
loại mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa. Sự xuất hiện

c

được chứng minh tính hữu dụng cho việc đánh giá biến động di truyền trong


18
và phát triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi
polymer hóa – PCR (Mullis và Faloona, 1987) [20] đã hình thành nên một
lượng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật
làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA . Nhiều dạng đặc điểm mang tính
thơng tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã được ứng dụng trong nghiên cứu

mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở thực vật. Các thực vật bậc cao
mang trong nó ba bộ gen: bộ gen trong nhân, bộ gen ty thể và bộ gen lạp thể.

Lu

Bộ gen lục lạp

Bộ gen lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông thường được đặc

ận

trưng bởi phân tử dạng vịng. Thành phần, kích thước, cấu trúc và trình tự
của bộ gen lục lạp đã được xác định là có mức độ bảo tồn cao trong các

vă

nghiên cứu về tiến hóa. Tính bảo tồn cao này chỉ ra rằng bất kỳ thay đổi nào

n

về cấu trúc, cách sắp xếp hay thành phần đều liên quan mạnh mẽ đến quan

th

hệ phát sinh. Các phần khác nhau của bộ gen tiến hóa theo các tỷ lệ khác
nhau và tương đối chậm ở mức độ trình tự nucleotide. Những vùng khơng

ạc

mã hóa của bộ gen lục lạp tiến hóa nhanh hơn những vùng mã hóa. Các đột

sỹ

biến ở DNA lục lạp thường là các thay thế nucleotide hay sự sắp xếp lại. Các
đột biến tăng đoạn hay mất đoạn tích lũy trong vùng không mang mã xảy ra

Si

với tỷ lệ ngang với sự thay thế nucleotide và chính kiểu đột biến này làm

nh

tăng cường tính đa dạng của các vùng khơng mang mã. Phần lớn các gen lục
lạp là loại gen đơn bản trong khi các gen trong nhân là thành viên của những

họ

họ đa gen. Tính bảo tồn cao của DNA lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng
nó để xây dựng lại mối quan hệ phát sinh và q trình tiến hóa ở các mức độ

mã hóa ở lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu quan hệ phát sinh
như sau:
Các trình tự bảo thủ ở bộ gen trong nhân
Bộ gen trong nhân có kích thước lớn nhất trong số ba bộ gen ở thực
vật (1.1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gen. Phần lớn các nỗ
lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình

c

từ lồi đến chi và đến họ thực vật. Có thể thấy những gen mã hóa và khơng