Luận văn thạc sĩ sinh học mối liên quan giữa tỷ lệ adn ty thể và adn nhân trong đánh giá sàng lọc phôi tiền làm tổ

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

ận

Lu
vă

n

Trần Thị Thanh Huyền

ạc

th
sỹ

MỐI LIÊN QUAN GIỮA TỶ LỆ ADN TY THỂ VÀ ADN NHÂN
TRONG ĐÁNH GIÁ SÀNG LỌC PHÔI TIỀN LÀM TỔ

nh

Si
c

họ
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2020


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
----------------------------

Lu

Trần Thị Thanh Huyền

ận
vă

n

MỐI LIÊN QUAN GIỮA TỶ LỆ ADN TY THỂ VÀ ADN NHÂN
TRONG ĐÁNH GIÁ SÀNG LỌC PHÔI TIỀN LÀM TỔ

ạc

th

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

sỹ

Mã số: 8420114

Si

nh

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

c

họ
Hướng dẫn 1: TS. Nguyễn Thị Trang Huyền

Hướng dẫn 2: TS. Trần Thị Thanh Huyền

Hà Nội - 2020


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn là công trình nghiên cứu của riêng tơi. Các
kết quả nêu trong luận văn chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào
khác. Các số liệu, ví dụ và trích dẫn trong luận văn đảm bảo tính chính xác,

tin cậy và trung thực. Tơi đã hồn thành tất cả các mơn học và đã thanh toán
tất cả các nghĩa vụ tài chính theo quy định của Phịng Đào tạo - Học viện
Khoa học và Công nghệ.
Vậy tôi viết Lời cam đoan này đề nghị Phòng Đào tạo - Học viện Khoa
học và Cơng nghệ xem xét để tơi có thể bảo vệ luận văn.

ận

Lu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

n

vă

NGƯỜI CAM ĐOAN

ạc

th
Trần Thị Thanh Huyền

sỹ
nh

Si
c

họ

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp, bên cạnh sự cố
gắng và nỗ lực của bản thân tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới
các tập thể và cá nhân đã tận tình giúp đỡ tơi.
Trước hết, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thị
Trang Huyền- Trường Đại Học Khoa học và Công nghệ Hà Nội, TS. Trần
Thị Thanh Huyền- Trung tâm công nghệ cao Vinmec – Hệ thống y tế Vinmec
đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong
thời gian học tập và nghiên cứu.

ận

Lu

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ, chỉ bảo tận tình về
chun mơn và sự động viên chân thành của tập thể nhân viên phịng Xét
nghiệm, cơng ty TNHH Cơng nghệ GenHD.

vă

n

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, các Cơ Phịng Đào tạo - Học viện
Khoa học và Cơng nghệ đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho
tơi trong suốt q trình học tập.

ạc

th

sỹ

Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên,
giúp đỡ tơi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Si

nh

Hà Nội, ngày … tháng …. năm 2020
Học viên

c

họ
TRẦN THỊ THANH HUYỀN


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

Deoxyribonucleic acid

Axit deoxyribonucleic

ADP

Adenosine diphosphate

Phân tử mang năng lượng

ARN

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

ATP

Adenosine triphosphate

Phân tử mang năng lượng

Base pair

Cặp bazơ

Comprehensive chromosome
screening

Sàng lọc nhiễm sắc thể toàn
diện

CGH

Comparative genomic
hybridization

Phương pháp lai so sánh hệ
gen

CNV

Copy number variation

dNTP

Deoxynucleotide triphosphates

bp
CCS

ận

Lu

ADN

n

vă

ạc

th

sỹ

Deoxynucleotit triphotphat

nh

Si

FADH2

Biến thể số lượng bản sao

Flavin adenine dinucleotide

Flavin adenin dinucleotit

họ

Kỹ thuật lai huỳnh quang tại
chỗ

Fluorescence in situ
hybridization

ICM

Inner cell mass

Nguyên bào phôi

ICSI

Intra- cytoplasmic sperm
injection

Tiêm trực tiếp tinh trùng
vào nỗn để tạo phơi

IUI

Intrauterine insemination

Bơm tinh trùng vào buồng
tử cung

ISH

In situ hybridization

Lai ghép tại chỗ

c

FISH


ISP

Ion Sphere Particles

Hạt ISP

IVF

In Vitro Fertilization

Thụ tinh trong ống nghiệm

Kilobyte

Kích thước tập tin

kDA

Kilodalton

Đơn vị khối lượng nguyên
tử

MA

mtDNA/nuDNA

Tỷ lệ ADN ty thể/ ADN
nhân

kb

Lu

Mb

ận

mRNA

Đơn vị thông tin

Megabyte
Messenger ribonucleic acid

vă

Mitochondrial DNA

NADH

Nicotinamide adenine
dinucleotide

Hệ gen ty thể

n

mtDNA

th

Nicotinamit adenin
dinucleotit

ạc
sỹ

NGS

ARN thơng tin

Giải trình tự gen thế hệ mới

Next generation sequencing

nh

Si
Nhiễm sắc thể

NST
Nuclear DNA

họ

nuDNA

Hệ gen nhân

c

PGCs
PGT-A
QC
qPCR

Primordial germ cells

Tế bào mầm nguyên thủy

Preimplantation genetic testing
for - Aneuploidy

Sàng lọc di truyền trước
chuyển phơi

Quality control

Kiểm sốt chất lượng

Quantitative Polymerase Chain
Reaction

Định lượng phản ứng chuỗi


Reactive oxygen species

Các dạng oxy hoạt động

Trophectoderm

Nguyên bào lá nuôi

tRNA

Transfer ribonucleic acid

ARN vận chuyển

WGA

Whole genome amplification

Khuếch đại toàn bộ hệ gen

WHO

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

Microliter

Micro lít

ROS
TE

µl

Lu

µm

Micrometer

Micro mét

ận
n

vă
ạc

th
sỹ
nh

Si
c

họ


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1. 1. Ưu- nhược điểm của một số phương pháp hỗ trợ sinh sản ............. 5
Bảng 1. 2. Hệ thống đánh giá điểm phôi giai đoạn phân chia theo tổ chức
Alpha .............................................................................................................. 11
Bảng 1. 3. Hệ thống đánh giá điểm phôi giai đoạn phôi nang theo Gardner’s
......................................................................................................................... 12

Bảng 1. 4. Ưu và nhược điểm của ba giai đoạn thực hiện sinh thiết phôi ...... 14
Bảng 2. 1. Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ........................................ 29

Lu

Bảng 3. 1. Số lượng và tỷ lệ phần trăm (%) tổng số phôi nghiên cứu ............ 45

ận

Bảng 3. 2. Số lượng và tỷ lệ phần trăm (%) tổng số phơi có hình thái tốt...... 51

n

vă
ạc

th
sỹ
nh

Si
c

họ


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1. 1. Sơ đồ quy trình PGT- A ................................................................... 7
Hình 1. 2. Hình ảnh time- lapse cho thấy sự phát triển của phôi ở các giai
đoạn phát triển ................................................................................................... 8

Hình 1. 3. Bộ gen của ty thể động vật có vú mã hóa 13 polypeptit của chuỗi
truyền điện tử ................................................................................................. 20
Hình 1. 4. Cơ chế di truyền thắt cổ chai ADN ty thể (mtDNA) ..................... 22
Hình 1. 5. Ion Torrent trên cơng nghệ bán dẫn.. ............................................. 28

Lu

Hình 2. 1. Sơ đồ các bước tiến hành thí nghiệm ............................................. 31

ận

Hình 2. 2. Tổng quan các bước tạo thư viện ................................................... 33

vă

Hình 2. 3. Sơ đồ hóa quy trình hoạt động chuẩn bị khn giải trình tự ......... 35

n

Hình 2. 4. Tinh sạch bằng hạt từ tạo ADN sợi đơn ........................................ 36

th

ạc

Hình 2. 5. Quy trình xử lý dữ liệu giải trình tự trong phần mềm Torrent Suite
......................................................................................................................... 37

sỹ

Hình 2. 6. Kết quả giải trình tự phơi 46, XY .................................................. 38

Si

Hình 2. 7. Kết quả giải trình tự phơi 46, XX .................................................. 38

nh

Hình 3. 1. Kết quả điện di sản phẩm sau bước khuếch đại ............................. 39

họ

c

Hình 3. 2. Đánh giá tổng quan về chất lượng kết quả giải trình tự của 1 chu kì
PGT-A ............................................................................................................. 40
Hình 3. 3. Đánh giá chất lượng kết quả giải trình tự của từng mẫu................ 41
Hình 3. 4. Đánh giá chất lượng kết quả xử lý số liệu giải trình tự ................. 42
Hình 3. 5. Hình ảnh phân tích các mẫu sinh thiết phơi ................................... 43
Hình 3. 6. Sự phân bố các đoạn đọc trên ty thể ở một số mẫu phơi ............... 44
Hình 3. 7. Sự phân bố chỉ số MA giữa nhóm phơi có hình thái khơng tốt và
nhóm phơi có hình thái tốt. ............................................................................. 45
Hình 3. 8. Phơi có 1 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 19) .......................... 46


Hình 3. 9. Phơi có 3 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 4, 8 và 22) .............. 46
Hình 3. 10. Phơi có 5 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 4, 13, 14, 15, 21) .. 47
Hình 3. 11. Phơi có 13 nhiễm sắc thể bất thường (NST số 3, 4, 5, 9, 11, 12,
13, 14, 15, 16, 18, 21 và Y) ............................................................................. 47
Hình 3. 12. Sự phân bố số lượng phơi trong từng nhóm theo số NST bị bất

thường.............................................................................................................. 47
Hình 3. 13. Sự phân bố chỉ số MA dựa theo nhóm phơi có số NST bị bất
thường.............................................................................................................. 48

ận

Lu

Hình 3. 14. Sự phân bố số lượng phôi theo mức độ bất thường số lượng NST
......................................................................................................................... 49

n

vă

Hình 3. 15. Sự phân bố chỉ số MA giữa các nhóm phơi theo mức độ bất
thường NST ..................................................................................................... 50

ạc

th

Hình 3. 16. Sự phân bố chỉ số MA giữa các nhóm phơi theo trạng thái bất
thường số lượng NST ...................................................................................... 52

sỹ
nh

Si
c

họ


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1

Lu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4

ận

1.1. VÔ SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP HỖ TRỢ SINH SẢN ............. 4

vă

n

1.2. TỔNG QUAN VỀ XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC DI TRUYỀN
TRƯỚC CHUYỂN PHÔI (PGT- A) ............................................................. 6

th

1.2.1. Sinh thiết phôi ................................................................................ 7

ạc

1.2.2. Các kỹ thuật phân tích di truyền sàng lọc phơi ............................ 15

sỹ

1.2.3. Khó khăn của PGT-A ................................................................... 18

Si

nh

1.3. TỔNG QUAN VỀ TY THỂ ............................................................... 19
1.3.1. Hệ gen ty thể và đặc điểm di truyền của hệ gen ty thể ................ 19

họ

1.3.2. Chức năng của ty thể .................................................................... 22

c

1.4. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU VỀ ADN TY THỂ TRONG IVF ..... 24
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ADN TY THỂ.................... 26
1.5.1. Phương pháp định lượng phản ứng chuỗi (quantitative polymerase
chain reaction/qPCR) ................................................................................ 26
1.5.2. Công nghệ giải trình tự thế hệ mới (NGS: Next generation
sequencing) ............................................................................................... 27
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .... 29

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU .......................................................................... 29


2.1.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................. 29
2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 29
2.1.3. Hóa chất .......................................................................................... 29
2.1.4. Máy móc và trang thiết bị ............................................................... 30
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 30
2.2.1. Thu thập mẫu .................................................................................. 32
2.2.2. PGT-A ............................................................................................. 32
2.2.3. Phân tích số liệu .............................................................................. 36

Lu

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 39

ận

3.1. KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI THƯ VIỆN ............................................... 39
3.2. KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ ................................................................ 40

vă

n

3.2.1. Sơ bộ về chất lượng giải trình tự và bộ số liệu thô ......................... 40

ạc

th

3.2.2. Tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân ở phơi hình thái tốt và hình thái
khơng tốt ................................................................................................... 44

sỹ

3.2.3. Mối liên quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân về hình thái
phơi và bất thường di truyền ..................................................................... 46

Si

nh

3.2.4. Mối liên quan tỷ lệ giữa ADN ty thể và ADN nhân trong nhóm phơi
lệch bội và ngun bội có hình thái tốt ..................................................... 50

họ

3.3. THẢO LUẬN ....................................................................................... 52

c

3.3.1. Tương quan giữa chỉ số MA và hình thái phơi ............................ 52
3.3.2. Tương quan tỷ lệ chỉ số MA giữa các nhóm phơi ngun bội và
lệch bội ở phơi có hình thái tốt ................................................................. 55
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 57
4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................... 57
4.2. KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 58
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 66

1

MỞ ĐẦU
Thống kê mới nhất từ Tổ chức Y tế Thế giới (WHO - World Health
Organization) cho biết Việt Nam đang là một trong những quốc gia tại khu
vực Châu Á - Thái Bình Dương có tỷ lệ vơ sinh khá cao [1]. Hiện tại, vô sinh
hiếm muộn đang dần trẻ hóa và có diễn biến phức tạp, gây khó khăn và áp
lực khơng nhỏ lên q trình hỗ trợ và điều trị sinh sản. Theo số liệu từ
Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản - Bệnh viện Phụ sản Trung ương, nếu như 10
năm trước chỉ tiếp nhận 2-3 cặp vợ chồng có các vấn đề về sức khỏe sinh
sản mỗi ngày thì năm 2015 con số này đã tăng lên gấp 20 lần.

ận

Lu

Các phương pháp hỗ trợ sinh sản cho thấy sự tiến bộ đáng kể trong hơn
30 năm qua; nhờ đó khả năng điều trị thành cơng vơ sinh hiếm muộn cũng
dần tăng lên. Tuy đã có những cải thiện đáng kể nhưng tỷ lệ sinh sau IVF (In
Vitro Fertilization - Thụ tinh trong ống nghiệm) vẫn còn tương đối thấp, trung
bình chỉ từ 20 – 30% mỗi lần chuyển phơi tươi ở hầu hết các phịng khám [2],
[3]. Mặc dù các phương pháp giúp tăng tỷ lệ cấy phôi thành công đã được đề
xuất và thực hiện như: chấm điểm hình thái phơi, FISH (Fluorescence in situ
hybridization- Kỹ thuật lai huỳnh quang tại chỗ), CGH (Comparative
genomic hybridization- Phương pháp lai so sánh hệ gen), NGS (Next
generation sequencing- Giải trình tự gen thế hệ mới), sàng lọc nhiễm sắc thể
toàn diện (CCS- Comprehensive chromosome screening), xét nghiệm thụ thể
nội mạc tử cung…nhưng phương pháp được nhiều trung tâm ưu tiên sử dụng

đến nay vẫn là dựa trên những đánh giá về đặc điểm hình thái. Tuy nhiên,
đánh giá hình thái phơi khơng phản ánh hồn tồn chất lượng thực của phơi.
Những phơi được chỉ định ở mức hình thái tốt nhất cũng có khả năng khơng
thể làm tổ hoặc không phát triển thành trẻ khỏe mạnh. Một trong những
ngun nhân chính của việc phơi làm tổ thất bại hay bị sảy thai là do sự hiện
diện của các bất thường về số lượng nhiễm sắc thể (lệch bội) trong các tế bào
phôi.

n

vă

ạc

th

sỹ

nh

Si

c

họ

PGT-A (Preimplantation genetic testing for Aneuploidy/Sàng lọc di
truyền trước chuyển phôi) được phát triển để phát hiện những bất thường như
vậy trong các mẫu phôi sinh thiết. Dựa trên kết quả PGT-A, bác sĩ lâm sàng

2

sẽ xác định và ưu tiên chuyển những phơi bình thường về số lượng nhiễm sắc
thể [4]. Dù vậy, vẫn có trường hợp phơi ngun bội nhưng khơng thể làm tổ
thành cơng [5]. Do đó, việc kết hợp kết quả xét nghiệm PGT-A với một số
yếu tố đánh giá bổ sung trong bước chọn phôi ưu tiên làm tổ là cần thiết để
tăng hiệu quả IVF.

ận

Lu

Ty thể là bào quan thiết yếu chịu trách nhiệm sản xuất năng lượng
trong tế bào, chúng có hệ gen riêng và sao chép độc lập với chu kì tế bào. Số
lượng ty thể trong tế bào là một dấu hiệu cho thấy mức độ hoạt động của tế
bào đó (tế bào trứng có khoảng 105 bản sao mtDNA, tế bào sinh dưỡng có
khoảng 10³- 104 bản sao của mtDNA) [6] và có vai trị quan trọng trong chức
năng của tế bào. Gần đây, ngày càng có nhiều nghiên cứu cho thấy mtDNA
như một dấu ấn sinh học trong sự làm tổ của phôi. Tuy những báo cáo đó cho
thấy hàm lượng mtDNA cao trong phơi nang có liên quan đến khả năng làm
tổ kém thì bên cạnh đó một số cơng trình nghiên cứu khác không đồng thuận
với quan điểm này. Các yếu tố gây nhiễu có thể ảnh hưởng đến số lượng bản
sao của mtDNA trong phơi ngun bội.

n

vă

ạc

th

sỹ

Cho đến nay, có rất ít nghiên cứu tiến hành xem xét vai trò của hàm
lượng mtDNA ảnh hưởng tới kết quả quá trình sàng lọc trước khi chuyển phôi
và liệu số bản sao mtDNA có thể được xem là một tiêu chí giúp bác sĩ lâm
sàng chọn lọc phôi để chuyển hay không vẫn cịn bỏ ngỏ. Ở Việt Nam chưa
có trung tâm hỗ trợ sinh sản IVF nào xem xét số liệu về hàm lượng mtDNA
trong xét nghiệm PGT-A. Từ đó có thể thấy, nghiên cứu hàm lượng mtDNA
trong hỗ trợ sinh sản ở thế giới và Việt Nam là một hướng đi còn khá mới và
mở rộng. Xuất phát từ thực tiễn và yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài
“Mối liên quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân trong đánh giá sàng
lọc phôi tiền làm tổ”.

nh

Si

c

họ

Mục tiêu của đề tài:
 Giải trình tự và xác định tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân của các mẫu
phôi sinh thiết.
 Khảo sát tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân ở các nhóm phơi khác nhau
trong xét nghiệm PGT-A. Từ đó, khảo sát sự tương quan giữa chỉ số

3

MA (tỷ số ADN ty thể/ADN nhân) và các tiêu chí chọn phơi hiện tại,
tiềm năng của chỉ số MA trong việc đánh giá ưu tiên chuyển phôi ở
mức độ di truyền.
Nội dung nghiên cứu:

ận

Lu

 Nghiên cứu mối tương quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân giữa
phôi có hình thái tốt và hình thái khơng tốt.
 Nghiên cứu mối tương quan giữa tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân giữa
các nhóm phơi ngun bội, nhóm phơi lệch bội, thể khảm và thể khảmlệch bội.
 Nghiên cứu mối tương quan tỷ lệ ADN ty thể và ADN nhân giữa phơi
hình thái tốt ngun bội và phơi hình thái tốt lệch bội.

n

vă
ạc

th
sỹ
nh

Si
c

họ


4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

VÔ SINH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP HỖ TRỢ SINH SẢN

ận

Lu

Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), vô sinh là một bệnh trong hệ thống
sinh sản được xác định là do người phụ nữ không mang thai lâm sàng trên 12
tháng sau khi quan hệ tình dục thường xun và khơng sử dụng các biện pháp
phịng tránh. Vơ sinh ngun phát là vơ sinh ở một cặp vợ chồng chưa bao giờ
có con. Vơ sinh thứ phát là thất bại trong việc thụ thai sau lần mang thai trước
[1]. Một định nghĩa khác về vô sinh được sử dụng ở Mỹ, một người phụ nữ
dưới 35 tuổi không thụ thai sau 12 tháng giao hợp mà không sử dụng các biện
pháp tránh thai. Nếu trên 35 tuổi, sau 6 tháng quan hệ tình dục khơng sử dụng
các biện pháp tránh thai mà vẫn không thụ thai. Ở Anh, vô sinh là không thể
thụ thai sau khi quan hệ tình dục thường xun khơng sử dụng các biện pháp
tránh thai trong 2 năm, trong trường hợp khơng có bệnh lý sinh sản đã biết
[7].

n

vă

ạc

th

Vơ sinh nam chiếm khoảng 20-35% các trường hợp vô sinh, trong khi
20-35% là do vô sinh nữ, 30- 40% là do các vấn đề xảy ra ở cả 2 giới và 1015% các trường hợp khơng tìm thấy ngun nhân [8]. Ngun nhân phổ biến
nhất gây vô sinh nữ là các vấn đề về rụng trứng, thường biểu hiện bằng các kỳ
kinh nguyệt thưa thớt hoặc vắng mặt. Vô sinh nam thường gặp nhất là do các
vấn đề trong quá trình xuất tinh, sự thiếu hụt tinh trùng trong tinh dịch, và
chất lượng tinh trùng …

sỹ

nh

Si

c

họ

Sự phát triển của y học và khoa học kỹ thuật với những bước tiến lớn
đã tạo ra các phương pháp hỗ trợ sinh sản có thể giúp khắc phục tình trạng
hiếm muộn, vơ sinh. Tùy vào tình trạng của bệnh nhân mà bác sĩ sẽ chỉ định
thực hiện các phương pháp hỗ trợ sinh sản khác nhau: Thụ tinh nhân tạoBơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI); Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)
hoặc thụ tinh trong ống nghiệm theo phương pháp tiêm trực tiếp tinh trùng
vào nỗn để tạo phơi (ICSI); hỗ trợ phơi thốt màng; cho nhận nỗn, tinh
trùng và phơi; phương pháp trưởng thành noãn trong ống nghiệm; chuyển

giao tử qua ống dẫn trứng, …


5

Bảng 1. 1. Ưu- nhược điểm của một số phương pháp hỗ trợ sinh sản
Các phương pháp
hỗ trợ sinh sản

Tỷ lệ thành công

+ Rối loạn khả năng xuất tinh.
+ Chất lượng tinh trùng kém: ít,
kém di động...
+ Rụng trứng khơng đều.
+ Lạc nội mạc tử cung nhẹ, trung
bình.
+ Vơ sinh khơng rõ ngun nhân.
+ Tinh trùng ít, xuất tinh ngược
hoặc khơng xuất tinh.
+ Khơng có tinh trùng.
+ Lạc nội mạc tử cung
+ Tắc 2 vịi trứng.
+ Xin trứng.
+ Vơ sinh không rõ nguyên nhân.
+ Bơm tinh trùng vào buồng tử
cung nhiều lần nhưng thất bại.
+ Chất lượng tinh trùng ít, kém,
khơng có tinh trùng.
+ Các trường hợp khơng rõ

ngun nhân.

+ Tùy thuộc vào
lứa tuổi.
+ 15-20% trong
mỗi chu kì.

ận

Lu

Ưu điểm

vă

Thụ tinh nhân tạo
- Bơm tinh trùng
vào buồng tử cung
(IUI)

Chỉ định

n

+ Kỹ thuật đơn + Chịu ảnh hưởng của
giản, thời gian thực thuốc kích thích rụng
hiện ngắn.
trứng.
+ Chi phí phù hợp, + Áp lực canh rụng
tự nhiên.

trứng.
+ Bất tiện.
+ Nguy cơ mang đa thai.
+ Hiệu quả cao.
+ Phải IVF hơn 1 lần.
+ Có thể lưu phơi.
+ Tác dụng phụ bởi hội
+ Vừa có thể có chứng kích thích buồng
con, vừa có thể sử trứng.
dụng trong sản + Đa thai (20-30%), thai
khoa để sàng lọc di ngoài tử cung (1-3%).
truyền.
+ Kỹ thuật phức tạp, địi
hỏi tay nghề chun mơn
cao, tốn kém.
+ Tận dụng trứng + Tốn kém, mất thời
đông lạnh.
gian.
+ Áp dụng cho + Biến chứng cho thai
trường hợp vô sinh nhi
nặng.
+ Mang đa thai, ngoài tử
cung.

nh
Si

c

+ 31% (35-37 tuổi).

+ 21% (38-40 tuổi).
+ 11% (41-42 tuổi).
+ 5% (trên 43 tuổi).

họ

Phương pháp tiêm
trực tiếp tinh
trùng vào nỗn để
tạo phơi (ICSI)

sỹ

Thụ tinh trong
ống nghiệm (IVF)

ạc

th

+ 41% (dưới 35
tuổi).
+ 32% (35-37 tuổi).
+ 23% (38-40 tuổi).

Khuyết điểm


6

ận

Lu

Thông thường khi tiến hành điều trị vô sinh, IUI sẽ được cân nhắc đầu
tiên vì đây là phương pháp hỗ trợ sinh sản giúp người phụ nữ có thể mang
thai một cách tự nhiên. Tuy nhiên, đối với các cặp vợ chồng không thể thụ
thai tự nhiên hoặc thụ tinh nhân tạo thất bại nhiều lần, IVF/ICSI là lựa chọn
tối ưu do hiệu quả mà chúng đem lại trong việc chữa trị vô sinh hiếm muộn.
Do tỷ lệ thành cơng tương đối cao và ít gây ảnh hưởng tới phôi nên phương
pháp thụ tinh trong ống nghiệm IVF đang là phương pháp điều trị vô sinh
hiếm muộn phổ biến hiện nay. Song song với việc thực hiện thụ tinh trong
ống nghiệm, để tăng khả năng mang thai và giảm rủi ro sảy thai, ngày nay
người ta áp dụng một số xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi để xác định
những bất thường về mặt gen di truyền ở các phơi được tạo ra trong q trình
IVF.

n

vă

1.2. TỔNG QUAN VỀ XÉT NGHIỆM SÀNG LỌC DI TRUYỀN TRƯỚC
CHUYỂN PHƠI (PGT- A)

ạc

th

Phơi bình thường ở người có 23 cặp nhiễm sắc thể (22 cặp nhiễm sắc
thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính). Một bản sao của cặp nhiễm sắc

thể được di truyền từ mẹ và bản còn lại được di truyền từ bố. Các bất thường
xảy ra trong giai đoạn đầu của sự phát triển ở tinh trùng, tế bào trứng hoặc
phơi đều có thể dẫn tới sự sai lệch về số lượng các nhiễm sắc thể trong phôi.
Trường hợp có thêm hoặc mất một hay nhiều nhiễm sắc thể được gọi là sự
lệch bội (bất thường số lượng nhiễm sắc thể).
Sự lệch bội là nguyên nhân cho phần lớn các trường hợp sảy thai trong
ba tháng đầu của thai kỳ, là yếu tố quan trọng làm cho tỷ lệ sinh thấp ở người
và sự thất bại của IVF. Các bất thường nhiễm sắc thể có thể xảy ra ở mọi lứa
tuổi của phụ nữ, tỷ lệ này gia tăng theo tuổi mẹ. Hầu hết các bất thường
nhiễm sắc thể đều không phù hợp với sự phát triển của phôi dẫn tới phôi
không làm tổ, sảy thai hoặc sinh non. Trong trường hợp những đứa trẻ này
được sinh ra thường bị ảnh hưởng bởi các rối loạn di truyền như hội chứng
Down (sự có mặt của 3 bản sao nhiễm sắc thể số 21), hội chứng Patau (3 bản
sao nhiễm sắc thể số 13), hội chứng Edward (3 bản sao nhiễm sắc thể số 18),
hội chứng Turner (1 bản sao nhiễm sắc thể giới tính X ở nữ), …

sỹ

nh

Si

c

họ


7

PGT-A (Xét nghiệm sàng lọc di truyền trước chuyển phôi) là một xét

nghiệm di truyền cho phép xác định những bất thường số lượng nhiễm sắc thể
trong phôi được thực hiện IVF bằng cách sàng lọc toàn bộ 23 cặp nhiễm sắc
thể người. Những phôi mang đúng số lượng nhiễm sắc thể sẽ có khả năng
phát triển thành những đứa trẻ bình thường. Bằng cách chọn lọc các phơi
khỏe mạnh mang đúng số lượng nhiễm sắc thể để chuyển vào tử cung của thai
phụ, PGT-A giúp cải thiện tỷ lệ thành công IVF và khả năng thụ thai sau
chuyển phôi, giảm tỷ lệ sảy thai, cho phép chuyển đơn phôi - giảm nguy cơ
biến chứng khi chuyển đa phôi, tránh sinh ra những đứa trẻ mang hội chứng
di truyền…[9].

Lu

Sinh thiết
phôi

ận

IVF tạo
phơi

Xét nghiệm
di truyền

Chuyển
phơi

vă

n

Hình 1. 1. Sơ đồ quy trình PGT- A

ạc

th
1.2.1. Sinh thiết phôi

sỹ

1.2.1.1. Sự phát triển của phôi trước khi làm tổ

Si

nh

Khi tinh trùng lọt vào bào tương noãn, màng tế bào bọc tinh trùng sát
nhập với màng tế bào bọc noãn. Nhân và bào tương tinh trùng lọt vào bào
tương của noãn, màng tinh trùng nằm lại bên ngồi nỗn và nhân của tinh
trùng gọi là tiền nhân đực. Cùng lúc đó, nỗn bào 2 đã hồn thành lần phân
chia thứ 2 của quá trình giảm phân sinh ra nỗn chín (tiền nhân cái) và cầu
cực 2 [10].

c

họ


8

ận

Lu
n

vă
th

ạc

Hình 1. 2. Hình ảnh time- lapse cho thấy sự phát triển của phôi ở các giai
đoạn phát triển
[Nguồn: />
sỹ

nh

Si

18 giờ sau khi quá trình thụ tinh diễn ra, sự xuất hiện của 2 tiền nhân
(đực - cái) và 2 cầu cực (sản phẩm hai lần phân bào giảm nhiễm của nỗn)
chứng tỏ nỗn đã được thụ tinh thành cơng. Chỉ sau đó vài giờ, 2 tiền nhân
tiến lại gần nhau, hịa màng và hợp nhân. Hợp tử hình thành chứa nhân tế bào
với bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội và ngay lập tức tiến hành lần phân chia
nguyên nhiễm đầu tiên sinh ra 2 phôi bào.

c

họ

24 giờ sau thụ tinh, hợp tử bắt đầu quá trình phân chia gọi là phân cắt.

Sự phân cắt phân chia hợp tử thành các phơi bào giống hệt nhau về hình thái
và chức năng nhưng khơng làm thay đổi kích thước của hợp tử. Giai đoạn 4
phôi bào xuất hiện vào khoảng 40 - 50 giờ sau khi thụ tinh. Qua mỗi lần phân
chia, các phơi bào mới được hình thành có kích thước nhỏ hơn phơi bào sinh
ra nó nhưng kích thước của cả hợp tử thì khơng đổi. Vào đầu ngày thứ 4, khi
trứng được thụ tinh có khoảng 12 -16 phôi bào, giai đoạn này gọi là phôi dâu.


9

Khi quan sát lớp cắt phôi giai đoạn này, người ta thấy phần trung tâm của
phơi có một khối phơi bào lớn (đại phôi bào) và phần ngoại vi được hình
thành từ hàng phơi bào nhỏ hơn (tiểu phơi bào).

ận

Lu

Ở ngày thứ 4, khi phơi có khoảng 30 tế bào, phôi dâu di chuyển vào
buồng tử cung, nằm vùi trong chất dịch do niêm mạc tử cung tiết ra và bắt đầu
quá trình hấp thu chất dịch. Chất dịch thấm qua màng trong suốt chui vào các
khoang gian bào nằm xen giữa lớp tiểu phôi bào và khối đại bào. Do lượng
dịch tích tụ được ngày càng tăng nên khoang chứa dịch dần dần lớn lên và
được gọi là khoang phôi nang. Khối tế bào trung tâm của phôi dâu bị khoang
phôi nang đẩy dần về một cực, gọi là cực phơi, cịn cực đối lập gọi là cực đối
phơi. Những tiểu phôi bào ở lớp ngoại vi của phôi dâu co lại tạo nên thành
của khoang phôi nang. Khi đó phơi được gọi là phơi nang gồm cấu tạo riêng
biệt: khối tế bào trung tâm được gọi là nguyên bào phơi (inner cell mass/ICMhình thành nên phơi thai), những tế bào hình thành lớp ngồi của phơi nang
được gọi là nguyên bào lá nuôi (trophectoderm/TE-cung cấp chất dinh dưỡng
cho phôi, phát triển thành một phần nhau thai) và khoang phơi nang.

n

vă

ạc

th

sỹ

Từ ngày thứ 5, phơi nang thốt khỏi màng trong suốt nhờ tác dụng của
enzym phân hủy, nguyên bào ni phát triển mạnh và có thể tiếp xúc với nội
mạc tử cung để làm tổ [10].

nh

Si

c

họ

1.2.1.2. Các phương pháp đánh giá chất lượng phôi
Trong mỗi chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm, sự thành công phụ thuộc
vào rất nhiều yếu tố, trong đó, chất lượng phơi đóng vai trị vơ cùng quan
trọng. Do đó, trong suốt q trình ni phôi, các bác sĩ sẽ liên tục quan sát sự
phát triển và tiến hành phân tích, đánh giá để xếp loại phôi vào từng giai đoạn
phát triển của phôi: giai đoạn tiền nhân, phôi ngày 3 hay phôi ngày 5. Các kỹ
thuật viên phòng xét nghiệm và bác sĩ điều trị sẽ đánh giá chất lượng phôi

thông qua sự quan sát hình thái và xếp loại phơi vào các nhóm (phơi rất tốt,
phơi tốt, phơi trung bình và phơi xấu) để đưa ra quyết định về thứ tự ưu tiên
chuyển phôi, thời gian chuyển, số lượng phôi chuyển và kế hoạch đông
phôi…Tùy vào từng giai đoạn phát triển của phôi mà có các tiêu chí đánh giá
cụ thể.


10

 Đánh giá giai đoạn tiền nhân:
Đánh giá phôi giai đoạn tiền nhân phụ thuộc vào 2 đặc điểm quan
trọng: kích thước và vị trí của tiền nhân. Có nhiều hệ thống thang điểm được
sử dụng để đánh giá giai đoạn này nhưng ở Việt Nam, hệ thống thang điểm
được sử dụng phổ biến là của tổ chức Alpha [11].
 Đánh giá giai đoạn ngày 3
Đối với phôi ngày 3 người ta chủ yếu dựa vào 4 tiêu chí [11]:

ận

Lu

+ Số lượng phôi bào: số lượng phôi bào thường là chẵn (2, 4, 6, 8). Tuy nhiên,
số lượng phôi bào có thể là số lẻ 3, 5, 7 khi quan sát ở giai đoạn phân chia hay
khi xuất hiện sự phân chia không đồng bộ (một phần bào tương ở trong phôi
bị vỡ ra tạo thành mảnh vụn tế bào khơng có nhân).

n

vă

+ Độ đồng đều về kích thước phơi: nếu các phơi có kích thước đồng đều hoặc
sự chênh lệch khơng q 20% thì được đánh giá là đạt và xếp vào phơi loại 1.
Cịn nếu mức độ chênh lệch về kích thước là từ trên 20 – 50%, sẽ được xếp
vào phôi loại 2, loại 3.

ạc

th

sỹ

+ Độ phân mảnh bào tương: đây là những khối bào tương có màng bao,
không nhân. Mức độ phân mảnh chia thành 3 cấp: ≤ 10%, > 10-25%, > 25%.

Si

nh

+ Nhân phôi bào: Những phơi đa nhân thường có tỷ lệ bất thường về nhiễm
sắc thể cao hơn, được xếp vào phôi loại 3. Nếu chuyển phơi này vào tử cung
thì sẽ giảm khả năng làm tổ và tăng nguy cơ sảy thai tự phát.

c

họ


11

Bảng 1. 2. Hệ thống đánh giá điểm phôi giai đoạn phân chia theo tổ chức

Alpha [11]
Thang
điểm

Đánh giá

Mô tả
Mức độ phân mảnh tế bào 10%

1

Kích thước tế bào tương ứng với giai đoạn phát
triển

Tốt

Khơng có phơi bào đa nhân

2

ận

Lu

Mức độ phân mảnh tế bào 10-25%

Trung bình

vă

Đại đa số tế bào đạt kích thước tương ứng với giai
đoạn phát triển

n

Khơng có phơi bào đa nhân

th

ạc

Mức độ phân mảnh tế bào >25%
Xấu

Kích thước tế bào khơng phù hợp với giai đoạn phát
triển

sỹ

3

Si
nh

Có phôi bào đa nhân

c

họ

 Đánh giá giai đoạn phôi nang

Đánh giá hình thái phơi nang dựa vào tiêu chuẩn của Gardner’s để đo
độ mở rộng của khoang phôi nang và hiện tượng thoát màng, đặc điểm của
ICM và TE [12].


12

Bảng 1. 3. Hệ thống đánh giá điểm phôi giai đoạn phơi nang theo
Gardner’s [12]
Tiêu chí

Mơ tả

1

Phơi nang giai đoạn sớm, khoang phơi chiếm
dưới ½ tổng thể tích của phơi.

2

Phơi nang, khoang phơi chiếm trên ½ tổng
thể tích phơi.

3

Phơi nang đầy, khoang phơi chiếm hầu hết
thể tích của phơi.

4

Phơi nang rộng, khoang phôi phát triển rộng
làm cho mỏng màng trong suốt.

ận

Lu

Độ mở rộng của
khoang phơi
nang và hiện
tượng thốt
màng

Đánh giá

n

vă
A

Nhiều tế bào, hình thành biểu mơ liên kết

B

Vài tế bào tạo thành biểu mơ rời rạc

C

Vài tế bào, tế bào có kích thước lớn

A

Rất nhiều tế bào, liên kết chặt chẽ

B

Nhiều tế bào, gắn kết rời rạc

C

Rất ít tế bào

nh

Si

c

họ

Đánh giá
nguyên bào
phơi (ICM)

Phơi nang đã thốt màng.

sỹ

Đánh giá
ngun bào lá
ni (TE)

ạc

6

Phơi nang đang thốt màng

th

5

Việc đánh giá hình thái phơi trong từng giai đoạn phát triển là cần thiết
cho việc xếp loại nhóm phơi ưu tiên chuyển và làm tăng khả năng thành cơng
IVF. Các phơi trung bình và xấu về hình thái thường khó sống sót dưới tác
động của q trình đào thải tự nhiên nên những phơi xấu thường sẽ bị loại bỏ
từ những ngày đầu. Tuy nhiên không phải tất cả phơi có hình thái khơng tốt


13

thì đều là phơi xấu và bị loại bỏ (những mẹ có nhiều hoặc chỉ có phơi có hình
thái khơng tốt). Những phơi có hình thái khơng tốt vẫn sống sót qua q trình
chọn lọc tự nhiên khắt khe thì khả năng sống tiếp khá cao. Lúc này, xét
nghiệm di truyền trước chuyển phôi là cần thiết để loại bỏ những phơi bất
thường cả về hình thái và di truyền.

ận

Lu

1.2.1.3. Các giai đoạn sinh thiết phơi
Q trình sinh thiết để sàng lọc di truyền trước chuyển phơi có thể được
thực hiện ở 3 giai đoạn khác nhau: sinh thiết ngay sau khi trứng thụ tinh (sinh
thiết thể cực thứ nhất và thứ hai), sinh thiết phôi ở giai đoạn phân cắt (ngày
thứ 3 sau thụ tinh) hay sinh thiết ở giai đoạn phôi nang (ngày thứ 5 sau thụ
tinh). Mỗi giai đoạn sinh thiết đều mang những ưu điểm, khuyết điểm cũng
như chỉ định riêng. Tùy thuộc vào chỉ định của bác sĩ dựa trên tình hình điều
trị của bệnh nhân mà phương án sinh thiết được lựa chọn.

n

vă

ạc

th
sỹ
nh

Si
c

họ