Sản xuất chitin chitosan từ vỏ tôm

Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
CHƯƠNG I
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Chitin là một polysaccharide đứng thứ hai về lượng trong tự nhiên chỉ sau
cellulose. Chitin và các sản phẩm của chúng hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lónh vực như: y học, sản xuất mỹ phẩm, bảo quản nông sản, xử lý môi trường.
Ngoài ra khi ta khử acetylene trong hợp chất chitin sẽ tạo thành chitosan là đơn vò
cao phân tử của glucosamine, là một chất có ứng dụng rộng rãi trong các ngành công
nghiệp nhẹ, thực phẩm, nông nghiệp. Việc nghiên cứu và tách chiết chitin từ vỏ giáp
xác đã được thực hiện hơn một thế kỷ nay.
Hiện nay, tôm là mặt hàng chế biến chủ lực của ngành thuỷ sản Việt Nam,
chủ yếu là tôm đông lạnh. Theo báo cáo của Bộ thuỷ sản, sản lượng tôm năm 2003
là 193973 tấn, tuỳ thuộc vào sản phẩm chế biến và sản phẩm cuối cùng, phế liệu
tôm có thể lên tới 40 – 70% khối lượng nguyên liệu. Tương ứng với sản lượng tôm
hàng năm sẽ có khối lượng phế liệu khổng lồ gồm đầu và vỏ tôm được tạo ra. Hiện
nay, ở nước ta nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm chưa được tận dụng trên quy mô lớn.
Tình trạng trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học công nghệ, cho ngành
thuỷ sản là phải sử dụng hợp lý và hiệu quả lượng phế liệu tôm rất lớn do các nhà
máy chế biến thuỷ sản tạo ra hàng ngày để sản xuất ra sản phẩm có giá trò cao,
chitin – chitosan.
Tuy nhiên, quy trình sản xuất chitin được sử dụng phổ biến hiện nay là theo
phương pháp hoá học, protein trong đầu và vỏ tôm được loại bỏ bằng cách xử lý với
NaOH. Như vậy, vừa tốn một lượng hoá chất vừa có hại cho môi trường, hơn nữa con
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
1
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
đường xử lý hoá học làm giảm chất lượng sản phẩm chitosan vì phản ứng với NaOH
làm giảm đi độ nhớt của chitosan.
Một trong những hướng giải quyết vấn đề trên là sử dụng chế phẩm enzyme

thuỷ phân protein trong vỏ tôm để sản xuất ra sản phẩm chitin có chất lượng cao và
vừa giải quyết được vấn đề môi trường. Nhiều loại enzyme protease đã được trích ly
từ tự nhiên và được ứng dụng rộng rãi như: protease từ nội tạng tôm cá, bromelaine
từ dứa, papain từ đu đủ, protease từ vi sinh vật vv.
Việc sử dụng enzyme vào sản xuất công nghiệp không những đem lại hiệu
quả cao mà còn có thể làm giảm chi phí sản xuất bằng cách tái sử dụng lại enzyme.
Để có thể tái sử dụng được enzyme ta có thể tiến hành cố đònh enzyme vào một chất
mang bằng phương pháp nhốt và chitosan là một chất được xem là có nhiều triển
vọng trong việc cố đònh enzyme và tế bào. Vớùi mong muốn góp phần giải quyết
những yêu cầu trên, chúng tôi đã thực hiện đề tài “sản xuất chitin – chitosan từ vỏ
tôm”
1.2. Mục đích khoá luận
Sản xuất chitin – chitosan bằng cách sử dụng enzyme protease thu được từ
nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae bằng các nguyên liệu rẻ tiền, đồng thời nghiên
cứu ứng dụng chitosan thu được làm giá thể cố đònh enzyme
1.3. Nội dung
Thu nhận enzyme protease từ Aspergillus oryzae.
Khảo sát quá trình kết tủa của enzyme protease.
Sử dụng enzyme protease trong sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm. Khảo sát
quá trình thuỷ phân.
ng dụng chitosan làm giá thể cố đònh enzyme protease.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
2
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
CHƯƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Nguồn gốc và sự tồn tại của chitin – chitosan trong tự nhiên
Chitin – chitosan là một polysaccharide tồn tại trong tự nhiên với sản lượng
rất lớn đứng thứ hai sau cellulose. Trong tự nhiên chitin tồn tại trong cả động vật và

thực vật.
Chitin – chitosan là polysaccharide có đạm không độc, có khối lượng phân tử
lớn. Cấu trúc của chitin là tập hợp các monosaccharide (N-acetyl-β-D-glucosamine)
liên kết với nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi có tổ
chức. Hơn nữa chitin tồn tại rất hiếm ở trạng thái tự do và hầu như luôn luôn nối bởi
các cầu nối đẳng trò (coralente) với các protein, CaCO
3
và các hợp chất hữu cơ khác.
Về mặt lòch sử, chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào 1821, trong cặn
dòch chiết từ một loại nấm. Ông đặt tên cho chất này là “Fungine” để ghi nhớ nguồn
gốc của nó. Năm 1823 Odier phân lập một chất từ bọ cách cứng mà ông gọi là chitin
hay “chiton”, tiếng Hy Lạp có nghóa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có
mặt của nitơ trong đó. Cuối cùng cả Odier và Braconnot đều đi đến kết luận chitin
có dạng công thức giống như cellulose.
2.1.1 Cấu trúc hoá học của chitin
Chitin có cấu trúc tinh thể rất chặt chẽ và đều đặn. Bằng phương pháp nhiễu
xạ tia X. người ta có thể chứng minh được chitin tồn tại ở 3 dạng cấu hình: α, β, γ-
chitin.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
3
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Các dạng này của chitin chỉ do sự sắp xếp khác nhau về hướng của mỗi mắt
xích (N-acetyl-D-glucosamin) trong mạch.
Có thể biểu diễn mỗi mắt xích này bằng mũi tên chỉ nhóm –CH
2
OH, phần
đuôi chỉ nhóm –NHCOCH
3
, thì các cấu trúc α, β, γ - chitin được mô tả như sau:

α – chitin β- chitin γ – chitin
α – chitin có cấu trúc các mạch được sắp xếp ngược chiều nhau đều đặn, nên
ngoài liên kết hydro trong một lớp và hệ chuỗi, nó còn có liên kết hydro giữa các lớp
do các chuỗi thuộc lớp kề nhau nên rất bền vững. Do các mắt xích sắp xếp đảo
chiều, xen kẽ thuận lợi về mặt không gian và năng lượng. Đây cũng là dạng phổ
biến trong tự nhiên.
β,γ- chitin da mắt xích ghép với nhau theo kiểu song song (β- chitin ) và hai
song song một ngược chiều (γ- chitin ), giữa các lớp không có loại liên kết hydro.
Dạng β- chitin cũng có thể chuyển sang dạng α – chitin nhờ quá trình acetyl hoá cho
cấu trúc tinh thể bền vững hơn.
Qua nhiều nghiên cứu về sự thuỷ phân chitin bằng enzyme hay acid HCl đậm
đặc thì người ta thấy rằng chitin có cấu trúc là một polymer được tạo thành từ các
đơn vò N-acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết β- (1-4) glucozit.
Công thức phân tử: [C
8
H
13
O
5
N]
n
Phân tử lượng: M
chitin
= (230.09)
n
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
4
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Hình 1 Công thức cấu tạo của chitin

Tên gọi: poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucose
Poly(1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranose
2.1.2 Tính chất của chitin
Chitin ở thể rắn và có độ kết tinh cao do gốc –NHCOCH
3
ở vò trí cacbon thứ
hai, làm tăng liên kết hydro giữa các mạch và trong mạch với nhau
Chitin là một polysaccharide bền trong môi trường kiềm nhưng kém bền trong
môi trường acid
Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong acid loãng, trong kiềm loãng,
các thuốc thử Schweitzer và các dung môi hữu cơ như rượu, este,. nhưng nó hoà tan
trong một số dung dòch như hydrochloride, acid đậm đặc (acid nitrit, formic, acid
khan). Đặc biệt nó còn hoà tan trong dung dòch đặc nóng của muối thioxianat liti
(LiSCN) và muối thixianat canxi [Ca(SCN)
2
] tạo thành dung dòch keo
Chitin ổn đònh với các chất oxy hoá khử như KMnO
4
, H
2
O
2
, NaClO hay
Ca(ClO)
2
, lợi dụng tính chất này để khử màu chitin.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
5
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm

Khi đun nóng trong môi trường kiềm đậm đặc, chitin bò khử bởi gốc acetyl tạo
thành chitosan
2.1.3 Cấu trúc hoá học của chitosan
Trong các dẫn xuất của chitin thì chitosan là một trong những dẫn xuất quan
trọng vì nó có hoạt tính sinh học cao và có nhiều ứng dụng trong thực tế.
Việc sản xuất chitosan tương đối đơn giản, không cần dung môi, hoá chất độc
hại, đắt tiền. Chitosan thu được bằng phản ứng deacetyl hoá chitin, biến đổi nhóm N-
acetyl thành nhóm amin ở vò trí C
2
.
Do quá trình khử acetyl xảy ra không hoàn toàn nên người ta qui ước nếu độ
deacetyl hoá (degree of deacetylation) DD > 50% thì gọi là chitosan, nếu DD < 50%
gọi là chitin
Chitosan có cấu trúc tuyến tính từ các đơn vò 2-amino-2-deoxy-β-D-
glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-(1-4) glucozit.
Công thức phân tử chitosan [C
6
H
11
O
4
N]
n
Phân tử lượng: M
chitosan
= (161.07)
n
Hình 2 Công thức cấu tạo của chitosan
Tên gọi khoa học: poly(1-4)-amino-2-deoxy-β-D-glucose
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương

SVTH: Đặng Tiến Đông
6
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Poly(1-4)-2-amino-2-deoxy-β-D-glucopyranose.
Qua cấu trúc của chitin – chitosan ta thấy chitin chỉ có một nhóm chức hoạt
động là –OH ( H ở nhóm hydroxyl bậc 1 linh động hơn H ở nhóm hydroxyl bậc 2
trong vòng 6 cạnh) còn chitosan có 2 nhóm chức hoạt động là –OH, -NH
2
, do đó
chitosan dễ dàng tham gia phản ứng hoá học hơn chitin. Trong thực tế chitin –
chitosan đan xen nhau, vì vậy tạo ra nhiều sản phẩm đồng thời, việc tách và phân
tích chúng rất phức tạp.
2.1.4 Tính chất của chitosan
Trọng lượng phân tử chitosan tuỳ thuộc vào điều kiện sản xuất, thường nằm
trong khoảng 10.000 – 1.000.000 Da với mức độ deacetyl hoá thường là 70 – 90%
Chitosan ở thể rắn, màu trắng ngà, không mùi, không vò, không tan trong
nước, kiềm, aicd đậm đặc nhưng tan trong acid loăng, tan tốt trong dung dòch acid
acetic loãng (0.5 – 1.5%) tạo thành dung dòch keo, trong suốt. Lợi dụng tính chất này
của chitosan để thực hiện cố đònh enzyme bằng phương pháp nhốt
Chitosan là một polyamine, nó được xem như là một polymer cationic có khả
năng cho các ion kim loại nặng bám dính vào các bề mặt tích điện âm tạo ra phức
chất với kim loại và tủa xuống, loại các ion kim loại nặng ra khỏi dung dòch
Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là trên các khuẩn gây bệnh
như E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm
nhất là nấm Candida albicans
Chitosan có nhiệt độ nóng chảy là 309 – 311
0
C
Chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo màng, tạo hạt, khả năng hấp phụ tốt, có
tính chất cơ lý bền vững, ổn đònh, thường được dùng cố đònh enzyme qua cầu nối

glutaradehyde.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
7
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Chitosan phản ứng với các acid đậm đặc tạo thành muối khó tan, tác dụng với
iod và acid sulfuric thành phản ứng màu tím, có thể dùng trong phân tích đònh tính
chitosan
Ngoài các tính năng trên của chitosan, nó còn được xem là nguồn nguyên liệu
vô cùng quý giá để cho ra các dẫn xuất chitosan rất hấp dẫn trong các lónh vực thực
phẩm, dược phẩm, sinh học và bảo vệ môi trường
2.1.5 Nguồn thu nhận chitin
Chitin có mặt ở khắp nơi trong tự nhiên trong đông vật, thực vật và cả vi sinh
vật
Trong động vật chitin là một thành phần quan trọng của các vỏ một số động
vật không xương sống như: cồn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong động
vật bậc cao monome của chitin là một thành phần chủ yếu trong mô da nó giúp cho
sự tái tạo và gắn liền các vết thương ở da. Trong thực vật chitin có ở thành tế bào
nấm họ zygenmyctes, và các sinh khối nấm mốc, một số loài tảo .
Tuy nhiên trên thực tế vỏ tôm cua lại chiếm thành phần chitin khá cao(14-
35%). Với giá thành rẽ nên hầu hết các cơ sở sản xuất chitin – chitosan đều từ vỏ
tôm. Vì lý do giảm thiểu ô nhiễm môi trường (sản xuất chitin – chitosan chủ yếu
bằng phương pháp hoá học). Nâng cao chất lượng sản phẩm, tận thu các phế phẩm
có giá trò (vỏ tôm từ nhà máy) vv góp phần giải quyết ô nhiễm mà còn đem lại hiệu
quả kinh tế cao.
Bảng 2.1: bảng biểu diễn thành phần hoá học trong đầu tôm
Thành
phần
m độ Đạm toàn
phần

Protein
thô
Lipide Calci Phosphor
Hàm
lượng
73.22 1.86 11.64 2.01 2.19 0.37
2.2 Phương pháp sản xuất chitin – chitosan
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
8
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Hiện nay sản xuất chitin – chitosan chủ yếu bằng phương pháp hoá học và
phải qua các quá trình sau:
a) Quá trình khử khoáng
Trong vỏ tôm thành phần chủ yếu là muối CaCO
3
, MgCO
3
và rất ít Ca
3
(PO
4
)
2.
nên người ta thường dùng các loại acid như HCL, H
2
SO
4
để khử khoáng. Khi khử
khoáng, nếu dùng HCl thì cho hiệu quả cao hơn. Nếu dùng H

2
SO
4
sẽ tạo muối khó
tan nên ít sử dụng. Phản ứng của HCl để khử khoáng như sau:
MgCO
3
+ 2HCl = MgCl
2
+ CO
2
+ H
2
O.
CaCO
3
+ 2HCl = CaCl
2
+ CO
2
+ H
2
O
Ca
3
(PO
4
)
2
+ 6HCl = 3CaCl

2
+ 2H
3
PO
4
Trong quá trình rửa thì muối Cl
-
tạo thành được rửa trôi, nồng độ acid HCl có
ảnh hưởng lớn đến chất lượng của chitosan thành phẩm, đồng thời có ảnh hưởng lớn
đến thời gian và hiệu quả khử khoáng. Nến nồng độ HCl cao sẽ rút ngắn được thời
gian khử khoáng nhưng sẽ làm cắt mạch do có hiện tượng thuỷ phân các liên kết β-
(1-4) glucozit để tạo ra các polymer có trọng lượng phân tử trung bình thấp, có khi bò
thuỷ phân triệt để đến glucosamin. Ngược lại nếu nồng độ HCl quá thấp thì quá trình
khử khoáng sẽ không triệt để và thời gian xử lý kéo dài ảnh hưởng đến chất lượng
sản phẩm.
Sau khi khử khoáng tiến hành rửa trung tính, công đoạn này có tác dụng rửa
trôi hết các muối, acid dư tan trong nước. Quá trình rửa kết thúc khi dòch rửa cho pH
= 7.
b) Quá trình loại protein
Sau khi có vỏ tôm đã loại khoáng. Ta tiến hành loại bỏ hoàn toàn protein bằng dung
dòch NaOH 3%, protein bò kiềm thuỷ phân thành các amin tự do tan và được loại ra
theo quy trình rửa trôi. Lượng NaOH 3% cho vào đến khi ngập toàn bộ vỏ tôm và
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
9
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
kiểm tra pH = 11 -12 là được để đảm bảo việc loại bỏ protein được hoàn toàn. Đun ở
nhiệt độ 90 -95
0
C trong 3.5- 4 giờ (trong quá trình nung lưu ý vấn đề trào dung môi

do tạo bột nhiều và mùi bay ra khó chòu) sản phẩm sau khi nung được rửa sạch bằng
nước thường hoặc nước cất đến pH = 7.
Tiếp đó chúng tôi tiến hành rửa trung tính, nhằm mục đích rửa trôi hết các,
muối natri, các amin tự do và NaOH dư. Sấy khô ở 60
0
C thu được chitin thô.
c) Quá trình tẩy màu (loại bỏ astaxanthin)
chitin thô có màu hồng nhạt do còn sắc tố astaxanthin. Do chitin ổn đònh với
các chất oxy hoá như thuốc tím (KMnO
4
) oxy già (H
2
O
2
) nước javen (NaOCl +
NaCl), Na
2
S
2
O
3
, CH
3
COCH
3
lợi dụng tính chất này ta sử dụng KMnO
4
và H
2
O

2
để
khử màu cho chitin.
d) Điều chế chitosan
quá trình điều chế chitin thành chitosan thực chất là quá trình deacety hoá
chitin, chuyển hoá nhóm –NHCOCH
3
thành nhóm NH
2
và loại bỏ nhóm –CH
3
CO,
chuyển hoá thành muối natri (CH
3
COONa. Để thực hiện được quá trình deacetyl hoá
hoàn toàn, người ta sử dụng NaOH đậm đặc 50% thời gian 4 giờ nhiệt độ ở 110 –
120C . ở đây dựa vào tính chất chitosan tan được trong dung dòch acid loãng tạo
thành dung dòch keo trong suốt, trong khi chitin không tan do đó ta có thể sơ bộ kiểm
tra mức độ chuyển hoá chitin thành chitosan bằng cách lấy một ít sản phẩm cho vào
CH
3
COOH 1%. Nếu sản phẩm tan tạo thành dung dòch keo trong suốt là được. Sau
đó rửa trung tính và sấy khô, chitosan thu được có màu trắng sáng. Quá trình điều
chế chitosan tử chitin cho hiệu suất tương đối cao (60 -75%)
2.3 Ứng dụng của chitin – chitosan
a) Trong công nghiệp thực phẩm
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
10
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm

Chitosan dùng để bảo quản hoa quả và rau tươi, bảo quản thực phẩm tươi
sống.
Làm màng mỏng để bao gói bánh kẹo.
Chitosan và muối của nó được dùng như chất tinh luyện nước ép từ trái cây
như nước táo, cà rốt, chất này làm thay thế các chất cũ như silicasol, gelatin,
b) Trong mỹ phẩm
Chitosan dùng làm chất phụ gia, làm kem bôi mặt, thuốc làm mềm da, làm
tăng khả năng hoà hợp sinh học giữa kem thuốc và da, cấu tạo thuốc đònh hình tóc,
kem bôi da lột mặt,
c) Trong y tế
Chitosan dùng làm chất phụ gia rất tốt cho kỹ nghệ bào chế dược phẩm (keo
kết dính viên, tá dược độn, chất tạo nang mềm, )
Chitosan là chất mang polymer sinh học để gắn thuốc bằng liên kết cơ học
hay hoá học nhằm tạo ra thuốc polymer có nhiều tác dụng mới. Chitosan được coi là
một hệ thống vận tải thuốc khá lý tưởng.
Bản thân chitosan và các dẫn xuất của nó được dùng làm thuốc chữa bệnh:
thuốc hạ cholesterol trong máu, thuốc chữa trò các vết thương, vết bỏng. Thuốc chữa
đau dạ dày, thuốc chống đông tụ máu, thuốc dùng tăng cường miễn dòch cơ thể và
khả năng chống nhiễm HIV,
d) Ngành y
Chitosan là vật liệu cho y khoa rất tốt như: da nhân tạo, mô ghép, chỉ khâu
phẫu thuật tự tiêu, kem chữa bỏng, thuốc chữa lành nướu sau khi nhổ răng,
e) Trong nông nghiệp
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
11
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Chitosan được dùng như là một thành phần chính trong thuốc phòng trừ nấm
(đạo ôn, khô vằn, ), dùng làm thuốc kích thích sinh trưởng cho cây lúa, cây công
nghiệp, cây cảnh, cây ăn quả,

f) Trong công nghệ hoá học
Chitosan được dùng để xử lý nước thải công nghiệp, có khả năng tạo phưc với
các kim loại nặng độc hại, dùng để lọc nước sạch tiêu dùng
g) Trong công nghệ sinh học
Chitosan được dùng làm chất nang để cố đònh enzyme và các tế bào
2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất và ứng dụng trong thực tế của chitin và
chitosan ở việt nam và thế giới
Trước đây người ta đã thử tách chiết chitin từ thực vật biển nhưng nguồn
nguyên liệu không đủ để đáp ứng nhu cầu sản xuất. Trữ lượng chitin phần lớn có
nguồn gốc từ vỏ tôm cua. Trong một thời gian các chất phế thải này không được thu
hồi mà lại thải ra ngoài gây ô nhiễm môi trường. Năm 1977 Viện kỹ thuật
Masachusetts (Mỹ), khi tiến hành xác đònh giá trò của chitin và protein trong vỏ tôm,
cua đã cho thấy việc thu hồi các chất này có lợi nếu sử dụng trong công nghiệp.
Phần protein thu được sẽ dùng để chế biến thức ăn gia súc, còn lại chitin sẽ được
dùng làm như một chất khởi đầu để điều chế các dẫn xuất có nhiều ứng dụng trong
lónh vực công nghiệp
Việc nghiên cứu chitin – chitosan và các ứng dụng của chúng trong sản xuất
phục phụ đời sống là một hướng nghiên cứu tương đối mới mẻ ở nước ta. Vào những
năm 1978 đến 1980 trường Đại học thủy sản nha trang đã công bố quy trình sản xuất
chitin – chitosan của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, như chưa có ứng dụng cụ thể trong sản
xuất. Gần đây trước yêu cầu xử lý phế liệu thuỷ sản đông lạnh đang ngày càng cấp
bách, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin – chitosan cũng như tiềm năng thò
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
12
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học của chúng ta bắt tay vào nghiên cứu
hoàn thiện quy trình sản xuất chitin – chitosan ở bước cao hơn, đồng thời nghiên cứu
các ứng dụng của chúng trong các lónh vực sản xuất công nghiệp.
Hiện nay ở Việt Nam có nhiều cơ sở khoa học đang nghiên cứu sản xuất chitin

– chitosan như: Trường Đại Học Nông Lâm – TPHCM. Trung tâm nghiên cứu
polymer – Viện Khoa Học Việt Nam, Viện Hoá thuộc phân Viện Khoa Học Việt
Nam tại TPHCM, Trung tâm công nghệ và sinh học Thuỷ sản - Viện nghiên cứu
nuôi trồng thuỷ sản 2.
miền Bắc, Viện Khoa Học Việt Nam đã kết hợp với xí nghiệp thuỷ sản Hà
Nội sản xuất chitosan và ứng dụng trong lónh vực nông nghiệp ở đồng lúa Thái Bình
và đã thu được một số kết quả đáng kích lệ.
miền Nam Trung tâm công nghệ và sinh học thuỷ sản phối hợp với một số
cơ quan khác: Đại Học Y Dược TPHCM, phân Viện Khoa Học Việt Nam. Viện Khoa
Học nông nghiệp miền nam, . đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin –
chitosan trong lónh vực nông nghiệp, y dược và mỹ phẩm.
Trong nông nghiệp chitosan được sử dụng để bảo vệ các hạt giống nhằm mục
đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất, đồng thời nó còn có tác dụng cố đònh
phân bón, thuốc trừ sâu, tăng cương khả năng nảy mầm của hạt
Qua nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan và các nguyên tố vi lượng lên một số
chỉ tiêu sinh hoá của mạ lúa ở nhiệt độ thấp thì kết quả nghiên cứu cho thấy chitosan
vi lượng làm tăng diệp lục và hàm lượng nitơ; đồng thời hàm lượng các enzyme
amylase, catalase hay peroxidaza cũng tăng lên.
Ngày nay chitosan còn được dùng làm nguyên liệu bổ sung vào thức ăn cho
tôm, cá, cua để kích thích sinh trưởng.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
13
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Những ứng dụng của chitin – chitosan và những dẫn xuất của chúng ngày
càng phát triển. Một số đã được ứng dụng như là: chỉ khâu tự huỷ, da nhân tạo, thấu
kính chiết xuất, và một số ứng dụng khác đang được nghiên cứu như : tác động kích
thích miễn dòch, chống sự phát triển của khối u, đặc tính làm giảm cholesterol máu,
trò bỏng nhiệt
Da nhân tạo có nguồn gốc từ chitin, nó giống như một tấm vải và được bọc ốp

lên vết thương chỉ một lần đến khi khỏi. Da nhân tạo bò phân huỷ sinh học từ từ cho
đến lúc hình thành lớp biểu bì mới. Nó có tác dụng giảm đau, giúp cho các vết sẹo
bỏng phục hồi biểu bì nhanh chóng. Trường Đại Học Dược Hà Nội, Đại Học Y Dược
Hà Nội, Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia cũng đã chế tạo thành
công loại da nhân tạo này và bước đầu ứng dụng hiệu quả.
Chitin – chitossan và các oligo của nó có đặc tính miễn dòch do nó kích thích
các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dòch với các tế bào khối u và các tác nhân gây
bệnh.
Những nghiên cứu gần đây hướng vào các oligo, N-acetyl-glucosamin và
glucosamin, các chất này có một số tính chất của các polymer tương ứng nhưng lại
có ưu thế là tan tốt trong nước do đó dễ dàng được hấp thụ.
Hiện nay trên thế giới đã thành công việc sử dụng chitosan làm chất mang để
cố đònh enzyme và tế bào. Enzyme cố đònh đã cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi
enzyme trong công nghiệp, y học và khoa học phân tích. Enzyme cố đònh được sử
dụng lâu dài, không cầc thay đổi chất xúc tác. Nhất là trong công nghệ làm sạch
nước, làm trong nươc hoa quả, sử dụng enzyme cố đònh rất thuận lợi và đạt hiệu quả
cao. Chitosan thoả mãn yêu cầu đối với chất mang có phân tử lượng lớn, bền vững
không tan và ổn đònh với các yếu tô hoá học.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
14
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Do có cấu trúc tương tự như cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung
vào nguyên liệu sẩn xuất giấy cũng tốt hơn. Trong sản xuất giấy qua nghiên cứu
người ta thấy nếu bổ sung 1% chitosan thì độ bền của giấy tăng lên khi bò ướt hay
tăng độ nét khi in.
Có thể thay hồ tinh bột bằng chitosan để hồ vải, nó có tác dụng làm tơ sợi
bền, mòn, bóng đẹp, cố đònh hình in, chòu được acid hay kiềm nhẹ.
Chitosan được sử dụng để sản xuất kem chống khô da do tính chất của
chitosan là có thể cố đònh dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm –NH

4
+
. các
nhóm này liên kết với các tế bào sừng hoá của da, nhà vậy các nhà khoa học đã
nghiên cứu sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da chống nắng.
Nhờ khả năng làm đông tụ các thể rắn lơ lửng giàu protein và nhờ khả năng
dính tốt các ion kim loại như Pb, Hg . do đó chitin được sử dụng để tẩy lọc nguồn
nước thải công nghiệp từ các nhà máy chế biến thực phẩm.
Chitosan sử dụng để chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm
đông thực phẩm.
Do chitosan có tính chất diệt khuẩn, do đó nó được tạo thành màng mỏng để
bao gói thực phẩm chống ẩm mốc, chống mất nước.
Đặc tính diệt khuẩn của chitosan được thể hiện trên các mặt sau:
Khi tiếp xúc với thực phẩm chitin – chitosan sẽ lấy đi từ các vi sinh vật này
các ion thiết yếu, ví dụ như ion Cu
2+
. Như vậy vi sinh vật sẽ bò chết do sự mất cân
bằng liên quan đến các ion thiết yếu.
Ngăn chặn phá hoại chức năng màng tế bào.
Gây ra sự rò rỉ các phần bên trong tế bào.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
15
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Như vậy việc dùng chất chitosan bao bọc quanh bề mặt thực phẩm có thể kéo
dài thời gian bảo quản, giảm sự hư hỏng do khả năng kháng nấm, kháng khuẩn của
nó.
2.5 Một số quy trình sản xuất chitin và chitosan trên thế giới và ở việt nam
Trên Thế Giới
a) Quy trình thuỷ nhiệt Yamasaki và Nacamichi (nhật bản)

Nguyên liệu là vỏ cua đã khô, sạch được đem khử khoáng bằng HCl 2N trong
thời gian là 1 giờ (tác giả cho rằng hiệu quả khử khoáng có thể đạt được 100%).
Sau đó đem rửa sạch và đem làm khô. Tiếp theo là tiến hành kết hợp hai công
đoạn khử protein và deacetyl đồng thời trong dung dòch NaOH 15N ở nhiệt độ 150
0
C
trong 1 giờ, kết quả cho thấy protein được tách ra triệt để và độ deacetyl đạt trên
70%. Sau thời gian 1 giờ đem rửa sạch và làm khô sẽ thu được chitosan thành phẩm.
Phương pháp này có ưu điểm là quy trình đơn giản công đoạn, rút ngắn đáng
kể thời gian sản xuất so với các quy trình khác. Hoá chất sử dụng ít (HCl và NaOH),
chitosan thu được có độ tinh thiết cao. Tuy nhiên cũng có nhược điểm là sản phẩm
chitosan thu được có độ nhớt thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng cho các khâu sản xuất.
b) Quy trình sản xuất chitin của Hackman
Vỏ tôm hùm được rửa sạch và sấy khô ở nhiệt độ 100
0
C tiếp theo được khử
khoáng bằng HCl 2N với tỷ lệ w/v = 1/10 ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 5 giờ đem
rửa trung tính và sấy khô ở 100
0
C và đem xay nhỏ.
Ngâm tiếp trong dung dòch HCl 2N với tỷ lệ w/v=1/2.5 ở nhiệt độ phòng. Sau
48 giờ đem ly tâm thu phần bã và đem rửa trung tính. Ngâm bã bột đã rửa trong dung
dòch NaOH 1N với tỷ lệ w/v=1/2.5 ở nhiệt độ 100
0
C, sau 42 giờ đem ly tâm thu phần
bã. Sau đó lại tiếp tục ngâm trong NaOH 1N với tỷ lệ và nhiệt độ trên, sau 12 giờ
đem ly tâm thu phần bã. Tiếp theo đó rửa trung tính và đem làm sạch bằng cách ly
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
16

Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
tâm với các chất theo thứ tự: nước, etanol và ete. Sau đó làm khô ta được sản phẩm
dạng bột màu kem.
Với quy trình này thì có nhiều công đoạn tăng khả năng khử khoáng, khử
protein song do cồng kềnh, chỉ thích hợp cho đối tượng là vỏ tôm hùm, tôm mũ ni và
vỏ cua, thời gian thực các công đoạn kéo dài, do đó quy trình Hackman chỉ mang tính
nghiên cứu thí nghiệm, không có tính khả thi nếu sản xuất đại trà, quy trình mới chỉ
dừng lại đến sản phẩm là chitin.
c) Quy trình sản xuất chitosan của pháp
Nguyên liệu vỏ tôm sạch được đem đi hấp chín, phơi khô, ta đem đi xay nhỏ.
Khử protein bằng NaOH 3.5% với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ 65
0
C. sau 2 giờ vớt ra
rửa trung tính, tiếp đó ngâm trong HCl 1N với tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 2
giờ vớt ra tiến hành tẩy các chất màu hữu cơ bằng aceton với tỷ lệ w/v=1/5, ở nhiệt
độ phòng sau 30 phút vớt ra rửa sạch và tẩy màu lại bằng nước javen (NaOCl +
NaCl) 0.135%, tỷ lệ w/v=1/10, ở nhiệt độ phòng sau 6 phút với ra rửa trung tính, thu
được chitin sạch. Sau đó tiến hành deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ
w/v=1/4, ở nhiệt độ 85
0
C sau thời gian 4 giờ đem rửa trung tính thu được chitosan.
Quy trình có ưu điểm là thời gian sản xuất ngắn, sản phẩm có màu sắc đẹp,
sạch do có hai bước khử sắc tố. Tuy nhiên NaOCl là một chất oxy hoá mạnh, ảnh
hưởng đến mạch polymer, do đó độ nhớt sản phẩm giảm rõ rệt. Mặt khác aceton có
giá trò đắt tiền, tổn thất nhiều, giá thành sản phẩm sẽ cao. Chưa kể các yếu tố trong
an toàn sản xuất, công nghệ này khó áp dụng trong điều kiện sản xuất ở nước ta hiện
nay.
d) Phương pháp điều chế chitin của Capozza
Cân 149g nguyên liêu vỏ tôm sạch cho vào bình khuấy với một máy khuấy,
thêm từ từ 825ml acid HCl 2N vào bình, thực hiện phản ứng ở 4

0
C trong thời gian 48
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
17
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
giờ. Sản phẩm sau quá trình khử khoáng được rửa sạch bằng nước đến pH = 7. xác
đònh hàm lượng tro 0.4 -0.5%. sau đó sản phẩm được khuấy ở nhiệt độ phòng với
1500ml acid fomic HCOOH 90%. Để qua đêm. Hỗn hợp được lọc ly tâm lấy phần bã
và rửa lại với nước nhiều lần cho đến khi pH = 7. sản phẩm sạch sau đó được ngâm
được tráng rửa lại trong ethanol 96
0
và ether, sấy khô ở 40
0
C dưới áp suất giảm.
Khối lượng chitin thô sạch thu được là 66g hiệu suất 44,3%
Tại Việt Nam
a) Quy trình sản xuất chitosan của Đỗ Minh Phụng
Nguyên liệu là vỏ tôm khô được khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ
w/v=1/2.5. ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ đem rửa trung tính, tiếp theo đun trong
NaOH 8% với tỷ lệ w/v=1/1.5, ở nhiệt độ 100
0
C, sau 2 giờ khử protein rồi đem rửa
trung tính.
Tiến hành tẩy màu bằng KMnO
4
1% trong môi trường H
2
SO
4

10% sau 1 giờ
rửa sạch và khử màu phụ bằng Na
2
S
2
O
3
1.5% trong 15 phút, vớt ra rửa sạch thu được
chitin.
Deacetyl chitin bằng NaOH 40% với tỷ lệ w/v=1/1, ở nhiệt độ 80
0
C sau 24 giờ
đem rửa sạch và cuối cùng thu được chitosan.
Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu trắng đẹp. Song thời gian còn
dài, sử dụng nhiều chất oxy hóa dễ làm ảnh hưởng tới độ nhớt của sản phẩm.
b) Quy trình sản xuất chitosan ở trung tâm cao phân tử viện khoa học
Việt Nam
Nguyên liệu là vỏ ghẹ hay vỏ tôm sạch được khử khoáng lần 1 bằng HCl 4%
ở nhiệt độ phòng, sau thời gian 24 giờ đem rửa trung tính để làm giảm lượng NaOH
tiêu hao ở công đoạn sau.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
18
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Nấu trong NaOH 3% ở nhiệt độ 90 -95
0
C sau 3 giờ đem rửa trung tính, tiếp tục
khử khoáng lần hai bằng HCl ở nhiệt độ phòng 90 -95
0
C sau 3 giờ đem rửa trung

tính. Cuối cùng nấu trong NaOH 40%, rửa trung tính và sấy khô thu được chitosan.
Sản phẩm chitosan sản xuất theo quy trình này có màu sắc không đẹp bằng
sản phẩm theo quy trình của kỹ sư Đỗ Minh Phụng, thời gian thực hiện quy trình kéo
dài, nhiều công đoạn.
c) Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp thủy sản Hà Nội
Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lý tách
khoáng lần 1 trong HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2, ở nhiệt độ phòng 24 giờ vớt ra rửa trung
tính. Sau đó dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỷ lệ w/v=1/2.8 ở nhiệt độ 90-
95
0
C, sau 3 giờ rửa và tiến hành khử khoáng lần 2 cũng dùng HCl 4%, tỷ lệ w/v=1/2,
ở nhiệt độ phòng sau 24 giờ đem rửa trung tính. Để tách protein lần 2 cũng dùng
NaOH 2%, w/v=1/2.8, ở nhiệt độ 90-95
0
C, sau 3 giờ rửa trung tính và tiến hành khử
khoáng lần 3 cũng giống như lần khử khoáng trên. Sản phẩm đem làm khô thu được
chitin.
Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu. Nhưng
nhược điểm là thời gian sản xuất của quy trình kéo dài, nồng độ hoá chất polymer
trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm.
d) Quy trình sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp với hoá
học.
Việc sản xuất chitosan theo phương pháp sinh học kết hợp hoá học cũng thực
hiện theo các bước: khử khoáng, khử protein và deacetyl.
Công đoạn khử khoáng hiệu quả nhất và duy nhất chỉ thực hiện bằng phương
pháp hoá học.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
19
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm

Công đoạn khử protein và deacetyl có thể thay thế bằng phương pháp sinh
học, đó là khử protein bằng enzyme protease và deacetyl bằng enzyme deacetylaza.
Vỏ tôm được ngâm trong HCl 10% tỷ lệ w/v =1/10, để ở nhiệt độ phòng trong
thời gian 5 giờ. Rửa sạch đến pH = 7.sau đó khử protein bằng papain 13% tỷ lệ w/v
=1/5, pH = 5-5,5, ở nhiệt độ 70 -80
0
C trong thời gian 4 giờ. Rửa sạch, tẩy màu sấy
khô ở nhiệt độ 60
0
C thu được chitin thô, trắng. Deacetyl chitin bằng NaOH 35%, tỷ
lệ w/v =1/10, ở 90
0
C trong thời gian 5,5 giờ. Rửa sạch và sấy khô thu được chitosan
sạch.
Chitosan thu được có màu sắc trắng, đẹp trong và mềm mại. Quy trình papain
cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các quy trình khác. Tuy nhiên điều kiện khó khăn
do việc tìm mua hoặc sản xuất enzyem deacetylaza nên công đoạn deacetyl được
thực hiện bằng việc nấu NaOH đậm đặc.
e) Quy trình sản xuất chitin – chitosan theo phương pháp sinh học
Trong vài năm gần đây đã có nhiều phát hiện mới liên quan đến sản xuất
chitin – chitosan bằng cách nuôi cấy nấm móc Rhizopus azygosporus và nấm mốc
Actinomucor taiwanensis và cô lập chitin – chitosan từ sự nuôi cấy đó. Sau khi nuôi
cấy tế bào nấm mốc được thu nhận từ canh trường lên men và xử lý chúng với
NaOH nồng độ 1N ở 121
0
C thời gian 15 phút. Sau đó trộn với nước cất đem đi ly tâm
rửa lại bằng nước cất hoặc cồn rồi tiếp tụ xử lý với dung dòch acetic 2% ủ nhiệt độ
95
0
C trong 12 giờ.

Kết quả hình thành dạng bùn sau đó cô lập bằng cách ly tâm. Phần tan ở trên
chứa chitosan phần cặn lắng xuống chứa chitin.
Ưu điểm của phương pháp này là ít sử dụng hoá chất ít gây ô nhiễm môi
trường sản phẩm chất lượng cao. Nhược điểm là giá thành cao quá trình thực hiện
phức tạp hơn các quy trình hoá học.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
20
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
2.6 Nhu cầu sử dụng phương pháp sinh học kết hợp với hoá học
Qua các quy trình sản xuất trên ta đã thấy rõ phương pháp hoá học còn nhiều
hạn chế, tiêu tốn nhiều hoá chất gây ô nhiễm môi trường. Còn phương pháp sinh học
giá thành lại cao, do đó điều kiện cấp thiết là phải có một quy trình sản xuất ít gây ô
nhiễm và giá thành hợp lý vì vậy ta sẽ thay thế quá trình thuỷ phân protein bằng
enyzme protease.
2.7 Các nguồn enzyme protease
a) Từ động vật
Protease động vật thường có ở t tạng, niêm mạc ruột non, niêm mạc dạ dày,
….
Pancreatin: gồm trypsin, chymotrypsin và một số enzyme khác có ở t tạng,
chúng được tiết ra ngoài tế bào cùng với dòch t.
Pepsin có ở niêm mạc dạ dày, được tiết ra ngoài tế bào cùng với dòch vò.
Renin chỉ có ở ngăn thứ tư trong dạ dày bê non dưới 5 tháng tuổi, là enzyme
đông tụ sữa điển hình trong công nghệ sản xuất phomat.
b) Từ thực vật:
enzyme protease từ thực vật có ở các phần khác nhau của cây như: thân, lá
và đặc biệt có nhiều ở quả.
Enzyme này chủ yếu có ở một số cây vùng nhiệt đới như: đu đủ, dứa, cây
sung, articho và đậu tương.
Ví dụ:

Papain có trong mủ cây đu đủ, quả đu đủ còn xanh.
Bromelin có trong thân cây thơm và quả thơm xanh.
Ficin có trong mủ cây sung, quả sung, quả vả
c) Từ vi sinh vật
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
21
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease. Các enzyme này
có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc được tiết vào trong môi trường nuôi
cấy (protease ngoại bào). Cho đến nay protease ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn
các protease nội bào. Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp
và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp
và y dược.
Trong các loại protein, protein vi sinh vật từ nấm mốc là được sử dụng rộng
rãi nhất vì sản lượng lớn, dễ dàng thao thác, dễ dàng nuôi cấy chủ động được nguồn
protein cho sản xuất. Enyzme có hoạt tính cao vv . do đó chúng tôi đã chọn nấm
mốc Aspergillus oryza vì enzyme protease từ nấm mốc có hoạt tính cao, sinh sản
nhanh, dễ dàng thu nhận chủ động được trong quá trình sản xuất.
2.8 Đặc điểm chủng nấm mốc Aspergillus oryzae
a) Phân loại
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota
Ngành phụ: Pezizomycota
Lớp: Ascomycetes
Bộ: Plectascales
Họ: Aspergillusceae
Giống: Aspergillus
Loài: Aspergillus Oryzae
b) Đặc điểm

Hình thái
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
22
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Chủng nấm mốc Aspergillus oryzae có màu xanh, sợi nấm phát triển rất mạnh
(chiều ngang 5 – 7µm), có vách ngăn chia sợi nấm thành nhiều tế bào (nấm đa bào),
phát triển thành từng đám gọi là hệ sợi nấm hay khuẩn ty.
Điều kiện phát triển
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành bào tử là 45%
Độ ẩm môi trường tối ưu cho sự hình thành enzyme là 55 – 58%
Độ ẩm không khí là 85 – 95%
pH môi trường là 5.5 – 6.5
Nhiệt độ nuôi cấy là 27 – 30
0
C
Hình 2.1 Aspergillus oryzae dưới kính hiển vi
2.8.1 Thu nhận enzyme protenase từ phương pháp nuôi cấy bề mặt
Để thu nhận chế phẩm proteinase từ vi sinh vật cưng như các enzyme khác có
thể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp nuôi cấy bề mặt và phương pháp
nuôi cấy về sâu. Phương pháp nuôi cấy bề mặt thường dùng để nuôi cấy nấm mốc,
phương pháp nuôi cấy bề sâu thường dùng đối với vi khuẩn.
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
23
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh đã được nghiên
cứu và phát triển rất mạnh trong những năm đầu thế kỷ 20. lượng enzyme được tạo
thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với phương pháp nuôi cấy
chìm. Nguyên liệu sử dụng nuôi cấy bề mặt thường là những nguyên liệu có nguồn

gốc về thực vật như cám mì, cám gạo, gạo, ngô, trấu khi nuôi cấy vi sinh vật để
thu nhận protease người ta cho thêm bột đậu xanh hoặc bột đậu nành như nhưng cơ
chất cảm ứng cho sự tổng hợp của protease.
Quá trình phát triển của nấm mốc trong môi trường bán rắn khi nuôi bằng
phương pháp bề mặt trải qua các giai đoạn sau:
Giai đoạn 1: giai đoạn này kéo dài 10 -14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi
cấy. giai đoạn này có những thay đổi sau:
Nhiệt độ tăng rất chậm
Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa
Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi
Khối môi trường còn rời rạc
Enzyme mới bắt đầu hình thành
Trong giai đoạn này phải đặc biệt quan tâm đến chế độ nhiệt độ. Tuyệt đối
không được đưa nhiệt độ cao quá 30
0
C vì thời kỳ đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt.
Giai đoạn 2: giai đoạn này kéo dài khoảng 14 – 18 giờ. Trong giai đoạn này
có những thay đổi cơ bản sau:
Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rất
mạnh. Các sợi nấm tạo ra những mạng sợi chằng chòt khắp trong các hạt môi trường.
Môi trường được kết lại khá chặt
Độ ẩm môi trường giảm dần
Nhiệt độ môi trường tằng nhanh có thể lên tới 40 – 45
0
C
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
24
Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm
Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh, do sự đồng hoá mạnh của nấm sợi

Các loại enzyme được hình thành và enzyme nào có chất cảm ứng trội hơn sẽ
tạo ra nhiều hơn
Lượng oxy trong không khí giảm và CO
2
sẽ tăng dần, do đó trong giai đoạn
này cần phải được thông khí mạnh và nhiệt độ cố gắng duy trì trong khoảng từ 29
-30
0
C là tốt nhất
Giai đoạn 3: giai đoạn này kéo dài khoảng 10 -20 giờ. giai đoạn này có một
số thay đổi cơ bản sau:
Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do mật độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm
lại
Nhiệt độ của khối môi trường giảm, do đó làm lượng không khí môi trường
xuống còn 20 – 25
0
C thể tích không khí/thể tích phòng nuôi cấy/1 giờ. Nhiệt độ duy
trì ở 30
0
C. Trong giai đoạn này bào tử được hình thành nhiều do đó lượng enzyme
giảm. Chính vì thế việc xác đònh thời điểm cần thiết để thu nhận enzyme là rất cần
thiết.
Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được chế phẩm enzyme. Chế phẩm
này được gọi là chế phẩm enzyme thô (vì ngoài thành phần enzyme ra, chúng còn
chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước có trong môi trường).
2.8.2 Thu nhận và tủa enzyme
Có nhiều phương pháp khác nhau để thu nhận enzyme từ môi trường nuôi cấy
như: dùng dung dòch muối loãng hoặc dùng nước. Thông thường, để chiết enzyme
người ta dùng nước với tỷ lệ thích hợp cho môi trường nuôi cấy vào, khấy đều trong
thời gian nhất đònh, loại bỏ cặn, lấy dòch trong chứa enzyme hoà tan.

Để tủa enzyme cũng có nhiều phương pháp:
GVHD: TS Nguyễn Hoài Hương
SVTH: Đặng Tiến Đông
25