Giáo trình sinh hoá học với cơ sở khoa học của công nghệ gen (giáo trình cao học nông nghiệp) phần 2

PHAN HAI

CO SO KHOA HOC
CUA CONG NGHE GEN

217



Chương mười một

CẤU TRÚC AXIT NUCLEIC,

VAI TRO LUU GIU MAT MA DI TRUYEN CUA DNA
Axit nucleic là những hợp chất có phân tử lượng rất lớn, nó có trong tất cả
các tế bào sống ở trạng thái tự do hoặc dưới dạng liên kết với protein để tạo
thành nucleoprotein. Virut - có cấu trúc từ một phân tử axit nucleic rất quan
trọng vì nó lưu giữ các thơng tin di truyền đồng thời nó giúp thể hiện các thơng
tin di truyền đó.
Axit nucleic được tạo ra do q trình trùng hợp các nucleotit cho nên cũng có
thể gọi axit nucleic là polinucleotit. Ngoài chức năng trùng hợp để tạo thành axit
nucleic, nueleotit cịn đóng vai trị rất quan trọng q trình trao đổi chất trung gian,

đó là những hợp chất chứa nhiều năng lượng ATP, NAD”, NADP”, FAD, CoA...)
Nueleotit được cấu tạo từ 3 thành phần chính là :
- pốc kiểm nitơ dị vòng
- đường pentoza
- axit phosphoric

Đường pentoza gồm 2 loại là :
Riboza và

Desoxi riboza
Từ đó ta có 2 loại axit nucleic là :
1. Axit desoxiribonucleic (DNA hay là ADN) tìm thấy trong chromosom
của nhân tế bào động vật và thực vật. Đối với các lồi procariơt như là vi khuẩn
tảo xanh da trời cũng có DNA trong các chromosom.
Người ta cịn tìm thấy DNA trong mitochondri
cũng như cloroplast ở các loại thực vật quang hợp.
2. Axit ribonuclic (RNA

hay ARN)

của tế bào động,

thực vật

tìm thấy chủ yếu trong xitoplasma của

tế bào. Người ta phân biệt có 5 loại RNA đó là :
*

RNA ribosom

RNA vận chuyển
RNA thơng tin

RNA khởi động

RNA Khác

219

số virut
Chúng tham gia vào quá trình thể hiện các thông tin đi truyền. Một
thực vật, động vật và bacterophage chỉ bao gồm một gen là phân tử RNA.

I. DUONG PENTOZA
c6 chita B-D-riboza, con trong phân tử DNA

Trong phan tit RNA
B-2-desoxiriboza.

O

HOH,C

H

H

OH

H

OH OH
B-D-Riboza

oO

HOH,C

-

H

H

HY

H

có chứa

OH
H

OH H
B-2-desoxi-D-Riboza

Cả hai loại đường đều thuộc dạng D và B

II. GỐC NITƠ (GỐC KIỀM)
Các gốc nitơ đều xuất phát từ hai loại gốc nitơ dị vòng là purin và pirimidin...

1. Gốc purin

Có hai loại gốc purin tìm thấy trong phân tử DNA và RNA, đó là adenin và guanin.

NZ

T”

Hy

é FY
N

Purin

-

‘Or

\

—_

NH

N

i

"é)

—Ä

NH

H,NS

Adenin

Guanin

Người ta cịn tìm thấy một số gốc purin khác nhất là trong phân tử RNA thông
tinvận chuyển tRNA với số lượng nhỏ. Cho đến ngày nay người ta biết có khoảng
50 loại gốc hiếm thuộc hai loại purin và pirimidin. Đối với purin ví dụ như :
ĩ
HN

~ ; |>

N
Hipoxanthin

N
N
NH

HạC-N
H,

O
lỊ

~ À

N
NH

5-methil-guanin

2. Gốc pirimidin

Từ gốc pirimidin có ba loại là xitosin, uraxil và thimin. Trong phan tit DNA

có xitosin và thimin.
220


Trong phân tử RNA có xitosin và uraxil

NH,
N
Đ

_.

Pirimidin

NZ
O

O

H

|

4

d

I

H3

Trong

DNA

H

Thimin

Xitosin

O
I

HN
O=

Trong
RNA
|
H

Xitosin

Người

ta tìm thấy một

Uraxil

số gốc bất bình

thường

trong

phân

tử DNA

của

bacteriophage như là 5-hydroximethil xitosin thay cho vi tri xitosin -

N

im

CH;OH

H
5-hydroximethyl xitosin

III. NUCLEOSIT

Khi một gốc nitơ kết hợp với một phân tử đường riboza hay desoxiriboza sẽ
tạo ra một ribonucleosit hay một desoxiribonucleosit.

NH,

NH,
N

oN

N

HOH,C
OH
Adenosin (Adenosin ribonucleosit)

H

H

Desoxisitidin (xitosin desoxiribonucleosit).

21


Bang sau đây tóm tắt tên của những nucleosit :

Bảng 11.1 : Các loại nucleosit chính

Gốc Nitơ

Ribonucleosit....

Desoxiribonucleosit

Adenin

Adenosin

Desoxiadenosin

Guanin

Guanosin

Desoxiguanosin

Uridin

Xitosin

Xitidin
Ribothimidin

Thimin

-Desoxiuridin

:

Uraxil

'Đesoxixitidin
Desoxithimidin

IV. NUCLEOTIT

Khi một nucleosit tác động với một phân tử axit phosphoric sẽ tạo thành
một nucleotit. Theo thành phần đường pentoza, người ta phân biệt 2 loại
nucleotit 14 ribonucleotit va desoxiribonucleotit.

Khi thuỷ phán một hỗn hợp nucleotit bằng các phương pháp khác nhau có
thể nhận được các kết quả như sau :
Thuỷ phân bằng
axit yếu

Gốc nitơ-pentoza-phosphat _ ——————————>Øốc

Nucleotit

——————

Thuy phan bang
kiém yéu

nitơ + pentoza-phosphat

Géc nito-pentoza + phosphat

=.
-

N

.

Nucleosit

Bảng 11.2: Bảng tóm tắt các nucleotit
Gốc nitơ | Ribonucleosit-5'-monophosphat

Desoxiribonucleosit -5'- monophosphat

Adenin

Desoxiadenosin 5'monophosphat = dAMP

Adenin 5'monophosphat =AMP

Guanin

Guanosin 5’monophosphat = GMP_ | Desoxiguanosin 5’monophosphat = d@MP

Uraxil

Uridin-5'-monophosphat = UMP

Desoxiuridin S'monophosphat = dUMP

Xitosin

Xitidin 5'monophosphat = CMP

Desoxixitidin S'monophosphat = dCMP

Thimin

Thymin ribosit 5'monophosphat
(rất hiếm)

Desoxithimidin 5'monophosphat = dTMP

222

,


V. CAU TRUC BAC MOT CUA AXIT NUCLEIC
tử DNA

phân

Trong

và RNA,

liên kết với

nucleotit

các

nhau

qua

cầu

diestephosphat ở vị trí cacbon số 3 của đường pentoza và vị trí cacbon số 5 của
phân tử đường pentos tiếp theo. Kết luận này dựa trên kết quả thực nghiệm sau :

- Khi trung hoà một phân

tử axit nucleic

nhận

thấy mỗi phân

tử axit

phosphoric chỉ có một chức năng axit tự do.
- Khi dùng enzim thuỷ phân axit nucleic tuỳ thuộc vào loại enzim ta có thể thu
được một hỗn hợp nucleosit 5'monophosphat hoặc nucleosit 3'monophosphat.
Mạch polinucleotit được cấu tạo theo thứ tự một phân tử đường pentoza, tiếp

đến một axit phosphoric, tiếp theo là đường pentoza rồi axit phosphoric. Cấu trúc
này đặc trưng cho cả DNA và RNA. Các phân tử DNA và RNA chỉ khác nhau về độ
dài của mạch polinucleotit. Dưới đây là một đoạn trinucleotit của phân tử RNA.

|
O
oO
gi.
no

|

E

HN,

OH,C

HOH,C

ở

1

H

“Al

HO- Lo

H

4

Kẻ,

3

OH

3
OH

H

Riboza

OH,C

223


Các gốc nitơ tham gia vào mạch polinucleotit cũng tương tự như thứ tự các
axit amin trong mạch polipeptit, nó rất quan trọng quyết định bản chất của phân

tử DNA hay RNA.

XÁC ĐỊNH THỨ TỰ CÁC NUCLEOTIT
Xác định thứ tự các gốc nitơ trong một phân tử RNA và DNA cịn khó khăn
hơn việc xác định thứ tự các axit amin trong mạch protein. Để nghiên

cứu cấu

trúc bậc một của axit nucleic người ta phải thuỷ phân chúng.

1. Thuỷ phân RNA và DNA

A. Thuỷ phân bằng kiềm
Phân tử RNA có thể bị thuỷ phân bằng kiểm bởi sự cắt đứt mối liên kết giữa

nhóm phosphat và nguyên tử cacbon số 5 của phân tử đường pentoza bên cạnh.

Hỗn hợp thu được sau thuỷ phân là những nucleotit 3'phosphat.

wih

rs

HỆ

OH

pes

Ap

+Gp
+ Up + Cp

Phân tử DNA bền vững với việc thuỷ phân bằng kiểm.
B. Thuỷ phân bằng ribonucleaza tuyến tụy
Đó là một enzim endonucleaza, nó cắt mạch phosphodiester bên trong mạch

của phân tử RNA giống như thuỷ phân bằng kiểm, phân tử DNA cũng có khả

năng kháng enzim này. Vị trí cắt mạch xảy ra ở nucleotit bên cạnh cacbon 3' là
một gốc nitơ thuộc nhóm pirimidin.
Xitosin

\

Vl

As

Uraxil

Uraxil

NÌNG af

—*.

Guanin

3)

Cp+ApUp+Up

Xitosin

số

2)

sử NA

Su

Ribo nucleaza

+ GpCp + Up

C. Thuy phan bang nucleaza T,

Enzim này cắt mối liên kết phosphadieste của phân tử RNA khi bên cạnh vị
trí cacbon3' là các nucleotit có gốc kiểm là guanin.

224


NHI bebe ye mma
Xitosin

Adonin

Guanin

—»

Uraxi

pCpApGp

Uraxil

Xitosin

Uraxi

+ UpUpCpGp

D. Thuy phan bang ribonucleaza U,
N6 ciing 14 mét enzim endonucleaza phân cách mối liên kết phosphodieste
của phân tử RNA ở những vị trí cacbon 3' mà nucleotit bên cạnh, có gốc nitơ là
adenin hay guanin. Người ta dùng enzim này để cắt tiếp các sản phẩm thu được

sau khi thuỷ phân bang ribonucleaza T,.

E. Thuỷ phân bằng phosphodiesteraza của noc déc ran
Khác với những enzim ở trên, nó phân cắt mối liên kết giữa axit phosphoric
với cacbon 3' của đường pentoza. Sản phẩm tạo ra là nucleosit 5'-monophosphat.
Mat khác nó là exonucleaza, nó tấn cơng phân tử oligo và polinucleotit từ đầu 3'
Và giải phóng ra nueleosit -5'- monophosphat.
Adenin

A,

7

ae

Uraxil

PO

3 }

sò

Ba

Guanin

Xitosin

“hệ

3

mo

Py

Xe

fp

Phosphodiesteraza
—_————>

ON

Enzim này tác động lên cả DNA

pA+ pU + pG + pC

và RNA

E. Thuỷ phân bằng phosphodiesteraza của lá lách
Đây cũng là một exonucleaza, nó tấn cơng RNA
phóng một cách tuần tự nucleosit 3' monophosphat.

và DNA

từ đầu 5' và giải

`

G. Tac dụng của phosphataza kiêm cia E.coli
Phosphataza kiểm của E.coli cũng như các phosphataza khác nó chỉ có thể
cắt phân tử axit phosphoric ra khỏi một đầu của phân tử RNA
Guanin

“i

P|

Uraxil

`P

Me

Xitosin

P. |

hay DNA.

Adenin

P-

[TP

— >

pGpUpCpA+Pi


H. Tac dộng của desoxiribonucleaza (=DNaza)

Những

DNaza

đầu tiên được phát hiện thường khơng

mang

tính đặc trưng

như RNaza. Người ta nghiên cứu nhiều về hai loại endonucleaza sau :
tụy phân giải

- DNaza (I) tuyến
monophosphat.
- DNaza

axit

(II)

giai

phan

tao ra oligodesoxiribonucleotit

DNA
DNA

tao

ra

oligodesoxiribonucleotit

5”
3’

monophosphat.
"endonucleaza

Gần đây người ta phát hiện ra các enzim

han chế”

có trong

nhiều loại vi khuẩn làm nhiệm vụ phân giải tất cả các phân tử DNA thêm nhập
từ bên ngoài vào vi khuẩn. Những enzim này phân cắt phân tử DNA mot cách rất
đặc biệt. Ví dụ 3 loại endonucleaza sử dụng hiện nay lấy từ vi khuẩn E.coli Eco
R1, Haemophilus

trí nó cắt mạch.
Eco

RI

Hae III

Hind III

aegitus (Hae III) va Haemophilus

influenzae

(Hind MI) va vi

AC

Ỷ

GAATTC
CTTAAG
Ỹ
L
GGCC
CCGG
†
‡
AAGCTT
TTCGAA

t

2. Xác định thứ tự các nucleotit trong phân tử RNA
Có ba phương pháp để xác định cấu trúc bậc một của phân tử RNA.
a) Thuỷ phân bằng enzim ribonucleaza tuyến tụy, nucleaza T¡, nucleaza U;
hoặc các loại nucleaza khác. Số oligonucleotit thu được sẽ tiếp tục định tính

bằng phương pháp sắc ký trên cột. Phương pháp này đòi hỏi một số lượng mẫu
đủ lớn song lại cho phép định tính được các nucleotit.
sau sắc ký cột đem soi trên máy quang phổ tử ngoại.

Các

tiểu phần

thu được

Cũng có thể dùng phương pháp điện di 2 chiều trên giấy xelluloza - axetat,

trên gel policriamit. Số lượng mẫu khi dùng phương pháp này cần ít song phân

tử RNA ở đây phải được đánh dấu bằng ””P, kỹ thuật đánh dấu rất dé dàng với vi

khuẩn, song với động vật bậc cao thì quả là một vấn để phức tạp. Phân tử RNA
sau khi được đánh dấu, dùng kỹ thuật thuỷ phân một phần hay tồn phần, sau đó

226


dùng

dung

dịch

thuỷ

phân

để

đưa

vào

điện

di

hai

chiều.

Những

mach

oligonucletit ngắn có thể định tính dựa vào vị trí của chúng trên sắc điện di đồ.

b) Phương pháp dùng 32p đánh dấu ở đâu cacbon 5' để xác định thứ tự các
nucleotit trong những mạch polinucleotit có độ dài vừa phải hoặc phân tử tRNA.

Trước tiên đánh dấu phân tử RNA

nhờ enzim polinucleotitkinaza và ATP có

3*'Py, sau đó dùng RNaza tuyến tuy, nucleaza Tạ hay U;¿ thuỷ phân, sau đó dùng

dung dịch thuỷ phân để chạy điện di trên gel poliacrilamit để định tính các
nucleotit.

c) Dùng

một

sợi RNA

tổng

hợp

từ virut

in vitro

làm

mẫu,

dùng

4 loại

nucleotit có đánh dấu để theo dõi thứ tự của chúng trong quá trình sinh tổng hợp

sợi bổ sung.

3. Xác định thứ tự các nucleotit trong phân tử DNA
Về nguyên tắc cũ¿:g tương tự như việc xác định thứ tự các nucleotit trong

RNA. Điều khác nhau ìà, với những đoạn ngắn RNA người ta dùng các enzim để

phân cắt. Còn với :hững đoạn ngắn DNA

người ta dùng thuỷ phân bằng hoá

chất. Những đoạn ngắn này thu được do dùng enzim endonucleaza hạn chế để

cắt các phân tử DNA. Những đoạn ngắn DNA được đánh dấu bằng *?P, sau đó

được tiến hành với 4 phản ứng hoá học sau :

- Xử lý với dimethilsunfat, dưới tác động
khỏi mạch polinucleotit, ta nhận
của mạch là G.

được

những

của nhiệt, phân
đoạn

tử guanin tách

nucleotit có điểm

tận cùng

- Xử lý với dimethilsunfat trong mối trường axit làm các gốc purin tạo ra những
đoạn nueleotit có tận cùng trong mạch là A và G. So sánh với những đoạn xử lý theo
phương pháp trước để biết thứ tự các nucleotit có tận cùng A tiếp đến G.
- Xử lý với hydrazin

trong môi trường

đoạn nucleotit kết thúc bằng C.

NaCl

1M cho phép xác định

những

- Xử lý với hydrazin (không trong môi trường muối) cho phép cắt những
đoạn có tận cùng bằng C và T. So sánh với kết quả cất theo phương pháp trên
cho phép định vị cho T.

Sản phẩm của 4 phản ứng trên sẽ được phân tích bằng điện di để tách các

đoạn nueleotit khác nhau tuỳ theo kích thước của chúng. Những đoạn càng ngắn

càng chuyển xa hơn từ điểm xuất phát. Xác. định thứ tự các nucleotit trong phân
tử DNA bằng máy ôto radiographi.


VI. CAU TRUC BAC HAI CUA DNA
Rất nhiều quan sát trên dung dịch DNA

sau

nhận thấy rằng, phân tử DNA

khi tách khỏi tế bào có cấu trúc hình như khác với cấu trúc vốn có của nó trong
nhân tế bào. Sau khi xử lý nhiệt, phân tử DNA

có cấu trúc một sợi đơn giản. Rất

có thể phân tử DNA phải có cấu trúc bậc hai.

Các loại DNA

Khoảng

cách các

gốc kiểm

cho một t

Chiều dài một tur helic

Hình thái

Ngắn và rộng |

`

Dài hơn và | Dài và mảnh

mảnh hơn

Năm 1953 hai nhà khoa học người Mỹ là Crick và Watson đã đề xuất một
mô hình cấu trúc bậc hai của phân tử DNA có tính đến tất cả những tính chất
của nó.

Hai ơng đã dựa vào những kết quả nghiên cứu nhiều năm trước đó của các

nhà khoa học như :

- Kết quả phân tích số lượng gốc nitơ cho thấy. Trong phân tử DNA có :
Số lượng ademin = Số lượng thimin
Do dé:

Số lượng guanin = Số lượng xitosin
A
G
==.

T

Cc

=1

Tổng các gốc purin bằng tổng số các gốc pirimidin :
(A+G)=(C+T)

„.
A+T
Song tỷ lệ Gic

|
;
.
thì rất khác nhau ở những phân tử DNA khác nhau, nó đặc

trưng cho lồi, nó lớn hơn

phân tử giàu G + C.

1 khi phân tử DNA

giàu A + T, và nhỏ hơn

1 khi

- Wilkins dùng tia X để nghiên cứu phân tử DNA đã đi đến kết luận rằng `

phân tử DNA có cấu trúc hình xoắn (helic).

228)


- Kết quả thực nghiệm cho
thấy mạch polidesoxirinucleotit
được duy trì nhờ có mối liên kết
hydro.

Từ

Crick

phân

những

va Watson

tử DNA

hai
mạch
quấn quanh

kết

được

quả

đã cho
cấu

trên

rằng

tạo từ

polidesoxinucleotit
nhau tạo thành một

hình xoắn kép.

Các gốc nitơ nằm trên một

mặt phẳng vng góc với trục
của

hình

giữa

các

xốn.

gốc

Khoảng

nitơ

trong

một mạch là 3,4A°. Một
xoắn có chiều dài là 34A”.

cách

cùng

bước

Những gốc nita cha hai sợi
liên kết với nhau bằng mối liên
kết hydro. Giữa A và T là hai
mối liên kết, giữa G và C là ba

mối

liên

kết

lượng lớn mối
làm cho phân

hydro.

Nhờ

số

liên kết như vậy
tử DNA có cấu

trúc hình xoắn vững chắc, nhờ
các gốc nitơ đối nhau là adenin

Hinh 11.1. So 6 cau tric DNA

với thimin, guanin với xitosin.
A

Trên mơ hình này có thể hiểu được tại sao `.
Vì
thimin

rằng

nếu

phân

ở kia, tương

tử Adenin

tự như

vậy với

có trong
guamin

mạch

G

1

C
này

và xitosin.

thì
Thứ

địi

hỏi

tự các

phân
gốc

tử
nitơ

của một mạch sẽ quyết định một cách tự động thứ tự các gốc nitơ của mạch
kia. Hai mạch của phân tử DNA không giống nhau mà là ngược nhau, bổ
sung cho nhau. Hai sợi đi theo chiều ngược nhau và các mối liên kết 3', 5'
cũng đi theo chiều ngược lại.

Mối liên kết hydro giữa các gốc nitơ giúp duy trì trạng thái hình xoắn của
phân tử DNA.

229


3

Cấu trúc phan tit DNA bao gồm 2 sợi xoắn vào nhau theo mơ hình của Crick
và Watson ngày nay tìm thấy ở thực khuẩn thể (bacteriophage), vi khuẩn, động
và

vật

thực

vật.

Tuy

nhiên

cũng

Sinsheimer tìm thấy phân tử DNA
một

sợi xốn.

Khi

thâm nhập

có

những

ngoại

lệ,

của bacteriophage _

vào tế bào

vi khuẩn

DNA

ví dụ,

vào

năm

1959

(X174 chỉ bao gồm có
của

@X174

mới

tiến

hành nhân đơi (replication) thành phân tử DNA bao gồm 2 sợi xoắn.

Một số virut có phân tử DNA chỉ gồm một mạch polinucleotit trong

một phần chu kỳ tồn tại của nó
Năm

1959, R. Sinsheimer phat hiện ra rằng phân tử DNA

@XI174 chỉ bao gồm có một mạch

của bacteriophage

polinucleotit. Các thực nghiệm đưa đến kết

luận :
- Tỷ lệ giữa các gốc nitơ DNA

$¿X174 không tuân theo quy luật [A]=[T] và

[G]=[C].
- Độ nhớt của dung dịch DNA

cùng nồng độ.

230

@X174

kém

hon dung dich DNA

cia E.coli

- Nhóm amin của các gốc nitơ trong
phan tu DNA X174 dễ dàng tác dung
với formaldehit, trong khi đó tro¡g phân

tử DNA

có cấu trúc hình xoắn kép đều

khơng có phản ứng formaldehit.
Tuy vậy phan ti DNA
tại dạng

một

mạch

trong

9X174 chi t6n
một

giai đoạn

nhất định trong chu kù tồn tại của nó. Khi
thâm nhập E. coli, nó lại có cấu trúc hai
mạch xoắn. Kết quả này càng làm tăng sự
đúng đắn của mơ hình Crick và Watson.

Hình 11.2. Anh chụp qua kính hiển vi điện

tử phân tử DNA của phage ^

Phân tử DNA thường rất dài

Phân tử DNA thường rất dài ví dụ :
chromosom của E.coli chỉ bao gồm một phân tử DNA có 4 triệu cặp gốc kiểm,
phân tử lượng bằng . 2,6 x 10”, chiều dài hình vịng là 14 x 10°A°, đường kính
20A°.

B. Zimm tìm thấy chromosom của loại ruồi đấm Drosophila melanogaster
bao gồm mội phân tử DNA có chiều dài vòng là 2,1 em với 6,2 x 10” cặp gốc

nitơ. Phân tử DNA

của một sé vi khuẩn có thể trực tiếp nhìn thấy bang mat qua

kính hiển vi điện tử.

Bảng ¡1 2 : Kích thước các phân tử DNA

Sinh vật

Cặp gốc kiểm

Chiều dài vịng

Bacterio phage A
Bacterio phage T;

$1

48,6
166

1,7

Micoplasma
E.coli

760
4.000

260
1.360

13.500
165.000

4.600
56.000

Polioma

Virut

Vi khuẩn

Nhóm

lÈucarytcs

Nấm men
Drosophila

Người

(nghìn cặp)

2.900.000

(um)

17
56

990.000

1 Kilobaza = 1000 cap gốc nitơ của phân tử có mạch xoắn kép hoặc 1000

gốc kiểm của phân tử có một mạch polinucleotit.

231


1 Kilobaza của phân tử DNA
khối lượng khoảng 660 Kdal.

có mạch

xoắn kếp có chiều dai 0,34j1m

va

Q trình xoắn, tở, thuận nghịch của phân tử DNA
liên kết
Hai mạch xuắn của phân tử DNA dễ dàng tách nhau ra khi các mối

cách làm Rồng
hydro giữa, các gốc nitơ bộ đứt ra. Điều đó có thể thực hiện bằng

dung dịch DNA

hoặc bổ sung axit hoặc kiểm để ion hoá gốc nitơ của chúng. Ở

khỏi nhau
một nhiệt độ nhất định, hai mạch xoắn của phân tử DNA đột nhiên tở
nhiệt độ tở
ra. Nhiệt độ này thay đổi tuỳ thuộc vào từng loại DNA và gọi là
máy
(Melting temperature) Tm. Sự tở của phân tử DNA có thể đo được trên

[GC]= 35%

14

50%

Độ hấp thu

quang phổ tử ngoại ở bước sóng 260nm.

66%

1.3

41.2

Sợi xoắn kép

44

Hình

Nhiét dé (°C)

7 T.3. Đường

cong

của shin th ak

85 (0c)
nhiệt độ to

so

Nhiệt độ tở của phân tử DNA

220

260

300

Hình 11.4. Chiéu dai buéc song (nm)

phụ thuộc rất lớn vào thành phần

gốc nitơ của

chúng. Những phân tử chứa nhiều GC có Tm cao hơn những phân tử chứa nhiều AT.
Tm của phân tử DNA

của nhiều loài khác nhau thay đổi tỷ lệ thuận với hàm

lượng GC, có thể đạt 77 đến 100°C khi lượng GC tang tir 20% dén 78%. Cap
GC liên kết bằng 3 mối liên kết hydro do đó bền vững hơn cặp AT chỉ bằng 2

mối liên kết hydro.
Trong cơ thể dưới tác động của một số loại protein phân tử DNA

cũng bị tở ra.

Hai mạch của DNA tách nhau ra khi nhiệt độ cao, khi nhiệt độ xuống thấp
hơn Tm, hai mạch lại tái kết hợp với nhau.
232


Một số DNA có phân tử là một vịng khép kín hay vịng xoắn cuộn
Qua kính hiển vi điện

nhận thấy có một số DNA

tử người

ta

có hình vịng

khép kín.

Một số chromosom của E.coli cũng
có hình vịng khép kín gấp hàng nghìn

lần đường kính của vi khuẩn.

Khơng phải tất cả các loại DNA đều
có cấu tạo vịng

khép

kín. Ví dụ DNA

của bacteriophage T; có hình một mạch

thẳng. DNA của bacteriophage ^ có thể
chuyển đổi từ dạng thẳng sang dạng
vịng khép kín.

,

Phân tử DNA cịn có thể có cấu tạo
xoắn vào nhau. Nhờ cấu trúc này làm
Hình

11.5. Vịng khép kín (trên) và vịng xoắn

cuộn (dưới) của một số phantir DNA

cho nó thêm vững bền. Cho đến ngày
nay người ta phân biệt có 3 loại DNA :

A-DNA,

2 mạch

xoắn

phải của nó

có chứa l1 cặp gốc nitơ cho một chu kỳ xoắn, có độ nghiêng 20 độ so với trục
thẳng đứng của phân tử DNA. Nó hình thành do quá trình khử bớt nước của

dang B-DNA.
B-DNA, 2 mach xoắn phải của nó mang đúng mơ hình kinh điển của Crick
và Watson.

Một chu kỳ xoắn chứa 10 cặp gốc nitơ có mặt phẳng vng

trục của phân tử DĐA.

góc với

Z-DNA. Khác với hai loại trên, nó có cấu trúc hai mạch xoắn trái. Mỗi chu
kỳ xoắn chứa 12 cặp gốc nitơ. Mơ hình này do A. Rich cùng các cộng sự phát
hiện dựa trên các nghiên cứu về cấu trúc tinh thể của d (CG)

3'.

VII. VAI TRÒ LƯU GIỮ MẬT MÃ DI TRUYỀN CỦA PHÂN TỬDNA
Đã từ lâu người ta đã tìm hiểu về vai trị của phân
việc lưu giữ các mật mã di truyền và phát hiện ra rằng

tử DNA,

liên quan đến

:

1. Đối với các cơ thể bậc cao, có một mối tương quan giữa số lượng DNA chứa
trong tế bào với số lượng thông tin di truyền. Mặt khác số lượng DNA trong nhân
của tế bào cơ thể thường là nhị bội thể 2n, còn tế bào sinh dục là đơn bội In.
233


2. Người ta quan sát thấy rằng thứ tự các gốc nitơ trong phân tử DNA

của

thế hệ con thường khá đồng nhất với thứ tự gốc nitơ trong phân tử DNA của bố

mẹ chúng. Việc này có thể chứng minh được bằng kỹ thuật lai.

3. Những tác nhân vật lý, hoá học gây đột biến thường là gây sự biến đổi
phân tử DNA.

cho phép vận

4. Với vi sinh vật, người ta ghi nhận rằng phân tử DNA
chuyển một hoặc nhiều tính trạng di truyền.

- Chuyển giao một tính trạng (Transformation). Người ta bổ sung phân tử
DNA lay từ vi khuẩn kháng streptomixin vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn mẫn
cảm với kháng sinh, sau một thời gian nhất định thấy xuất hiện thế hệ vi khuẩn
kháng streptomixin. Tính trạng này đã được
môi trường.

bổ sung vào

nhận từ phân tử DNA

- Chuyển giao nhiều tình trạng (Transduction) ví dụ DNA

của bacteriophage

khi thâm nhập tế bào vi khuẩn sẽ chuyển giao toàn bộ những tính trạng của nó
để biến DNA của vi khuẩn thành DNA của bacteriophage và tiêu diệt vi khuẩn.
- Kết giao (conjugaison) đó là sự kết giao trực tiếp giữa hai tế bào vi khuẩn,
tế bào thứ nhất có thể chuyển hố một phần hay tồn bộ chromosom sang tế bào
thứ hai. Người ta ghi nhận rằng có mối tương quan giữa số lượng DNA từ tế bào
cho chuyển sang tế bào nhận với số lượng các tình trạng chuyển giao.

5. Thí nghiệm trên vi khuẩn pneumococci
Vi khuẩn pneumococci

:

đóng vai trò quan trọng trong việc xác định vai trò

lưu giữ mật mã di truyền của phân tử DNA. Bình thường pneumococci có một
lớp vỏ bọc cấu tạo từ polisacarit. Chính lớp vỏ bọc này mang độc tính và gây ra

bệnh viêm phổi ở người và động vật có vú.

COO-

4 Tứ

CH,OH

coo"

O
O

H

Gốc glucoronat

Người

Gốc glucoza

ta đã tạo được một

eo
H

f

H

Gốc glucoronat

loại pneumococci

‘HOH
5
:
Gốc glucoza

không

bằng con đường gây đột biến. Loại đột biến này khơng

có vỏ bọc

polisacarit

gây độc tính. Loại vi

khudn pneumococci (P) binh thường có khuẩn lạc trơn nhẫn ký hiệu là §. Loại P

đột biến có khuẩn

enzim
234

lạc xù xì được ký hiệu là R. Vi khuẩn

dehydrogenaza

để

chuyển

hố

UDP-glucose

P đột biến khơng

thành

có

UDP-glucoronate.


Enzim này cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp lớp vỏ bọc polisacarit có cấu
trúc gồm các gốc glucoza và glucoronate luân chuyển nhau.
Năm 1928, Fred Griffith phát hiện ra rằng, chủng R khơng độc tính có thể

chuyển thành chủng § mang độc tính bằng cách sau :
Ơng đã tiêm chuột theo sơ đồ :
Lol
R sống + S đã

dùng nhiệt làm
chết

Lô II

Lô II

R sống

S - đã dùng
nhiệt làm chết

Lô I: Tiêm chủng S đã làm chết bằng nhiệt trộn lẫn với chủng R sống
Lô II : Tiêm chủng R sống
Lô II : Tiêm chủng S đã làm chết bằng nhiệt.
Kết quả cho thấy chuột ở lơ I chết hồn tồn, cịn chuột ở lơ II và II cịn

sống 100%.

7

Trong máu của chuột chết người ta tìm thấy chủng S sống như vậy là trình
trạng gây bệnh của chủng S đã là chết bằng nhiệt được chuyển giao sang chủng

R sống. Sau này người ta tìm thấy ra khả năng chuyển giao tính trạng có thể

thực hiện in Vitro. Người ta bổ sung vào môi
trường nuôi cấy chủng R một số nước chiết từ
định tế bào chủng § đã làm cho một số tế bào

của chủng R chuyển thành chủng S.
Năm

1944. O. Avery và C. Macleod đã tiến

hành nghiên cứu làm cho chủng R chuyển thành

chủng S. Các tác giả đã đi đến những kết luận :

- Chất chiết xuất từ nhân tế bào sau khi
làm sạch, xác định thành phần hố học các

ngun tố cấu thành nó cho thấy giống hệt như
thành phần của DNA
- Các tính chất vật lý, hoá học chất chiết

xuất từ nhân tế bào chủng § giống với DNA.
- Dịch chiết xuất bao gồm protein và lipit
khơng mang hoạt tính

- Xử

Hinh 11.6
Hinh ảnh chủng R (khuẩn lạc nhỏ)

chuyển thành chủng S (khuẩn lạc lớn)

trypsin

lý dịnh

chymotrypsin

chiết xuất từ nhân
khơng

làm

nó mất

bằng
hoạt

tính

- Xử lý bằng ribonucleaza cũng khơng làm
mất hoạt tính

235


- Xử lý bằng desoxiribonucleaza làm mất hoàn toàn hoạt tính.
Từ đó đi đến kết luận, chất chiết xuất từ nhân tế bào chủng S có thể làm cho

chủng R biến thành chủng § chính là DNA.
Cơng trình nghiên cứu này đã mở ra cho sinh hoá học một hướng phát triển

mới lầm cơ sở cho công nghệ gen sau này. Cho đến năm 1944 người ta đều cho

rằng chính protein trong chromosom mang những thơng tin di truyền cịn DNA
đóng vai trị thứ yếu.

6. Năm 1951 R. Herriot cho rằng, một bacteriophage có cấu trúc như một cái
kim với phần đi rất to, bên trong chứa DNA, bên ngồi được bao bọc bằng một
màng protein. Đầu nhọn của nó cắm vào tế bào vi khuẩn, nhờ có các enzim giúp hoà
tan màng tế bào để tạo thành một lỗ hổng, sau đó tồn bộ phần bên trong của virut
thâm nhập vào bên trong tế bào chứ không phải là bản thân con virut. Giả thiết này
được A. Hershey và M chase tiến hành thực nghiệm như sau :

- Họ dùng *’P để đánh dấu DNA

của phage (bacteriophage) và dùng 355 dé

đánh dấu protein trong vỏ bọc. Sự đánh dấu này là rất đặc trưng vì DNA
chứa § và protein không chứa P.
Protein

không

- Dùng phage đã đánh dấu cho thâm nhập
E.coli sau một thời gian ngắn trong tủ ấm.
- Dịch nuôi cấy thu được đưa vào ly tâm với
tốc độ 10.000 vịng phút, làm cho các virut tách

Màng tếbào
Hình 1] 7°

khỏi tế bào E.coli đã bị nhiễm.
- Tiếp tục cho ly tâm với tốc độ cao hơn

đến mức toàn bộ các tế bào E. coli lắng xuống

dưới đáy ống ly tâm, cịn các virut ở lại trong

dịch phía trên. Đem phân tích tìm ??P và *°S két

Sơ đồ phage T; chuyển DNA của nó _ quả thu được cho thấy :
vào tế bào vi khuẩn.

&

- Hầu

ji

hết DNA

trong vi khuẩn

.

của phage

được

tìm

thấy

- Hầu hết protein của phage tìm thấy ở dịch phía trên.
Các thí nghiệm tiếp theo cho thấy dưới 1% ”ŠS được chuyển từ phage bố mẹ
sang phage thế hệ con cháu. Ngược lại có 30% ??P của phage bố mẹ xuất hiện
trong thế hệ con cháu.

336


Chương

mười

hai

CẤU TRÚC CỦA PHÂN TỬRNA
NH,

Phân tử RNA chỉ có một mạch dài
nucleotit liên kết với nhau theo hướng
3-5” phosphodieste. Số lượng nucleotit
từ một vài đến hàng nghìn. Khác với
DNA, trong phân tử RNA có chứa
đường riboza và uraxil thay cho đường

desoxiriboza va thimin trong phân tử
DNA.

Xitosin

Uraxil có thể tạo ra với thimin

thành một cặp gốc nitơ.

B’

sh
NH, .
Ị- ĐHNZ2 _
|
Ny
HO-P-0
kN
Adenin
OH,C

E>
O

DNA

có hai mạch xoắn. Vì vậy số

lượng adenin sẽ khác với uraxil và

guanin khác với xitosin trong hầu
hết các phân tử RNA.

Tuy vậy phân tit RNA cé thé tu

gấp nó để tạo thành những đoạn
xoắn kép. Trong những đoạn xoắn

OH

HO-P=0

Phân tử RNA chỉ có một mạch
ribonucleotit. Do đó nó khác với

kép đó thì uraxil sẽ tạo thành

cặp

với adenin và guamin tạo thành cặp
với xitosin hay uraxil. Tỷ lệ các
đoạn có cấu trúc xoắn kép thì khác nhau trong các loại RNA khác nhau.

Ò

P”-G-G-G-U-G-G-G-A C C C C
C-U-C -G-U-C-C-U
|
Hs
~

DNA

G G G G

xs

NCZ

U
U

3?

Một số phân tử RNA của virut có cấu trúc mach xoắn kép nhỏ là phân tử
và cũng mang những gen gây bệnh

237


Trong tế bào có chứa năm loai RNA là :

- RNA thông tin (mRNA) - phục vụ làm khuôn mẫu để tổng hợp protein.

Mỗi một phân tử mRNA có chứa một gen hoặc một nhóm gen để tổng hợp một
loại protein. Do đó mRNA là một nhóm các chất rất khác nhau. Trong tế bào

có chiều dài trung bình khoảng 1,2 Kb.

E.coli có chứa các mRNA

- RNA vận chuyển (tRNA) có nhiệm vụ vận chuyển axit amin đã được hoạt hoá

đến ribosom để tổng hợp lên phân tử protein theo mẫu của mRNA. Có ít nhất 21
loại tRNA tương ứng với21 loại axit amin khác nhau. tRNA bao gồm khoảng 25

nucleotit (25 Kdal). Chúng thuộc nhóm RNA có phân tử lượng nhỏ nhất.
- RNA

ribosom (rRNA) là thành phần chính của ribosom song vai trị chính

xác của chúng trong q trình tổng hợp protein chưa hoàn toàn biết rõ. Trong tế
bào E.coli có ba loại rRNA

rRNA16S

gọi là rRNA25S,

và rRNA5S.

Cách phân

loại này là theo hệ số lắng đọng S.
Bảng 12.1 : Các RNA trong phân tử E.coli

Loai RNA

Số lượng |
theo %

1) RNA ribosom(rRNA)

80

2) RNA van chuyén (tRNA)|

15

3) RNA thong tin (mRNA)

5

Hệ sốlắng | Phân tử lượng |
đọng (S)

23

(kdal)

1,2 x 10°

16

0,55 x 10°

4

2,5 x 10

5

Số lượng

nucleotit

3700

36x10

| `

1700
120

75

Rất đa dạng

4) RNA khởi động

5) RNA khác

RNA ribosom

238

Y
LLL

a

x

Š

Uh

om)

Hinh 12.1

RNA van chuyén


Hệ số lắng đọng của các đại phân tử được tính theo đơn vị Svedberg 1S =

1013 giây. Đơn vị này được gọi theo tên của nhà bác học Thuy Điển, người sáng
lập ra ly tâm siêu tốc.

Vai trị thơng tin cua MRNA
Năm

1961 lần đầu tiên F. Jacob và J. Monod đã phát hiện vai trị thơng tin

của mRNA.

Hai ơng nhận thấy rằng protein được tổng hợp trong xitoplasma chứ

không phải trong hạt nhân. Mà phân tử DNA lại chứa trong hạt nhân, vậy những

thơng tin di truyền mà nó lưu giữ làm thế nào để chuyển vào xitoplasma. Hai
nhà khoa học trên đã phỏng đốn rằng phải có những tính chất sau :
1. Chất mang thơng tin là một polinucleott.

2. Thành phần gốc nitơ (hay gốc kiểm) của chất mang thông tin phải phản
ánh được thành phần gốc kiểm của DNA mà nó đặc trưng cho.

3. Chất mang thơng tin phải đa dạng vì một gen hay một nhóm gen có độ
dày rất khác nhau.

4. Chất mang thơng tin kết hợp với ribosom

ở vị trí diễn ra q trình sinh

tổng hợp protein trong một thời gian ngắn.

Š. Chất mang thông tin sẽ được tổng hợp và phân giải rất nhanh.
Ở thời điểm mà Jacob và Monod

đề ra những tiêu chuẩn trên thì khơng có

một phân tử RNA đã biết đáp ứng được. Ví dụ rRNA được xem là mẫu tổng hợp

protein thì có kích thước rất thuần nhất, thành phần gốc kiểm tương đối giống
nhau ở những sinh vật có tỷ số gốc kiểm khác nhau trong phân tử DNA. Mặt

khác rRNA vững bền và nó kết hợp véi 5’
- Đuorouraxil với tốc độ chậm.

RNA

vận chuyển

thường có phân tử

lượng q nhỏ và cũng khơng
với những tiêu chuẩn trên.

`"

thích ứng

Khi tiến hành cho nhiễm E.coli bằng

phape
sống
kiểm
kiểm
Hình 12.2
Ảnh qua kính hiển vi đện tử : phage T; đang

Tạ, phát hiện thấy RNA mới có đời
bán phần rất ngắn. Thành phần gốc
của nó giống với thành phân gốc
của DNA phage.

Giả thuyết đã được chứng minh bằng
thực nghiệm.

tấn công tế bảo vi khuẩn E.coli

239


n
Khi nhiễm E.coli bằng phage Tạ nhận thấy rằng hầu như toàn bộ protei

tổng hợp được sau khi nhiễm đều có đặc tính di truyền thuộc về phage.

Sau khi nhiễm xuất hiện một loại RNA có đời sống bán phần ngắn có thành
phan nucleotit giéng nhu cua DNA phage.
vì rằng rRNA và tRNA

thơng tin (mRNA)

Rõ ràng đây chính là RNA

khơng

tổng hợp sau khi nhiễm phage T;.
Vai trd cha mRNA

3?

5

còn được chứng minh qua các thí nghiệm lai RNA.

5’ mach DNA
.

GAATGGCTC
T

FEHM41H

Vào năm 1961, S.SpŸegelman phát
.

minh

~

kỹ

thuật

lai

.

các

phân

2,

tử

.

axit

nucleic nhằm sáng tổ câu hỏi, liệu các

thứ tự gốc kiểm của mRNA được tổng

hợp sau khi nhiễm

DNA virut

phage

T; có đối

xứng (theo quy luật ghép đơi các gốc

nitơ) với thứ tạ các gốc kiểm của DNA
T;ạ hay không ? Công việc bắt đầu
bằng cách nâng nhiệt độ vượt quá

Cường độ phóng xạ

nhiệt độ tở của DNA để tạo thành
DNA bao gồm một mạch. Những mạch

đơn này lại có thể kết hợp với nhau để
tạo thành mạch xoắn kép nếu ta hạ
nhiệt độ từ từ xuống.

Từ thực nghiệm

này, Spiegelman cho rằng nếu mRNA

có thứ tự các gốc kiểm tương ứng với

DNA thì một mạch mRNA

kết hợp với một mạch
thành một xoắn kép.
sau :
1. RNA

tổng hợp được sau khi nhiễm

cũng có thể

DNA

để tạo

Thực nghiệm được tiến hành như
E.coli bang phage T, (T, mRNA)

được đánh dấu bằng ?P, Tạ DNA được đán dấu bằng °H. Hai loại này được
chuẩn bị trong hai thực nghiệm riêng biệt.

2. Tr6n T, mRNA va T, DNA tang nhiét độ cao hơn nhiệt độ gây tở sợi
xoắn của DNA, thu được dung dịch gồm những mạch đơn DNA va RNA, ha

nhiệt độ xuống khoảng 20-22°C.

3. Hỗn hợp đã ]àm lạnh đem đi phân tích bằng ly tâm siêu tốc thu được 3

pic, pic thứ nhất tương ứng với mRNÀ, pic thứ 2 tương ứng với DNA và pic thứ

240

3 tương ứng với phân tử lái có cấu trúc xoắn kép song gồm

1 sợi DNA

và một

sợi RNA. Như vậy là Tạ mRNA tạo thành phân tử lai với Tạ DNA. Tạ mRNA
không tạo thành phân tử lai với bất cứ một phân tử DNA của vi khuẩn. Điều này

đưa đến kết luận quan trọng là m RNA

sao chép một cách chính

xác những

thơng tin di truyền trên phân tử DNA để tiến hành tổng hợp phân tử protein đặc
trưng cho từng cơ thể.
Kỹ thuật lai còn phát hiện

ra rằng rRNA

và tRNA

cũng đều được tổng hợp

theo khuôn mẫu của DNA.

Các kiểu chuyển thông tin
DNA lưu giữ tất cả các thông tin di truyền của cơ thể sinh vật ngoại trừ một

số phage và virut RNA (ví dụ như virut polimielit) ở đây khơng có DNA nên
RNA đảm nhiệm vai trị lưu giữ các thông tin di truyền. Rõ ràng là những thơng
tin này cần được bảo tồn trong q trình phân chia tế bào. Do đó trong q trình
phân chia tế bào sẽ xảy ra q trình nhân đơi phân tử DNA (duplication hay
replication). Một q trình đồi hỏi các thơng tin di truyền trong tế bào mẹ phải
được bảo tồn đầy đủ trong các tế bào con.
Những thông tin này cho phép tổng hợp các protein đặc chủng theo quy luật
một ger. => một mạch polipeptit. Tuy nhiên các thông tin khơng thể chuyển

trực

tiếp sang q trình sinh tổng hợp protein, nó phải được mRNA sac chép. RNA.
thơng tin chỉ huy việc lắp ghép các phân tử axit amin để tạo thành phân tử
protein. Cho đến ngày nay người ta biết được 5 kiểu vận chuyển thông tin là :

1. Truyền thơng tin từ DNA sang DNA, đó lä q trình nhân đơi phân tử
DNA nhằm đảm bảo lưu giữ tồn bộ những thơng tin di truyền.
2.

Truyền

thơng

tin

từ

DNA

sang

RNA

-

đó

là

q

trình

(transcription). Q trình này cho phép truyền các thông tin từ phân
sang các phân tử RNA khác nhau.

sao

chép

tử ĐNA

3. Truyền thông tin từ RNA sang protein. Đây là quá trình dịch các mật mã
di truyền (tranduction). Quá trình này cho phép tổng hợp, các proiein đặc trưng
theo đúng những thông tin chứa trong phân tử RNA thông tin
Trong trường hợp virut là một phân tử RNA ta có :

4. Vận chuyển thơng tin tử RNA sang RNA. Trong trường hợp này phân tử
RNA sẽ đảm nhiệm vai trị làm khn mẫu để tổng hợp RNA của virut (quá
trình phát triển của virut) đồng thời làm khuôn mẫu để tổng hợp phân ti RNA

thông tin. Phân tử mRNA

thể gây bệnh.

này sẽ đảm nhiệm việc tổng hợp protein đặc trưng có

241