Bài giảng phương pháp đánh giá chất lượng thực phẩm (phần 4) chương 4 hồ phú hà, vũ thu trang

Chương IV : Phân tích các chỉ
tiêu vi sinh vật
4.1. Chuẩn bị mẫu phân tích vi sinh
4.1.1. Phương pháp lấy mẫu
4.1.2. Vận chuyển và bảo quản mẫu
4.1.3. Xử lý mẫu phân tích
4.2. Các phương pháp kiểm định vi sinh vật trong thực
phẩm
4.2.1. Các phương pháp truyền thống
4.2.2. Các phương pháp xác định nhanh và tự động hóa

1

1

Pha lỗng mẫu
• Các dung dịch pha lỗng

• Tại sao khơng dùng nước cất?
2

1


Một số dung dịch pha lỗng
đặc biệt

• Dung dịch Natri citrat (dùng cho phomat,
phomat chế biến, sữa sấy màng)
– Na3C6H5O7.2H2O

20 g/L

• Dung dịch dikali hidro phosphat 20g/L
– pH7,5: caseinat, phomat, phomat chế biến,
váng sữa chua
– pH8,5: casein axit, casein lactic
3

Một số phương pháp định
lượng vi sinh vật

4

2


Đếm trực tiếp tế bào bằng
buồng đếm hồng cầu

5

Phương pháp đếm số xác suất
lớn nhất (MPN)
Nguyên tắc:
• Vi sinh vật được ni cấy trong mơi trường lỏng và
có khả năng thể hiện các đặc tính lên men (đục, đổi
màu, sinh khí, mùi…)
• Pha lỗng mẫu liên tiếp theo bội số của 10 cho tới
khi kết quả âm tính
• Mỗi độ pha lỗng cần ni cấy 3 ống lặp lại ở điều

kiện thích hợp
• Kiểm tra vi sinh vật có phát triển hay khơng, tính số
ống có kq (+)
• Xử lý số liệu theo bảng Mac Grady, và từ đó tính
ra số lượng VSV
6

3


Phương pháp MPN
Chuẩn bị và pha loãng mẫu

Cấy mẫu vào trong ống nghiệm chứa
mơi trường (mỗi độ pha lỗng 3 ống)

Ni cấy ở nhiệt độ thích hợp

Đọc kết quả, xác định số đặc trưng,
tra bảng Mc Grady, tính kết quả

7

Phương pháp MPN

8

4

Chọn số đặc trưng

9

10

5


Tính số tế bào

11

Phương pháp đếm khuẩn lạc

12

6


Phương pháp đếm khuẩn lạc

13

• Đơn vị hình thành khuẩn lạc (cfu) là gì?

14

7

15

Tính số lượng vi sinh vật
• Quan sát và đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa
(30-300).
• Tính tổng số VSV theo cơng thức :

•
•
•
•
•

ΣC - tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa
n1 - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 1
n2 - số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ 2
f1 - Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ 1
v - thể tích mẫu cấy vào mỗi hộp petri

16

8


Báo cáo kết quả
• Theo TCVN 6264:1997:
– Giữ lại đĩa có số khuẩn lạc từ 10-300
– Tính số khuẩn lạc theo cơng thức

– Nếu tất cả đều ít hơn 10 khuẩn lạc?
– Nếu tất cả đều nhiều hơn 300 khuẩn lạc?
– Đơn vị của N?
17

• Giả sử độ pha lỗng 10-3 đếmđược 168 và
215 khuẩn lạc; độ pha loãng 10-4 đếm
được 14 và 25 khuẩnlạc → tính số cfu
trong 1 ml mẫu ban đầu?
• 1,92 x 10^5 cfu/ml
• Giả sử ở độ pha lỗng 10-1 hút thiếu 0,1
ml → tính sự chênh lệch kết quả?
• 1%

18

9


1. Định lượng tổng số vi sinh vật
• Tổng số VSV = VSV tồn tại và phát triển được trên mơi
trường dinh dưỡng chung, ở 300C, 24 - 72 giờ.
• Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí, ưa ấm có trong SPTP
để đánh giá mức độ nhiễm tạp, tinh trạng vệ sinh, điều kiện
bảo quản và dự đoán khả năng hư hỏng của ẩn phẩm
Phương pháp chuẩn : kỹ thuật đếm khuẩn lạc
1. Nguyên tắc:
- Nuôi cấy môi trường thạch dinh dưỡng, 3010C, hiếu khí,
48–72 giờ
- Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó ➔ số lượng tế bào sống có

trong mẫu phân tích.
19

19

VSV tổng số

Quy trinh ph©n tÝch VSV tổng số

Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu
TGA (Trypton Glucoza Agar)

•Ni cấy trên / trong mơi trường thạch
(30oC, 24-72 h).

Quan sát và đm khun lc

N (khuẩn lạc/g, ml) =



Trypton(pepton) 5 g;
 Glucoza 4 g;
 Cao nÊm men 2,5 g;
 Th¹ch 15 g;

1 lit

Số KL : 30-300

C
(n 1 + 0,1n 2 ).f 1 .v
20

20

10


Khuẩn lạc vi sinh vật tổng số
hiếu khí ưa ấm

21

21

2. Định lượng tổng số nấm men-nấm mốc
Phương pháp chuẩn : kỹ thuật đếm khuẩn lạc
1. Nguyên tắc:
Môi trường chứa chất ức chế vi khuẩn (Oxytetracyclin hoặc
Chloramphenicol, (Yeast Glucose Chloramphenicol - YGC)
- Ni cấy 301oC, hiếu khí, thời gian 48 - 72 giờ.

- Đếm số khuẩn lạc mọc trên đó ➔ tổng số nấm men-nấm
mốc có trong mẫu phân tích.

22

22

11


2. Định lượng tổng số nấm men-nấm mốc
Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu

•Ni cấy trên / trong mơi trường thạch
(30oC, 24-72 h).

(Yeast Glucose chloramphenicol)
Glucoza 20 g;
Cao nÊm men 5
Th¹ch 15
1 lit
Chloramphenicol (0,1)
(Tetracyclin, Oxytetracyclin)

Quan sát và đm khun lc

N (khuẩn lạc/g, ml) =

C
(n 1 + 0,1n 2 ).f 1 .v
23

23

Khuẩn lạc nấm men, nấm mốc

24

24

12


VSV gây bệnh và
gây ngộ độc

3. nh lng Coliforms v E.coli

 2 phương pháp tiêu chuẩn:
- Đếm khuẩn lạc

- MPN
Môi trường đặc hiệu :
- Endo
- BGBL (Brilliant Green Bile Lactose)
- VRB (Violet Red Bile)
- EC

25

25

Môi trường xác định Coliform và E.coli
Môi trường Endo
Pepton 10 g; lactoza 10 g; K2HPO4 2,5 g; sulfit natri 3,3 g;
fucshin kiềm 0,3 g; thạch 15 g; H2O cho đủ 1000 ml; pH
=7,5

Nguyên tắc
Natri sulfit và fucshin = phức chất fuchsin-sulfit
coliform lên men đường lactoza tạo thành aldehyt và
axit,
Aldehyt tác động đến phức chất fuchsin-sulfit và giải
phóng fuchsin,
Fuchsin tự do nhuộm khuẩn lạc thành màu hồng đến
màu đỏ cánh sen, có thể có ánh kim hoặc không.
26

26

13


Mơi trường xác định Coliform vµ E.coli
Mơi trường BGBL
Pepton 10; lactoza 10; mật bò 20; Brilliant green 0,0133; H2O
cho đủ 1000 ml; pH =7,2
Môi trường VRB
Pepton 10; lactoza 5; NaCl 5; muối mật 1,5; tinh thể tím
0,002; Đá trung tính 0,03; thạch 15 g; H2O cho đủ 1000 ml;
pH =7,5

Môi trường EC
Tryptose 20 g; lactoza 5 g; muối mật No3 1,5 g; K2HPO4 4 g
: KH2PO4 1,5g; NaCl 5 g; H2O cho đủ 1000 ml; pH =7
27

27

Hình ảnh khuẩn lạc trên mơi
trường đặc hiệu
•Khuẩn lạc mầu hồng đến
mầu đỏ đậm
•d >0,5 mm
•Mơi trường Endo

28

•Mơi trường VRB

28

14


Quy trinh định lượng Coliform vµ E.coli = MPN
Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu (100, 10-1, 10-2, 10-3)

CÊy mt tăng sinh -TLS
(37oC, 48 h, 9 èng).
Khí → ống (+)

Coliforms
chịunhiƯt

CÊy mt EC
(42-44oC, 48 h).

Cấy mt khẳng định
BGBLB (37oC, 48 h)

Coliforms
phõn

ng (+)

ng (+)

CÊy dd Trypton
(42-44oC, 48 h).



Thử nghiệm
Indol

Coliforms
Thư nghiƯm
IMVCi

E.coli

29

29

VSV g©y bƯnh
E. coli

PhÐp thử khẳng định IMViC

I= Th nghim sinh Indol

(+)

M= Th nghim MR (Methyl Red)

(+)

V= Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)

(-)

iC= Thử nghiệm Citrat

(-)

30

30

15


Quy trinh định lượngColiform vµ E.coli = đếm KL
Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu (100, 10-1, 10-2, 10-3)

CÊy mt VRB

(37oC, 48 h, 9 èng).
Đếm KL mầu
đỏ, chọn 5KL

Coliforms
chịu nhiÖt

CÊy EC lỏng
(44oC, 24-48 h).

CÊy vào BGBL lỏng
(37oC, 24-48 h)

Coliforms
phân

ống (+)

ống (+)

CÊy dd Trypton
(42-44oC, 48 h).



Thử nghiệm
Indol

Coliforms
Thư nghiƯm

IMVCi

E.coli

31

31

VSV g©y bƯnh
E. coli

Quy trinh phân tích E.coli

Phơng pháp đếm khuẩn lạc
Chun b v pha loÃng mu

Cấy trên môi trờng thạch
(42-44oC, 24-48 h).
Nuôi cấy trong nước Trypton
( 42oC, 48 h).
Thử nghiệm IMViC

Tính tỷ lệ khẳng định E.coli

M«i trêng Endo

I :Indol; M: methyl Vi :

C
(n 1 + 0,1n 2 ).f1 .v

.R

32

32

16


VSV gây bệnh
E. coli

Phép thử khẳng định IMViC

a. Th nghim sinh Indol

(+)

b. Thử nghiệm MR (Methyl Red)

(+)

c. Thử nghiệm VP (Voges-Proskauer)

(-)

d. Thử nghiệm Citrat

(-)

33

33

a. Thử nghiệm sinh Indol
Thử nghiệm sinh Indol (I) (+)
tryptophanaza
Indol
Tryptophan
+ DMABA
p-DMABA

quinon (mầu đỏ)

1. Mẫu i chng
2. Phn ứng (+) E.coli
DMABA : 4-DiMethylAminoBenzAldehyt

➔Phân biệt E.coli (+) với các loại coliform khác34 (-)
34

17


Chủng E.coli NC10

35

35

Hình ảnh test indol của khuẩn lạc E. coli
NC10

36

36

18


Phép thử khẳng định E. coli trong rau cải muối
chua

(-) Mẫu không sinh Indol
(+) Mẫu sinh Indol.

(-)

(+)
37

37

b.Thử nghiệm Methyl Red
Thử nghiệm Methyl Red (MR) (+)
- (+) có mầu đỏ (hồng) khi pH<4,4

(-) có mầu cam

khi pH 5,0-5,8

(-) có mầu vàng

khi pH>6

KhuÈn l¹c nghi ngê ➔mt Glucoza Photphat
➔ 37oC, 2-5 ngày ➔ + thuốc thử MR
1. M©ị đối chứng
2. Phản ứng (+) E.coli

➔Phân biệt E.coli (+) với các loại coliform khác38 (-)
38

19


c. Thư nghiƯm VP (Voges-Prouskauer)
Glucoza

Ngun tắc :

Axit pyruvic
Hỗn hợp axit (formic, axetic,
succinic, ethanol, CO2…)

2,3-butanediol

Thuốc thử (O2, OH,

(O2, OH-)

-naphthol, guanidin)

Axetoin
-naphthol

Không đổi mầu ➔ (-)

Diaxetyl
guanidin

E.coli

(-)

Diaxetyl-guanidin
Mầu đỏ ➔ (+)

Klebsiella, Enterobacter

39

39

Thư nghiƯm VP
Cách tiến hành :
•- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm có chứa 0,2
ml mơi trường VP. Ni 37oC, 24 h.
-Cho 2 giọt dung dịch creatin, 3 giọt 1-naphton pha trong

cồn và sau đó cho 2 giọt dung dịch KOH, lắc đều

- Phản ứng (+) khi xuất hiện mầu hồng đến mầu đỏ tươi
trong vịng 15 phút.

•Mơi trường VP
•Pepton 7g; glucoza 5 ; K2HPO4 5;
H2O cho đủ 1l; pH =6,9

40

40

20


d. Thư nghiƯm khả năng ph©n giải xitrat
Ngun tắc :
pH kiềm ➔ Axetat + Format

+ ACoA

Xitrat

pH trung tính ➔ Axetat + CO2

pH axit ➔ Axetoin + Lactat
Xitrat + NH3

 pH kiềm

+ chỉ thị ➔ quan sát mầu

➔Phân biệt E.coli (-) với các loại coliform khác (+)
như Klebsiella và Enterobacter
41

41

Thư nghiƯm kh nng phân gii xitrat
Chn KL nghi ng E.coli

Cấy trên mt SCA hoặc CCSA
(35oC; 24-48 h, 4 ngày)
Quan sát mầu thạch
SCA (Simmons Citrate Agar) / Bromth. blue
CCSA (Christensens Citrate Sulfit Agar)/ phenol đỏ

(-)

(+)

-Na hoặc K xitrat
-Bromothymol blue (pH 6,9)
-pH<6 vàng
-pH=7 xanh lục
-pH>7 xanh dương



E.coli (-)

42

42

21


Kiểm tra Salmonella trong nem chua
Ure (_)
Citrat (+)

43

43

VSV g©y bƯnh
S.aureus

4. Định lượng Staphylococcus
aureus

Phương pháp đếm khuẩn lạc :
Nguyên tắc :
Nuôi cấy trên các môi trường thạch chọn lọc
(Chapman hoặc Baird-Parker)
Khẳng định = thử nghiệm coagulaza

44

44

22


Môi trường đặc trưng cho S. aureus
Môi trường Chapman: Pepton 10 g; Cao thịt 1 g; Manitol 10;
NaCl 75 g; Thạch 15 g; pH 6,8; H2O cho đủ 1000 ml.

 tạo khuẩn lạc mầu vng

45

45

VSV gây bệnh
St.aureus

Mụi trng c trng cho S.
aureus

- Môi trường Baird-Parker: Pepton 10 g; Cao nấm men
1 g; Cao thịt 5 g; Pyruvat natri 10 g; Glycocol 12 g; dịch nhũ
lòng đỏ trứng 50 ml; Tellurit kali (K2TeO3)0,1 g; LiCl 5 g;
Thạch 20 g; pH 7,2; H2O cho 1000 ml.
tạo khuẩn lạc mầu đen cú
vũng sỏng rng
Kh tellurit thnh tellure
Sau 24 h
Kl mầu đen, 0,5-1 mm

lồi, có vòng sáng rông 1-2
mm
Sau 48 h
mầu đen, 1-1,5 mm
lồi, vòng sáng đục 2-4 mm
46

46

23


VSV g©y bƯnh
St.aureus

Quy trinh ph©n tÝch Staphylococcus aureus
(PP đếm khuẩn lạc)

Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu

- Chapman

•Cấy trên mơi trường thạch chọn lọc
(37oC, 24-48 h)

- Baird-Parker

Chän 5 khuÈn l¹c nghi ngờ
Cy vo TSA
(37oC, 24-48 h)

Phép th khẳng định
ãTh nghim ngng
kt coagulaza

N=

•Tinh tỷ lệ khuẩn lạc đặc trưng

 C .R

n.f .v

47

47

Quy trinh định lượng S. aureu
(PP MPN)
Chuẩn bị và pha lo·ng mẫu (100, 10-1, 10-2, 10-3)
CÊy mt tăng sinh MSB
(37oC, 48 h)

Mannitol Salt Broth

c ng (+)
Cấy mt khẳng định
BPA (37oC, 48 h)

Chọn KL đặc trưng


Thử nghiệm khả
năng đông tụ

Tra bảng MPN và tính
48

48

24


Thử nghiệm coagulaza
•Staphylococcus có khả năng tiết enzym coagulaza làm
đơng kết các thành phần huyết tương
•Phép thử khẳng định :
•- Chọn khuẩn lạc nghi ngờ ➔ ống nghiệm 0,5 ml dịch huyết
tương thỏ, lắc đều ➔ tủ ấm 370C, 2 - 24h➔ đơng tụ huyết
tương?

➔ S.aureus (+)
49

49

VSV g©y bƯnh

5. Định lượng Salmonella

Phương pháp đếm khuẩn lạc :

Ngun tắc :

• Ni cấy trên các mơi trường tăng sinh sơ bộ
• Ni cấy trên các mơi trường tăng sinh chọn lọc
• Ni cấy trên các mơi trường rắn đặc hiệu
• Khẳng định = phép thử kiểm tra đặc tính sinh hố của các

khuẩn lạc nghi ngờ

50

50

25