Chống lại côn trùng hại nông sản phẩm

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
= = = =  = = = =

TIỂU LUẬN

Môn học:

Công nghệ sinh học thực phẩm

Chủ đề:

Chống lại côn trùng hại nơng sản phẩm

GVHD:

Nguyễn Thị Lâm Đồn

Nhóm:

2_ Thứ 2_Tiết 6-8

Hà Nội, 2/2019
1


CÁC THÀNH VIÊN TRONG NHÓM
STT

Mã sinh viên

Họ và tên

1

636675

Phạm Quang Vinh ( nhóm trưởng)

K63CNTPF

2

636609

Nguyễn Thị Dun

K63CNTPF

3

636611

Đặng Thu Giang

K63CNTPF

4

636613

Đồn Thị Ngọc Hà

K63CNTPF

5

636612

Vũ Thu Hà

K63CNTPF

6

636617

Ngô Quang Hải

K63CNTPF

7

636122

Nguyễn Thị Hồng Hạnh

K63CNTPA

8

636621

Phạm Thị Hạnh

K63CNTPF

9

636620

Phùng Thị Hạnh

K63CNTPF

10

636618

Trương Thị Hạnh

K63CNTPF

Lớp

2


MỤC LỤC
PHẦN 1: MỞ ĐẦU.............................................................................................................4
1.1. Đặt vấn đề..............................................................................................................4

1.2. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................................6
1.3. Mục đích nghiên cứu ............................................................................................6
PHẦN 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................................................7
2.1. Tổng quan về vấn đề nghiên cứu ........................................................................7
2.1.1. Khái niệm............................................................................................................7
2.2. Các phương pháp chuyển gene ở thực vật ...........................................................9
2.2.1. Phương pháp chuyển gene trực tiếp ..................................................................9
2.2.2. Phương pháp chuyển gene gián tiếp .................................................................15
2.3. Quy trình chuyển gene ......................................................................................16
2.4. Thành tựu ..............................................................................................................19
2.5. Đánh giá .................................................................................................................21
2.5.1. Lợi ích ...............................................................................................................21
2.5.2. Nguy cơ và hạn chế ..........................................................................................25
2.6. Thực trạng .............................................................................................................28
2.6.1. Trên thế giới......................................................................................................28
2.6.2 Việt Nam ............................................................................................................29
PHẦN 3: PHẦN KẾT LUẬN ...........................................................................................34

3


PHẦN 1: MỞ ĐẦU
Cây trồng biến đổi gene (Genetically Modified Crop - GMC) là loại cây
trồng được lai tạo ra bằng cách sử dụng các kỹ thuật của công nghệ sinh học hiện
đại, hay còn gọi là kỹ thuật di truyền, công nghệ gene hay công nghệ DNA tái tổ
hợp, để chuyển một hoặc một số gene chọn lọc để tạo ra cây trồng mang tính trạng
mong muốn.
Về mặt bản chất, các giống lai từ trước đến nay (hay còn gọi là giống truyền
thống) đều là kết quả của quá trình cải biến di truyền. Điểm khác biệt duy nhất
giữa giống lai truyền thống và giống chuyển gene là gene (DNA) được chọn lọc

một cách chính xác dựa trên khoa học công nghệ hiện đại và chuyển vào giống cây
trồng để đem lại một tính trạng mong muốn một cách có kiểm sốt.
1.1.

Đặt vấn đề
Các cây trồng và nơng nghiệp đã đóng vai trị quan trọng trong phát triển và

thúc đẩy sự văn minh. Các cây trồng cung cấp những thức ăn bền vững cho con
người, cho động vật, sợi cho xây dựng và quần áo, thuốc men, dược phẩm, nước
hoa, các hóa chất cho các q trình sản xuất công nghiệp, năng lượng để nấu
nướng và sưởi ấm và gần đây nhất, sinh khối để đáp ứng nhu cầu ngày một tăng về
nhiên liệu phục vụ vận tải.
Bên cạnh đó, các cây trồng cịn đóng vai trị chủ yếu về mặt mơi trường
bằng việc ngăn ngừa xói mịn đất, tăng cường mức oxy trong khí quyển, giảm sự
phát tán CO2 từ việc đốt than đá, và làm giàu đất bằng nito, mà chúng quay vòng
theo chu kỳ giữa đất và khí quyển. Nếu dân số tiếp tục tăng như dự đốn, thì trong
50 năm tới chúng ta cần phải sản xuất thêm thức ăn cho người, thức ăn cho động
vật và sợi hơn so với thời gian của toàn bộ lịch sử loài người và sản xuất cây trồng
giảm dần.
4


Nhưng bên cạnh việc phát triển của cây trồng là sự phát triển của sâu bệnh
hại cây trồng ngày càng phức tạp và khó kiểm sốt. Điều này đặt ra một số thách
thức chủ yếu cho nông nghiệp ở thế kỷ XXI:
- Cần tạo ra các giống cây trông kháng lại sâu bệnh
- Cần nghiên cứu tạo ra các loại gene kháng được sâu bệnh ở những loại cây
trồng chủ đạo.
- Những cây trồng cần được phát triển để có thể sinh sôi nảy nở trong những
điều kiện khắc nghiệt sao cho những đất ít màu mỡ có thể được sử dụng để

trồng những cây quan trọng, mùa vụ trồng cần phải kéo dài và sản lượng
không bị giảm bởi hạn hán, thời tiết nóng, lạnh và các tác động khác.
- Những ảnh hưởng đến môi trường của nông nghiệp do việc sử dụng thuốc
trừ sâu, thuốc diệt cỏ và phân bón cần phải giảm bớt.
Ví dụ các cây trồng cần được biến đổi để chịu được bệnh dịch, để có thể hấp
thu có hiệu quả các chất dinh dưỡng trong đất, và cạnh tranh với cỏ dại trong việc
hút nước và hấp thụ ánh sáng mặt trời. Những cây lương thực cần được tối ưu hóa
để phục vụ sức khỏe và dinh dưỡng của con người, cung cấp các vitamin thiết yếu,
các acid amin và protein nhằm giúp xóa bỏ tình trạng suy dinh dưõng và bệnh tật.
Những thách thức này sẽ đòi hỏi phải áp dụng những kỹ thuật nhân giống và phân
tử tinh vi nhất mà hiện nay đang có, cũng như việc phát triển những kỹ thuật mới.
Tuy nhiên chưa bao giờ có một thời kỳ nào sôi động hơn cho ngành sinh học cây
trồng và nông nghiệp, và cuộc cách mạng công nghệ tạo ra bởi kỷ nguyên các bộ
gen cho cơ hội duy nhất để thực hiện những mục tiêu này trong thời gian hai thập
kỷ tới hoặc sớm hơn. Chính vì vậy, việc ứng dụng những thành tựu của công nghệ
sinh học vào sản xuất nông nghiệp đã, đang và sẽ là sự lựa chọn tất yếu nhằm đáp
ứng được những nhu cầu lương thực, thực phẩm của con người trên toàn cầu.

5


Trên cơ sở thực tiễn đó, chúng tơi đã chọn đề tài: “Chống lại côn trùng hại nông
sản phẩm” làm đề tài tiểu luận môn Công nghệ Sinh học thực phẩm của mình.
1.2.

Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Đối tượng: các loại cây trồng biến đổi gene
Phạm vi: ở đây chúng tơi chỉ đề cập đến một số vai trị cơ bản của thực vật

biến đổi gene chỉ trong lĩnh vực sản xuất nông nghiệp để chống lại côn trùng và

sâu bệnh gây hại.
1.3.
-

Mục đích nghiên cứu
Duy trì và mở rộng đa dạng sinh học (biodiversity).

- Tăng năng suất, tăng khả năng phòng chống các loại sâu bệnh.
- Cải thiện khả năng cung cấp dinh dưỡng cũng như đáp ứng các đòi hỏi
cao về chất lượng sản phẩm cây trồng.
- Tạo ra các sản phẩm không gây hại cho môi trường.
- Tăng cường tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học.
 Cơng nghệ biến đổi gene đã được áp dụng trên nhiều loại cây trồng chủ
đạo có giá trị kinh tế cao và đã thu được nhiều thành tựu mang tính đột
phá. Cây trồng chuyển gene (CTCG) đã mang lại nhiều lợi ích cho cả các
nhà sản xuất và người tiêu dùng.

6


PHẦN 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
2.1. Tổng quan về vấn đề nghiên cứu
2.1.1. Khái niệm
Chuyển gene (transgenesis) là đưa một đoạn DNA ngoại lai vào genome của
một cơ thể đa bào, sau đó đoạn DNA ngoại lai này sẽ có mặt ở hầu hết các tế bào
và được truyền lại cho thế hệ sau. Vì vậy khái niệm chuyển gen chỉ được sử dụng
cho thực vật và động vật. Nấm men, vi khuẩn và tế bào nuôi cấy mang một đoạn
DNA ngoại lai được gọi là các tế bào tái tổ hợp (recombinant cell) hoặc tế bào biến
nạp (transformed cell).
Thực vật chuyển gene là thực vật có gene ngoại lai (gene chuyển) xen vào

trong DNA genome của nó.
Gene ngoại lai này phải được truyền lại cho tất cả mọi tế bào, kể cả các tế
bào sinh sản mầm. Nếu dòng tế bào mầm bị biến đổi, các tính trạng bị biến đổi này
sẽ được truyền cho các thế hệ kế tiếp thơng qua q trình sinh sản bình thường.
Nếu chỉ có dịng tế bào sinh dưỡng bị biến đổi, chỉ có cơ thể mang các tế bào sinh
dưỡng đó bị ảnh hưởng và không di truyền lại cho thế hệ sau. Việc chuyển gene
ngoại lai vào động vật (thực vật) chỉ thành công khi các gene này di truyền lại cho
thế hệ sau.
Cây trồng chuyển gene là sự biến đổi vật chất di truyền, tiếp nhận thêm
những gene mới, kết quả là xuất hiện những tính trạng mới dưới sự tác động của
môi trường.
2.1.2. Một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến q trình chuyển gene
Khơng phải tồn bộ tế bào đều thể hiện tính tồn năng (totipotency).

7


Các cây khác nhau có phản ứng khơng giống nhau với sự xâm nhập của một
gene ngoại lai.
Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả
năng thu nhận gene biến nạp vào genome.
Mô thực vật là hỗn hợp các quần thể tế bào có khả năng khác nhau. Cần xem
xét một số vấn đề như: chỉ có một số ít tế bào có khả năng biến nạp và tái sinh cây.
Ở các tế bào khác, có hai trường hợp có thể xảy ra: một số tế bào nếu được tạo điều
kiện phù hợp thì trở nên có khả năng, một số khác hồn tồn khơng có khả năng
biến nạp và tái sinh cây.
Thành phần của các quần thể tế bào được xác định bởi loài, kiểu gene, từng
cơ quan, từng giai đoạn phát triển của mô và cơ quan.
Thành tế bào ngăn cản sự xâm nhập của DNA ngoại lai. Vì thế, cho đến nay
chỉ có thể chuyển gene vào tế bào có thành cellulose thơng qua Agrobacterium,

virus và bắn gene hoặc phải phá bỏ thành tế bào để chuyển gene bằng phương pháp
xung điện, siêu âm và vi tiêm.
Khả năng xâm nhập ổn định của gene vào genome không tỷ lệ với sự biểu
hiện tạm thời của gene.
Các DNA (trừ virus) khi xâm nhập vào genome của tế bào vật chủ chưa đảm
bảo là đã liên kết ổn định với genome.
Các DNA (trừ virus) không chuyển từ tế bào này sang tế bào kia, nó chỉ ở
nơi mà nó được đưa vào.

8


Trong khi đó, DNA của virus khi xâm nhập vào genome cây chủ lại không
liên kết với genome mà chuyển từ tế bào này sang tế bào khác ngoại trừ mô phân
sinh (meristem).
2.1.3. Hướng nghiên cứu cây trồng kháng côn trùng gây bệnh
Có rất nhiều hướng nghiên cứu về các loại cây trồng chuyển gene nhưng
chúng tôi sẽ đi sâu hơn vào hướng nghiên cứu kháng côn trùng, sâu bệnh hại cây
trồng.
Cây trồng chuyển gene kháng côn trùng phá hoại. Sử dụng hóa chất để
phịng trừ sâu bọ cơn trùng vừa đắt tiền vừa tác động xấu đến môi trường. Các cây
trồng như bông, ngô và khoai tây chuyển gene đang được sản xuất thương mại biểu
hiện độc tố của Bacillus thuringensis (Bt) để tạo ra tính kháng đối với các côn
trùng loại nhai-nghiền (chewing insects). Vi khuẩn B. thuringensis tổng hợp các
protein δ- endotoxin tinh thể được mã hóa bởi các gene Cry. Khi côn trùng ăn vào
bụng, các prototoxins bị đứt gãy trong dạ dày kiềm của côn trùng để tạo thành độc
tố hoạt động. Các liên kết này tạo ra các receptor đặc trưng trong các tế bào biểu
mô ruột làm thành các lỗ chân lông và cuối cùng là gây chết côn trùng.
2.2. Các phương pháp chuyển gene ở thực vật
2.2.1. Phương pháp chuyển gene trực tiếp

Các phương pháp chuyển gene trực tiếp bao gồm:
- Chuyển gene trực tiếp bằng súng bắn gene
- Chuyển gene trực tiệp bằng xung điện
- Chuyển gene trực tiếp nhờ hóa chất
- Chuyển gene trực tiếp qua ống phấn
- Chuyển gen trực tiếp bằng vi tiêm
9


2.2.1.1. Chuyển gene trực tiếp bằng súng bắn gen
Khái niệm: Súng bắn gene (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông
tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế
bào thực vật.
Nguyên tắc chung: Sử dụng các viên đạn có kích thước nhỏ nhưng tỷ trọng
cao để đạt gia tốc cao, dưới tác dụng của 1 lực nén xuyên qua vỏ và màng tế bào
đưa ra lớp AND bọc ngoài vào tế bào và tiếp cận với bộ gene của tế bào.
Ưu điểm:
- Dễ dàng tiến hành.
- Có thể chuyển gene vào nhiều loại tế bào và mô.
- Bắn vào một lần được nhiều thiết bị.
- Qúa trình chuyển gene nhanh, thao tác đơn giản.
- Các vector mang gene tái tổ hợp đơn giản và chỉ cần 1 lượng vector nhỏ.
Nhược điểm:
- Đòi hỏi thiết bị đắt tiền (khơng phải phịng thí nghiệm nào cũng có thể đầu
tư).
- Có thể gây ra sự xáo trộn trật tự của đối tượng chuyển gene.
- Tần số biến nạp ổn định thấp.
2.2.1.2. Chuyển gene bằng xung điện
Khái niệm: Chuyển gene bằng súng điện là phương pháp sử dụng xung điện
trong thời gian ngắn để tạo ra các lỗ trên màng tế bào trần làm cho DNA bên ngồi

mơi trường có thể xâm nhập vào bên trong tế bào.
Quy trình chuyển gene bằng súng điện:
10


- Tạo dung dịch tế bào huyền phù.
- Tạo xung điện với hiệu điện thế cao trong thời gian ngắn.
- Protoplast bị thủng một số chỗ.
- DNA thâm nhập, gắn vào hệ gen thực vật.
- Nuôi cấy protoplast trong môi trường chọn lọc.
- Nuôi cấy invitro, tái sinh cây.
- Chọn lọc cây chuyển gene.
Ưu điểm:
- Phương pháp này có thể thực hiện với các mơ invitro cịn ngun vẹn.
- Đoạn DNA ngoại lai được biến nạp có kích thước lớn.
Nhược điểm:
- Tỷ lệ các tế bào được chuyển gene còn thấp.
- Sức sống của tế bào bị giảm đột ngột do bị sốc điện.
- Việc tái sinh ở một số lồi rất khó khan.
2.2.1.3. Chuyển gene nhờ hóa chất
Khái niệm: Chuyển gene nhờ hóa chất là phương pháp chuyển gene vào
protoplast (tế bào trần) nhờ các chất hóa học như polyethylene glycol (PEG) hoặc
canxi phosphate.
Nguyên tắc: Khi có sự tác động của hóa chất thì màng của protoplast bị thay
đổi và protoplast có thể thu nhận DNA ngoại lai vào bên trong tế bào.
Ở nồng độ cao, PEG làm ADN cần biến nạp khơng cịn ở trạng thái hịa tan
nữa mà kết dính lại trên màng sinh chất. Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý

11

nồng độ cao của Ca2+ hoặc ở nồng độ pH cao, ADN biến nạp sẽ được chuyển nạp
vào trong tế bào protoplast.
Ưu điểm:
- Hiệu quả chuyển gene cao, ổn định nếu q trình biến nạp thành cơng.
- Khơng địi hỏi thiết bị đắt tiền.
Nhược điểm:
- Tần số chuyển gene rất thấp do khơng kiểm sốt được q trình chuyển
gene.
- Dễ xảy ra hiện tượng dung hợp tế bào trần, gây khó khan trong việc phân
tích biểu hiện gene.
- Tái sinh tế bào trần sau chuyển gene khó khăn.
2.2.1.4. Chuyển gene qua ống phấn
Chuyển gene qua ống phấn được đề xuất lần đầu tiên năm 1988 trên cây lúa
bởi nhóm Ray Wu đại học Cornell (Mỹ) dựa trên sự kế thừa cơng trình của Duan
và Chen (TQ,1985) với tỷ lệ hạt chuyển gene/hạt thí nghiệm là 20%.
Ở Việt Nam, phương pháp này đang được viện Nghiên cứu cây bông và viện
Công nghệ sinh học thử nghiệm ở quy mô lớn trên cây bông.
Khái niệm: Chuyển gene qua ống phấn là phương pháp không qua nuôi cấy
invitro, các DNA ngoại lai được chuyển trực tiếp bằng đường ống phấn.
Nguyên tắc: DNA ngoại lai chuyển vào cây theo đường ống phấn, chui vào
bầu nhụy cái. Thời gian chuyển gene là vào lúc hạt phấn mọc qua vòi nhụy và lúc
đưa tinh vào thụ tinh.

12


Thời điểm chuyển gene tốt nhất là xảy ra đúng khi q trình thụ tinh ở nỗn
và cho tế bào hợp tử chưa phân chia. Như vậy sự chuyển gene chỉ xảy ra ở một tế
bào cái duy nhất.

2.2.1.5. Chuyển gene bằng vi tiêm
Khái niệm: Chuyển gene bằng vi tiêm là chuyển gene trực tiếp vào tế bào
protoplast hoặc tế bào đơn (chưa hình thành vỏ cứng) bằng cách sử dụng vi tiêm
nhỏ, kính hiển vi và các thao tác.
Nguyên tắc: Một lượng nhỏ DNA được tiêm trực tiếp vào nhân tế bào phôi
trần hoặc tế bào nguyên vẹn một cách cơ học dưới kính hiển vi.
Phương pháp này cho phép đưa gene vào đúng vị trí mong muốn ở từng tế
bào với hiệu quả tương đối cao.
Ưu điểm:
- Có thể tối ưu lượng DNA đưa vào tế bào.
- Quyết định được đưa DNA vào loại tế bào nào.
- Có thể đưa 1 cách chính xác thậm chí vào tận nhân và có thể quan sát được.
- Các tế bào có cấu trúc nhỏ như hạt phấn và tế bào tiền phơi mặc dù hạn chế
và số lượng cũng có thể tiêm chính xác.
- Có thể ni riêng lẻ các tế bào vi tiêm và biến nạp được vào mọi giống cây.
Nhược điểm:
- Mỗi lần tiêm chỉ được một phát tiêm và chỉ với một tế bào.
- Cần dung các thiết bị có độ chính xác cao và cần kỹ năng phức tạp của
người sử dụng.

13


**Ngồi những phương pháp chuyển gene trên cịn phương pháp chuyển gene
bằng kỹ thuật siêu âm:
Khái niệm: Chuyển gene bằng kỹ thuật siêu âm là dùng sóng siêu âm để
chuyển gene vào tế bào trần.
Nguyên tắc: Sau tạo protoplast, ta tiến hành trộn protoplast với plasmid chứa
gen mong muốn tạo dung dịch huyền phù.
Tiến hành cắm máy siêu âm vào dung dịch huyền phù khoảng 3mm và cho

máy phát vào tầm số 20kHz, thời gian 600-900ms.
Sóng siêu âm làm cho lớp màng protoplast biến đổi tạo ra các lỗ giúp cho
DNA ngoại lai xâm nhập vào tế bào.
Các bước chuyển gene bằng kỹ thuật siêu âm:
- Tạo dung dịch tế bào huyền phù.
- Tạo song siêu âm với tầm số cao.
- Protoplast bị thủng một số chỗ.
- ADN thâm nhập vào.
- Nuôi cấy protoplast.
- Tái sinh cây.
- Chọn lọc cây chuyển gen.
Ưu điểm:
- Chuyển được lượng protoplast nhiều.
- Không độc hại đối với tế bào.
Nhược điểm:
- Giá thành thiết bị tương đối cao.
14


- Đòi hỏi kỹ thuật cao.
2.2.2. Phương pháp chuyển gene gián tiếp
2.2.2.1 Phương pháp chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium
Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển
một đoạn DNA của nó vào các tế bào thực vật. Khi DNA vi khuẩn được hợp nhất
với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn cơng vào hệ thống tổ chức của tế bào một
cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn.
Thật không may mắn cho các nhà trồng cây ân quả khi gặp phải loài vi khuẩn này
bởi vì nó chính là thủ phạm gây ra bệnh khối u hình chóp và bệnh long rễ ở nhiều
loài cây cảnh và cây ăn quả.
Mặc dù hệ thống chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium là có hiệu quả đối với

một số lồi nhưng khơng phải tất cả thực vật có thể được biến nạp bằng con đường
này. Đặc biệt lớp một là mầm bao gồm các cây ngủ cốc chính trên thế giới như lúa,
lúa mì và ngô là không được biến nạp dễ dàng nhờ A. Tumefaciens.
Để khai thác và sử dụng A. Tumefaciens như là một vector chuyển gene các
nhà khoa học đã loại bỏ các gene gây khổi u và gene mã hóa opine của T -DNA và
thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và
bờ trái của T-DNA và các gene voer. Gene chuyển được xen vào giữa các vùng bờ
của T-DNA. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể
tế bào thực vật.
Phương pháp chuyển gene gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra
đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gene chuyển
đặc biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô
được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức độ khởi đầu của vi khuẩn A.
Tumefaciens sử dụng môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử
dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gene của thực vật.
15


2.2.2.2. Chuyển gene nhờ virus
Bên cạnh vi khuẩn Agrobacterium còn có các hệ thống dùng virus làm
vector chuyển gene vào thực vật. Về nguyên tắc, bất kỳ loại virus nào cũng có thể
được sử dụng làm vector để chuyển vật liệu di truyền vào trong tế bào. Nhiều
nhóm trong số đó, các papovavirus, adenovirus, retrovirus...được sử dụng vào
những mục đích chuyên biệt. Ðể sử dụng làm vector, các phần khác nhau của
genome virus được thay thế bằng gene cấu trúc quan tâm. Virus có thể được sử
dụng để lây nhiễm vào tế bào giai đoạn sớm của phôi trước khi được chuyển ghép
vào cây mẹ. Gene chuyển với vector retrovirus xâm nhập một cách hiệu quả vào hệ
gen của vật chủ nhưng virus sử dụng phải là virus an toàn, không gây bệnh.
Ưu điểm:
- Chúng dễ xâm nhập và lây lan nhanh trong cơ thể thực vật.

- Có thể mang đoạn DNA lớn hơn so với khả năng của các plasmid.
Nhược điểm:
- Các acid nucleic của virus không ghép nối với bộ gene của thực vật, bởi vậy
AND tái tổ hợp không di truyền được cho các thế hệ sau thơng qua hạt. Do
đó nhân giống các gene phải qua con đường vơ tính.
- Sự lây nhiễm virus thường làm yếu tế bào thực vật ở các mức độ khác nhau

2.3. Quy trình chuyển gene
Từ khi người ta khám phá ra rằng các thí nghiệm chuyển gene có thể thực
hiện nhờ một loại vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens, thì các nhà khoa học
tin rằng Agrobacterium có thể chuyển gene vào tất cả các cây trồng. Nhưng sau đó
kết quả thực tế cho thấy chuyển gene bằng Agrobacterium không thể thực hiện
được trên cây ngũ cốc (một lá mầm) vì thế hàng loạt kỹ thuật chuyển gene khác đã
16


được phát triển đó là các kỹ thuật chuyển gene trực tiếp như bắn gene bằng vi đạn
(bombardement/gene gun), vi tiêm (microinjection), xung điện (electroporation),
silicon carbide, điện di (electrophoresis), siêu âm (ultrasonic), chuyển gene qua
ống phấn (pollen tube) ... Đến nay, nhờ cải tiến các vector chuyển gene nên kỹ
thuật chuyển bằng A. tumefaciens đã thành công cả ở cây ngũ cốc đặc biệt là lúa.
Kỹ thuật này trở nên một kỹ thuật đầy triển vọng đối với cây chuyển gene ở thực
vật.
Quá trình chuyển gene được thực hiện qua các bước sau:
- Xác định gene liên quan đến tính trạng cần quan tâm.
- Phân lập gene (PCR hoặc sàng lọc từ thư viện cDNA hoặc từ thư viện
genomic DNA).
- Gắn gene vào vector biểu hiện (expression vector) để biến nạp.
- Biến nạp vào E. coli.
- Tách chiết DNA plasmid.

- Biến nạp vào mô hoặc tế bào thực vật bằng một trong các phương pháp khác
nhau đã kể trên.
- Chọn lọc các thể biến nạp trên môi trường chọn lọc.
- Tái sinh cây biến nạp.
- Phân tích để xác nhận cá thể chuyển gene (PCR hoặc Southern blot) và đánh
giá mức độ biểu hiện của chúng (Northern blot, Western blot, ELISA hoặc
các thử nghiệm in vivo khác...).
Nguyên liệu để thực hiện sự biến nạp là các tế bào thực vật riêng lẽ, các mơ
hoặc cây hồn chỉnh.
Cản trở lớn nhất của sự tiếp nhận DNA ở phần lớn sinh vật là thành tế bào.
Muốn làm mất thành tế bào thực vật người ta thường sử dụng enzyme và dưới
17


những điều kiện thích hợp người ta có thể tạo ra tế bào trần, tế bào trần tiếp nhận
DNA nói chung dễ dàng. Chẳng hạn sử dụng phương pháp xung điện, ở đây tế bào
được đặt ở trong một xung điện ngắn, xung điện này có thể làm xuất hiện những lỗ
tạm thời ở trên màng tế bào, những phân tử DNA có thể đi vào bên trong tế bào.
Sau khi biến nạp người ta tách những enzyme phân giải và để cho tế bào phát triển,
thành tế bào mới được tạo nên. Các tế bào biến nạp này được ni cấy trên các mơi
trường nhân tạo thích hợp cùng với các chất kích thích sinh trưởng để tạo nên cây
hồn chỉnh. Sau đó bằng các phương pháp phân tích genome như PCR, Southern
blot, Northern blot được thực hiện để tìm ra chính xác những cây biến đổi gene.
Bên cạnh các phương pháp biến nạp Agrobacterium hoặc xung điện, hiện nay
có hai phương pháp khác cũng thường được sử dụng để đưa DNA vào trong tế bào.
Phương pháp thứ nhất là vi tiêm: với một cái pipet rất nhỏ người ta có thể đưa các
phân tử DNA trực tiếp vào nhân tế bào mà người ta muốn biến nạp. Phương pháp
này đầu tiên chỉ được sử dụng ở tế bào động vật, nhưng sau này người ta đã sử
dụng cho tế bào thực vật. Phương pháp thứ hai là bắn vào tế bào các vi đạn
(microprojectile), thường bằng vàng hoặc wolfram, được bao bọc bởi DNA.

Phương pháp này được gọi là phi sinh học và được sử dụng thành công ở nhiều
loại tế bào khác nhau.
Ở động-thực vật chuyển gene, sản phẩm cuối cùng thường không phải là tế bào
biến nạp, mà là một cơ thể biến nạp hoàn toàn. Phần lớn thực vật được tái sinh dễ
dàng bằng nuôi cấy mô tế bào. Tuy nhiên, tái sinh cây một lá mầm như ngũ cốc và
các loại cỏ khác cũng gặp một vài khó khăn. Từ một tế bào biến nạp duy nhất
người ta có thể tạo ra một cây chuyển gene, trong đó mỗi tế bào mang DNA ngoại
lai và tiếp tục chuyển cho thế hệ sau sau khi nở hoa và tạo hạt.

18


2.4. Thành tựu
Công nghệ chuyển gene kháng sâu bệnh vào cây trồng đã đem lại rất nhiều
thành tựu to lớn, đặc biệt là đối với ngành nông nghiệp.
Một số thành tựu ở cây lúa:
- Chuyển nạp gen cryIA trong cây lúa: Datta và Cs (1998) đã thực hiện
chuyển
thành công gen cryIA với 2 promoter có tính chất cấu trúc là 35ScaMV và
Actin–1 vào câu lúa với 2 dạng hình khác nhau là indica va japonica bằng
phương pháp bắn gene trên tế bào trần. Các tác giả sử dụng phân tích
southern kết quả cho thấy 100 cây được chuyển nạp đươc xác nhận là có sự
kết hợp của gene cryIA và genome của cây lúa có 81 trong 800 cây lúa khi
có kết quả dương về phân tích southern được thanh lọc với sâu đục thân màu
vàng (Scirpophaga incertulas) cho thấy 100% sâu non chết. Trong trường
hợp chuyển nạp gene này trên giống lúa japonica Taipei 309 với promoter
Actin-1, trong vector có gene kháng Hygromycine, hph đi kèm với promoter
CaMV 35S, Wu và Cs đã ghi nhận gene này rất hiệu quả diệt sâu đục thân
màu vàng, đặc biệt là protein độc tố trong thân cây lúa.
Nhóm tác giả bao gồm: Nguyễn Hữu Hổ, Nguyễn Văn Uyển, Krabi Datta,

Swapan Kumar Datta thuộc Viện sinh học nhiệt đới và Viện lúa quốc tế đã thành
công trong việc tạo cây lúa chuyển gene Nàng Hương Chợ Đào kháng cao đối với
sâu đục thân bằng phương pháp gián tiếp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Trong nghiên cứu này các tác giả đã sử dụng chủng vi khuẩn
LBA4404 mang plasmit pBin-BAR-UBR-IB mang gen Bt phối hợp (hybrid) giữa
CryIA(b) và CryIB. Các tác giả đã sử dụng nhiều phương pháp: nuôi cấy tế bào
thực vật, PCR, lai southern blot, trắc nhiệm ELISA, thử tính kháng thuốc diệt cỏ,
thử tính kháng sâu... Qua thí nghiệm và thử tính kháng sâu thấy rằng trong 100%
19


sâu chết ở tất cả các trường hợp chuyển gene, trường hợp đối chứng tỷ lệ sâu chết
từ 0 – 14.5%.
Ngồi ra, nhóm tác giả Niranjan Baisakh, Norman Oliva cùng với Nguyễn Hữu
Hồ và Nguyễn Văn Uyển cũng đã thành công trong việc tạo ra các cây lúa thơm
chuyển gene Jasmine và Nàng Hương Chợ Đào kháng sâu Bt bằng sử dụng
phương pháp bắn gene. Khi thử tính kháng sâu sau khi tạo ra cây chuyển gene thấy
răng tỉ lệ dâu chết ở những cây này lên tới 90 - 100% cịn cây đối chứng tỉ lệ sâu
chết là khơng đáng kể. Kết quả này phù hợp với kết quả của một số tác giả nghiên
cứu trước đây khi sử dụng gene Bt này để chuyển vào một số giống lúa khác như
IR64, IR72 ...
Bằng phương pháp bắn gene, tác giả Nguyễn Hữu Hổ cũng tạo ra giống lúa Một
Bụi chuyển gene kháng sâu Bt mang gene chyển là gene phối hợp cryIA(b) +
cryIB(c). Kết quả cũng đã thu được giống có khả năng kháng sâu cao như các
giống lúa trong các thí nghiệm trên.
- Sử dụng RNAi để diệt côn trùng gây hại cho cây trồng: Các nhà khoa học
của Monsanto ve Devgen N.V. đã thực hiện phương pháp này có hiệu quả.
Báo cáo khoa học đã được cơng bố trên tạp chí Nature Biotechnology. RNAi
làm im lặng những gene cần thiết của của trùng gây hại cây trồng khiến
chúng dừng hấp thu dinh dưỡng và làm chết ấu trùng. Các nhà khoa học này

đã sử dụng RNAi để kiểm sốt cơn trùng gây hại rễ bắp (WCR) làm mơ hình
cho những nghiên cứu tiếp theo. Cây chuyển gene có tác dụng với các cơn
trùng gây hại, các cơn trùng này ăn lá thì thấy chúng bị chết. Việc sử dụng
RNAi để kiểm sốt cơn trùng gây hại cơn trung sẽ bổ sung đáng kể cho
chiến lược giống chuyển gene Bt (protein diệt côn trùng) trên cây cải bắp,
bông vải đậu nành ...

20