Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính khánh vi sinh vật của vi khẩn lên men LACTIC để chọn chủng tiềm năng PROBIOTIC

Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Chương 1: Mở Đầu
1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay công nghệ sinh học là một lónh vực đang phát triển và có nhiều
tiềm năng lớn. Việt Nam cũng đã từng bước tạo điều kiện để phát triển công
nghệ sinh học, đặc biệt là những ứng dụng trong nông nghiệp và cả trong công
nghiệp.
Probiotic một thành quả khoa học, một thành quả của công nghệ sinh học.
Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi ví tính hợp lý và
hiệu quả mà nó thể hiện. Hiệu quả tác dụng của probiotic không chỉ đơn thuần
là làm thức ăn ngon hơn mà có rất nhiều tác dụng, như: tiêu hoá thức ăn và làm
bớt sự rối loạn tiêu hoá; đẩy mạnh sự tổng hợp vitamin B và một số enzyme
tiêu hoá; cải thiện sự dung nạp lactose; cải thiện chức năng miễn dòch; ngăn
chặn những chỗ loét trong hệ thống tiêu hoá; ngăn chăn chứng viêm; giảm
cholesterol; giảm tỷ lệ chết non; làm giảm số lượng vi khuẩn gây hại; tăng
trọng nhanh…
Trên quan điểm về an toàn sinh học, an toàn thiết thực thì probiotic đang
chiếm thế thượng phong so với một số phương cách khác. Vì tính hiệu quả của
probiotic (tính trò bệnh) là sự điều hoà tự nhiên không làm tồn dư kháng sinh,
tồn dư tác hại trong sinh vật chủ. Mà với sự khắt khe của con người thì điều này
là số một.
Như đã biết trước đây và cả hiện nay nhiều nông dân sử dụng chất kháng
sinh trong chăn nuôi như là biện pháp tối ưu nhất bởi những lợi ích mà nó mang
lại như:
• Tăng năng suất sinh trưởng và sinh sản ở gia súc, gia cầm
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 1
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
• Tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, làm cho vật nuôi thích ứng nhanh
chóng với sự thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong
khẩu phần ăn

• Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thòt mỡ, tăng tỷ lệ thòt
nạc, làm cho thòt trở nên mềm hơn và không nhiễm mầm bệnh).
• Phòng các bệnh mãn tính và ngăn chặn xẩy ra những dòch bệnh do
vi trùng.
• Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi.
Tuy nhiên, thế giới đã nhanh chóng nhận ra những tác động xấu do việc
làm này mang lại. Sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi (sử dụng không
đúng cách trong điều trò, phòng bệnh và dùng trong thức ăn chăn nuôi như chất
kích thích sinh trưởng) đã dẫn đến một hậu quả rất nghiêm trọng là làm tăng
hiện tượng kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn gây bệnh trên người và vật
nuôi. Có ý kiến cho rằng, việc sử dụng kháng sinh liều thấp trong chăn nuôi đã
biến vật nuôi thành nơi để một số loài vi khuẩn “ học” cách vô hiệu hoá tác
dụng của các loại kháng sinh. Hậu quả của sự kháng kháng sinh ở vi khuẩn về
kinh tế rất lớn. Tuy nhiên, những thiệt hại về kinh tế không phải là chính yếu
mà vấn đề đáng lo ngại là không chỉ vật nuôi mà ngay cả loài người đang đứng
trước hiểm hoạ xẩy ra các thảm dòch do những loài vi khuẩn kháng thuốc gây ra
mà không thể kiểm soát được.
Như vậy nghiên cứu phát triển và ứng dụng probiotic vào cuộc sống là một
công việc cần được quan tâm và đầu tư nhiều hơn nữa. Có như vậy mới tiếp tục
hoàn thiện probiotic đem lại hiệu quả cao hơn, chất lïng cuộc sống ngày được
cao hơn, an toàn hơn đáp ứng nhu cầøu ngày càng cao và khắt khe của chúng ta.
Có thể nói đây là sự tác động thân hữu của con người vào tự nhiên nên đã mở
ra một chiến lược phát triển bền vững và an toàn.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 2
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Khoa học công nghệ luôn phát triển nhằm để đáp ứng lại nhu cầu ngày
càng cao của con người. Trên phương trình tăng tiến này, con người đòi hỏi khắt
khe hơn về chất lượng của mọi loại sản phẩm đặc biệt là sự an toàn về sức khoẻ
của chính bản thân họ. Mà chính những nhu cầu này là kích thích tố trực tiếp

thúc đẩy khoa học phát triển. “ Probiotic” là một phần của sự phát triển ấy.
Để có thể có một chế phẩm probiotic có đầy đủ những hoạt tính cần thiết,
khâu chọn lọc chủng vi khuẩn để làm probiotic là cực kì quan trọng. Bởi vì ngay
tại khâu này sẽ quyết đònh vai trò và tác dụng của chế phẩm lên đối tượng cần
quan tâm. Tuy nhiên, trong phạm vi nhỏ hẹp của nghiên cứu này, tôi chỉ thực
hiện đề tài ở bước kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật vì thời gian thực hiện đề
tài chỉ trong 12 tuần không cho phép tôi thực hiệân hoàn chỉnh tất cả các tiêu chí
tuyển chọn Probiotic. Chính vì thếø tôi đã chọn đề tài “THỬ NGHIỆM VÀ SO
SÁNH CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐO HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT
CỦA VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC ĐỂ CHỌN CHỦNG TIỀM NĂNG
PROBIOTIC”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Thử nghiệm và so sánh các phương pháp đo hoạt tính kháng vi sinh vật của
vi khuẩn lên men lactic.
Chọn lọc vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính probiotic.
1.3. Đối tượng nghiên cứu
Vì thời gian hạn hẹp, đề tài chỉ tập trung ở những đối tượng sau :
- Vi khuẩn lên men lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men ( cà muối,
dưa muối, nem, sữa lên men) và có nguồn gốc từ các chế phẩm dược.
- Vi sinh vật chỉ thò Escherichia coli.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 3
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
1.4. Phương pháp nghiên cứu
1.4.1. Phương pháp luận
Trước khi bắt tay vào thực hiện đề tài này, tôi đã tham khảo khá nhiều các
nghiên cứu từ trước tới nay về probiotic cũng như các phương pháp tuyển chọn
nó. Nhận thấy có khá nhiều phương pháp được sử dụng để thực hiện việc chọn
lọc này, tôi đã xem xét và chọn ra những phương pháp điển hình nhất cho đề tài
của mình.

Tôi xin đề xuất sơ đồ tiến hành nghiên cứu như sau:
Hình 1.1: Sơ đồ nghiên cứu
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 4
Tổng hợp biên tập tài liệu
Phân tích các nghiên cứu liên quan
Tiến hành thử nghiệm các phương phápTrao đổi ý kiến với giáo viên hướng dẫn
Phân tích ưu điểm – khuyết điểm của các phương pháp
Chọn phương pháp tối ưu, tiến hành chọn lọc probiotic
Đưa ra kết quả nghiên cứu
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
1.4.2. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thò biểu diễn.
Sử dụng phần mềm Statgraphics xử lý số liệu thô, tính giá trò trung bình, độ
lệch chuẩn, vè đồ thò tương quan.
1.5. Ý nghóa khoa học và thực tiễn
Tìm hiểu về các phương pháp đánh giá khả năng kháng vi sinh vật chỉ thò
của các vi khuẩn lên men lactic.
Tạo tiền đề cho các nghiên cứu liên quan sau này tại phòng thí nghiệm.
Góp phần chọn lọc được chủng vi khuẩn lên men lactic có hoạt tính
probiotic.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 5
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Chương 2: Tổng Quan Tài Liệu
2.1. Tổng quan về Probiotics
2.1.1. Giới thiệu sơ lược về probiotic
2.1.1.1. Giới thiệu chung
Việc sử dụng các vi khuẩn lactic như thức ăn bổ sung đã xuất hiện từ lâu
khi con người biết đến sữa lên men. Việt nghiên cứu được bắt đầu từ

Metchnikoff làm việc ở viện Pasteur Paris. Ông ta cho rằng vi sinh vật trong
ruột có ảnh hưởng xấu tới sức khỏe vật nuôi và những ảnh hưởng xấu này có
thể được cải thiện bởi việc sử dụn sữa chua. Ông đã trích dẫn các quan sát về
nông dân Bungari sử dụng số lượng lớn sữa chua và có tuổi thọ rất cao. Ông
phân lập được hệ sinh vật từ sữa chua ông gọi là “Bulgarian bacillus” và sử
dụng chúng trong các thử nghiệm. Những sinh vật này được xác đònh và được
biết đến là Lactobacillus bulgaricus và ngày này được gọi là L. delbrueckii
subsp bulgaricus là một trong số sinh vật được sửdụng để lên men sữa và sản
xuất yoghurt. Sau khi Metchnikoff mất vào năm 1916, hoạt động nghiên cứu
này chuyển về USA. Được biết ở thời điểm đó người ta đã đề xuất việc sử dụng
các L. acidophilus và nhiều thử nghiệm đã được thực hiện với sinh vật này. [34]
Thuật ngữ probiotic vốn có nhiều đònh nghóa khác nhau, nó được sử dụng
lần đầu tiên năm 1965 (Lilly & Stillwell ) để mô tả một chất được tạo bởi một
protozoan để kích thích sự tăng trưởng của một sinh vật khác. Đến năm 1974,
Parker đã sử dụng để chỉ các chất bổ sung thức ăn động vật: là các sinh vật và
chất có tác động tích cực lên động vật bằng cách cân bằng vi sinh vật ruột.
Fuller (1989) đã đưa ra đònh nghóa rất gần với hiện nay là “ một bổ sung vi sinh
vật sống qua thức ăn có tác động tích cực lên ký chủ bằng cách cải thiện cân
bằng vi sinh vật đường ruột”. [33]
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 6
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Bảng 2.1: Một số sản phẩm sữa lên men có chứa đựng các vi khuẩn
probiotic (T. Mattila-Sandholm, M. Saarela, Probiotic functional foods)
Dạng sản
phẩm
Tên sản
phẩm
Công ty
Vi Khuẩn probiotic bổ

sung (10
7
-10
8
LAB/ml)
Nơi sản xuất
Yoghurt LC1 Nestle L. johnsonii LC-1
France,
Belgium,
Spain,
Switzerland,
Portugal,
Italy,
Germany,
UK
Yoghurt Gefilus Valio L. rhamnosus GG Finland
Yoghurt Vifit Mona L. rhamnosus GG
Netherlands,
Ireland
Yoghurt Vifit Sudmilch L. rhamnosus GG Germany
Yoghurt
drink
Yo-Plus
Waterfor
d Foods
L. acidophilus Ireland
Yoghurt Bio-Pot Onken Biogarde cultures Europe
Yoghurt LA7 Bauer L. acidophilus Germany
Fermented
milk drink

Yakult Yakult L. casei Shirota strain
Nertherlands,
UK,
Germany
Cultures
yoghurt-
style
product
Gaio
MD-
Foods
E. faecium Denmark
Yoghurt SNO
Dairygol
d
L. acidophilus Ireland
Yoghurt
Actimel
Cholester
ol
Control
Danone L. acidophilus Belgium
Fermented
milk drink
Actimel Danone L. casei Europe
Yoghurt Yoplait Waterfor
L. acidophilus
Ireland
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 7

Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
d-Foods
Fermented
milk drink
Bra-Mjolk Arla
Bifidus, L. reuterii, L.
acidophilus
Sweden
Fermented
milk drink
Fyos Nutricia L. casei Netherlands
Yoghurt
Symbalan
ce
Tonilait
L. reuterii, L. casei, L.
acidophilus
Switzerland
Yoghurt Shape St Ivel L. acidophilus Ireland, UK
2.1.1.2. Hiệu quả sử dụng probiotic
Đã có rất nhiều chế phẩm probiotic dành cho người hay cho vật nuôi được
đăng kí bảo hộ sáng chế. Hầu hết các sản phẩm này chứa Lactobacillus spp.
hoặc Streptococcus spp., một số chứa Bifidobacteria spp., Saccharomyces
boulardii, hay Bacillus subtilis. Ảnh hưởng của các chế phẩm probiotic có thể là
trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua sự điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột.
Những chế phẩm này có những hiệu quả sử dụng được biết tới như sau: [2], [3],
[5], [25], [32], [33]
 Có khả năng kháng ung thư và chống các yếu tố đột biến
 Kìm hãm vi sinh vật gây bệnh đường tiêu hóa
 Cải thiện việc sử dụng lactose ở những người không dung nạp

lactose
 Làm giảm Cholesterol trong huyết thanh
 Kích thích hệ thống miễn dòch
 Giảm nhiễm trùng đường niệu
 Tăng trọng (5%) ở gia cầm
 Giảm bệnh nhiễm trùng ở gia cầm
 Giảm tiêu chảy ở dộng vật non
 Giảm tác dụng phụ của chất kháng sinh
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 8
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Hiệu quả lâm sàng của một vài chủng probiotic được trình bày trong Bảng
dưới đây:
Bảng 2.2: Tác dụng lâm sàng của một số chủng probiotic [8], [15]
Chủng Tác dụng lâm sàng trên người
Lactibacillus rhamnosus GG
(ATCC 53103)
Giảm hoạt tính enzyme phân, giảm tiêu chảy
do kháng sinh ở trẻ em, điều trò và dự phòng
rotavirus và tiêu chảy cấp ở trẻ em, điều trò
tiêu chảy tái phát do Clostridium difficile,
kích thích miễn dòch, giảm nhẹ triệu chứng
viêm da không điển hình ở trẻ em
Lactobacillus johnsonii
(acidophilus) LJ-1 (La1)
Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tăng
cường miễn dòch, hỗ trợ điều trò Helicobacter
pylori
Bifidobacterium lactis Bb-12 Dự phòng tiêu chảy du lòch, điều trò tiêu chảy
do virus, kể cả rotavirus, cân bằng hệ vi sinh

vật đường ruột, cải thiện tình trạng táo bón,
kích thích hệ miễn dòch, giảm nhẹ triệu chứng
viêm da không điển hình ở trẻ em
Lactobacillus reuteri
(BioGaia Biologics)
Rút ngắn thời gian bò tiêu chảy do rotavirus ở
trẻ em, điều trò tiêu chảy cấp ở trẻ em, an
toàn và dung nạp tốt ở bệnh nhân trưởng
thành HIV dương tính
Lactobacillus casei Shirota Cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giảm
hoạt tính enzyme phân, có tác động tích cực
đối với ung thư mặt bàng quang và ung thư cổ
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 9
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
tử cung, không ảnh hưởng tới hệ miễn dòch
của người khỏe mạnh
Lactobacillus plantarum
DSM9843 (299v)
Cân bằng hệ bi sinh vật đường ruột, tăng hàm
lượng acid béo mạch ngắn trong phân
Saccharomyces boulardii
Dự phòng tiêu chảy do kháng sinh, điều trò
viêm ruột kết do Clostridium difficile, dự
phòng tiêu chảy ở bệnh nhân sử dụng dinh
dưỡng qua ống
Chủng trong sữa chua
(Streptococcus thermophilus
hay L. delbrueckii subsp
bulgaricus

Không có tác dụng trên tiêu chảy do
rotavirus, không có hiệu ứng tăng cường miễn
dòch khi bò tiêu chảy do rotavirus, không có
tác dụng lên hoạt tính enzyme phân
Vào cuối năm những năm 1940 có hai nghiên cứu phát triển về hệ vi sinh
vật đường ruột này. Đầu tiên, thấy rằng thuốc kháng sinh bổ sung trong thức ăn
đã thúc đẩy tăng trưởng của vật nuôi. Mong muốn khám phá cơ chế này đã ảnh
hưởng tới việc tăng cường nghiên cứu về thành phần của hệ vi sinh vật đường
ruột này và cách thức mà nó tác động lên vật chủ. Thứ hai, càng ngày càng có
nhiều vật nuôi bò bệnh, cung cấp cho những thí nghiệm để khám phá hệ sv trong
đường ruột bởi những vật chủ có sẵn. Và cuối cùng cho thấy rằng L. acidophilus
không là vi khuẩn lactobacillus duy nhất có trong ruột non mà có nhiều sinh vật
khác cần được nghiên cứu để sử dụng làm probiotics. Những nghiên cứu tiếp
sau đó cho thấy có khoảng 10
14
vi sinh vật thuộc khoảng 400 loài khác nhau tồn
tại ở trong ruột (Moore & Holdemann 1974), chính vì vậy việc nghiên cứu về
những sinh vật có thể sử dụng làm probiotic ngày càng được mở rộng. [30]
Sau nhiều nghiên cứu, người ta đã tổng kết lại được rất nhiều sinh vật có
thể sử dụng làm probiotic. Điều này sẽ được trình bày ở mục tiếp theo.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 10
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
2.1.1.3. Các thành phần của Probiotics
Bảng 2.3: Những vi sinh vật được xem như là probiotic (Holzapfel et al. 2001) [5]
Lactobacillus Bifidobacteriu
m
Other lactic acid
Bacteria
Non-lactic acid

bacteria
L. acidophilus
L. amylovorus
L. casei
L. cripatus
L. delbrueckii
subsp.Bulgaricus
L. gallinarum
L. gasseri
L. johnsonii
L. paracasei
L. plantarum
L. reuteri
L. rhamnosus
B.
adolescentis
B. animalis
B. bifidum
B. breve
B. infantis
B. lactis
B. Longum
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Lactococcus lactis
Leuconostoc mesenteroides
Pediococcus acidolactici
Streptococcus thermophilus
Sporolactobacillus inulinus
Bacillus cereus var. Toyoi

Escherichia coli Nissle 1917
Propionibacterium freudenreichii
Saccharomyces cerevisiae
Saccheromyces boulardii
2.1.1.4. Tiêu chí chọn lọc chủng probiotic [2], [3], [33], [34]
Các sinh vật được lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng được các tiêu chuẩn
như:
 Tiêu chuẩn về an toàn
 Tiêu chuẩn về đặc điểm và chức năng
Đã có nhiều nghiên cứu, nhiều thông tin về những tiêu chuẩn dành cho
probiotic, ta có thể tổng kết lại như sau:
 Khía cạnh an toàn của probiotic bao gồm những điểm cụ thể sau:
• Có đònh danh chính xác
• Những chủng sử dụng cho người tốt nhất là có nguồn gốc từ người
• Được phân lập từ đường tiêu hóa của người khỏe mạnh
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 11
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
• Được chứng minh là không có khả năng gây bệnh
• Không liên quan tới bệnh tật
• Không gây khử liên hợp muối mật
• Đặc điểm di truyền ổn đònh
• Không mang các gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được
Tính an toàn của các chủng probiotic là điều được quan tâm hàng đầu. Có
một số phương thức giúp tiến hành đánh giá tính an toàn của probiotic như:
nghiên cứu trên các đặc tính của chủng probiotic, nghiên cứu về dược động học
của chủng probiotic, nghiên cứu các tác động qua lại giữa probiotic và vật chủ.
Các probiotic thường thuộc nhóm vi sinh vật GRAS (Generally Regarded As
Safe)
Bảng 2.4: Vi sinh vật probiotics và tính an toàn của chúng [2], [15]

Vi sinh vật Khả năng lây nhiễm
Lactobacillus
Không gây bệnh, đôi khi gây nhiễm trùng cơ hội ở
các bệnh nhân suy giảm miễn dòch (AIDS)
Lactococcus Không gây bệnh
Streptococcus
Gây bệnh cơ hội, có S. thermophilus được sử dụng
trong các sản phẩm sữa
Enterococcus
Gây bệnh cơ hội, một vài chủng có khả năng kháng
kháng sinh
Bacillus Chỉ có Bacillus subtilis được sử dụng làm probiotics
Bifidobacterium
Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở
người
Propionobacterium Có tiềm năng trong việc sử dụng làm probiotic
Saccheromyces
Phần lớn không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng ở
người
Phần lớn những vi sinh vật sử dụng làm probiotic cho người đều phải đạt
những yêu cầu khắc khe như đã nêu trên. Còn đối với vật nuôi ta có thể nới
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 12
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
lỏng những yêu cầu này, tùy thuộc vào từng loại vật nuôi và tính an toàn khi sử
dụng của nó.
 Trước khi một probiotic có thể mang lại những lợi ích trên sức
khỏe con người chúng thường phải có những đặc điểm sau: [2], [4], [23]
• Chủng vi sinh vật phải có những đặc điểm phù hợp với công nghệ
để có thể đưa vào sản xuất. dễ nuôi cấy.

• Có khả năng sống và không bò biến đổi chức năng khi đưa vào sản
phẩm.
• Không gây các mùi vò khó chòu cho sản phẩm.
• Các vi khuẩn sống phải đi đến được nơi tác động của chúng. Để tồn
tại được nó phải có đặc tính sau:
Có khả năng dung nạp với acid (chòu pH thấp ở dạ dày) và dòch vò
của người.
Có khả năng dung nạp với muối mật (là đặc tính rất quan trọng để
probiotic có thể sống sót được khi đi qua ruột non).
• Có khả năng bám dính và niêm mạc đường tiêu hóa vật chủ.
• Có khả năng sinh các enzyme hoặc các sản phẩm cuối cùng mà vật
chủ có thể sử dụng.
• Có khả năng kích thích miễn dòch nhưng không có tác động gây
viêm.
• Có khả năng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên, có hoạt tính đối
kháng với các vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt là sinh vật gây bệnh đường ruột.
• Sản xuất các chất kháng vi sinh vật ( ví dụ như bacteriocin,
hydrogen peroxide, acid hữu cơ).
• Có khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 13
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Sau đây là một số chức năng quan trọng của những chủng được sử dụng
làm probiotic
 Khả năng bám dính [1], [2], [10]
Khả năng bám vào bề mặt và sau đó là phát triển trong đường tiêu hóa
người được xem là điều kiện tiên quyết quyết đònh chức năng của probiotic.
Những vi khuẩn có khả năng bám dính vào bề mặt ruột sẽ tồn tại lâu hơn và do
đó có điều kiện để biểu hiện những tác động điều hòa miễn dòch hơn là những
chủng không có khả năng nám dính

Khả năng bám dính sẽ tạo nên một mối tương tác giữa probiotic và bề mặt
niêm mạc ruột là nơi chứa các tế bào lympho, điều này sẽ kích thích tính miễn
dòch tại chỗ và toàn bộ cơ thể. Do đó người ta cho rằng chỉ có những chủng
probiotic có khả năng bám dính mới tạo được hiệu quả cảm ứng miễn dòch và
làm ổn đònh hàng rào bảo vệ niêm mạc ruột.
Sự bám dính của probiotic cũng tạo nên khả năng cạnh tranh gắn kết vào
biểu mô ruột, giữa những vi khuẩn gây bệnh và probiotic. Qua một số thử
nghiệm, đều cho thấy Lactobacillus acidophilus còn sống hay đã chết do nhiệt
đều có khả năng ức chế sự bám dính của các vi khuẩn gây bệnh.
Trong thử nghiệm về khả năng bám dính của probiotic người ta thường
kiểm tra trên những dòng tế bào ung thư trực tràng như HT-29 và Caco-2. Hai
dòng tế bào này được biệt hóa thành tế bào ruột, được sử dụng như là một mô
hình cho biểu mô ruột non. Những thử nghiệm này cho ta biết được sự khác biệt
về khả năng bám dính của những chủng probiotic khác nhau.
Ngoài sử dụng hai dòng tế bào trên, người ta còn có thể nghiên cứu bằng
kỹ thuật sinh thiết, bằng cách sinh thiết một mẫu mô sau một thời gian sử dụng
probiotic. Kỹ thuật này được xem là cho kết quả chính xác nhất về khả năng
bám dính của probiotic. Tuy nhiên vẫn còn gặp nhiều hạn chế trong vấn đề về
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 14
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
đạo đức của việc lấy mô, đòi hỏi người thực hiện có chuyên môn cao, và có thể
mắc sai số.
 Khả năng điều hòa miễn dòch [1], [2]
Những cải thiện hệ miễn dòch bởi probiotic có thể được trình bày theo 3
cách sau:
1. Tăng cường hoạt động của đại thực bào, nâng cao khả năng thực bào của
sv hay hạt carbon
2. Tăng khả năng sản xuất kháng thể thường là loại IgG và IgM và
interferon (nhân tố kháng virus không đặc hiệu)

3. Tăng cường khả năng đònh vò kháng thể trên bề mặt ruột, thường là IgA
 Khả năng chống lại các yếu tố gây bệnh [2], [5]
Để có thể tác động lên hệ sinh thái vi khuẩn đường ruột thì điều khá quan
trọng đó là probiotic phải có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh bằng
cách tiết ra các kháng sinh hay là những chất cạnh tranh.
Vi khuẩn probiotic tạo ra các chất đa dạng mà ức chế cả vi khuẩn Gram
dương và Gram âm. Những hợp chất này có thể làm giảm không chỉ những sinh
vật mang mầm bệnh có thể sống được mà còn ảnh hưởng đến sự trao đổi chất
của vi khuẩn và sự tạo ra các độc tố.
Qua nghiên cứu cho thấy các kháng sinh và chất cạnh tranh thường thấy ở
các chủng probiotic là:
• Bacteriocin
• Hydrogen peroxide
• Acid hữu cơ (acid lactic, acid acetic )
• Diacetyl…
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 15
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Cơ chế tác động: cạnh tranh với các nguồn bệnh để ngăn chặn sự bám dính
vào đường ruột, cạnh tranh dinh dưỡng cần thiết cho sự sống sót của mầm bệnh,
tác động kháng độc tố.
 Khả năng chống đột biến và các yếu tố gây ung thư [2], [5], [18]
Trong nhiều năm qua, có những nghiên cứu cho thấy vi sinh vật trong thực
phẩm hay trong hệ sinh thái ruột có khả năng chống đột biến và chống lại các
yếu tố gây ung thư. Cơ ché này được nghiên cứu và kết luận như sau:
Nhờ sự gắn kết và phân hủy các chất gây ung thư
Sản xuất các hợp chất kháng ung thư
Điều hòa những enzyme tiền chất gây ung thư ruột, như các enzyme phân
(nitroreductase, β-glucuronidase ) có khả năng chuyển các chất tiền sinh ung
thư thánh chất gây ung thư trong trực tràng

Ức chế khối u bằng một cơ chế đáp ứng miễn dòch
Những vấn đề vẫn còn giới hạn trong mô hình in vitro hay in vivo, việc mở
rộng ra trên người để dự phòng ung thư còn đang là vấn đề còn nhiều tranh cãi.
2.1.2. Qui trình chọn lọc các chủng Probiotic
Quá trình chọn lọc chủng probiotic xây dựng theo hình 2.2 và 2.3 được trình
bày sau đây:
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 16
Tuyển chọn và xác đònh chủng dựa trên kiểu hình và
kiểu gen
Tên chi, loài, ký hiệu chủng
Đăng ký trong bảo tàng giống quốc tế nào?
Xác đònh chức năng
In vitro
Trên động vật
Dánh giá độ an toàn
In vitro và trên động vật
Trên người: pha 1
Pha 2: Thử nghiệm mù kép ngẫu
nhiên gồm nhóm thử nghiệm và nhóm
đối chứng uống thuốc vờ (DBPC) để
xác đònh tính công hiệu của chủng
hoặc sản phẩm
Tốt nhất nên thử nghiệm
DBPC độc lập lần 2 để
khẳng đònh kết quả
Dán nhãn
Tên chi, loài, ký hiệu chủng
Số lượng tối thiểu vi khuẩn sống
Điều kiện bảo quản thích hợp

Thông tin liên hệ với khách hàng
PROBIOTIC
Pha 3: Kiểm nghiệm mức độ hiệu quả trên người
So sánh hiệu quả điều trò 1 bệnh đặc trưng bằng
probiotic với phương pháp điều trò thông thường.
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Hình 2.1: Sơ đồ hướng dẫn của FAO và WHO trong tuyển chọn Probiobic
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 17
Phân lập các
dòng vi khuẩn
Sàng lọc in
vitro
Sàng lọc in vivo
quy mô nhỏ
Kiểm tra khả năng gây bệnh
đối với vật chủ
Không đạt
OK
?
Đạt
Đạt
Thử nghiệm in vivo
quy mô pilot
OK
?
Khả năng gây bệnh đối với
điều kiện nuôi (nếu cần)
OK
?

OK
?
Loại
bỏ
PROBIOTIC
Đạt
Đạt
Không đạt
Không đạt
Không đạt
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Hình 2.2 : Sơ đồ tuyển chọn các vi sinh vật dùng làm Probiotic
2.1.3. Các tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật
Probiotics
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 18
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Các tiêu chuẩn để đánh giá hoạt tính của vi sinh vật Probiotics đều dự trên
cơ sở sự ức chế tăng trường vi sinh vật chỉ thò của các chủng probiotic, được khái
quát như sau:
Hình 2.3: Sơ đồ khái quát hóa tiêu chuẩn đánh giá hoạt tính của vi sinh vật
Các chỉ tiêu và phương pháp trên sẽ được giới thiệu kó hơn ở phần tiếp
theo.
2.1.3.1. Khả năng bám dính (Adhesion assay) [9], [24], [41]
Nguyên tắc: dựa trên mối quan hệ tương tác giữa probiotic và bề mặt niêm
mạc ruột là nơi chứa các tế bào lympho. Ngoài ra sự bám dính của probiotic tạo
nên khả năng cạnh tranh gắn kết vào biểu mô ruột giữavi khuẩn gây bệnh và
probiotic.
Tế bào Caco2 ở nội tạng thường được sử dụng trong nghiên cứu in vitro
dựa trên hệ thống tế bào bám dính của Lactobacilli không gêy bệnh. Chuỗi tế

bào này được sử dụng để kiểm tra hện thống tế bào bám dính và sự xâm nhập
của các vi sinh vật chỉ thò
Tế bào Caco2 được nuôi cấy tăng sinh khối tế bào trong Eagle’s minimum
essential medium (MEM). Hỗn hợp chứa vi khuẩn khoảng 10
8
tb/ml và 240µl
MEM được sử dụng để ủ với tế bào Caco2. Sau khi nuôi ủ, sinh khối tế bào
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 19
Probiotics
Sự
bám
dính
Chòu
acid dạ
dày
Kháng
vi sinh
vật
Chòu
được
muối
mật
Thử
nghiệm
in vivo
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
được nhuộm với dung dòch màu Giema. Lúc này quan sát được các tế bào
Lactobacilli bám chặt trên tế bào Caco2 dưới kính hiển vi độ phòng đại 100.
Hình 2.4: Minh họa các vi khuẩn probiotic bám dính lên bề mặt ruột tác

động đối kháng với các vi khuẩn gây bệnh [47]
2.1.3.2. Khả năng chòu acid dạ dày [24], [41]
Nguyên tắc: pH của dạ dày và ruột thường thấp do các acid gây ra như
oxalic acid, butylic acid, folic acid Chính vì vậy các vi khuẩn probiotic cần
phải chòu được điều kiện pH thấp, hay là dung nạp được với acid trong dạ dày
và ruột thì mới có thể phát huy được tác dụng probiotic của mình.
Để kiểm tra khả năng này, người ta nuôi cấy các vi khuẩn probiotic trên
môi trường MRS với điều kiện pH là 2.5 và đối chứng trên MRS thông thường.
Sau đó quan sát mật độ vi sinh vật ở bước sóng 600nm. Tiếp tục so sánh sự sống
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 20
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
sót dưới điều kiện này ở các mốc thời gian, từ 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và
24h.
2.1.3.3. Khả năng chòu được muối mật [24], [41]
Có loại muối mật: glycochalat Natri và Taruocholat Natri. Muối mật có
chức năng quan trọng trong việc tiêu hóa và hấp thu lipid ở ruột non kéo
theo sự hấp thu các vi ta min tan trong lipid như A, D, E, K. Khi xuống đến
hồi tràng, 95% muối mật được tái hấp thu rồi theo theo tính mạch của trở về
gan và được tái bài tiết, gọi là chu trình ruột gan. Còn lại 5% muối mật
được đào thải theo phân có tác dụng giữ nước trong phân và duy trì nhu
động ruột già. Chính vì khả năng này mà khả năng chòu được muối mật
cũng là một điều kiện để đánh giá hoạt tính của probiotic, đòi hỏi các vi
khuẩn probiotic không gây ảnh hưởng gì tới lượng muối mật ở trong ruột.
Để kiểm tra khả năng này, tương tự như kiểm tra khả năng chòu pH thấp,
cũng dùng môi trường MRS có bổ sung 0.3% muối mật và đối chứng trên MRS
thông thường. Sau đó so sánh mật độ tế bào vi khuẩn ở bước sóng 600µnm.
2.1.3.4. Khả năng kháng vi sinh vật
Điển hình về nghiên cứu khả năng kháng vi sinh vật của probiotic đó chính
là nghiên cứu của Schillinger và Lucke [28]. Sau này phát triển thêm nhiều

nghiên cứu mới, tuy nhiên tất cả những nghiên cứu từ trước tới giờ đều dựa trên
khả năng sinh kháng sinh hay các chất cạnh tranh để ngăn chặn sự phát triển
của các vi sinh vật gây bệnh.
Hình 2.5 sẽ cho thấy sơ đồ khái quát hóa về các phương pháp đánh giá
hoạt tính kháng vi vinh vật dựa trên dạng vật liệu khác nhau.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 21
Turbidometric
assay method
well
diffusion
assay
Spot
on
lawn
Disc
diffusion
assay
Agar
spot
test
Dùng sản phẩm
thô (dòch nuôi
cấy)
Sản phẩm đã qua
tinh chế (dòch nuôi
cấy ly tâm loại bỏ
tế bào)
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Hình 2.5: Sơ đồ khái quát hóa các phương pháp in vitro trong kiểm tra đánh giá

hoạt tính kháng vi sinh vật của probiotic.
Sau đây là giới thiệu chi tiết hơn về các phương pháp giới thiệu tại bảng 2.5
Bảng 2.5: Các phương pháp kiểm tra khả năng kháng vi sinh vật
Phương pháp
Nguyên tắc sử
dụng
Cách thực hiện
Turbidometric
assay method
(Đo độ đục) [16],
[31]
Ức chế tăng
trưởng vi khuẩn
chỉ thò bằng các
sản phẩm trao đổi
chất của vi khuẩn
Probiotic
Trong môi trường lỏng(1). Cho dòch ly
tâm môi trường(2) nuôi cấy LAB vào
môi trường phát triển của vi khuẩn chỉ
thò. Sau 21h đo OD ở bước sóng
600nm, so sánh % với ống đối chứng
không sử dụng dòch ly tâm trên.
Disc diffusion
assay
(khuếch tán qua
vòng giấy lọc)
[7], [11], [19],
[31]
Như trên Trên môi trường agar(3). Thấm giấy

vào dòch ly tâm môi trường (2) nuôi
cấy LAB. Đặt giấy thấm lên bề mặt
môi trường agar đã trải vi khuẩn chỉ
thò trước đó. Ủ qua đêm, kiểm tra
vùøng kháng khuẩn.
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 22
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
Well diffusion
assay
(khuếch tán qua
giếng thạch) [12],
[19], [20], [25],
[41]
Như trên Trên môi trường agar (3). Trải vi
khuẩn chỉ thò, đục lỗ đường kính 8mm.
Cho dòch ly tâm môi trường(2) nuôi
cấy LAB. Ủ qua đêm, kiểm tra vùøng
kháng khuẩn
Đấu tranh trực
tiếp của Probiotic
với vi khuẩn chỉ
thò
Giống như trên. Tuy nhiên sử dụng
trực tiếp dòch nuôi cấy LAB. Ủ qua
đêm, kiểm tra vùøng kháng khuẩn
Spot on lawn
[12], [11], [31],
Đấu tranh trực
tiếp của Probiotic

với vi khuẩn chỉ
thò
Trên môi trường agar (4). Nhỏ dòch
chứa tế bào LAB, cố đònh bằng 1 giọt
môi trường (5). Đổ hỗn hợp vi khuẩn
chỉ thò với 7ml môi trường (5) lên, để
đông, được hai mặt kẹp của hai môi
trường (4) và (5). Ủ qua đêm, kiểm tra
vùøng kháng khuẩn.
Agar spot test
(khuếch tán trên
bề mặt thạch)
[27], [19], [5]
Đấu tranh trực
tiếp của Probiotic
với vi khuẩn chỉ
thò.
Trên môi trường agar (3). Trải vi
khuẩn chỉ thò, nhỏ giọt môi trường (2)
nuôi cấy LAB. Ủ qua đêm, kiểm tra
vùøng kháng khuẩn.
Giải thích thêm:
Môi trường (1) BHI Broth
Môi trường (2) MRS Broth
Môi trường (3) BHI Agar 2%
Môi trường (4) MRS Agar 2%
Môi trường (5) BHI Agar 0,7%
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 23
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

Kiểm tra vùng kháng khuẩn là đo vòng trong suốt không có sự phát triển
của vi khuẩn chỉ thò.
Agar spot test
Well diffusion assay
Disc diffusion assay
Spot on lawn
Hình 2.6: Minh họa các phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng vi sinh vật [19]
2.1.3.5. Thử nghiệm in vivo [10], [41]
Đây là khâu quan trọng trong quá trình hình thành nên một chế phẩm
Probiotic. Vì nó thể hiện được tính an toàn của sản phẩm cũng như là vấn đề về
đạo đức. Một chế phẩm probiotic trước khi trở thành thành phẩm để sản xuất và
tiêu thụ, phải trải qua công đoạn thử nghiệm in vivo nhằm kiểm tra ảnh hưởng
của chế phẩm lên cơ thể tiếp nhận. Tức là kiểm tra độc tính hay những biến đổi
xấu lên cơ thể tiếp nhận khi sử dụng chế phẩm này. Qui trình kiểm tra này có
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 24
Đồ án tốt nghiệp khóa 05- Khoa MT & CNSH GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương
thể bắt đầu với thử nghiệm in vivo trên chuột hoặc thỏ, sau đó mới được thử
nghiệm trực tiếp trên cơ thể tiếp nhận như gia súc gia cầm với chế phẩm trong
chăn nuôi Đặc biệt nếu là chế phẩm dành cho người thì việc thử nghiệm càng
phải gắt gao và đòi hỏi tính chính xác, tính an toàn cao.
2.1.4. Ứng dụng Probiotics trong chăn nuôi [1], [3]
Phương pháp chăn nuôi hiện đại trong đó bao gồm các điều kiện và chế độ
ăn gây ra stress và có thể gây ra những thay đổi trong thành phần của hệ vi sinh
vật mà làm cho vật nuôi giảm sự đề kháng đối với bệnh tật.
Probiotic được bổ sung vào thức ăn để tăng cường tốc độ tăng trưởng của
vật nuôi và cải thiện sức khỏe của chúng bằng cách tăng sự đề kháng. Mục đích
của phương pháp tiếp cận probiotic là để cân bằng lại hệ vi sinh vật và phục hồi
sức đề kháng của động vật. Sự điều trò như vậy không đưa bất cứ hóa chất vào
bên trong cơ thể động vật. Giảm nguy cơ nhiễm bệnh và không đưa hóa chất

độc hại vào trong chuỗi thức ăn.
Nó được giả đònh rằng probiotic đã tác dụng đến cả vùng dạ dày và tác
dụng lên bệnh tiêu chảy và các bệnh nhiễm trùng khác. Tuy nhiên, gần đây có
những nghiên cứu tại một số quốc gia khác nhau đã chỉ ra rằng các tác động này
có thể được tổng quát hơn. Các kết quả thu được đã chứng tỏ rằng một số vi
khuẩn được sử dụng trong probiotic (lactobacilli) có khả năng kích thích hệ
miễn dòch. Điều này được đặt ra hoàn toàn mới đối với những ảnh hưởng của
probiotics đã biết, trong đó nó có thể tác động tới tình hình bệnh dòch về đường
ruột, cũng như phòng chống các bệnh về đường ruột.
Probiotic hiện nay đã thay thế các hóa chất tăng trưởng vẫn thường quảng
bá cho các nông trại chăn nuôi và sự yêu cầu tăng khả năng kháng bệnh cũng
được thực hiện. Yêu cầu về lợi ích mà probiotic mang lại trong chăn nuôi gia
súc như sau:
SVTH: Đỗ Quê Mi Hương
MSSV: 105111016 Trang 25