Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS để sản xuất chế phẩm PROBITICS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA MÔI TRƯỜNG & CÔNG NGHỆ SINH HỌC
------------o0o-----------

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề Tài:

TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI
KHUẨN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ĐỂ
SẢN XUẤT CHẾ PHẨM PROBIOTICS
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ NGÀNH:

111

GVHD: TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
SVTH: NGUYỄN HOÀNG ÂN
MSSV: 105111004
LỚP:

05DSH

TP. Hồ Chí Minh, Tháng 6 năm 2009


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp ngoài nổ lực bản thân còn có sự giúp đỡ
của quý thầy cô và các bạn trong lớp.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
TS. Nguyễn Hoài Hương là người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những

kiến thức, kinh nghiệm q báo trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp.
Thầy cô khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học đã trang bị cho tôi
những kiến thức quý báo trong suốt thời gian học tập 4 năm tại nhà trường
Thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hòan
thành tốt đồ án tốt nghiệp.
Tất cả các bạn sinh viên lớp 05DSH đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
làm đồ án.
Lời cảm tạ cuối cùng xin được giành gia đình. Con xin cảm ơn ba mẹ. Ba mẹ luôn
là điểm tựa vững chắc, là niềm động viên và tạo điều kiện cho con có ngày hôm
nay.


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

CHƯƠNG 1 - MỞ ĐẦU
Probitics là những vi sinh vật sống có ảnh hưởng tốt đến vật chủ bằng cách
giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Vi khuẩn probiotics giúp hoàn thiện hệ
tiêu hóa, kháng các vi khuẩn gây bệnh thông qua các chất kháng khuẩn ( acid,
bacteriocins, H2O2), tăng cường hệ thống miễn dịch, giảm cholesterol trong máu,
khắc phục hiện tượng không tiêu hóa đường lactose có trong sữa, giảm tiêu
chảy.... Đặc biệt vi khuẩn probiotics không gây hại cho vật chủ.
Hiện nay probiotics được ứng dụng rộng rãi trong các thực phẩm, dược
phẩm, trong chăn nuôi. Sử dụng probiotics trong dược phẩm và chăn nuôi có thể
hạn chế được việc sử dụng kháng sinh, giảm tác động đến sức khỏe con người.
Phần lớn các chế phẩm probiotics là vi khuẩn lactic được phân lập từ hệ đường
ruột của người và động vật và được xem là an toàn: L. acidophilus, L. casei...
Môi trường MRS là môi trường chuẩn để phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
lacitc để thu sinh khối, nhưng nếu sử dụng môi trường này thì giá thành sản phẩm

cao, kết quả chế phẩm tạo thành giá rất cao.
Đề tài :” Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi khuẩn Lactobacillus
acidophilus để sản xuất chế phẩm probiotics ”. Với mục đích tận dụng các nguồn
nguyên liệu rẻ tiền để thay thế cho môi trường MRS trong sản xuất sinh khối vi
khuẩn lactic nói chung và L. acidophilus nói riêng.
Nội dung nghiên cứu của đề tài:
 Khảo sát chọn nguồn cacbon thay thế glucose trong môi trường lên men.
 Tối ưu hóa môi trường cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn L.
acidophillus
 So sánh động học nuôi cấy L. acidophilus trên môi trường MRS và môi
trường tối ưu

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 1


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

 So sánh khả năng ức chế vi sinh vật chỉ thị (E. coli) của dịch nuôi cấy L.
acidophilus trong môi trường MRS và dịch chiết dứa tối ưu.

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 2


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

CHƯƠNG 2 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.. Probiotics
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu Probiotics
Vào những năm đầu của thế kỷ 19, những nghiên cứu đầu tiên về sự tương
tác của vi sinh vật với cơ thể vật chủ đã bị phủ nhận. Đến đầu 1885, Escherich
đã miêu tả về sự hình thành hệ vi sinh vật trong ruột của trẻ em và nêu ra những
lợi ích của chúng trong tiêu hoá. Doderlein khẳng định rằng sự có lợi của vi
khuẩn trong âm đạo bằng cách sản xuất ra acid lactic, nó có thể ngăn chặn hoặc
ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh. Các vi khuẩn sản xuất acid lactic
trong quá trình trao đổi chất mà tiêu biểu là nhóm vi khuẩn lên men lactic đã
được sử dụng kết hợp với các sản phẩm lên men sữa. Cuốn sách Prolongation of
Life của Metschnikoff đã đưa ra những lợi ích của vi khuẩn lactic đến sức khoẻ
của con người khi con người sử dụng những sản phẩm sữa kết hợp với các vi
khuẩn lactic. Ông cho rằng người Cap-ca có thể sống lâu là do họ đã sử dụng một
lượng lớn các sản phẩm sữa lên men [19].
Henry Tissier là một bác só khoa nhi ở Pháp kiểm tra phân của những trẻ em
bị tiêu chảy và thấy rằng chỉ chứa một lượng ít các vi khuẩn “bifi”. Trong khi đó
vi khuẩn này lại tồn tại một lượng lớn trong phân của các trẻ em có sức khoẻ tốt.
Ông cho rằng vi khuẩn này có thể giúp bệnh nhân hồi phục lại bệnh.[45]
Năm 1900, Tissier cho rằng Bifidobacteria và một số nhóm vi khuẩn khác sản
sinh acid lactic nhưng chủ yếu là vi khuẩn lactic có tác dụng tốt đối với sức khoẻ
[19].
Năm 1917, trước khi Alexander Fleming khám phá ra ampicilin, giáo sư
Alfred Nissle người Đức đã phân lập ra một chủng thuộc loài E. coli không gây
bệnh từ phân của các chiến binh trong chiến tranh thế giới thứ nhất và ông đặt
tên chủng này là Nissle 1917. Các chiến binh này bị bệnh viêm ruột kết và chủng
SVTH: Nguyễn Hoàng AÂn

Trang 3


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

vi khuẩn Nissle 1917 được sử dụng như là probiotics để trị bệnh cho các chiến só
[46].
2.1.2. Định nghóa Probiotics
Probiotics là thuật ngữ có nguồn gốc từ Hy Lạp bao gồm có hai từ: “pro”
có ý nghóa là vì, “biosis” có nghóa là sự sống. Probiotics được định nghóa đầu tiên
là do Parker(1974): “ những sinh vật và các chất mà giúp cân bằng hệ sinh vật
đường ruột”. Nhưng 1989, Fuller đã định nghóa lại Probiotics:” những vi sinh vật
sống bổ sung vào thức ăn mà chúng có tác động tốt đến sức khoẻ của động vật
chủ bằng cách tạo cân bằng hệ sinh vật đường ruột” [17]. Bifidobacteria và
lactobacilli là chi được sử dụng rộng rãi nhất. Nấm men (Saccharomyces
cerevisiae), một vài chủng E. coli và Bacilllus spp cũng được sử dụng như một
probiotics [46].
Havenaar và Huis Int Veld, 1992 định nghóa:” probiotics là một hoặc sự
kết hợp của các vi sinh vật sống, ảnh hưởng có lợi đến vật chủ, hoàn thiện hệ vi
sinh vật đường ruột [26].
Theo viện khoa học quốc tế ( International Life Sciences Institute), nhóm
làm việc tại châu Âu (1998) định nghóa probiotics: “ là vi sinh vật sống bổ sung
vào thức ăn tác động có lợi đến vật chủ” [26].
Theo tổ chức thực phẩm, nông nghiệp và sức khỏe thế giới “ probiotics là
những vi sinh vật sống, khi mà sử dụng một lượng đầy đủ như là thức ăn, sẽ mang
lại sức khỏe tốt cho vật chủ ”û [25].
Theo FAO:” Những vi sinh vật khi sử dụng với một lượng đủ sẽ tác động

có lợi đến vật chủ”. Hầu hết probiotics là vi khuẩn, sinh vật đơn bào [49].
2.1.3. Cơ chế tác động của probiotics
Sự tương tác lẫn nhau bình thường của hệ vi sinh đường ruột là một trong
các yếu tố quan trọng đảm bảo sức khỏe của vật chủ, sự tương tác này bị gián
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 4


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

đoạn có thể dẫn đến một số bệnh lý do mất cân bằng hệ vi sinh đường ruột làm
tăng nhanh số lượng vi khuẩn gây bệnh. Probiotics được chứng minh là có khả
năng chống lại một số tác nhân gây bệnh như Escherichia coli, Salmonella,
Listeria monocytogenes, Helicobacter pylori, và rotavirus. Cơ chế tác động của
probiotics như sau:
2.1.3.1. Sinh tổng hợp ra các chất kháng khuẩn : bao gồm bacteriocins,
acid hữu cơ, và hydrogen peroxide .
Bacteriocins là một chất kháng khuẩn, được chia làm 4 lớp:


Lớp thứ nhất là những phân tử peptid nhỏ (< 5 kDa)



Lớp thứ hai là những phân tử peptid nhỏ (< 10 kDa), thường là những

phân tử peptid hoạt động ở màng tế bào.



Lớp thứ 3 là những phân tử protein lớn (>30 kDa), bền về nhiệt, gồm

các enzyme ngoại bào


Lớp thứ tư là những bacteriocins phức tạp, ngoài protein còn có các

thành phần khác như lipid và cacbohyrate [35].
Bacteriocins được sản xuất bởi vi khuẩn lactic, khi tiến hành phân tích gen
cuả các vi khuẩn lactobacilus gồm L. plantarum, L. acidophilus NCFM, L.
johnsonii NCC 533, vaø L. sakei đều thấy chúng là các loài có khả năng sinh
bacteriocins và chúng thường độc đối vi khuẩn gram dương như

Lactococcus,

Streptococcus, Staphylococcus, Listeria, và Mycobacteria. Cơ chế hoạt động cơ
bản của bacteriocins chủ yếu tạo nên những lỗ trên màng tế bào chất và sau đó
enzyme được tiết ra gây trở ngại cho quá trình trao đồi chất của vi khuẩn gây
bệnh. Một vài vi khuẩn thuộc chi Bifidobacteria cũng có khả năng sản xuất ra
bacteriocins gây độc cho cả vi khuẩn gram âm và gram dương. Đặc biệt probiotics
còn kích thích các tế bào biểu mô ruột sản xuất ra các chất kháng khuẩn [25].

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 5


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

Acid hữu cơ cũng có tác dụng ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh,
được sản xuất bởi vi khuẩn lactic như acetic, lactic, acid propionic làm pH môi
trường hạ thấp xuống ảnh hưởng đến pH nội bào của vi khuẩn gây bệnh. Một vài
vi khuẩn chi Lactobacillus ngăn chặn sự phát triển của Salmonella enterica bằng
cách sản xuất ra acid lactic [25].
Hydrogen Peroxide cũng là chất kháng khuẩn, một vài vi khuẩn
Lactobacillus trong cơ quan âm đạo phụ nữ được tìm thấy chúng có khả năng sản
sinh ra hydrogen peroxide ngăn cản sự phát triển vi khuẩn gây bệnh gonococci
trong cơ quan sinh dục nữ. Ngoài ra vi khuẩn Lactobacillus còn ngăn chặn sự phát
triển của Gardnerella vaginalis khi có sự kết hợp của hydrogen peroxide, lactic
acid, và bacteriocins [25].
2.1.3.2. Cạnh tranh vị trí gắn kết
Khả năng gắn kết trên biểu mô ruột là một yếu tố quan trọng cho vi sinh vật
cư trú trên ruột, và cũng chính là giai đoạn đầu của q trình xâm nhiễm. Probiotics
trong hệ tiêu hóa có chức năng ngăn chặn khả năng bám dính của tác nhân gây
bệnh và giảm lượng chất độc của chúng trên biểu mô ruột. Một vài vi khuẩn
Lactobacilli và Bifidobacteria có khả năng cạnh tranh vị trí với vi khuẩn gây bệnh
bao gồm S. enterica, Yersinia enterocolitica và bám dính trên tế bào biểu mô
ruột. Một vài trường hợp, vi khuẩn probiotics có thể chiếm cả vị trí gắn kết của vi
khuẩn gây bệnh ngay cả khi những vi khuẩn gây bệnh này đã bám chặt trên tế
bào biểu mô nếu được xử lý với probiotics [25]. Lactobacillus GG và
Lactobacillus plantarum 299V cạnh tranh vị trí bám với Escherichia coli 0157H7
và HT-29, Lactobacilli fermentum RC-14 cạnh tranh vị trí bám dính với
Staphylococcus aureus do đó làm giảm sự bám dính của các tác nhân gây bệnh
[25].

SVTH: Nguyễn Hoàng AÂn

Trang 6


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

Ngoài ra probiotics còn có các cơ chế khác tác động lên các vi khuẩn gây
bệnh. Vi khuẩn probiotics như Treptococcus thermophilus và Lactobacillus
acidophilus enha hoạt hóa tạo ra protein bịt kín vùng bị tổn thương của ruột. Thứ
hai, các vi khuẩn probiotics khác như Lactobacillus rhamnosus GG có khả năng
ngăn ngừa bệnh viêm ruột và các tế bào chết bám trên biểu mô ruột. Cuối cùng
là chức năng ngăn chặn, lactobacillus được chứng minh rằng là chủng có khả
năng làm giảm độ thẩm thấu vào màng nhầy, hạn chế được sự xâm nhập của vi
sinh vật có kích thước nhỏ ở chuột [26].
Sinh tổng hợp chất nhày là một trong những cơ chế chống lại các tác nhân
gây bệnh, chất nhầy sẽ cô lập, bất hoạt vi sinh vật gây bệnh. MUC2 và MUC3 là
hai mRNA làm tăng kích thích sản sinh ra chất nhầy, bảo vệ tế bào biểu mô
chống lại sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh. Lactobacillus plantarum 299v được
chứng minh rằng có khả năng làm giảm tác động của E. coli trên tế bào biểu mô
ruột.
2.1.3.3. Cạnh tranh nguồn dinh dưỡng
Probiotics còn có khả năng cạnh tranh các chất dinh dưỡng với các vi sinh
vật gây bệnh. Bất kỳ vi sinh vật nào cũng cần có nguồn dinh dữơng để phát triển,
chẳng hạn sự phát triển vi khuẩn probiotics sử dụng đường đơn (glucose, fructose)
làm giảm sự phát triển của Clostridium difficile (sử dụng đường đơn ) [26].
Sắt là yếu tố quan trọng đối với tất cả các tế bào sống ngoại trừ
Lactobacillus plantarum và Borrelia burgdorferi, nó cần thiết trong các quá trình
sinh hóa trong tế bào và có thể gây độc ở ngưỡng cao. Sự hấp thu và lưu trữ sắt

được điều chỉnh bởi tế bào [19]. Siderophore lá chất có khối lượng phân tử thấp,
có khả năng gắn kết các ion sắt. Siderophore có thề hòa tan sắt tủa thành dạng dễ
sử dụng cho vi sinh vật. Do đó tận ứng yếu tố này, có thể chọn các vi sinh vật vô
hại có khả năng sản xuất siderophore làm vi khuẩn probiotic, nó sẽ cạnh tranh ion
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 7


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

sắt với vi khuẩn gây bệnh [9]. Bifidobacteria có khả năng sản sinh siderophore và
cạnh tranh ion sắt trong ruột già như E. coli [19].
Ngoài ra probiotics còn tác động đến hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn
gây độc, quorum sensing có liên quan đến quá trình điều hòa các nhân tố gây độc
của vi khuẩn đặc biệt là Virio. Vi khuẩn probiotics sẽ phá vỡ hệ thống này, đây
cũng là một biện pháp mới để chống lại các vi khuẩn gây bệnh trong thủy sản.
2.1.3.4. Kích thích miễn dịch
Mặc dù cơ chế vẫn chưa được sáng tỏ, việc sử dụng probiotics có tác dụng
làm tăng dáp ứng miễn dịch, nhất là miễn dịch tự nhiên. Spanhaak et al thí
nghiệm sử dụng Lactobacillus casei Shirota ở 20 người đàn ông. Những ngừơi
đàn ông này được ăn theo chế độ trong 8 tuần, 10 người đàn ông được uống sữa
lên men bổ sung 1x1012 cfu/ml Lactobacillus casei Shirota, 10 người còn lại uống
sữa lên men. Kết quả làm tăng đáp ứng miễn dịch ở 10 người sử dụng sữa chua
có bổ sung Lactobacillus casei Shirota [27]. Nhiều chủng Lactobacillus có khả
năng hoạt hóa đại thực bào, kích thích hình thành bạch cầu trung tính, kích thích
tế bèo tua (dendrit) làm tăng khả năng tổng hợp IgA và interferon gamma.
2.1.4. Vi sinh vật probiotics:

2.1.4.1.Vi khuẩn lactic:
Lactobacillus : Hầu hết các vi sinh vật probiotics đều là các vi khuẩn sản
sinh ra acid lactic. Từ xưa con người đã biết cách sử dụng các vi khuẩn có lợi bổ
sung vào các sản phẩm lên men, chủ yếu thuộc loài L. casein và một vài chủng L.
acidophilus. Cách đây khoảng 40 năm và 30 năm ở Đức vi khuẩn lactic đã được
ứng dụng bổ sung vào trong các sản phẩm sữa lên men. Hai loài “Lactobacillus
acidophilus” và “Bifidobacterium bifidum” được giới thiệu rất phổ biến ở Đức
vào cuối 1960 trong các sản phẩm bơ sữa bởi vì nó có thể giúp ổn định vi khuẩn
đường ruột và tạo một cảm giác chua nhẹ gây cảm hứng cho người tiêu dùng
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 8


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

trong các sản phẩm sữa chua. Ở Đức sản phẩm có tên thương mại là “mild
yogurts” hoặc “bio-yogurts“. Ở Mỹ sữa acidophilus lại được phát triển và điều
quan trọng đối với các loài này là phải được chứng minh là an toàn với người sử
dụng. L. casei/paracasei, L. rhamnosus, L. acidophilus, và L. johnsonii đây là
những loài được sử dụng nhiều nhất và đã được chứng minh là an toàn cho người
sử dụng [19].
Lactobacillus có khoảng 60 loài bao gồm L. acidophilus, L. plantarum, L.
casei, và L. rhamnosus…. Cách đây hơn 100 năm con người đã sử dụng các vi
khuẩn Lactobacillus bổ sung vào thực phẩm nhằm tăng thời gian bảo quản, tăng
vị ngon, tạo ra các cấu trúc khác nhau trong thực phẩm. Hương vị của sản phẩm là
do các sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus. Chẳng hạn acetaldehyde có
trong yogurt, diacety có trong có trong các sản phẩm sữa lên men [19].

Khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh của lactobacillus đã được nghiên
cứu trong điều kiện in vitro, đặc biệt khả năng bám dính và cạnh tranh vị trí bám
dính của lactobacillus với các vi khuẩn gây bệnh. Coconnier et al, chứng minh
được L. acidophilus ngăn cản sự bám dính của E. coli O157:H7, Salmonella
enterica, Yersinia pseudotuberculosis và Listeria monocytogenes trên tế bào Caco2 cells. Tương tự như vậy, Forestier et al. cũng chứng minh được khả năng ngăn
cản bám dính của L. casei và L. rhamnosus Lcr35 đối với E. coli và Klebsiella
pneumoniae trên tế bào Caco-2 cells. Ngoài cớ chế cản trở sự bám dính của vi
khuẩn gây bệnh thì Lactobacillus còn ức chê vi khuẩn gây bệnh bằng sinh acid
làm pH môi trường giảm xuống và bacteriocins. Theo nghiên cứu của Vescovo et
al, ông tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của năm chủng L. casei trên
Aeromonas hydrophila, L. monoytogenes, S. typhimurium,và S. aureus trong điều
kiện invitro. Tuy nhiên ở nghiên cứu này, L. casei IMPCLC34 là chủng có tác
động mạnh nhất đối với Aeromonas hydrophila, S. typhimurium, và S. aureus, tuy
SVTH: Nguyễn Hoàng AÂn

Trang 9


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

nhiên nó không có tác động kháng đối với L. monocytogenes. Nhưng ngược lại
Lactobacillus spp phân lập từ gà lại có khả năng kháng lại Campylobacter spp
trong điều kiện invitro [19].
Dựa vào khả năng sinh bacteriocins của Lactobacillus, mà Lactobacillus
được sử dụng rất nhiều trong các sản phẩm rau quả, thịt, và cá lên men. Khả năng
sinh bacteriocins của lactobacillus được khám phá vào 1975, và nhiều loại
bacteriocins khác đã được biết đến. Hiện nay lactobacillus được ứng dụng rộng
rãi trong các sản phẩm cá, bơ sữa, và thịt trong vấn đề bảo quản và nâng cao chất

lượng sản phẩm. Hầu hết các chủng sinh bacteriocins đều đã được biết, như
Lactocin 705 bởi L. casei CRL705 khaùng S. aureus, L. monocytogenes, S. pyogenes,
Acidocin CH5 bởi L. acidophilus CH5 kháng vi khuẩn gram âm, acidophilin 801
bởi L. acidophilus IBB 801 kháng một số vi khuẩn gram âm và gram dương… [19].
Bifidobacteria: Vi khuẩn Bifidobacteria được phát hiện đầu tiên bởi Henry
Tissier (1899, 1900) khi ông nghiên cứu vi sinh vật trong phân của những đứa trẻ.
Lúc ban đầu Tissier xếp nó vào chi Bacillus, nhưng đến năm 1924 xếp nó vào chi
Bifidobacteria sau khi quan sát thấy những đặc điểm khác nhau về mặt hình thái
học và cấu tạo vách tế bào so với chi bacillus. Chúng hình roi, không di chuyển,
không sinh bào tử, kị khí bắt buột. Trong cơ thể người có khoảng 500 vi khuẩn,
trong đó Bifidobacteria là một trong những vi khuẩn chiếm số lượng đáng kể trong
ruột. Mười loài khác nhau của Bifidobacteria đã được phân lặp từ cơ thể người.
Trong số các loài đó là B. longum, B. bifidum, và B. infantis đã được biết đến.
Bifidobacteria cũng như lactobacillus có khả năng kháng lại các vi khuẩn gây
bệnh bằng acid lactic và acetic và các chất kháng khuẩn như bacteriocins. Một số
vi khuẩn Bifidobacteria được sử dụng như thuốc kháng khuẩn trong điều kiện in
vitro và in vivo với Salmonella, Shigella, Clostridium, Bacillus cereus,
Staphylococcus aureus, Candida albicans, và Campylobacter jejuni. Một nghiên
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 10


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

cứu thực tiễn cho thấy B. bifidum có khả năng kháng Shigella dysenteriae trong
điều kiện in vitro [19].
Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về khả năng kháng các vi khuẩn gây

bệnh và vi khuẩn gây hỏng thức ăn. Trong đó, Gagnon et al thử khả năng kháng
của năm loài thuộc chi bifidobacterial đối với E. coli O157:H7 trong invitro, và
kết quả hai trong năm lòai thể hiện khả năng kháng E. coli O157:H7. O’Riordan
và Fitzgerald sàng lọc được 22 vi khuẩn Bifidobacterium và trong đó có 12 loài có
khả năng kháng vi khuẩn gram âm và gram dương, bao gồm Pseuedomonas spp.,
Salmonella spp, E. coli,…. Trong nghiên cứu của Gibson and Wang về khả năng
kháng của 8 vi khuẩn bifidobacteria trong điều kiện invitro với Listeria
monocytogene, Clostridium perfringens, Salmonella spp, vibrio cholerae, và E.
coli, hầu hết E. coli và C. perfringens bị tiêu diệt bởi B. infantis va øB. Longum.
bifidobacterial còn được ứng dụng bổ sung vào thức ăn cho những đứa bé gớp
phần làm giảm tỷ lệ mắc bệnh tiêu chảy và tiêu chảy cấp do rotavirus do với
những đứa trẻ bình thường [19].
Không giống với Lactobacillus, bifidobacteria rất hạn chế về các tài liệu về
bacteriocins. Bifidin là một bacteriocins được sinh ra từ B. bifidum NCDC 1452 có
khả năng kháng rất nhiều vi khuẩn : E. coli, Bacillus cereus, Staphylococcus
aureus, Micrococcus flavus, và Pseudomonas fluorescens [19].
2.1.4.2.Nấm men:
Lactobacillus, Bifidobacterium được sử dụng rộng rãi nhất trong các sản
phẩm probiotics, tuy nhiên nấm men cũng được sử dụng như một probiotics. Theo
nghiên cứu của H. Kumura, Y. Tanoue, M. Tsukahara, T. Tanaka, và K.
Shimazaki kiểm tra hoạt tính probiotic của tám loài nấm :Debaryomyces
occidentalis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces lodderae, Kluyveromyces

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 11


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

marxianus, Saccharomyces cerevisiae, và Yarrowia lipolytic được phân lập từ kefir
[21].
Saccharomyces boulardii tác dụng trị tiêu chảy ở trẻ nhỏ. Theo bác só
Karpa S. boulardii có khả năng sinh enzyme khử độc tố của C. difficile.
Saccharomyces boulardii, khác với lactobacilli hoặc bifidobacteria nó không tạo
hệ vi sinh trong ruột người mà nó chỉ tồn tại một hoặc hai tuần trong ruột. Chúng
ngăn chặn các tác nhân gây bệnh và sau đó ra khỏi ruột, đồng thời giúp
lactobacilli và bifibacteria phát triển nhanh [55]. Theo kết quả nghiên cứu của
McFarland và Bernasconi Saccharomyces boulardii phát triển tốt nhất ở 37 0C và
có thể sống sót khi trãi qua hệ tiêu hóa của người và động vật. S. boulardii có
khả năng ức chế sự phát triển của nấm Candida albicans [19].
Hiện nay các sản phẩm probiotics trên thị trường chủ yếu sử dụng
Lactobacillus và bifidobacteria. Probiotics có thể chỉ là chế phẩm chi tồn tại một
lòai hoặc có sự kêt hợp với các loài khác nhö Bacillus cereus, B. clausii, B.
pumilis, Escherichia coli (Nissle), Propionibacterium freudenreichii, P. jensenii, P.
acidopropionici, P. thoenii, vaø Saccharomyces boulardii. Ngoaøi ra nấm men cũng
được sử dụng như một probiotics bổ sung vào thức ăn cho vật nuôi. Có khoảng
65% các sản phẩm sữa probiotics được bán trên thị trường châu Âu, trong khi đó ở
Nhật thì có khoảng 70% trong các loại thực phẩm bán trên thị trường. Ở Mỹ,
Canada, Châu Âu người ta sử dụng kết hợp nhiều chi khác nhau để trị các bệnh
trên lợn và gia cầm: Bifidobacterium. Lactobacillus, Streptococcus, Bacillus,
Bacteroides, Pediococcus, Leuconostoc vaø Propionibacterium (Lloyd-Evans,
1989; Tobey, 1992). Nhưng ở Nhật và một số nước phía Đông sử dụng thêm
chủng Clostridium với tên thương mại là Broilact và Aviguard sử dụng để phòng
bệnh nhiễm Salmonella ở gia cầm.
2.1.5. Các tiêu chuẩn chọn vi khuẩn probiotics:
SVTH: Nguyễn Hoàng AÂn

Trang 12


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

Các vi sinh vật dùng làm probiotics phải đảm bảo các đặc điểm sau:
- Không gây bệnh, khi sử dụng nó sẽ có tác động tốt đối với vật chủ
- Có khả năng tồn tại khi đi xuyên qua dạ dày ( dịch tiêu hoá, dịch acid, dịch
mật)
- Có khả năng bám đính tốt trên niêm mạc ruột của đường tiêu hoá vật chủ
- Sản xuất các kháng sinh chống lại các mầm bệnh: acid, bacteriocin, H 2O2….
- Duy trì tốt khả năng sống trong quá trình sản xuất, bảo quản và sử dụng
- Có khả năng bám dính vào niêm mạc đường tiêu hoá vật chủ
- Dễ nuôi cấy
- Kích thích hoạt động của gen kháng và sinh ra chất chống ung thư.
- Tăng cường khả năng hấp thụ lactose
- Giảm huyết áp của những người bị chứng cao huyết áp.
- Ngăn ngừa và giảm mức độ gây bệnh tiêu chảy
- n định cấu trúc gen trong quá trình tạo chế phẩm
2.1.6. Ứng dụng của probiotics
2.1.6.1. Trong thực phẩm và dược phẩm
Trong cơ thể người tồn tại khoảng 1014 tế bào vi sinh vật với sự đa dạng
của các loài, có khoảng 400 loài. Các vi sinh vật tồn tại trong đường ruột tác động
qua lại giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột. Sự tồn tại của các vi sinh vật trong
hệ tiêu hoá còn phụ thuộc vào chế độ dinh dưỡng trong cơ thể. Trong cơ thể luôn
tồn tại các vi khuẩn cơ hội, khi gặp điểu kiện thuận lợi nó sẽ phát triển đủ số
lượng và gây độc cho cơ thể.
Vi khuẩn probiotics được rộng rãi trong các sản phẩm khác nhau trên khắp

thế giới, chúng được bổ sung vào thực phẩm, tạo ra các chế phẩm thuốc và bổ
sung vào thức ăn cho vật nuôi.

SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 13


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

Thực phẩm probiotics là thực phẩm chứa các vi khuẩn sống có lợi và
không ảnh hưởng đến sức khỏe của con người. Chẳng hạn, trong các sản phẩm
sữa lên men bổ sung Lactobacillus acidophilus có thể giúp cho những người
không có khả năng hấp thu sữa có thể hấp thụ tốt hơn. Một số thực phẩm
probiotics như là phomat, sữa chua, kifer, dưa cải, giấm… [50]
Thực phẩm probiotics hiện nay được bán rất phổ biển ở Mỹ phần lớn là
yogurt. Yogurt được làm từ sữa kết hợp với các loài Streptococcus thermophilus
và Lactobacillus acidophilus hoặc Lactobacillus bulgaricus. Sữa có nguồn gốc từ
bò, dê, cừu….
Kefir cũng là một sản phẩm lên men, có thể được làm từ nhiều nguồn gốc
khác nhau: sữa bò, sữa cừu, sữa dê. Ngoài ra có thể làm từ sữa đậu nành, sữa gạo
và nước dừa. Khi chọn được vi khuẩn probiotics thích hợp sẽ cấy vào sữa, những
loài có thể dùng là Lactobacillus kefiri, một số chi Leuconostoc, Lactococcus
Thức uống probiotics được giới thiệu đầu tiên vào 2007 bởi New Food,
được khám phá bởi Steve Demos, đây là loại đồ uống chứa Lactobacillus
plantarum 299v.
Ngoài ra còn nhiều sản phẩm lên men khác mang tính chất truyền thống:
món dưa cải bắp ở Đức, kim chi ở Hàn quốc, choucroute ở pháp[51]

Probiotics được sử dụng như một loại thuốc chữa bệnh, hiện nay trên thị
trường ngoài các sản phẩm đa dạng về probiotics ở dạng thực phẩm, còn có các
dạng viên nén, dạng dịch, dạng bột dùng điều trị một số bệnh đường tiêu hóa:
- Tiêu chảy do kháng sinh: khoảng 20% người dùng thuốc kháng sinh,
đặc biệt là Clindamycine, Cephalosporine, Penicilline bị mắc bệnh tiêu chảy.
Nguyên nhân là do kháng sinh sẽ giết các vi sinh vật đường ruột làm mất cân
bằng hệ vi sinh đường ruột. Clotridium difficle và Kelbsiela oxytoca là hai tác
nhân gây bệnh chính, khi hệ vi sinh đường ruột ổn định chúng vẫn tồn tại với số
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 14


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

lượng ít trong ruột, khi mất cân bằng thì chúng tăng lên nhanh và giải phóng độc
tố là A và B gây bệnh tiêu chảy và viêm ruột. Có nhiều nghiên cứu sử dụng
probiotics để chữa bệnh tiêu chảy do kháng sinh và kết quả cho thấy S. boulardii,
Lactobacillus rhamnosus GG, Enterococcus faecium SF68 có tác dụng tốt. Chúng
làm giảm đáng kể thời gian phục hồi khi mắc bệnh [39]. Một nghiên cứu sử dụng
L. acidophilus để trị bệnh tiêu chảy do sử dụng thuốc kháng sinh erythromycin,
nghiên cứu này tiến hành trên 16 người, một nữa cho sử dụng 125ml sữa chua
chứa L. acidophilus mỗi ngày, nữa nhóm còn lại cho sử dụng sữa chua không có
L. acidophilus. Kết quả nghiên cứu, nhóm sử dụng sữa chua có chứa L.
acidophilus bệnh hồi phục trong 2 ngày, nhóm còn lại 8 ngày [27].
- Tiêu chảy cấp : Nguyên nhân do rotavirus, chủ yếu ở trẻ em ở các nước
đang phát triển. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng Lactobacillus. rhamnosus
GG, Bifidobacterium bifidum và Streptococcus thermophilus làm giảm lượng

rotavirus trong hệ tiêu hóa [39]. Một nghiên cứu điều trị tiêu chảy cấp tính trẻ em
ở châu Á, cho thấy rằng khi sử dụng Lactobacillus rhamnosus GG có thể rút ngắn
một nữa thời gian chữa trị. Ở châu Âu, kết quả nghiên cứu sử dụng L. rhamnosus
đã bị bất hoạt bởi nhiệt cũng mang lại kết quả tương tự như L. rhamnosus sống [9]
. Bin và Boulloche đã thực hiện nghiên cứu sử dụng Lactocbacillus acidophilus
để điều trị tiêu chảy cấp ở trẻ em. Bin tiến hành nghiên cứu 50 trẻ en bị tiêu chảy
cấp ở Trung Quốc. Ông lấy ngẫu nhiên 30 người điều trị bằng cách sử dụng L.
acidophilus, còn 20 bé còn lại thì điều trị bằng phương pháp bình thường. Kết quả
cho thấy không có sự khác biệt giữa hai cách chữa trị, thời gian khỏi bệnh của hai
phương pháp chữa bệnh là như nhau. Nghiên cứu của Boulloche et al ở 103 bé
còn bú sữa mẹ và trẻ em bị tiêu chảy cấp sử dụng L. acidophilus đã bất hoạt bằng
cách sử dụng nhiệt. Kết quả cũng cho thấy không có sự khác biệt giữa hai nhóm
điều trị. Thời gian phục hồi bệnh như nhau [27].
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 15


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

- Viêm đường tiêu hóa: do nhiều tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, vi rút, kí
sinh trùng nhưng nguyên nhân chủ yếu là do nhiễm rotavirus và Helicobacter
pylori gây viêm loét và ung thư dạ dày. Chúng xâm nhập vào các tế bào ở đỉnh
nhung mao ruột, phá hủy nhung mao, làm mất khả năng hấp thụ các chất dinh
dưỡng. Do khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng kém, các chất cacbohydroxit tồn
động trong ruột, dẫn đến tiêu chảy và mất nứơc nghiêm trọng gây nguy hiểm
cho trẻ sơ sinh và trẻ dưới ba tuổi và trẻ suy dinh dưỡng [9].
- Ngừa ung thư: Một số thành viên của vi khuẩn đường ruột có khả năng

tiết ra các enzyme như glycosidase, azoreductase, nitroreductase và βglucoronidase, chúng sẽ hoạt hóa các chất tiền ung thư thành các chất ung thư
hoạt hóa. Những nghiên cứu trên người sử dụng L. acidophilus hoặc Lactobacillus
casei làm giảm đáng kể hoạt động của các enzyme trên [36].
- Giảm cholesterol: Cholesterol là một chất béo steroid, có ở màng tế bào
của tất cả các mô trong cơ thể, và được vận chuyển trong huyết tương của mọi
động vật. Khi lượng cholesterol trong máu cao sẽ gây ra một số bệnh tim mạch
như xơ vữa động mạch, huyết áp tăng, bệnh lý ở hệ thống mạch vành như nhồi
máu cơ tim, đột q. Trong cơ thể, cholesterol có 2 dạng mà y học gọi là LDL-C
có trọng lượng phân tử thấp (hay còn gọi là cholesterol có hại) và HDL-C có
trọng lượng phân tử cao(hay còn gọi là cholesterol có lợi). HDL vận chuyển
cholesterol đến các cơ quan, vì vậy nếu hàm lượng của HDL trong máu càng cao
thì càng giảm nguy cơ mắc bệnh mạch vành. Ngược lại LDL-C vận chuyển
cholesterol từ cơ quan đến mạch máu cho nên nếu nồng độ LDL-C trong máu cao
là có nguy cơ mắc bệnh cao. LDL-C luôn tạo ra các mảng xơ vữa trên thành các
động mạch nói chung và động mạch vành tim nói riêng. Các mảng xơ vữa này
làm cho lòng các động mạch vành bị chít hẹp hoặc có thể bít tắc, từ đó gây nên
tình trạng thiếu máu đến nuôi dưỡng tế bào cơ tim, gây ra các cơn đau thắt ngực
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 16


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

và nhồi máu cơ tim. Nghiên cứu của Gilliland SE, Nelson CR, Maxwell C trong
điều kiện in vitro vi khuẩn có thể làm giảm lượng colesterol trong môi trường
nuôi cấy. Một nghiên cứu của Lin et al. về khả năng làm giảm cholesterol trong
máu của Lactobacillus bulgaricus và Lactobacillus acidophilus. Ông tiến hành

trên 23 người cho sử dụng thuốc dạng viên nén chứa 3x10 7 CFU Lactobacillus
bulgaricus và Lactobacillus acidophilus trong 16 tuần, và 15 người không sử dụng
thuốc. Kết quả ở nhóm cho sử dụng thuốc thì hàm lượng cholesterol trong máu
giảm xuống từ 5.7 xuống 5.4 sau 16 tuần [27]. Nghiên cứu ở Ấn Độ, sử dụng sữa
trâu lên men bằng loài L. acidophilus làm giảm lượng cholesterol trong máu 12 20% sau một tháng sử dụng [27]. Hai nghiên cứu khác sử dụng E. faecium và S.
thermophilus, các nhà nghiên cứu tiến hành thử nghiệm trên 29 người đàn ông,
cho sử dụng sữa lên men chứa 10 8 - 1011 cfu/ml E. faecium và S. thermophilus và
28 người đàn ông sử dụng sữa bình thường. Kết quả cho thấy hàm lượng
cholesterol trong máu giảm 0.37 - 0.41 mmol/L sau 6 tuần sử dụng, nhóm sử dụng
sữa bình thường thì hàm lượng cholesterol không đổi. Sau đó tác giả tiến hành
nghiên cứu lần hai ở phậm vi rộng hơn, ông tiến hành tương tự ở 87 người đàn
ông và phụ nữ kết quả cho thấy hàm lượng cholesterol giảm nhiều sau 4 -12 tuần
và thí nghiệm cuối cùng 24 tuần và 30 tuần thì thấy không có sự thay đổi nhiều.
Ông đưa ra kết luận E. faecium có khả năng làm giảm Cholesterol trong máu
nhanh [27].
- Tăng cường khả năng tiêu hóa lactose và hoạt động của các enzyme
khác: Hiện tượng không có khả năng tiêu hóa lactose tìm thấy khắp trên thế giới
do cơ thể không có enzyme lactase thủy phân lactose. Enzyme này được giải
phóng khi vi khuẩn bị dung giải do tác dụng của acid mật [9]. Triệu chứng của
bệnh thường gây phìn bụng, đầy hơi, tiêu chảy. Theo kết quả nghiên cứu của
Rasstal et al 2000 vi khuẩn latobacii và bifidobacteria làm tăng enzyme lactase
SVTH: Nguyễn Hoàng AÂn

Trang 17


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

trong ruột non [17]. Ở trẻ sơ sinh thường mắc chứng kém tiêu hóa đường
saccarose, khắc phục bằng cách cho uống saccharomycess cerevisiae, trong nấm
men có chứa enzyme saccarase.
2.1.6.2. Nông nghiệp
2.1.6.2.1. Nuôi trồng thủy hải sản.
UN FAO ước tính tới năm 2020 một nữa lượng thủy sản cung cấp cho tòan
thế giới sẽ được cung cấp nhờ nuôi trồng thủy sản do các nguồn cá khai thác tự
nhiện bị khai thác quá mức. Ở Việt Nam nuôi trồng thủy sản cũng đang trên đà
phát triển, năm 2002 chính phủ đã quyết định thủy sản là ngành kinh tế ưu tiên,
trong đó nuôi tôm là ngành mũi nhọn nhằm tăng kinh ngạch xuất khẩu, chuyển
đổi cơ cấu kinh tế kém hiệu quả, giảm áp lực khai thác ven bờ, nâng cao việc sử
dụng đất và tạo việc làm cho người dân. Năm 2002 Việt Nam đã xuất khẩu trên 2
tỉ USD thủy sản, trong đó tôm chiếm 50% đứng hàng thứ 5 trên thế giới. Hiện nay
phổ biến nhất là nuôi tôm sú và cá ba sa, tuy nhiên hiện nay ngành nuôi trồng
thủy sản đang mắc phải khó khăn chủ yếu là dịch bệnh do vi khuẩn, virút, nấm,
ký sinh trùng gây ra. Khi phát hiện bệnh nông dân thường sử dụng kháng sinh đổ
xuống hồ hoặc bổ sung thêm vào thức ăn. Kháng sinh có thể điều trị tức thời đối
với các vi khuẩn gây bệnh, tuy nhiên khi sử dụng nhiều lần vi khuẩn sẽ trở nên
kháng thuốc ( khó trị hơn), mặc khác khi sử dụng thường xuyên sẽ để lại dư lượng
kháng sinh trong tôm, cá nuôi gây ảnh hưởng đến con người dẫn đến nguy cơ khó
dùng kháng sinh trị bệnh cho con ngươi và không thể nhập khẩu sang các nước
khác gây thiệt hại lớn. Nhiều nông dân sử dụng kháng sinh như một tác nhân
phòng bệnh ngay khi vật nuôi chưa phát bệnh.
Virút là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm, là mối đe dọa
hàng đầu đối với ngành nuôi trồng thủy sản. Hiện nay người ta phát hiện khoảng
20 virut gây bệnh trên tôm, hầu hết là thành viên họ Pavoviridae, Baculoviridae,
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 18

Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

Piconaviridae, Togaviridae cùng một số họ khác. Bệnh đầu vàng ở tôm được phát
hiện đầu tiên ở Thái vào 1990 tại một hồ nuôi tôm sú do Yellow Head Virus gây
ra. Bệnh đốm trắng do virut thuộc chủng Baculoviru được phát hiện đầu tiên tại
Đài Loan tỷ lệ chết rất cao có thể 100% sau 3 - 5 ngày nhiễm bệnh [8].
Vi khuẩn cũng là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đặc biệt là Virio làm tôm
chết rất nhanh. Ngoài ra nấm và kí sinh trùng cũng là tác nhân gây bệnh trên
tôm. Tôm thường nhiễm nấm là lagenidium calinectes và Sirolpidium spp ở giai
đọan ấu trùng nên tỷ lệ chết rất cao. Kí sinh trùng là động vật nguyên sinh có thể
lây nhiễm tất cả các giai đoạn phát triển của tôm như Zoothamnium, Epistylis,
Vorticella, anophrys, Acineta ssp, Lagenophrys, Ephelota là các tác nhân kí sinh
bên ngoài [8].
Ngoài yêu tố dịch bệnh Ngoài yếu tố dịch bệnh ô nhiễm môi trường nuôi
trồng cũng là vấn đề khó khăn. Với mục đích tăng sản lượng, người dân nuôi với
mật độ cao và không có biện pháp xử lý thích hợp gây hiện tượng thiếu oxy trong
ao dẫn đến tôm bị ngạt. Thức ăn dư thừa dẫn đến hiện tượng phú dưỡng hóa làm
tảo phát triển, các chất hữu cơ trong ao trích lũy ngày một tăng sẽ làm giảm
lượng oxy hòa tan. Lớp bùn lắng động lâu ngày tạo điều kiện cho các vi khuẩn kị
khí phát triển sinh khí H2S và CH4. Amoni tồn tại dưới dạng NH 3 hoặc NH4+ tùy
thuộc vào pH của môi trường. NH3 độc tính cao hơn NH4+ do NH3 không mang
điện tích dễ thấm qua màng tế bào mang cá và hòa tan tốt trong chất béo, NH 4+
có kích thước lớn hơn, mang điện và kết hợp với nước nên khó thấm qua tế bào
mang cá. Khi nồng độ NH3 cao tôm sẽ bị ngộ độc cấp tính và chết nhanh. Các
hợp chất chứa nitơ dạng oxy hóa gồm nitrite và nitrate khi vượt qua nồng độ
0.3mg/l sẽ gây ngộ độc cho tôm [9].
Cơ chế tác động của probiotics trong thủy sản: cạnh tranh vị trí gắn kết với

vi khuẩn, sản xuất ra các chất ức chế, cạnh tranh nguồn năng lượng, tăng cường
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 19


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng, nâng cao đáp ứng miễn dịch, can thiệp
vào hệ thống quorum sensing của vi khuẩn gây bệnh, nâng cao chất lượng nước
ao
Hiện nay có một số biện pháp khắc phục như dùng kháng sinh đổ trực tiếp
hoặc bổ sung vào thức ăn cho tôm, phương pháp này hiện nay không được chấp
nhân. Ở tôm hệ miễn dịch không đặc hiệu, nó không có khả năng ghi nhớ được
các bệnh nên sử dụng vacine một mặt không đạt được kết quả cao, mặc khác chi
phí cao, tốn nhiều thời gian. Do đó biện pháp tốt nhất là sử dụng probiotics trong
phòng và chữa bệnh ở tôm. Probiotics được dùng với nhiều hình thức như tiêm
trực tiếp, bom vào đường ruột, nhúng vào dung dịch probiotics, bổ sung vào thức
ăn. Phương pháp hữu hiệu nhất là nhúng tôm vào dung dich probiotics ( tôm ở
giai đoạn ấu trung hoặc bổ sung vào thức ăn hàng ngày cho tôm).
-

Vi khuẩn và nấm được sử dụng nhiều nhất có vai trò như probiotics.

Bacillus spp là vi khuẩn gram dương được sự dụng phổ biến trong cải tạo môi
trường nước trong các ao nuôi, chúng chuyển hóa các chất hữu cơ thành CO 2 và
sinh khối, giảm vi khuẩn gây beänh trong ao [40]. Một nghiên cứu của Watchariya
Purivirojkul, Nontawith Areechon, Prapansak Srisapoome và Monchan Maketon

phân lập Bacillus spp từ ruột của tôm gồm 3 chủng B. pumilus NW01, B.
sphaericus NW02 và B. subtilis NW03, sau đo sử dụng ba chủng trên kiểm tra khả
năng kháng với V. harveyi trong điều kiện in vitro với mật độ 102 CFU/ml, kết
quả lượng vi khuẩn V. harveyi từ mức 4.23x10 2 ở 0 giờ sau đó tăng 1.40±0.21 ×
10 7 cfu/ml ở 24 giờ rồi tiếp tục giảm 7.80±1.90 × 10 5 cfu/ml ở 120 giờ [31].
- Các vi khuẩn sinh acid lactic cũng được sử dụng rộng rãi, Gatesoupe(1991)
chứng minh được Lactobacillus giúp loài cá bơn phát triển nhanh [48]. Một thí
nghiệm khả năng kháng của vi khuẩn dị dưỡng đường tiêu hóa của cá hồi và cá
bơn với tác nhân gây bệnh là A. samodicida, kết quả cho thấy vi khuẩn tạo vòng
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 20


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

kháng và bao phủ lên A. samodicida [48]. J Brunt and B Austin tiến hành thí
nghiệm trên cá hồi, ông tiến hành phân lập vi khuẩn trong ruột cá hồi và test với
hai chủng Lactococcus garvieae 29-99 và Streptococcus iniae 00-318. Vi khuẩn
được phân lập trên môi trường MRS và định danh bằng sinh hoc phân tử, tên là
Aeromonas sobria GC2. Khi tiến hành test hai Aeromonas sobria GC2 với
Lactococcus garvieae 29-99 và Streptococcus iniae 00-318 kết quả cho thấy
Aeromonas sobria GC2 có khả năng kháng Lactococcus garvieae 29-99 và
Streptococcus iniae 00-318 ( là hai chủng gây bệnh chết ở cá hồi và được phân
lập Viện Nghiên Cứu Thủy Sản ). Sau đó tiến hành thực nghiệm, bổ sung thức ăn
cá hồi bị bệnh với liều lượng 5x10 -7 tế bào/ gam thức ăn, kết quả thiệt hại 75%
đến 100% khi không bổ sung probiotics vào thức ăn, nhóm điều trị thì thiệt hại từ
0- 6% [13]. Một nghiên cứu về khả năng sống sót của tôm Litopenaeus vannamei

sau khi bị nhiễm Virio harveyi, tác giả phân lập vi khuẩn lactic từ ruột tôm trưởng
thành tại trường đại học Santa Catarina, Brazil, chọn các khuẩn lạc hình cầu và
xác định hình thái bằng phương pháp nhuộm gram. Các vi khuẩn phân lập được
trãi trên môi trường MRS ủ 24h và 350C, sau đó đục lỗ thạch đường kính 1cm, V.
harveyi được trãi trên môi trường Marine Agar, đặt thạch lên ủ cùng môi trường
Marine Agar ủ 24h ở 300C. Kết quả cho thấy vòng kháng của hai chủng C2 và B6
có vòng phân giải lớn nhất là 8.0 ± 0.5mm và 6.0 ± 0.6 [13].Theo nghiên cứu của
Lara-Flores et al. (2003), ông sử dụng hai chủng probiotics là nấm (
Saccharomyces cerevisiae) bổ sung vào thức ăn cho cá bột Nile tilapia
(Oreochromis niloticus), kết quả nghiên cứu giảm tỷ lệ chết ở cá bột, cá tăng
trưởng nhanh hơn [15].
2.1.6.2.2. Chăn nuôi.
Sự phát triển của khoa học kỹ thuật, con người đã cải biến di truyền tăng
năng suất gia cầm. Khi điều này là tốt cho ngành chăn nuôi gia cầm, con người
SVTH: Nguyễn Hoàng AÂn

Trang 21


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

bắt đầu tăng mật độ nuôi, làm tăng nguy cơ nhiễm các bệnh nguy hiễm cho vật
nuôi, đặc biệt là vi khuẩn như E. coli, Salmone spp, Clostridium perfringens và
Campylobacter spp. Một thời gian rất dài con người đã sử kháng sinh trong điều
trị các loại bệnh này. Nhiều quốc gia đã nghiêm cấm sử dụng kháng sinh bởi vì
chúng sẽ tạo ra các vi khuẩn kháng thuốc sẽ khó chữa trị cho con người hơn khi bị
nhiễm. Do đó một biện pháp thay thế tốt nhất và kinh tế nhất là sử dụng các chế
phẩm probiotics bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi.

Probiotics được sử dụng trị các bệnh rối loạn hệ vi sinh đường ruột và tăng
khả năng thẩm thấu của ruột. Trong hệ tiêu hóa vi khuẩn di chuyển qua dạ dày
đến ruột non và bám chặt vào biểu mô, chúng giúp tăng tốc độ phát triển và khả
năng chuyển hóa thức ăn ở heo, gà và thú con. Probiotics giúp trung hòa lượng
độc tố trong ruột do E. coli gây ra ( đây là vi khuẩn gây bệnh chủ yếu ở heo).
Vi khuẩn probiotics cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh như
Clostridium perfringens, giảm khả năng hoạt động của vi khuẩn phân hủy urê,
tổng hợp vitamin, kích thích hệ thống miễn dịch, duy trì hệ vi sinh đường ruột,
hòan thiện hệ tiêu hóa [43].
Những sản phẩm probiotics đã được biệt đến rất nhiều qua các sản phẩm
sữa lên men và sản phẩm bơ sữa. Các sản phẩm probiotics được ứng dụng trong
chăn nuôi ở các nộng trại chỉ được giới thiệu cách nay khoảng hai thập niên với
mong đợi là giúp nâng cao hệ thống miễn dịch chống lại các tác nhân gây bệnh.
Việc sử dụng probiotics đã được quan tâm rất nhiều đặc biệt ở các quốc gia phát
triển như châu Âu đã ngăn cấm sử dụng kháng sinh ngăn ngừa và trị bệnh cho
động vật nuôi [43].
Gia cầm: Sản xuất gia cầm thu lãi rất cao, do lợi nhuận mà các chủ trang
trại không quan tâm đến sức khỏe con người mà sử dụng kháng sinh một cách
bừa bãi, do đó việc cấm sử dụng thưốc kháng sinh ở châu Âu vào ngày 1 tháng 1
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 22


Đồ án tốt nghiệp

GVHD: TS. Nguyễn Hoài Hương

năm 2006 ở các trang trại chăng nuôi gia cầm đã được ban hành. Một trong những
thành công của chế phẩm probiotics sử dụng trong chăn nuôi gia cầm là Bacillus

subtilis với tên thương mại là CloSTATM. Chế phẩm này giúp hoàn thiện khả năng
phát triển của vật nuôi. B. subtilis còn được biết đến có khả năng ngăn cản sự
phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong hệ tiêu hóa của gà. B. subtilis PB6,
Streptococcus pneumonia đã được chứng minh rằng có khả năng giết Clostridium
perfringens, Campylobacter jejuni,. Các chế phẫm của B. subtilis thường được
bảo quản ở các dạng viên nén. Các chế phẩm probiotics có thể chỉ chứa một loài
như Enterococcus faecium với tên thương mại là Protexin® , nhưng đồng thời cũng
có thể là sự kết hợp của

nhiều loài thuộc các chi như Lactobacillus,

Streptococcus, Enterococcus. Cơ chế bảo vệ của probiotics ở gia cầm chủ yếu
cạnh tranh vị trí bám dính với vi khuẩn gây bệnh. Sự bám dính của vi khuẩn
probiotics trên ruột của gia cầm là một trong những đặc điểm quan trọng cho việc
tuyển chọn các vi khuẩn probiotics. Các nghiên cứu được biết đến rộng rãi như vi
khuẩn latic, B. subtilis, Enterocuccus faecium là những loài có sức sống tốt nhất
trong hệ tiêu hóa của động vật. Nhiều tác động có lợi của probiotics như hoàn
thiện hệ thống miễn dịch, hòan thiện hệ vi sinh đường ruột, giảm các tác nhân
gây viêm, giảm lượng amoniac và urê thải ra, giảm lượng cholesterol, tăng khả
năng bám dính. Hiện nay có nhiều nghiên cứu xa hơn sử dụng probiotics nâng
cao khả năng phát triển và tăng chất lượng trứng gà [43]. Salmonella là tác nhân
chính gây bệnh thương hàn, phó thương hàn, bạch lỵ ở gia cầm, chúng thừơng tồn
tại trong đường tiêu hóa của gà và có thể gây bệnh cho con người qua thức ăn.
Nghiên cứu của J. Vicente, S. Higgins, L. Bielke, G. Tellez,D. Donoghue, A.
Donoghue, and B. Hargis ở gà tây bị nhiễm salmonela, tiến hành hai thí nghiệm
với bảy loài, chia làm hai nhóm: nhóm thứ nhất năm loài: :Escherichia coli,
Kluyvera ascorbata, Klebsiella travesanii, Lactobacillus casei, và Lactobacillu
SVTH: Nguyễn Hoàng Ân

Trang 23