Chương 8 Các quá trình lên men (Phần 3) ppt

Chương 8
Các quá trình lên men (Phần 3)
IV. Hiện tượng cộng dưỡng (syntrophy)
Trong vi sinh vật học có nhiều ví dụ về hiện tượng cộng dưỡng, một hiện
tượng mà hai sinh vật khác nhau có thể cùng nhau phân giải một chất nào đó
- và bảo toàn năng lượng của quá trình phân giải đến mức không cơ thể nào
trong hai cơ thể đó một mình có thể làm được.
Trong đa số trường hợp, bản chất của một phản ứng cộng dưỡng có liên
quan tới khí dihydro (H
2
) sinh ra bởi một trong hai đối tác và được tiêu thụ
bởi đối tác kia.
Do vậy, cho đến nay, cộng dưỡng cũng còn được gọi là sự chuyển H
2
liên loài. Kẻ tiêu thụ H
2
có thể là bất kỳ một cơ thể nào trong số các vi khuẩn
khử sunfat, lên men homoacetate, và vi khuẩn sinh methane. Hãy xem xét
trường hợp cộng dưỡng liên quan tới quá trình lên men ethanol thành acetate
và sự sản sinh methane sau đó. Như có thể thấy trên hình 2, bọn lên men
ethanol thực hiện một phản ứng không thuận lợi về mặt năng lượng tự do
(ΔG
o'
dương). Tuy nhiên, H
2
được sinh ra bởi đối tác lên men rượu lại là một
chất cho điện tử đầy giá trị đối với quá trình hình thành methane do một vi
khuẩn sinh methane thực hiện. Và khi cộng hai phản ứng lại thì phản ứng
tổng thể sẽ là một phản ứng toả nhiệt và có thể trợ giúp sinh trưởng của cả
hai đối tác trong hỗn hợp cộng dưỡng.
Lên men ethanol

2CH
3
CH
2
OH +
2H
2
O
→

4H
2
+ 2CH
3
COO
-
+2H
+

+19,4 kJ /phản
ứng
Sinh methane
4H
2
+ CO
2

→

CH

4
+ 2H
2
O
- 130,7 kJ/phản
ứng
Phản ứng cộng dưỡng
2CH
3
CH
2
OH +
CO
2

→

CH
4
+ 2CH
3
COO
-

- 111,3 kJ/phản
ứng
Một ví dụ khác của hiện tượng cộng dưỡng là sự oxi hóa butirat thành
acetate cộng với H
2
bởi vi khuẩn cộng dưỡng oxi hóa acid béo

Syntrophomonas:
Butirat
-
+ 2H
2
O → 2acetate
-
+ H
+
+ 2H
2
, ΔG
o'
= +48,2 kJ/phản ứng
Sự biến đổi năng lượng tự do của phản ứng này rất không thuận lợi và trong
ống giống thuần khiết, Syntrophomonas không thể mọc được trên butirat.
Song nếu H
2
vừa sinh ra trong phản ứng được tiêu thụ ngay bởi một cơ thể
đối tác (như một vi khuẩn sinh methane) thì Syntrophomonas lại sinh trưởng
rất tốt trong ống giống cấy chung với bọn tiêu thụ H
2
.
V. Lên men rượu nhờ nấm men và vi khuẩn
Ethanol là một trong số các sản phẩm lên men phổ biến nhất gặp ở vi sinh
vật. Bản thân thực vật và nhiều loài nấm cũng tích lũy ethanol dưới các điều
kiện kị khí. Vi sinh vật sản sinh ethanol chủ yếu là nấm men, đặc biệt là các
chủng thuộc loài Saccharomyces cerevisiae. Giống như đa số nấm, nấm men
là những cơ thể hô hấp hiếu khí, nhưng khi vắng mặt không khí chúng sẽ lên
men hiđrat cacbon thành ethanol và CO

2
. Nhiều vi khuẩn kị khí và hiếu khí
cũng tạo thành ethanol như các sản phẩm chính hoặc sản phẩm phụ khi lên
men các hexose hoặc pentose.
1. Sự tạo thành ethanol nhờ nấm men
Sự lên men glucose thành ethanol và CO
2
nhờ Saccharomyces cerevisiae
diễn ra theo con đường Embden-Meyerhof. Sự chuyển hóa piruvat thành
ethanol gồm hai bước. Trong bước một, piruvat được loại CO
2
thành
acetaldehit nhờ piruvat-đecacboxilase với sự tham gia của
tiaminpirophosphate. Trong bước sau, acetaldehit bị khử thành ethanol nhờ
alcohol-đedihydrogenase chứa NADH.
2Et 2CO2 2NAD2NADH 2 Piruvat 2 Acetaldehyt Glucose
Bằng sự chuyền H này, dihydro tách ra do triosephosphate-
dehydrogenase xúc tác sẽ được tiêu thụ, nhờ vậy trạng thái oxi hóa-khử sẽ
được cân bằng.
2. Các dạng phương trình Neuberg
Các phương pháp và phát hiện của Carl Neuberg về lên men rượu không chỉ
có ý nghĩa lịch sử. Ông đã khám phá ra rằng, không chỉ glucose mà cả
piruvat cũng được nấm men lên men và acetaldehit xuất hiện như một sản
phẩm trung gian có thể bị bắt giữ bởi dihydrosulfit. Dihydrosulfit vốn không
độc đối với nấm men. Nếu bổ sung dihydrosulfit vào một môi trường chứa
glucose đang được nấm men lên men thì acetaldehit sẽ bị kết tủa do tạo
thành phức chất :
CH
3
-CHO + NaHSO

3
→ CH
3
- CHOH -SO
3
Na
Lúc đó glycerin sẽ xuất hiện như một sản phẩm lên men mới, đồng thời hiệu
suất ethanol và CO
2
sẽ giảm xuống.
Lên men với sự có mặt của dihydrosulfit đã được sử dụng trong công nghiệp
để sản xuất glycerin. Nguyên lý của nó là, acetaldehit bị bắt giữ, và do vậy
không thể hoạt động như một chất nhận điện tử được nữa. Lúc này, thay cho
acetaldehit, dihydroxiacetonphosphate được sử dụng làm chất nhận điện tử
và bị khử thành glycerin-3-phosphate rồi tiếp tục bị loại phosphate để trở
thành glycerin. Phương trình phản ứng diễn ra như sau :
Glucose + Dihydrosulfit → Glycerin + Acetaldehit-sulfit + CO
2

Phương trình lên men cải biến này được gọi là dạng lên men Neuberg 2.
Khi bổ sung các chất kiềm (NaHCO
3
, Na
2
HPO
4
) thì glycerin cũng được tạo
thành vì acetaldehit bị chuyển thành ethanol và acetate qua phản ứng hóa
hai, và do vậy không còn hoàn thành được chức năng của một chất nhận
điện tử. Phương trình lên men có tên là dạng lên men Neuberg 3 và được

viết như sau :
Glucose + 2H
2
O → Ethanol + Acetate + 2Glycerin + 2CO
2

Dạng lên men thông thường được Neuberg gọi là dạng lên men 1.
3. Hiệu ứng Pasteur
Hiệu ứng Pasteur là sự ức chế lên men rượu (hay quá trình đường phân) bởi
oxi (tức là bởi hô hấp hiếu khí). Sự chuyển sang hô hấp không những làm
giảm sự tạo thành ethanol và CO
2
mà còn làm giảm sự hấp thụ đường. Có
hai cơ chế chịu trách nhiệm đối với hiện tượng này.
Một mặt, đó là sự cạnh tranh ADP và phosphate vô cơ giữa hai quá trình
phosphorin chuỗi hô hấp và phosphorin hóa cơ chất. Sự loại dihydro xảy ra
trong phản ứng oxi hóa glyceraldehyt-3-phosphate cần ADP và phosphate
vô cơ (P
vc
) :
Glyceraldehyt-3-phosphate + NAD + P
vc
→ 3-phosphoglicerate + NAD
H
+
ATP
Do vậy, sự chuyển hóa cơ chất (glucose) qua con đường EM phụ thuộc vào
sự có mặt của ADP và phosphate. Tuy nhiên, trong điều kiện hiếu khí, sự
phosphorin hóa chuỗi hô hấp cũng cạnh tranh ADP và phosphate để phát
sinh ATP. Lúc đó nồng độ nội bào của ADP và phosphate giảm, và hậu quả

là, sự chuyển hóa glucose và do vậy, sự tạo thành ethanol cũng sẽ giảm. Khi
dùng đinitrophenol (DNP) để làm bất hoạt phosphorin hóa chuỗi hô hấp,
ADP và phosphate lại trở nên có sẵn đối với phản ứng loại dihydro của
glyceraldehyt-3-phosphate, bởi vậy người ta thấy ngay trong điều kiện
thóang khí, sự tiêu thụ glucose (cho lên men) vẫn tăng.
Cơ chế thứ hai chịu trách nhiệm đối với hiệu ứng Pasteur là cơ chế điều
hoà bằng enzyme dị lập thể. Hình 3 tóm tắt những quan hệ điều hòa chủ chốt
trong hiệu ứng này. Trong điều kiện thoáng khí, sự lên men rượu chỉ tạo
thành một vài ATP tính trên mỗi phân tử glucose. Để duy trì sự cung cấp
năng lượng, tế bào phải sử dụng nhiều glucose. Tỉ lệ của ATP/AMP trong
trường hợp này rất thấp. Trái lại, khi oxi xâm nhập vào môi trường, ATP
được tạo thêm rất nhiều nhờ sự quá trình phosphorin hóa chuỗi hô hấp.
Enzyme chìa khóa dị lập thể điều hòa sự sử dụng glucose trong nấm men lên
men rượu là phosphofructokinase. Đó là enzyme không thuận nghịch đầu
tiên của con đường EM. Nó xúc tác cho sự phosphorin hóa fructose-6-
phosphate thành fructose-1,6-điphophat nhờ ATP và bị kìm hãm dị lập thể
bởi ATP. Sự kìm hãm theo cơ chế liên kết ngược này làm tăng nồng độ
glucose-6-phosphate trong tế bào do tính thuận nghịch của phản ứng enzyme
trước đó. Glucose-6-phosphate kìm hãm dị lập thể hexokinase, kìm hãm cả
sự hấp thu glucose, do đó làm giảm sự tiêu thụ đường này.
Trong khi ATP kìm hãm dị lập thể phosphofructokinase thì AMP lại hoạt
hóa nó. Bởi vậy một tỉ lệ ATP/AMP thấp như trong lên men lại kích thích sự
hấp thu và sự trao đổi glucose.
Hoạt tính của phosphofructokinase cũng bị kìm hãm bởi xitrat. Nhờ chất
hiệu ứng âm tính thứ hai này mà tác dụng kìm hãm của ATP được tăng
cường, trái lại các ion amôn lại kích thích enzyme này.
Sự điều hòa mô tả ở trên có thể được chứng minh dễ dàng khi người ta đo
nồng độ nội bào của glucose, glucose-6-phosphate, fructose-6-phosphate,
fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate trước và sau khi chuyển từ
điều kiện nuôi kị khí sang điều kiện nuôi hiếu khí. Ngay sau khi được thông

khí, nồng độ glucose-6-phosphate và fructose-6-P của tế bào tăng nhanh, còn
nồng độ của fructose-1,6-diphosphate và các triose-phosphate lại giảm
mạnh. ở đây, phosphofructosekinase hoạt động như một cái van được điều
chỉnh bởi các ađenilat cũng như các chất trao đỗi trung gian khác. Nếu van
bị đóng, các chất trao đổi nằm phía trên van sẽ bị ứ đọng, còn các chất nằm
bên dưới van được tiếp tục chuyển hóa và do vậy, nồng độ giảm đi.
Hiệu ứng Pasteur cũng gặp ở vi khuẩn (chẳng hạn, ở E. coli) và ở mô động
vật. Nguyên tắc điều hòa là giống nhau, chỉ có những khác biệt về loại chất
hiệu ứng. Chẳng hạn, ở E. coli, không phải AMP mà ADP mới là chất hiệu
ứng dương. Những cơ chế cơ bản của trao đỗi chất thì rất giống nhau, còn
các cơ chế điều hòa thì thường có tính đặc hiệu loài và đặc hiệu chủng.
4.Kỹ thuật sản xuất ethanol nhờ nấm men
Các loài nấm men dùng trong sản xuất ethanol là các nấm đơn bào mang
nhiều đặc điểm phong phú về sinh trưởng và phát triển. Các loài được quan
tâm trước hết trong sản xuất công nghiệp là Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomyces uvarum (carslbergensis), Schizosaccharomyces pombe và
Kluyveromyces sp. Ngoài ra, nhiều biến chủng bắt nguồn từ các nấm men
này đã được tạo ra nhờ kỹ thuật di truyền.
Các tính chất mong muốn của một quá trình sản xuất ethanol công nghiệp
phụ thuộc nhiều vào việc lựa chọn chủng vi sinh vật dùng trong lên men.
Các chủng này phải có một năng suất sản phẩm cao trên một đơn vị cơ chất
được sử dụng, một tốc độ lên men cao, tính chịu cồn cần thiết, khả năng
sống sót ở nhiệt độ cao, tính bền trong các điều kiện lên men và tính chịu pH
thấp.
Khả năng sử dụng các cơ chất khác nhau phụ thuộc vào loài. Nói chung, các
cơ thể này có khả năng sinh trưởng và lên men ethanol có hiệu quả ở các giá
trị pH giữa 3,5-6,0 và nhiệt độ từ 28-35
o
C. Hiện nay người ta quan tâm
nhiều đến việc tạo ra các thể đột biến khuyết hô hấp từ nấm men nhờ việc sử

dụng các tác nhân hóa học như các thuốc nhuộm hoặc các hợp chất làm biến
tính protein. Các biến chủng này chứa ADN ti thể đã bị biến đổi theo hướng
ức chế sự tạo ra các enzyme cần thiết cho sự trao đổi chất hiếu khí và do vậy
thích hợp với sự tổng hợp rượu.
5. Hiệu suất lên men
Nấm men, dưới điều kiện kị khí chuyển hoá glucose thành ethanol trước hết
bằng con đường Embden-Meyerhof. Phản ứng thật sứ bao gồm sự tạo thành
2 mol ethanol, 2 mol CO
2
và 2 mol ATP trên mỗi mol glucose được lên men.
Do vậy, về mặt trọng lượng mỗi gam glucose về lý thuyết có thể tạo ra 0,51
g rượu. Tuy nhiên sản lượng đạt được trong lên men thực tế thường không
vượt quá 90-95% con số lý thuyết. Sở dĩ như vậy là vì một phần chất dinh
dưỡng đã được sử dụng để tổng hợp sinh khối mới và cho các phản ứng liên
quan tới sự duy trì tế bào. Cũng còn có các phản ứng phụ xảy ra (thường dẫn
tới Glycerin và sucxinat) tiêu thụ tới 4-5% cơ chất tổng số. Nếu loại trừ
được các phản ứng này thì sản lượng ethanol có thể tăng thêm được 2,7%.
Một nồng độ nhỏ oxi cần phải được cung cấp cho nấm men lên men vì đây
là thành phần cần thiết trong sự sinh tổng hợp các chất béo chưa bão hòa và
các lipit. Thông thường oxi được giữ trong dịch lên men ở nồng độ 0,05-0,1
mm Hg tính theo áp suất oxi. Bất cứ nồng độ nào nằm trên giới hạn đó đều
sẽ kích thích sinh trưởng, vi phạm đến sự tạo thành ethanol (hiệu ứng
Pasteur).
Các nhu cầu tương đối của các chất dinh dưỡng được dùng trong sự tổng
hợp ethanol tỉ lệ thuận với các thành phần chính của tế bào nấm men. Chúng
bao gồm C, O, N, và H. Thấp hơn một chút là P, S, K và Mg dùng để tổng
hợp các thành phần thứ yếu. Các muối vô cơ (như Mn, Co, Cu, Zn) và các
nhân tố sinh trưởng hữu cơ (acid amin, acid nucleic, và các vitamin) được
yêu cấu dưới dạng vết.
Nhiều loại nguyên liệu dùng để sản xuất rượu ở quy mô lớn (như rỉ đường

mía hay actiso Jerusalem) ngoài hiđrat C còn cung cấp toàn bộ các chất dinh
dưỡng cần thiết cho sinh trưởng của nấm men. Trong một số trường hợp,
người ta cũng đưa thêm vào một số chất dinh dưỡng bổ sung như các muối
amôn, phosphate K hay nguồn cao ngô rẻ tiền.
Cơ chế điều hòa nhờ enzyme dị lập thể Phosphofructosekinase
Nấm men rất mẫn cảm với sự ức chế bởi ethanol. Nồng độ 1-2% (w/v) đã đủ
để làm chậm sinh trưởng của vi sinh vật và ở nồng độ cồn 10% (w/v) tốc độ
sinh trưởng của nấm men gần như ngừng hẳn. Bản chất của hiện tượng kìm
hãm này là rất phức tạp. Việc thêm cồn vào pha log làm giảm nhanh tốc độ
sinh trưởng của nấm men (có lẽ do tác động lên sự tổng hợp protein), giảm
khả năng sống sót của tế bào (qua sự biến tính không thuận nghịch của các
enzyme), và ở một mức độ thấp hơn nhiều,
ethanol làm giảm tóc độ tổng hợp bản thân nó. Các dẫn liệu về mức độ chịu cồn
của một số chủng nấm men phụ thuộc rất nhiều vào thành phần acid béo trong
màng tế bào chất cho thấy rằng thành phần acid béo kích thích hoặc kìm hãm sự
tiết ethanol khỏi bào tương. Các kết quả khác cung chứng minh được rằng ethanol
được tạo ra trong lên men (ethanol tự sinh) ức chế lên sinh trưởng của tế bào mạnh
hơn là ethanol được đưa vào một cách nhân tạo từ bên ngoài.
6. Sự tạo thành ethanol nhờ vi khuẩn
Trong số vi khuẩn, kiểu lên men rượu phổ biến ở nấm men (EM, piruvat-
đecacboxilase) chỉ gặp ở Sarcina ventriculi. Đây là loài vi khuẩn chịu khí yếu, dễ
dàng phân lập được từ đất, nhưng cũng gặp cả trong dịch tiêu hóa của những người
mắc bệnh dạ dày. Các vi khuẩn này được coi là không bình thường vì có kích
thước rất lớn (đường kính 4 μm), tạo nên các dạng hộp bao gói (chứa trên 64 tế bào
mỗi hộp , được liên kết với nhau nhờ xenlulose), chịu pH (sinh trưởng được ở pH
từ 0,9 đến 9,8) và tạo thành nội bào tử.
Từ dịch ép lên men của cây dứa dại (Agave americana) ở vùng Mexico người ta đã
phân lập được một loài vi khuẩn hình que, di động, có lông roi ở hai cực, có khả
năng tạo thành ethanol. Vi khuẩn này có tên là Zymomonas mobilis, phân giải
glucose theo con đường 2-keto-3deoxi-6-phosphogluconat (KDPG) cắt piruvat

thành acetaldehit và đioxit cacbon. Acetaldehit được khử thành ethanol. Ethanol,
đioxit cacbon và một lượng nhỏ acid lactic là những sản phẩm lên men duy nhất.
Người ta để ý rằng trong rượu mạnh chế từ dứa dại, các nguyên tử cacbon số 2 và
số 3 cũng như số 5 và số 6 đã thay thế các nguyên tử cacbon số 1 và số 2 cũng như
số 5 và số 6 trong rượu chế từ nấm men.
Trong quá trình lên men của một số Enterobacteriaceae và Clostridium, ethanol
xuất hiện như một sản phẩm phụ. Tuy nhiên, tiền chất của ethanol, acetaldehit,
không được giải phóng trực tiếp từ piruvat nhờ piruvatđecacboxilase mà được tạo
thành nhờ sự khử acetil-CoA.
Các vi khuẩn lên men lactic dị hình (ví dụ Leuconostoc mesenteroides) tạo ra
alcohol theo một con đường hoàn toàn khác. Qua các bước đầu tiên của con đường
pentosephosphate (PP), glucose được phân giải thành pentosephosphate.
Phosphoketolase tấn công vào xilulose -5- phosphate :
Xilulose-5-phosphate+P
vc
→ Acetilphosphate + glyceraldehyt-3-phosphate
Acetilphosphate vừa tạo thành nhờ acetaldehit-đedihydrogenase và alcohol-
đedihydrogenase sẽ được khử thành ethanol. Sản phẩm phân giải còn lại là
glyceraldehyt-3-phosphate, sẽ được khử thành lactat qua piruvat.