vi khuan bacillus cereus 1 docx

Bacillus
cere
us
1. Giới tiệu về Bacillus cereus:
Bacillus cereus là trực khuẩn Gram dương, theo phân loại quốc tế thuộc giới bacteria,
ngành (phylum) firmicutes, lớp (Class) Bacilli, bộ (Order) Bacillales, họ (Family) Bacillaceaem,
chi (Genius) Bacillus, loài (Species) Cereus.
Trong chi bacillus này ngoài loài cereus còn có một số loài như:
Bacillus subtilis
Bacillus coagulans
Bacillus thuringiensis
Bacillus natto
Paenibacillus larvae
Bacillus cereus là loài vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả năng sinh nha
bào, được phát hiện đầu tiên trong một ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955. từ những năm
1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus được phát hiện và
báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, trên thực tế con số này lớn hơn rất nhiều.
1.1. Đặc điểm Bacillus cereus:
Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử. Kích thước 0,5–1,5 x 2-4 µ. Vi khuẩn không tạo
giáp mô, không có khả năng di động.
Hình 1: Bacillus cereus trên kính hiển vi Hình 2: khuẩn lạc Bacillus cereus
trên môi trường BA
1
1.2. Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mộc
Hiếu khí và kị khí tùy nghi.
Nhiệt độ 5-50
o
C, tối ưu 35-40
o
C.
ph 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2

Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.
Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng.
Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh
có vòng sáng.
Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh
có vòng sáng.
Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn
1.3. Tính chất sinh hóa:
Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên
men mannitol.
Khử nitrat thành nitrit.
Phản ứng VP (+)
Phân giải Tyroxin
Catalase (+), Citrate (+)
Mọc trên NB + 0,001% lyzozym
1.4. Tính chất gây bệnh- Độc tố-Triệu chứng:
Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua
đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
Đ

ộc
tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc
t
ố
Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rau
quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu
chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.
Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu
các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt
độ cao và dịch dạ dày.

Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết
người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho
sự phát triển của vi khuẩn.
Triệ
u


c
hứng


tr
ú

ng



độc:

Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 10
5
vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc.
Biểu hiện đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn. Bệnh
có thể kéo dài 24 giờ.
Trường hợp nhiễm type 1 có triệu chứng đau bụng tiêu chảy nhưng không sốt. Bắt đầu
sau 4-16 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn và kéo dài 12-24 giờ.
Phòng: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn hâm nóng trên 80
o
C trước khi ăn

So sánh độc tố type 1 và type 2:
2. Đặc tính 3. Type 1 4. Type 2
5. Bền với nhiệt 6. 45
o
C/30 phút 7. 120
o
C/90 phút
8. pH 9. ổn định pH 4-11 10. ổn định pH 2-11
11. Tính nhạy 12. Nhạy với enzyme protease và
trypsin
13. Kháng pepsin và
trypsin
Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y tế có khả năng
kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tình thành có năng lực kiểm nghiệm. Tuy
nhiên hiện nay phương pháp xét nghiệm vẫn dựa trên phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc trên
môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với các xét nghiệm hóa sinh khác. Phương pháp này có
nhược điểm là thời gian lâu, có thể mất nhiều ngày hoặc vài tuần và độ chính xác không cao.
Trong những năm gần đây, các phương pháp xét nghiệm vi sinh vật dựa trên nguyên
tắc
di
truyền phân tử và miễn dịch học đã được thiết lập như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain
Reaction), Elisa cho kết quả rất khả quan với độ chính xác cao, thời gian rút ngắn có thể xuồng
vài giờ, không đòi hỏi nhiều máy móc thiết bị do đó khả năng cơ động là rất cao. Những phương
pháp trên đã mở ra cho ngành vi hóa sinh học nói riêng và cả ngành công nghệ thực phẩm hiện
đại.
2. Cơ chế sản sinh độc tố Bacillus cereus
2.1. Giới thiệu chung về độc tố của B. cereus
Vì ngộ độc thực phẩm do B.cereus không phải là loại bệnh được nói đến nhiều, sự thật là
phạm vi ảnh hưởng của loại bệnh này ít được biết đến, được báo cáo là nguyên nhân gây ngộ độc
thực phẩm và chiếm khoảng 33% trong tổng số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm (đa số

các nguyên nhân là do vi rút) ở Norway (1988-1993), 47% ở Iceland (1985-1992). Tỷ lệ thấp
hơn nhiều được báo cáo ở các quốc gia khác bao gồm U.S (1.3%) và Canada (2.2%). Ở Anh và
xứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995.
B. cereus là một thực vật hoại sinh trong đất rất phổ biến. Nó được phân lập từ nhiều
nguồn thực phẩm đa dạng, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật, từ thịt, các và các sản
phẩm từ thịt cá cũng vậy. Phát hiện đầu tiên các về các mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm là từ
năm 1949 khi Hauge đã phân lập mẫu từ xốt vani sau khi có một ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu
chảy tại bệnh viện ở Oslo, Norway. Xốt vani được nấu trước khi tiêu thụ và bảo quản ở nhiệt độ
phòng cho đến khi sử dụng. Để khẳng định B. cerus là nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge đã phát
triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x10
6
ml
-1
và uống 200ml cocktail. Sau 13h, ông cảm
thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h. Hơn 20 năm sau,
một triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác do chủng B. cereus gây ra lại xuất hiện ở các công
nhân người Anh. Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn
(chưa đến 5h), điều này cho thấy rằng đây là một sự nhiễm độc. Ngày nay, bệnh này liên quan
đến triệu chứng gây nôn mửa do B. cereus.
Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau, thêm vào đó,
những ngộ độc khác do B.cereus gây ra là sự nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng
mắt. Hai loại ngộ độc thực phẩm là nguyên nhân bởi rất nhiều nhấn tố gây độc hại khác nhau.
Bệnh nôn mửa được mô tả với thời kỳ ủ bệnh ngắn (1-5h), nguyên nhân gây ra ngộ độc này là do
chuỗi polypeptide nhỏ (cereulide) đã hình thành trước ở trong thực phẩm (ví dụ như Gạo). Triệu
chứng bao gồm sự buồn nôn, sự nôn mửa ra và đau dạ dày (bảng 1-1). Bệnh tiêu chảy được mô
tả với thời kỳ ủ bệnh từ 8 – 16h, triệu chứng bao gồm đau bụng, đi tiêu ra nhiều nước và đau thắt
trực tràng (bảng 1-2). Nguyên nhân của triệu chứng này là do sự sản sinh ra độc tố đường ruột
trong thời kỳ sinh trưởng của B.cereus trong ruột non từ việc ăn vào bụng các tế bào hay bào tử
của vi khuẩn. Thông thường cả hai triệu chứng này là tương đối nhẹ, kéo dài ít nhất là 24h và
không phải luôn luôn đòi hỏi phải dùng thuốc. Tuy nhiên, nhiều trường hợp ngộ độc gây tiêu

chảy có thể xảy ra, nguyên nhân có lẻ là do các tế bào biểu mô chiếm đa số trong ruột non khi
các bào tử của B.cereus sinh sôi nảy nở và sản sinh ra độc tố đường ruột.
Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B. Cereus
Tính chất/ Hoạt động Mô tả
Liều nhiễm độc Số lượng B.cereus: 10
5
- 10
8
tb/g thực phẩm
Khối lượng độc tố: 12 - 32 μ
g/
kg
Độc tố được sản sinh ra Trong thực phẩm (25 - 30
o
C)
Thời kỳ ủ bệnh

½ đến 5h
Khoảng thời gian mang bệnh 6 - 24h
Triệu chứng Buồn nôn, nôn mửa
Loại thực phẩm thường gặp nhất Cơm nấu chin / chiên, mì ống, phở
Tên của độc tố Cereulide
Cấu trúc của độc tố Chuỗi polypeptide [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]
Khối lượng phân tử 1.2 kDa
Sinh kháng thể

Không (none)
Hoạt động sinh học trên người Gây nôn
Cơ quan nhận cảm 5-HT
3

Cytotoxic No
Hoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bào
Khả năng chịu nhiệt 90 phút ở 121
o
C
Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không
Việc sản sinh ra độc tố như thế nào Chưa biết, nhưng có thể liên quan đến enzyme
(not known, but probably enzymatically)
2.2. Cơ chế gây bệnh
2.2.1 Triệu chứng nôn mửa
Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của độc tố gây nôn mửa đã được thể hiện ở
bảng 1-1. Sự giải thích về cấu trúc của độc tố emetic đã đưa đến những hiểu biết sâu sắc hơn về
triệu chứng này. Độc tố emetic có tên là cereulide và là một chuỗi polypeptide ba lần lặp lại của
bốn amino và/hoặc oxy-acid (bảng 1-1)
Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng nôn mửa do
Bacillus cereus sản sinh ra. Bài báo này giải quyết được nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp
độc tố này dựa trên sự bất thường của độc tố depsipeptide từ Cacbon số 13 (
13
C) liệt kê ra trên 3
loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) trên môi trường tổng hợp trung gian. Sự phân
tích này được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino hay oxy acid qua NMR và ESI
– MS của phương pháp kính quang phổ trên cereulide và sản phẩm thủy phân là các dipeptide
của nó. Sự hợp nhất của nguyên tử cacbon số 13 (
13
C) là chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu và
L-Val, trong khi đó chỉ có 40%
13
C là kết hợp trong D-Ala của Cereulide.
Bacillus cereus được biết là nguyên nhân gây ra hai loại ngộ độc thực phẩm, đó là triệu
chứng nôn mửa và triệu chứng tiêu chảy. Phần lớn những ngộ độc do Bacillus cereus gây ra chỉ

mới phát hiện sau này. Cereulide được biết đến với cấu trúc bậc 1, với 1 dodecadepsipeptide
tuần hoàn, với 12 góc lập thể trung tâm. Hóa học lập thể được chỉ ra từ sản phẩm thủy phân là
các dipeptide kiềm tính, D-O-Leu, D-Ala, L-O-Val và L-Val. Đó là 1 ion Kali mạnh, nó liên kết
yếu với các ion Li
+
, ion Na
+
, ion Cs
+
, nhưng với ion Rb
+
nó lại liên kết mạnh nhất, hơn bất kỳ ion
kim loại kiềm nào. Cereulide tạo cấu trúc bậc 2 từ NMR và sự tính toán cơ học các phân tử được
biểu thị ở hình 1. Độc tố này là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành các ty lạp thể có chứa ATP
và các enzyme lien quan đến hoạt động chuyển hóa tế bào trong các mô khác nhau. Chúng ta bắt
đầu quan tâm đến con đường sinh tổng hợp của độc tố này cho các chương trình phòng chống
ngộ độc thực phẩm trong tương lai. Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp tương tự như
dodecadepsipeptide, valinomycin. Agata – một trong nhiều tác giả đã nghiên cứu quá trình phát
triển và sinh độc tố của bacillus cereus trong quá trình tổng hợp trung gian một cách đầy đủ từ
CADM (hỗn hợp các amino acid) và đường sucrose (đường mía). Người ta nhận thấy rằng,
bacillus cereus cho phép (chấp nhận) việc sản sinh ra cereulide cấu trúc bậc 1 và 3 amino acid
Val, Leu và Thr là cần thiết. Những nghiên cứu khác về quá trình sinh tổng hợp cereulide có lẻ
là cần thiết để thúc đẩy việc nghiên cứu tìm ra phương pháp ngăn chặn những ngộ độc từ thực
phẩm. Xét đoán từ cấu trúc của 1, tiền thân của D-Ala, L-O-Val và D-O-Leu sẽ lien quan đến
các amino acid như L-Ala, L-Val, và L-Leu.
Figure 2.ESI-mass spectrum of cereulide-K+complex upper trace. Natural isotope abundance
lower trace,
13
C enriched cereulide.
Trong thí nghiệm này, chúng tôi chú trọng đến sinh tổng hợp trung gian của 3 amino acid

là L-Val, L-Leu, và L-Ala (0.1g/L có đến 99% nguyên tử cacbon ở dạng
13
C trong cacboxylic, tất
cả 15 amino acid còn lại (0.1g/L), K
2
HPO
4
(5g/L) và MgSO
4
.7H
2
O (0.05g/L), được tiến hành ở
nhiệt độ 30
0
C và thời gian là 24h, giữ ở tốc độ lắc là 200 rpm, chúng tôi thu được 2mg cereulide
có cùng độc tính ở điều kiện này đã được đánh dấu để phục vụ cho phân tích các nghiên cứu tiếp
theo.
1
H NMR của mẫu này là đồng nhất với quang phổ đáng tin cậy ngoại trừ chất đồng vị của
cacbon
13
C. ESI mass (interpreting Electrospray Mass Spectra) của nó xuất hiện ở 7 đỉnh trung
tâm với m/z là 1201.48 khá hơn mức bình thường M + K với m/z là 1191.55 (thể hiện ở hình 2),
vì vậy cứ trung bình 10 đơn vị mass thì cao hơn bởi vì sự kết hợp cao của
13
Cs. Chính vì sự liên
hợp cao của
13
Cs vào phân tử cereulide đã thúc đẩy chúng ta trong việc đo lường mức quang phổ
NMR

13
C của ion K
+
trong phức hợp CDCl
3
để đạt được mức quang phổ như ở hình 3, với số liệu
đáng kể 171.4 (L-O-Val), 172.2 (D-O-Leu), 175.7 (L-Val) và 176.2 (D-Ala) đã được chuyển
sang mối tương quan giữa C-H của nó. Tương ứng với cường độ của 3 cacbon (C
6
, C
9
, C
12
) của
L-O-Val, D-O-Leu và L-Val là nhiều hơn hai lần C
6
D-Ala.
Figure 3.
13
C NMR spectrum of cereulide-K
+
complex enriched at the 4 carboxyl or carboamide
atoms (Ã). Brucker AMX-600, 150 MHz for
13
C at 300 K.
Figure 4.Decoupled NHs by irradiating a-protons
Tương tự với việc làm riêng các thí nghiệm đã đạt được với bức xạ β proton của 4 hợp
phần amino hay oxy – acid. Loại bỏ các kết quả đạt được với α proton của O-Val ở 4.61 ppm với
bức xạ β-H của nó ở 2.30 ppm để thay đổi từ bộ ba sang bộ kép (J=3.8 Hz cặp với
13

C của O-
Val) như đã thể hiện ở hình 5 . Bức xạ β-H của L-Val ở 2.24 ppm đã làm thay đổi α proton của
Val ở 3.82 ppm từ bộ năm thành bộ ba (J=5 Hz). Cả hai kết quả trên đều chỉ ra được sự kết hợp
cao cacbonyl cacbon của
13
C tiền thân của các amino acid đối với L-O-Val và cả L-Val. Chưa có
kết quả chính xác nào về sự kết hợp của
13
C, tuy nhiên trường hợp này lại đúng đối với Ala và O-
Leu (hình 5). Sự chiếu xạ gốc metyl của Ala ở 1.47 ppm gây ra α-H của nó (4.27 ppm) giống
như sự pha trộn của bộ ba và bộ kép biểu kiến với J=4 và 5 Hz, theo thứ tự định sẵn (tách biệt ra)
có nghĩa là tỷ lệ sát nhập lại để tạo thành cacbonyl cacbon là không quá cao (không đạt đến
100%). Sự chiếu xạ của β-Hs của O-Leu trong khoảng 1.84 ppm là không đạt kết quả bởi vì dải
sóng tự nhiên của nó quá rộng. Tuy nhiên, quang phổ NMR của
13
C (hình 3) và những thí
nghiệm riêng lẻ (hình 4, 5) là những minh chứng gần như 100% của sự kết hợp
13
C tiền amino
acid với 3 hợp phần (O-Leu, Val và O-Val) của cereulide.
Figure 5.Decoupling experiments of a protons of the four components by irradiating b protons.
Một phần trăm sự kết hợp của
13
C là được xác định bởi phép đo phổ từ các sản phẩm thủy
phân cereulide, vì vậy hai dipeptide thu được từ sự thủy phân bằng kiềm cereulide (1) với 0.1N
KOH (hoặc 1N NH
4
OH) ở rt trong 30 phút. Các sản phẩm thủy phân dipeptide là D-O-Leu-D-
Ala và L-O-Val-L-Val, được phân tích bằng phương tiện ESI (electrospray ionization)- thước
MS/MS ở trên Q-TOF của phép đo phổ (Mcro Mass Co.,Ltd, Manchester, UK). Để làm được

điều này các chất đồng vị thừa và
13
C kết hợp lại với nhau thành mẫu, pha loãng mẫu đó đến độ
hòa tan 10-100 pmol/μL trong 99,8% methanol: 0.2% acid formic trước khi bị electrospray ở
5μL/phút.
Ngày nay, L-Leu và L-Ala đã được chứng minh để xác định rõ là có được từ quá trình
sinh tổng hợp cereulide, vì hai acid amin này là cần thiêt cho B. cereus. Một trong những khả
năng có thể được nghiên cứu là cả ba L-amino acid sẽ ít nhất một lần được biến đổi thành các α-
keto acid và sau đó biến đổi thành D-O-Leu và L-O-Val hoặc là sự chuyển hóa amin để tạo
thành D-Ala. Trong trường hợp này chỉ có acid pyruvic sẽ bị pha loãng bởi vì số gốc cao vì L-
Ala là không cần thiết cho B. cereus. Nghiên cứu này có thể giải thích đến 95% sự kết hợp để tạo
thành D-O-Leu, L-O-Val, và L-Val khoảng (40%) sự kết hợp để tạo thành D-Ala.
2.1.1 Triệu chứng tiêu chảy
Triệu chứng tiêu chảy do ít nhất hai loại độc tố đường ruột sản sinh ra trong suốt quá
trình sinh trưởng của B.cereus trong ruột non. Sự hình thành độc tố đường ruột đầy đủ trong thực
phẩm để dẫn đến ngộ độc thực phẩm về lý thuyết mà nói là có thể, nhưng đối với thực phẩm
phục vụ cho con người thì đây là điều không thể chấp nhận. Điều này xảy ra khi, số lượng
B.cereus tồn tại trong thực phẩm thấp nhất là 10
6
/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường ruột
phải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và enzyme proteolytic của tá tràng.
Những nhân tố này sẽ làm giảm một cách nhanh chóng hoạt động của độc tố đường ruột thấp ơn
1% sơ với mức độ ban đầu. Thời gian tương đối dài giữa việc ăn vào những sinh vật này với việc
xuất hiện những triệu chứng của bệnh. Đặc điểm của triệu chứng tiêu chảy được thể hiện trong
bảng 1-3. Mức độ biến đổi của liều lây nhiễm có lẽ do khả năng sản sinh ra các độc tố đường
ruột khác nhau và do tính nhạy cảm của mỗi cá nhân là khác nhau.
Bảng 1-2 Đặc điểm bệnh tiêu chảy gây ra bởi chủng vi khuẩn B. cereus
Đặc
tí
nh

Liều gây nhiễm Thông thường là 10
5
/g hoặc /ml
Độc tố được sản sinh ra Trong ruột non
Loại độc tố Protein
Thời kỳ ủ bệnh 8 – 16h
Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24h
Triệu chứng Đau bụng dai dẳng, đi tiêu nhiều nước, thỉnh thoảng buồn nôn
Ở Na-Uy, hai lần bộc phát đã xảy ra với rất nhiều người bị ảnh hưởng sau khi ăn thịt hầm
với khoai tây và rau. Liều lượng gây bệnh xấp xỉ 10
4
– 10
5
. Lần đầu tiên bùng phát (1992), 17 –
24 người bị ngộ độc, 3 trong số các bệnh nhân phải nhập viện từ 1 – 3 tuần, triệu chứng bắt đầu
nặng ở 3 bệnh nhân này khá muộn (>24h). Lần thứ hai, bệnh bùng phát vào tháng 2 năm 1995
khi mà 152 trong số 252 người Na-uy bị ảnh hưởng trong suốt thời gian tham gia giải vô địch về
trượt tuyết. Các đối thủ trẻ tuổi (16 – 19 tuổi) bị nhiễm triệu chứng này sau hơn 24 giờ ủ bệnh và
họ bị đau từ 1 đến vài ngày.
Bào tử của B. cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là được phân biệt
để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế bào biểu mô của
người). Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình
thành tế bào B. cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản sinh ra độc tố,
nếu độc tố này xuất hiện trong đường ruột, độc tố đường ruột sẽ tập trung khoanh vùng ở vùng
ngoại biên của ống ruột sẽ tăng cao hơn trong lumen và vì vậy gây nên mối nguy lớn hơn và gây
bệnh một cách trầm trọng. Một điều có thể xảy ra đối với cơ chế này là thời gian ủ bệnh sẽ lâu
hơn như đã quan sát.
1
Số lượng và loại độc tố liên quan đến triệu chứng tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm từ B.
cereus là đề tài tranh cải từ nhiều năm qua và cho đến nay vẫn còn đang tranh luận. Cả dạng đơn

và dạng phức của độc tố đường ruột được xác định là nguyê nhân gây ra bệnh tiêu chảy. Có hai
sự khác biệt trong ba hợp phần của độc tố đường ruột được sản sinh bởi các thực phẩm nhiễm B.
cereus, một số nhóm cũng được mô tả độc tố đường ruột một hợp phần với các phân tử trọng
lượng khoảng từ 40 – 100 kDa. Một số hiểu biết hiện tại về độc tố đường ruột của B. cereus
được thể hiện ở bảng 1-3
Bảng 1-3 Properties of Enterotoxin Isolated from Bacillus cereus
Enterotoxin/Reference Molecular Weight Biogogical Test Used DNA Sequenced
Once main Pro 50 kDa Positive on: rabit loop tests No
and two other pro vascular permeability tests
component and mouse lethality
Three component 38.0 kDa Positive on: rabit loop tests, No
39.5 kDa vascular permeability tests,
43 kDa and Vero call test
One component 45 kD
a
Pos
itive
on: rabit loop tests No
vascular permeability tests,
and mouse lethality tests
One toxin component 40 kDa Positive on: Vero cell test No
and one non-toxin 48 kDa and Ca-co2 (human intestinal
component epithelial cells) cell tests
One component 41 kDa Positive on: mouse loop tests, Yes
vascular permeability tests
and mouse lethality tests
Những nghiên cứu gần đây về độc tố đường ruột đã khẳng định rằng cả độc tố chỉ có một
hợp phần và độc tố nhiều hợp phần đều có liên quan.
Những nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp giúp thiết lập nên các giải pháp ngăn ngừa
các độc tố sinh ra từ B.cereus trong tương lai gần. Hoặc có thể đưa ra các phương pháp giúp phát

hiện ra độc tố cereulide trong tự nhiên bất cứ lúc nào.
3. Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm
Để kiểm soát Bacillus cereus thì có nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào thời gian cho
kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính là phương pháp truyền thống
và phương pháp phân tích nhanh.
3.1. Các phương pháp truyền thống:
Đặc điểm và nguyên tắc:
Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật trên các môi
trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các loài vi sinh vật khác nhau.
Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ,
thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này còn một số hạn chế như độ nhạy không
cao, tốn nhiều nhân công và thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác
phòng ngừa.
Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây
bệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng, B.mycoides,
B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử
nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử
nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0.001%
lysozyme, được trình bày trong bảng sau:
Đặc tính
Loài
B.cereus B.thuringiensis B.mycoides B.anthracis B.megaterium
Gram
+
(a)
+ + + +
Catalase
+ + + + +
Di động
+/

-
(b)
+/
- -
(c)
-
+/
-
Khử nitrate
+ + + +
-
(d)
Phân hủy tyrosine
+ + +/
- -
(d)
+/
-
Kháng lysozyme
+ + + +
-
Phản ứng với lòng đỏ
trứng
+ + + +
-
Lên men glucose
+ + + +
-
Phản ứng VP
+ + + +

-
Sinh acid từ manitol - - - -
+
Tan máu (cừu)
+ + +
-
(d)
-
Các đặc tính của Bacillus nhóm I
a
+ :90 - 100% các chủng dương tính ;
b
+/- : 50% các chủng dương tính;
c
- : 90 – 100% : các
chủng âm tính;
d
- : Hầu hết các chủng âm tính.
Do có hình thái đặc trưng trên các môi trường thạch chọn lọc như : Mannitol-Egg Yolk-
Polymycin (MYP), Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb Mannitol
Bromothymol Blue Agar (PEMBA), nên B.cereus còn được phát hiện và định lượng bằng môi
trường này. Ngoài ra B.cereus cũng được định lượng bằng phương pháp MPN.
Q
u
i

trì
nh phân tích:
25g mẫu + 225ml môi trường pepton đệm (BPW) -> đồng nhất bằng Stomacher/ 1phút
để có độ pha loãng 10

-1
-> pha loãng thành dãy thập phân để có các độ pha loãng thích hợp.
Đ

ị
nh
lượ
ng
B.cere
us bằng ph
ươ
ng pháp đ
ế
m khuẩn lạc:
Phát hiện bằng môi trường chọn lọc:
Trải 0.1ml mỗi độ pha loãng lên các môi trường thạch rồi ủ 24h ở 30
o
C:
MYP: do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên khuẩn lạc
B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạo
thành.
MOSSE: khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng.
Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiên chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định
B.cereus.
Các phản ứng khẳng định:
Nhuộm Gram:
Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống thạch dinh
dưỡng -> ủ ở 30
o
C/ 24h -> nhuộm Gram -> quan sát dưới kính hiển vi tế bào nhuộm

bằng vật kính 100X nhúng trong dầu.
Các bước nhuộm Gram:
Chọn phiến kính sạch -> vẽ lên kính 1 vòng tròn, đường kính 2cm -> ở vị trí tương ứn
với vòng tròn, mặt còn lại nhỏ vài giọt nước cất thành 1 giọt lớn -> chuyển một ít sinh khối
khuẩn lạc vào giọt nước trên kính bằng que cấy vòng -> khuấy nhẹ bằng đầu que cấy -> dung
dịch huyền phù đồng nhất -> bôi đều trong khu vực của vòng tròn -> để yên cho vệt bôi khô ->
đưa phiến kính ở vị trí cạnh vệt bôi qua lại trên ngọn lửa đèn cồn/đèn Bunsen để cố định vệt bôi
(tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa)
Tương tự cho hai chủng vsv đối chứng trong cùng một phiến kính khác: E.coli làm chủng
đối chứng cho Gram (-) và Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho Gram (+).
Có hai phương pháp nhuộm Gram:
Phương pháp Jensen: nhỏ vài giọt dd methy violet lên vệt bôi -> giữ yên 20giây ->
dùng bình xịt nước lên vệt bôi -> rửa sạch phẩm nhuộm -> nhỏ vài giọt KI/I
2
lên vệt bôi/ để yên
1phút -> dùng bình xịt cồn 95% lên vệt bôi -> rửa phẩm nhuộm đến khi mất màu -> để yên vài
giây -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd safranin/30giây -> rửa sạch bằng nước, thấm nước dư
bằng giấy lọc.
Phương pháp Hucker: tương tự như phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi bằng dd
crystal violet/ 1 phút -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd KI/I
2
/ 1 phút -> khử màu bằng cách
xịt cồn 95% -> rửa lại bằng nước -> nhuộm màu bằng dd safranin/2phút.
Kết thúc qui trình nhuộm, quan sát dứơi kính hiển vi cho ta thấy tế bào nhuộm Gram (+)
có màu xanh tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng (E.Coli). B.cereus là trực
khuẩn lớn, Gram (+), thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi; bào tử hình bầu dục, không có
dạng bào tử nang.
Dùng que cấy vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh
dưỡng vào 0.5ml BPW vô trùng. Tạo huyền phù hóa dịch cho các phản ứng sinh hóa phía sau.
Thử nghiệm lên men glucose: Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth ->

ủ ở 35
o
C/ 24h, kị khí -> lắc mạnh ống nghiệm -> quan sát độ đục ( sự phát triển); sự chuyển màu
môi trường từ đỏ sang vàng ( chứng tỏ có sự sinh acid glucose trong điều kiện kị khí).
Thử nghiệm khả năng khử nitrate: cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate Broth ->
ủ 35
o
C/24h -> bổ sung vài giọt dd của thuốc thử nitrate -> có màu cam xuất hiện trong 10phút
(chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit)
Ống A đã cấy vi khuẩn trên canh trường Nitrate Broth chưa bổ sung thuốc thử.
Ống B và C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine và sulfanilic acid. Ống B
cho kết quả dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết quả âm tính
với nitrite.
Thử nghiệm VP: Ở vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ
glucose qua con đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là pyruvic acid. Để khôi
phục dự trữ NAD+ trong tế bào phục vụ cho con đường đường phân ở các loài vi sinh vật, sau
đó pyruvic acid tiếp tục được chuyển hóa khác nhau tạo ra các sản phẩm lên men cuối cùng khác
nhau. Họ Enterobacteriacceace có đặc tính chung là lên men sinh tổng hợp acid như acid formic,
acid acetic, acid succinic, ethanol, H
2
và CO
2
. Họ này có thể được chia thành hai nhóm là nhóm
không sinh 2,3-butanediol (ví dụ : E.coli) và nhóm sinh 2,3-butanediol (ví dụ: Enterobacter).
Phân tử 2,3-butanediol có thể được chuyển hóa qua lại thành acetoin: trong điều kiện có oxi và
môi trường có tính kiềm nhờ xúc tác của enzyme 2,3-butanediol dehydrogenase. Ngược lại
acetoin có thể bị khử thành 2,3-butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase; ngoài ra
acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệm
VP.
Như vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các loài trong Enterobacteriaceace dựa

trên sự oxi hóa acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxi
hóa acetoin thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-naphthol. Diacetyl kết hợp với
nhân guanidine có trong peptone kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ. Trong thuốc
thử Koblentz và O’Meara có chứa creatine có tác dụng bổ sung nguồn nhân guanidine.
C

ác
b
ư

ớ

c

tiế
n h à nh:
Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi
trường MR-VP), có pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh
khối (trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz thì cấy nhìu sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần
đã ủ 18-24h trên môi trường KIA hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 37
o
C / 24-48h hoặc
đến 10 ngày. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Có 3 loại thuốc
thử VP là:
Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B
là 40% KOH hoặc NaOH.
Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%, dung dịch B là
0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH.
Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH
Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó

nhỏ 2 giọt dung dịch B, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường. Lắc nhẹ ống 1 phút để oxi
hóa acetoin. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4h.
Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đối chứng như E.Coli (VP -)
bề mặt môi trường không đổi màu và Enterobacter cloacae (VP +) có màu đỏ trên bề mặt
môi trường.
Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng tyrosine ->
ủ 35
o
C/48h -> xuất hiện khuẩn lạc ( chứng tỏ tyrosine bị phân hủy)
Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2.5ml môi trường Nutrient
Broth chứa 0.001% lysozyme, thực hiện tương tự với môi trường không chứa lysozyme -> ủ ở
35
o
C/24h -> kiểm tra sự tăng trưởng trong môi trường chứa và không chứa lysozyme -> những
ống có kết quả âm tính ủ thêm 24h -> kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay không.
Dựa vào bảng để khẳng định dòng đã chọn là B.cereus hay không.
C

ác
thử ngh
iệ
m phân b
iệ
t
các

loài

tr
ong

Bacill
us nhóm I

:
Thử nghiệm tính di động:
Phương pháp 1: Dùng que cấy vòng cấy thẳng dịch 24h nuôi vào giữa môi trường
kiểm tra di động -> ủ 30
o
C/ 18-24h -> kiểm tra dưới ánh đèn kiểu mọc, dọc theo đừơng cấy. Kế
quả: loài di động mọc khuýêch tán vào môi trường theo hướng xa đường cấy, loài không di động
mọc trong và dọc theo đường cấy.
Phương pháp 2: bổ sung 0.2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạch
nghiêng Nutrient Agar -> cấy huyền phù vi khuẩn vào -> ủ thạch nghiêng ở 30oC/6-8h -> nhỏ
nước vô trùng lên kính hiển vi, đặt sinh khối vi khuẩn vào -> quan sát dưới kính hiển vi để kiểm
tra sự di động.
Hầu hết các chủng B,cereus, B.thuringiensis là di động; B.anthracis và B.mycoides
không di động.
Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ lên giữa đĩa
Nutrient agar -> ủ ở 30
o
C/48-72h -> kiểm tra sự phát triển của rễ giả (B.cereus không tạo cấu
trúc rễ giả, thường tạo nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides
(cấu trúc giống như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy).
Bacillus cereus (không có cấu trúc rễ giả)
Bacillus Mycoides (có cấu trúc rễ giả)
Thử nghiệm làm tan máu: cấy chủng lên môi trường thạch máu Trypticase Soy -> ủ ở
35
o
C/24h -> B.cereus làm tan máu mạnh, tạo vùng tan máu hòan tòan (β) 2-4 mm xung quanh
vùng phát triển. B.thuringiensis và B.mycoides cũng tan máu β. B.anthracis thường không làm

tan máu sau 24h.
Sự tạo độc tố protein dạng tinh thế: cấy huyền phù tế bào 24h lên ống thạch nghiêng
nutrient agar -> ủ 30
o
C/ 24h -> để yên ở nhiệt độ phòng /2-3ngày -> nhuộm bằng phẩm màu
fuchsin -> quan sát dưới kính hiển vi.
Tinh thể độc tố của B.thuringiensis xuất hiện sau 3 đến 4 ngày nuôi cấy, phát hiện được
bằng kỹ thuật nhuộm khi bào tử nang vỡ ra (tinh thể độc tố hình tứ giác dạng kim cương được
nhuộm màu tối, nhỏ hơn bào tử). Do đó nếu không quan sát được bào tử tự do cần để thêm vài
ngày rồi kiểm tra lại. B.cereus và các Bacillus khác cùng nhóm không tinh thể độc.
Cách tính kết quả:
Số tế bào B.cereus/1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha lõang và hiệu chỉnh
bằng tỉ lệ khẳng định (phần trăm khuẩn lạc được xác nhận là B.cereus).
Ví dụ: số khuẩn lạc đếm được ở độ pha lõang 10
-4
là 65, có 4 trong 5 khuẩn lạc được chọn
xác nhận là B.cereus (được kiểm tra bằng các phản ứng sinh hóa).
Số tế bào B.cereus/1g thực phẩm = 65 x 4/5 x 10000 x 10 = 5200000 (nhân 10 vì có 0.1
ml mẫu được trải dĩa).
3.2. Các phương pháp phân tích nhanh:
Theo nguyên lí của các phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chia phương pháp này
thành hai nhóm nhỏ: nhóm dựa trên nguyên tắc của sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên-
kháng thể (phương pháp miễn dịch) và nhóm dựa trên sự bắt cặp bổ sung các nucleotit
3.2.1 . Phương pháp miễn dịch:
Nhóm các phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên
bề mặt của tế bào vi sinh vật. Dựa trên nguyên tắc này có rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thành
phương pháp phát hiện nhanh vi sinh vật.
3.2.2 Ph ương pháp Elisa
3.2.2.1. Giới Thiệu Chung Về Elisa
Elisa (Enzyme linked Immunosorbent Assay) được tạm dịch là phương pháp phân tích

hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme, là phương pháp phân tích trong đó sử dụng kháng
thể đặc hiệu để nhận diện kháng nguyên (thường là Protein)
Phương pháp Elisa được phát triển từ kĩ thuật RIA (Radio Immuno Assay) vào những năm 1960,
bởi Rosalyn Sussman Yalow và Solomon Berson. Kĩ thuật này nhận biết kháng nguyên dựa trên
sự đánh dấu phóng xạ kháng thể.
Phương pháp phân tích Elisa được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y học, dược học hay thực
phẩm dựa trên liên kết kháng thể và kháng nguyên như: chuẩn đoán bệnh ung thư, HIV, các
bệnh do vi sinh vật khác hay trong xét nghiệm nhanh sự nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm.
Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là độ nhạy cao, phát hiện được liên kết kháng thể-
kháng nguyên ở mức độ nhất nhỏ, thời gian cho kết quả nhanh hơn các phương pháp xét
nghiệm hóa sinh, vi sinh truyền thống.
Ở đây, khái niệm kháng thể hay kháng nguyên là có tính tương đối vì trong nhiều trường hợp
kháng thể này có thể lại là kháng nguyên đối với kháng thể khác.
Các enzyme sử dụng trong đánh dấu thường là: peroxidase, beta-galactoxidase, alkaline
phosphatase.
Hình 3.1 : Các giếng và pipettes trong phân tích Elisa
3.2.2.2. Các phương pháp phân tích Elisa
Phương pháp Elisa trực tiếp (Direct Elisa)
Trong trường hợp này, kháng nguyên nằm trộn lẫn trong dung dịch đệm sẽ được
cho vào đáy giếng. Kháng nguyên sẽ liên kết cố định vào bề mặt của đáy giếng. Ủ
một thời gian ngắn, sau đó tiến hành rửa trôi. Những kháng nguyên nào không liên
kết sẽ được đưa ra ngoài.
Thêm dung dịch chứa kháng thể có gắn enzyme vào giếng, kháng thể sẽ liên kết
với kháng nguyên tạo phức hợp gắn chặt vào giếng. Ủ một thời gian để phức hợp ổn
định, sau đó tiến hành rửa trôi. Những kháng thể nào không liên kết với kháng
nguyên sẽ được rửa trôi.
Thêm dung dịch cơ chất có hệ đệm vào giếng. Nếu có sự tồn tại của phức hợp
kháng thể_E_kháng nguyên thì cơ chất dưới tác dung của E sẽ tạo màu cho dung
dịch. Dựa vào sự xuất hiện màu và cường độ màu trong dung dịch sẽ định tính và
định lượng được kháng nguyên.