Báo cáo thực tập Công nghệ sinh học

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO TỔNG KẾT
“PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN RS1 LIÊN KẾT NST GIỚI TÍNH X
GÂY BỆNH DỊCH KÍNH VÕNG MẠC”
Sinh viên thực hiện
Họ và tên: Trịnh Quốc Đạt
Lớp: K64CNSHA
Mã số sinh viên: 641164
Giáo viên hướng dẫn tại cơ sở
Họ và tên: PGS.TS. Nguyễn Hải Hà
Chức vụ: Phó trưởng phịng - Phịng Phân tích Hệ gen người
Cơ sở thực tập nghề nghiệp: Viện Nghiên cứu Hệ gen - Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ( VAST)
Thời gian: từ 05/09/2023 đến 06/10/2023

HÀ NỘI – 2022


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên cho phép em được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành
nhất tới ban chủ nhiệm, TS. Phạm Thị Dung, cùng các thầy cô khoa Công nghệ
sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã giới thiệu và tạo điều kiện cho em
được sang viện Công nghệ sinh học để thực tập nghề nghiệp.
Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ban
lãnh đạo Viện Nghiên cứu hệ gen, PGS.TS Nguyễn Hải Hà – phó phịng Phân
tích Hệ gen và là người hướng dẫn trực tiếp, hỗ trợ cả về chuyên môn và kiến
thức thực tế, bạn Lê Thành Nam – người đồng hành cùng em trong suốt q trình
thực tập, cùng tồn bộ cán bộ cơng nhân viên, đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo và

truyền đạt cho em những kiến thức, kinh nghiệm quý báu, tạo điều kiện cho em
hoàn thành đợt thực tập nghề nghiệp này.
Bằng tất cả lịng u thích của mình về lĩnh vực sinh học phân tử - sinh
học ứng dụng, cùng với mong muốn tìm hiểu thêm kiến thức mới và nâng cao kỹ
năng làm việc trong phịng thí nghiệm, em đã may mắn được có cơ hội thực tập
ở Viện Nghiên cứu Hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Được trải nghiệm qua các kỹ thuật, kiến thức mà trước nay ít có cơ hội được
thực hiện, sau khi hồn thành khóa thực tập này em đã trang bị cho bản thân rát
nhiều kiến thức bổ ích để tiếp tục sải bước trên hành trình của mình.
Khoảng thời gian 1 tháng đối với cá nhân em là không dài, và chưa đủ đẻ
em hài lòng với bản thân của hiện tại. Trong hành trình tiến bộ và học hỏi của
bản thân, Nhận thức được điều đó, em rất mong nhận được sự góp ý của quý
thầy cô, bạn bè để em rút kinh nghiệm và hoàn thành tốt hơn.
Em xin chân thành cảm ơn!
2


Hà Nội, ngày 15 tháng 10 năm 2023
Sinh viên
Trịnh Quốc Đạt

MỤC LỤC
PHẦN 1. GIỚI THIỆU CƠ SỞ THỰC TẬP NGHỀ NGHIỆP..............................................8

1. VIỆN NGHIÊN CỨU HỆ GEN...................................................................8
1.1. Lịch sử hình thành..................................................................................8
1.2. Chức năng................................................................................................8
1.3. Nhiệm vụ..................................................................................................8
1.4. Cơ cấu tổ chức.........................................................................................9
1.5. Các hoạt động thường xuyên của đơn vị..............................................9

1.6. Thành tựu nổi bật.................................................................................10
2. PHỊNG PHÂN TÍCH HỆ GEN................................................................11
2.1. Lịch sử thành lập..................................................................................11
2.5. Các kết quả nổi bật...............................................................................11
PHẦN 2. THỰC TẬP PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN RS1.................................................11

1. ĐẶT VẤN ĐỀ..............................................................................................11
3. YÊU CẦU....................................................................................................13
4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..............................................................13
4.1. Vật liệu......................................................................................................13
4.1.1. Đối tượng nghiên cứu...........................................................................13
4.1.2. Thiết kế nghiên cứu..............................................................................14


Nghiên cứu ngang:.................................................................................14
3


4.2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................14
4.2.1. Nghiên cứu các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân............................14
4.2.2. Xác định đột biến gen RS1...................................................................14


Lấy mẫu, bảo quản................................................................................14



Tách chiết DNA tổng số và giải trình tự WES....................................15



Phản ứng PCR.......................................................................................16



Thiết kế mồi............................................................................................16



Phản ứng PCR.......................................................................................17



Giải trình tự Sanger..............................................................................17



Phân tích kết quả giải trình tự Sanger bằng Bioedit..........................17

4.2.3. Xử lý và lưu kết quả..............................................................................17
4.3. Đạo đức nghiên cứu.................................................................................17


Tính tự nguyện.......................................................................................17



Bảo mật thơng tin..................................................................................17

5. THÍ NGHIỆM.............................................................................................17

5.1. Ngày 05/09/2023....................................................................................17
5.2. Ngày 06/09/2023 – 10/09/2023..............................................................18
5.3. Ngày 11/09/2023....................................................................................18
5.4. Ngày 12/09/2023....................................................................................19
5.5. Ngày 13/09/2023....................................................................................19
5.6. Ngày 14/09/2023....................................................................................19
5.8. Ngày 16/09/2023....................................................................................19
5.9. Ngày 17/09/2023 đến ngày 22/09/2023.................................................19
5.10. Ngày 23/09/2023..................................................................................20
5.11. Ngày 24/09/2023..................................................................................21
5.12. Ngày 25/09/2023..................................................................................21
5.13. Ngày 26/09/2023..................................................................................21
5.14. Những ngày còn lại.............................................................................22
4


6. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................................22
6.1. Kết quả...................................................................................................22
6.2. Thảo luận...............................................................................................22
7. CÁC KỸ THUẬT KHÁC HỌC ĐƯỢC TỪ CƠ SỞ THỰC TẬP.........22
7.1. Khử trùng các đầu tuýp dùng cho Micropipet......................................22
7.3. Sử dụng máy đo pH.................................................................................22
8. KẾT LUẬN..................................................................................................23
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................................23

PHẦN 1. GIỚI THIỆU CƠ SỞ THỰC TẬP NGHỀ NGHIỆP
1. VIỆN NGHIÊN CỨU HỆ GEN

1.1. Lịch sử hình thành
Được thành lập dựa trên quyết định số 1040/ QĐ – KHCNVN 06/08/2012 của

Chủ tịch Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, nay là Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam. Từ năm 2017 đến nay, Viên Nghiên cứu Hệ gen là
tổ chức khoa học công nghệ công lập trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và
Công nghệ Việt Nam theo quy định tại Nghị địh số 60/2017/NĐ – CP ngày
15/5/2017 của Chính phủ. Hoạt động dựa trên Quy chế tổ chức và hoạt động ban
hành theo Quyết định số 1731/QĐ – VHL ngày 8/8/2017 của Chủ tịch Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
1.2. Chức năng
Viên Nghiên cứu Hệ gen có chức năng nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát
triển công nghệ mới về hệ gen người và các sinh vật khác

5


1.3. Nhiệm vụ
Nghiên cứu cơ bản và phát triển công nghệ thuộc các lĩnh vực:
- Nghiên cứu cơ bản, ứng dụng về hệ gene người và y học hệ gene
- Nghiên cứu cơ bản, ứng dụng về hệ gene động vật, thực vật và vi sinh vật
đặc hữu của Việt Nam.
- Nghiên cứu cơ bản, ứng dụng trong các lĩnh vực OMICS, tin-sinh học và
các lĩnh vực liên quan
- Phát triển công nghệ, triển khai và chuyển giao công nghệ ttrong lĩnh vực
hệ gen học và các lĩnh vực khác có liên quan.
- Tư vấn, dịch vụ khoa học và công nghệ thuộc các lĩnh vực OMICS, tinsinh học, giám định gen, tư vấn xây dựng các phịng thí nghiệm về công
nghệ sinh học, hệ gen học và các lĩnh vực khác có liên quan.
- Hợp tác, hội nhập quốc tế về hệ gen học và csc lĩnh vực khác có liên quan
theo quy định của Nhà nước và của Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam.
1.4. Cơ cấu tổ chức
- Viện trưởng: GS.TS. Nguyễn Huy Hồng

- Phó viện trưởng: PGS. TS. Lê Thị Thu Hiền, TS. Lê Tất Thành
- Hội đồng khoa học gồm: Chủ tịch HĐKH – GS. TS. Nơng Văn Hải, Phó Chủ
tịch HĐKH – PGS. TS. Nguyễn Huy Hoàng, Thư ký HĐKH – TS. Nguyễn
Đăng Tơn.
- Gồm 07 phịng chun mơn, bao gồm:
Phịng Hệ Gen học người
Phịng Phân tích hệ gen
Phịng Hệ Gen học mơi trường
Phịng Hệ Gen chức năng
Phịng Hệ gen học vi sinh
6


Phịng Hệ Gen học miễn dịch
-

Lực lượng cán bộ: có 63 cán bộ đang học tập và làm việc tại đây, ngồi ra

cịn có các sinh viên từ các trường đại học lân cận, các NCV, TTS và các đối tác
nước ngoài sang để làm việc và trao đổi.
1.5. Các hoạt động thường xuyên của đơn vị
Những hoạt động thường xuyên của đơn vị bao gồm:
 Thực hiện các nhiệm vụ khoa học và công nghệ theo chức năng và nhiệm
vụ của học viện;
 Hợp tác quốc tế trong lĩnh vực gen người và các sinh vật đặc hữu, các vấn
đề lĩnh vực y sinh có liên quan.
 Tham gia đào tạo sau đại học tại Học viện Khoa học và Công nghệ,
Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà Nội, Học viện Nông nghiệp
Việt Nam,..
1.6. Thành tựu nổi bật

- Năm 2021, Viện có tống số 78 cơng trình khoa họ đã được cơng bố, trong đó
có 32 cơng trình đăng trên các tạp chí quốc tế ) 16 bài SCI, 11 bài SCI-E, 01
bài VAST1 và 04 bài trên tạp chí quốc tế khơng thuộc danh sách SCI/SCI-E
nhưng có mã chuẩn ISSN) và 46 bài trên tạp chí quốc gia và tạp chí chuyên
ngành trong nước
- Viện đã xuất bản 02 cuốn sách chuyên khảo ngành khoa học tự nhiên và cơng
nghệ
- Viện tiếp tục chủ trì thực hiện 07 đề tài cấp nhà nước, 10 nhiệm vụ do Quỹ
Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia ( NAFOSTED) tài trợ, 13 nhiệm
vụ cấp Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam. Một số đề tài nhánh và
nhiệm vụ khác, theo 4 hướng nghiên cứu chính: Nghiên cứu về hệ gen học
người, nghiên cứu về hệ gen học động vật, nghệ cứu về hệ gen học thực vật,
7


nghiên cứu về hệ gen học vi sinh vật và côn trùng.
- Số NCS được đào tạo tại đơn vị là: 19
- Số NCS là cán bộ của đơn vị đang đào tạo ở nước ngoài: 04
1.7. Hoạt động hợp tác quốc tế
Viện Công nghệ snh học đã chủ động được hơn trong các công tác hợp tác quốc
tế (gồm có việc cử cán bộ đi cơng tác nước ngồi, đón tiếp các chun gia nước
ngồi vào làm việc và ký kết hợp tác, dự án hợp tác quốc tế song phương, v.v) từ
đó đem lại những kết quả hợp tác có ý nghĩa to lớn đối với sự phát triển của Viện
như:
- Nhiều cán bộ khoa học trong lĩnh vực nghiên cứu lý thuyết, nghiên cứu cơ
bản đã đạt được trình độ quốc tế do thường xuyên được cập nhật các thông tin
khoa học mới thông qua các chuyến đi công tác trao đổi khoa học, hội nghị và
hội thảo quốc tế.
- Viện Công nghệ sinh học thông qua hợp tác quốc tế đã đào tạo được một đội
ngũ cán bộ khoa học có trình độ cao.

- Các cán bộ khoa học trẻ được cử đi học tập ở nước ngoài để tiếp cận với nền
khoa học tiên tiến của thế giới.
- Một số thiết bị nghiên cứu quý giá đã được các tổ chức nước ngoài trang bị
để phục vụ cho nghiên cứu.
2. PHỊNG PHÂN TÍCH HỆ GEN
2.1. Lịch sử thành lập
Được thành lập cùng lúc với các phòng ban khác khi Viện Nghiên cứu hệ gen ra
đời, Phịng Phân tích hệ gen tập trung vào việc ứng dụng các công nghệ, kỹ thuật
cùng với chuyên môn tiến hành nghiên cứu, phân tích đặc điểm, cấu tạo của các
mẫu genome, phân tích các đột biến,...phục vụ cho phát triển khoa học sinh học
phân tử.
8


2.5. Hướng nghiên cứu và các kết quả nổi bật
- Sàng lọc đột biến gen RB1 thể di truyền trên các bệnh nhi mắc u nguyên bào
võng mạc.
- Nghiên cứu đa hình/đột biến một số gen Cytochrome P450 trên người ở Việt
Nam – TS. Nguyễn Hải Hà
- Giải trình tự tồn bộ hệ gen các gia đình bị phơi nhiễm chất độc màu da cam.
- Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền giải tình tự gen thế hệ mới trong
sàng lọc bệnh Parkinson có yếu tố di truyền – TS. Nguyễn Đăng Tơn
- Phân tích trình tự exome các bệnh nhân Ly thượng bì bóng nước, Bạch tạng
và Thiểu sản vành tai ở Việt Nam – TS. Nguyễn Đăng Tơn.

PHẦN 2. THỰC TẬP PHÂN TÍCH ĐỘT BIẾN GEN RS1
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Retinoschisis liên kết nhiễm sắc thể X ( X-link Retinoschisis hay XLRS) là
bệnh di truyền ở mắt gây ra tình trạng loạn dưỡng ở mắt, cụ thể là ở vùng võng
mạc. Từ đó gây ra tình trạng nứt ( tách) ở võng mạc thần kinh và làm giảm dần

thị lực của người nam giới bị bệnh.
Gene RS1 là gen mã hóa cho protein Retinoschisin. Protein này được tìm thấy
trong võng mạc và có vai trị vơ cùng quan trọng. Võng mạc là một vùng mô
nhạy cảm với ánh sáng chun biệt nằm phía sau mắt. Retinoschisin có vai trò
gắn (liên kết) vào bề mặt các tế bào chuyên biệt trong võng mạc, có chức năng
phát hiện ánh sáng và màu sắc (hay còn gọi là các tế bào cảm quang).
Retinoschisin cịn có vai trị liên kết các tế bào lưỡng cực, chuyển tiếp tín hiệu
ánh sáng từ tế bào cảm quang đến các tế bào khác. Cùng với các nghiên cứu gần
đây cho thấy, retinoschisin đóng vai trị quan trọng trong sự phát triển và duy trì

9


võng mạc cũng như các tế bào chuyên biệt của nó, tham gia vào việc tổ chức các
tế bào võng mạc bằng cách gắn kết các tế bào lại với nhau.
Là một bệnh di truyền liên kết giới tính hiếm gặp, sự hiểu biết của con người về
bệnh này vẫn cịn tương đối ít. Bài báo cáo này nhằm mục đích tập trung vào
việc phân tích đọt biến gen RS1 và đi sâu vào tìm hiểu cơ chế gây bệnh, những
tác động của dạng đột biến này lên cấu trúc võng mạc cũng như chức năng thị
giác. Đồng thời, với vốn hiểu biết của các nhà khoa học hiện nay về bệnh này
cịn tương đối ít, thì việc nghiên cứu thêm về bệnh này có ý nghĩa to lớn trong
việc mở rộng kiến thức về căn bệnh này, mở ra cơ hội mới cho việc phát triển
các phương pháp chẩn đốn sớm và điều trị hiệu quả hơn. Ngồi ra, việc nghiên
cứu về thể đột biến RS1 nói riêng và căn bệnh võng mạc nói chung cũng là động
lực cho việc thúc đày sự phát triển của nghiên cứu di truyền, phát triển dược
phẩm trong lĩnh vực này.
2. MỤC TIÊU
- Mục tiêu về kiến thức
- Tìm hiểu, học tập các thao tác cơ bản của phịng thí nghiệm, sử dụng
thành thạo các dụng cụ, trang thiết bị.

- Hiểu biết cụ thể, chi tiết hơn về quy trình là việc với một mẫu bệnh phẩm
- Hiểu biết sâu hơn về cách mà các đột biến ảnh hưởng đến kiểu hình như
thế nào
- Định hướng nghề nghiệp tương lai của bản thân.
- Mục tiêu về kỹ năng
- Kỹ năng lập kế hoạch, triển khai các thí nghiệm trong cơng việc
- Kỹ năng vận hành các máy móc sử dụng trong thí nghiệm như máy PCR,
máy điện di, máy ly tâm, máy giải trình tự Sanger,…
- Kỹ năng giao tiếp, làm việc nhóm với mọi người trong phịng thí nghiệm.
10


- Mục tiêu về năng lực tự chủ và trách nhiệm
- Tự khám phá, sáng tạo, tự học hỏi.
- Hiểu biết rõ ràng hơn về trách nhiệm của cá nhân với cơ sở, với đồng
nghiệp, với các trang thiết bị trong phịng thí nghiệm.
- Rèn luyện được khả năng độc lập nghiên cứu.
3. YÊU CẦU
- Tác phong nhanh nhẹn, có tinh thần ham học hỏi.
- Hiểu được nguyên lý cơ bản của các phương pháp thí nghiệm sử dụng
trong quá trình thực tập.
- Có thể tiến hành một số thí nghiệm cơ bản.
4. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
4.1. Vật liệu
4.1.1. Đối tượng nghiên cứu
 Bệnh nhân được chẩn đoán mắc bệnh dịch kính võng mạc có yếu tố di
truyền: Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân được thu thập và được tiến hành
nghiên cứu phân tích di truyền ( tách chiết DNA tổng só và giải trình tự
WES).
 Bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu trước khi tiến hành thu mẫu.

Mẫu nghiên cứu sau khi thu thập sẽ được lưu vào CSDL, các thơng tin
trong q trình nghiên cứu được bảo mật cho bệnh nhân và được lưu trữ
tại phịng Phân tích hệ gen, Viện Nghiên cứu hệ gen trực thuộc Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
4.1.2. Thiết kế nghiên cứu
 Nghiên cứu ngang:
- Xác định mục tiêu nghiên cứu
- Thu thập dữ liệu
11


- Phân tích gene
- Đánh giá các yếu tố liên quan
- Nhận xét, kết luận
- Báo cáo kết quả
4.2. Phương pháp nghiên cứu
4.2.1. Nghiên cứu các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân
 Bệnh nhân có dấu hiệu giảm thị lực và đi khám
 Sau khi nghi ngờ do di truyền thì làm xét nghiệm gen để xem có dấu hiệu
mắc phải bệnh dịch kính – võng mạc hay khơng.
 Khám lâm sàng cho thấy bệnh nhân có biểu hiện:….
4.2.2. Xác định đột biến gen RS1
 Lấy mẫu, bảo quản
- Thu mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân ít nhất 2ml cho vào ống EDTA K2,
bảo quản ở nhiệt độ -20’C
- Vận chuyển mẫu về Viện Nghiên cứu hệ gen, phịng Phân tích hệ gen để
bảo quản.
 Tách chiết DNA tổng số và giải trình tự WES
a) Mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân được thu vào ống chứa EDTA K2 và
lưu trữ ở -20'C cho đến khi sử dụng. Sau đó được mã hóa và tách chiết

DNA tổng số theo quy trình sau:
- Chuẩn bị ống Eppendorf 1.5ml có chứa 20ul Proteinase K ( 20mg/ml). Sau
đó thêm 200ul máu và tiếp đó cho 20ul Rnase (20mg/ml). Hỗn hợp được
trộn đều bằng máy vortex và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.
- Thêm 200ul BL buffer, trộn đều bằng vortex, ly tâm lắng mẫu rồi đem hồn
hợp ủ trên máy ổn nhiệt ở 56’C trong 10 phút. Bổ sung 200ul Ethanol
100% vào hỗn hợp và trộn đều bằng vortex, spin nhẹ bằng máy spindown
12


sau đó chuyển hỗn hợp lên cột tách chiết đặt trong ống thu mẫu rồi dem ly
tâm với tốc độ 10,000 rpm trong 60 giây.
- Sau ly tâm, loại bỏ ống thu mẫu và chuyển cột lên ống thu mẫu mới, bỏ
sung 600ul BW buffer vào cột rồi đem lý tâm tiếp ở 10,000 rpm trong 60
giây.
- Sau ly tâm tiếp tục chuyển cột lên ống thu mẫu mới và thêm 700ul TW
buffer vào cột rồi đem ly tâm ở 10,000 rpm trong 60 giây. Đổ bỏ dịch
trong ống, đặt lại cọt vào ống và đem ly tâm ở 10,000 rpm trong 2 phút để
làm khô cột.
- Sau khi làm khô, chuyển cột sang ống Eppendorf 1,5ml mới, thêm cẩn
thận 80ul dung dịch TE 0.1M ở 56’C vào đáy cột, để cho đệm thấm đều và
ủ ở nhiệt độ phòng 3 phút. Sau đó đem ly tâm ở 12,000 rpm trong 1 phút
để thu DNA.
Kiểm tra DNA vừa thu được bằng điện di trên Agarose 0.8% và sa đó được
lưu trữ ở -20'C cho đến khi sử dụng.
b) Đo nồng độ dsDNA bằng bộ đo Qubit dsDNA HS Assay Kit ( Life
Technologies - Mỹ) sau khi đã kiểm tra bằng điện di Agarose 0.8% với
quy trình sau:
- Chuẩn bị một lượng vừa đủ dung dịch Qubit working bằng cách pha loãng
thuốc thử Qubit dsDNA HS Reagent trong bộ đệm Qubit dsDNA HS

Buffer với tỷ lệ 1:200.
- Thêm vào 2 ống đo Standard mỗi ống 190ul dung dịch Qubit working và
thêm 198ul Qubit working vào mỗi ống đo mẫu.
- Bổ sung lần lượt 10ul Qubit dsDNA HS Standard #1 (0ng/ul) và 10ul
Qubit dsDNA HS Standard #2 (10ng/ul) vào 2 ôg Standard. Với mỗi ống
đo mẫu, thêm 2ul DNA tổng số vào. Tương đương pha loãng 100 lần.

13


- Trộn đều và ủ trong bóng tối 2 phút ở nhiệt độ phòng trước khi đo. Lư ý
tránh tạo bọt trong quá trình thao tác.
- Nồng độ DNA tổng số được đo bởi máy Qubit 2.0 Fluorometer, cường độ
phát huỳnh quang từ chất màu sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ của dsDNA. từ
đó, máy đo sẽ tính tốn nồng độ dsDNA dựa trên nồng độ đường chuẩn
được xây dựng bởi 2 mẫu chuẩn và só lần pha lỗng của DNA tổng số.
c) Giải trình tự tồn bộ hệ gen mã hóa ( Whole Exome SequencingWES) được thực hiện theo quy trình sau:
- Thiết lập thư viện DNA
- Đánh giá chất lượng thư viện và định lượng thư viện DNA thu được
- Giải trình tự thư viện DNA đã làm giàu trên máy NextSeq 500 và phân
tích.
Bước này sinh viên chỉ đọc tài liệu và quan sát, chưa được trực tiếp thao
tác.
 Thiết kế mồi
Sử dụng phần mềm thiết kế mồi Primer3
- Sử dụng NCBI để tìm trình tự CDS
- Dùng cơng cụ để tìm các đoạn exom tương ứng.
- Dùng Primer3 để thiết kế mồi.
- Chọn mồi phù hợp nhất
 Phản ứng PCR

Sử dụng để khuếch đại đoạn gen cần tìm bằng chu trình nhiệt.
- Chuẩn bị hóa chất cho phản ứng PCR như enzym polymerase, đệm, mồi,
nước cất, DNA, máy PCR
- Cái đặt chu trình nhiệt mong muốn lên máy và bắt đầu quá trình
- Thu kết quả PCR.
 Giải trình tự Sanger
- Tinh sạch DNA để chuẩn bị PCR giải trình tự
14


- Giải trình tự
 Phân tích kết quả giải trình tự Sanger bằng Bioedit
4.2.3. Xử lý và lưu kết quả
- Kết quả sẽ được lưu trữ trong CSDL của Phòng Phân tích hệ gen.
4.3. Đạo đức nghiên cứu
 Tính tự nguyện
- Đối tượng nghiên cứu tự nguyện cung cấp mẫu phục vụ mục đích nghiên
cứu.
- Đối tượng nghiên cứu hiểu rõ ràng mục đích của ciệc thu thập mẫu và làm
thí nghiệm.
 Bảo mật thơng tin
- Tất cả thơng tin của đối tượng nghiên cứu được lưu trữ và bảo mật tỏng
CSDL của Phịng Phân tích hệ gen.
5. THÍ NGHIỆM
5.1. Ngày 05/09/2023
 Giới thiệu và làm quen với cán bộ nhân viên tại Phịng Phân tích hệ gen
 Nghe phổ biến kế hoạch thực tập và các nội quy phòng thí nghiệm;
 Đọc các tài liệu, bài báo khoa học để tìm hiểu về mỗi quá trình nghiên
cứu.
5.2. Ngày 06/09/2023 – 10/09/2023

Một số công việc đơn giản để làm quen phịng lab
 Nhận diện vị trí để các trang thiết bị, hóa chất cần thiết cho q trình làm thí
nghiệm.
 Vệ sinh văn phòng và các phòng lab
 Vận hành một số thiết bị trước khi làm việc ở phòng thí nghiệm chung.
 Luyện tập sử dụng Micropipet các loại.
15


5.3. Ngày 11/09/2023
Học cách pha một số hóa chất:
 Pha dung dịch Primer Mix
- [50]pmol/µl => [10], pha khoảng 10µl: Lấy lần lượt 1µl mồi F và 1µl mồi R, bổ
sung 8µl nước.

- [50]pmol/µl => [10], pha khoảng 30µl: Lấy lần lượt 3µl mồi F và mồi R, bổ
sung 24µl nước.

 Pha gel Agarose 0,8%, Agarose 1%
- Với dd gel Agarose 0.8% sẽ cân 0.8g bột Agarose và tương tự dd gel
Agarose 1% sẽ cân 1.0g bột Agarose.
- Hòa tan bột Agarose vào 100ml nước và đun trong bình thủy tinh bằng lị
vi sóng. ( Chú ý khơng đóng kín nắp bình và khơng lắc)
- Đến khi sơi sẽ bỏ ra kiểm tra xem bột đã tan hay chưa, nếu chưa thì tiếp
tục đun nhưng vẫn khơng được lắc, nếu đã tan thì bỏ ra để nguội.
- Gel Agarose sau khi hồn thành sẽ được đổ vào khn hoặc lưu trữ trong
tủ lạnh phục vụ thí nghiệm tiếp theo

 Pha dung dịch đệm TAE 1X ( thể tích 1 lít)
- Chuẩn bị Tris-base: Cân 2.420g bằng cân kỹ thuật 4 số và ch vào bình

thủy tinh.
- Chuẩn bị EDTA: Cân 0.740g bằng cân kỹ thuật 4 số và thêm vào bình
cùng với Tris-base
16


- Chuẩn bị Acid Acetic: Đo thể tích Acid Acetic cần dùng là 57.1ml và cho
vào bình hỗn hợp Tris-base và EDTA
- Thêm nước cất vào bình hỗn hợp vừa rồi cho đến khi thể tích đạt 1 lít.
- Khuấy đều hỗn hợp thu được dung dịch đệm TAE.

Dung dịch TAE 1X

5.4. Ngày 12/09/2023
Quan sát quá trình làm việc của nhân viên với 1 mẫu nghiên cứu

17


5.5. Ngày 13/09/2023
Nhận đề tài, lập đề cương chi tiết
5.6. Ngày 14/09/2023
 Tiến hành nhận mẫu
 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu máu.
- Lấy ống máu ra khỏi tủ đông, rã đông máu trên đá vảy.
- Bật máy ủ nhiệt hoặc bể ổn nhiệt ở mức 56ºC
- Ghi tên ống
- Chuẩn bị các hóa chất và dụng cụ tách máu, bao gồm:
+ Micropippet và đầu tuýp
+ Khay để ống Eppendorf

+ Mẫu máu
+ Bể ổn nhiệt cài nhiệt độ 56ºC
+ Cồn tuyệt đối ( 100%)
+ Buffer: BW buffer, TW buffer, AE buffer, BL buffer.
+ Ống Eppendorf và ống thu mẫu ( 1 cột, 2 ống Eppendorf, 3 ống thu)
- Tiến hành tách máu:
18


+ Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf 1,5ml, thêm 200µl máu vào
ống, ortex nhẹ và spin-down.
+ Thêm 20µl RNase vào mẫu, vortex nhẹ và spin-down. Để hỗn hợp ở
nhiệt độ phịng trong 2 phút.
+ Thêm 200µl BL buffer vào ống, vortex nhẹ và spin-down.
+ Ủ ở 56ºC trong vòng 15 phút, 400rpm ( Mỗi 5 phút lấy ống ra vortex
nhẹ 1 lần). Sau khi xong, lấy ra và để vào khay.
+ Thêm 200µl Ethanol 100% ( cồn tuyệt đối), vortex và spin-down.
+ Chuyển hỗn hợp lên cột, ly tâm 10.000rpm, 25ºC, 60s. Sau đó bỏ ống
thu, chuyển cột lên ống thu mới.
+ Thêm 600µl BW buffer, ly tâm 10.000rpm, 25ºC, 60s. Sau đó bỏ ống
thu, chuyển cột lên ống thu mới.
+ Thêm 700µl TW buffer, ly tâm 10.000rpm, 25ºC, 60s.
+ Ly tâm khô 60s, 25ºC, 13.000rpm. Chuyển cột lên ống Eppendorf.
+ Nhỏ 70µl TE buffer thật nhanh, nhưng tránh để đầu tuýp bị chạm vào
màng lọc làm rách màng. Ủ 5 phút trong nhiệt độ 56ºC.
+ Ly tâm 13.000rpm, 25ºC, 90s.
+ Thu mẫu DNA, vệ sinh và cất dụng cụ.

19

Tách chiết DNA tổng số

5.8. Ngày 16/09/2023
 Đo nồng độ DNA tổng số băng Qubit đsDNA HS Assay kit
20