Tổng quan về công nghệ ADN tái tổ hợp

TỔNG QUAN VỀ CƠNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP
ĐINH ĐỒN LONG
Bộ môn Y Dược học Cơ sở, Khoa Y Dược, ĐHQGHN

Lĩnh vực di truyền học phân tử đã có nhiều bước tiến nhanh chóng kể từ năm
1972 sau khi Paul Berg và các cộng sự là D.A. Jackson và R.H. Symons công bố thành
công đầu tiên trong việc tạo ra một phân tử ADN tái tổ hợp nhân tạo là kết quả ghép nối
ADN có nguồn gốc từ của hai loại virut khác nhau - SV40 (gây bệnh ở khỉ) và phagơ 
(lây nhiễm ở vi khuẩn E. coli). Thành công này đã mở đường cho nhiều nghiên cứu sau
này nhằm tạo ra các phân tử ADN tái tổ hợp khác nhau và nhân dòng (tạo ra nhiều bản
sao) của những phân tử tái tổ hợp đó. Về thuật ngữ, phân tử ADN tái tổ hợp được
dùng để chỉ các phân tử ADN được tạo ra từ hai hay nhiều phân đoạn ADN có nguồn
gốc khác nhau. Nhân dịng (hay nhân bản) là quá trình tạo ra một lượng lớn bản sao
của một phân tử (hoặc phân đoạn) ADN đặc thù, chẳng hạn như phân tử ADN chứa một
gen nhất định nào đó. Những phân tử ADN như vậy sau đó được dùng trong các thao tác
di truyền nhằm các mục đích khác nhau, như lập bản đồ di truyền, giải trình tự, gây tạo
đột biến hay biến nạp gen vào các tế bào. Việc dùng các nguyên lý của ADN tái tổ hợp
để thao tác các gen nhằm mục đích phân tích di truyền hoặc để phát triển các sản phẩm
mới hay cho các ứng dụng khác nữa được gọi chung là kỹ thuật di truyền. Nhờ thành
công trong việc tạo ra phân tử ADN tái tổ hợp đầu tiên, nhóm nghiên cứu của Paul Berg
được trao Giải thưởng Nobel Hóa học năm 1980. Mục tiêu của chương này là giới thiệu
một số nguyên lý và ứng dụng cơ bản trong cơng nghệ ADN tái tổ hợp.
I. NHÂN DỊNG ADN
Các phân tử ADN tái tổ hợp được tạo ra nhằm phục vụ nhiều ứng dụng khác
nhau. Chẳng hạn, để nghiên cứu một gen mã hóa protein ở người, chúng ta cần xác
định trình tự của nó đồng thời tìm hiểu cách mà nó được điều hịa biểu hiện. Đối với
hầu hết các gen, mỗi tế bào người chỉ chứa hai bản sao, vì vậy việc phân tích trực tiếp
gen đó thường khơng thực hiện được do số bản sao ban đầu q ít. Trong khi đó, các
quy trình nhân dịng phân tử cho phép gen đó được nhân lên thành một số lớn bản sao
(hầu như không hạn chế) phục vụ cho mục đích phân tích và thao tác nhằm biến đổi di
truyền. Những biến đổi di truyền này có thể bao gồm từ những thay đổi nhỏ, như thay

thế một vài nucleotit cho đến những biến đổi lớn như làm mất hoặc thêm vào một
đoạn lớn gồm nhiều gen. Một ứng dụng đặc trưng của công nghệ ADN tái tổ hợp là
khả năng tạo ra những gen mới và các sản phẩm của gen mà trước đó chưa hề có
trong tự nhiên.Việc cài các gen được biến đổi di truyền vào các vectơ biểu hiện phù
hợp còn giúp tạo ra những sản phẩm của gen vốn trước đó chưa hề tồn tại hoặc làm
tăng hiệu suất sinh tổng hợp cao hơn mức bình thường.
Đến nay đã có nhiều quy trình tạo và nhân dịng ADN tái tổ hợp được phát triển
gồm nhiều bước kỹ thuật khác nhau, nhưng tựu chung, có thể chia các bước này thành
ba giai đoạn chính: i) Phân lập ADN từ một cơ thể nhất định, ii) Phân cắt ADN thành
các phân đoạn bằng enzym giới hạn, rồi cài (gắn) từng phân đoạn riêng rẽ vào một
vectơ nhân dòng (còn được gọi là thể truyền nhân dòng; đây là phân tử ADN nhân


tạo có khả năng sao chép trong tế bào chủ, ví dụ như tế bào vi khuẩn) để tạo nên các
vectơ tái tổ hợp, và iii) Chuyển (biến nạp) các vectơ tổ hợp vào tế bào chủ, chẳng
hạn như E. coli; lúc này, phân đoạn ADN cài vào vectơ sẽ được nhân dịng cùng với
q trình sinh sản của tế bào chủ. Các phân tử ADN tái tổ hợp được truyền cho tất cả
các thế hệ tế bào con, từ đó tạo nên một quần thể các tế bào mang phân đoạn ADN
được nhân dòng giống nhau và được gọi là một dòng ADN.
Các bước cơ bản của một quy trình tạo ADN tái tổ hợp gồm có:
1) Chọn nguồn cung cấp ADN (cũng có thể là ARN) cần nhân dịng chứa trình tự
nucleotit được quan tâm. Phân tử ADN thu được từ bước này (nếu từ ARN thì
thường qua phiên mã ngược) được gọi là ADN ngoại lai hay ADN cài.
2) Chuẩn bị phân tử ADN cài có kích thước (chiều dài) thích hợp, đồng thời có
trình tự và cấu trúc các đầu 5’ và 3’ phù hợp cho việc gắn vào vectơ.
3) Chọn một vectơ nhân dòng phù hợp và chuẩn bị vectơ để nó có thể tiếp nhận
ADN ngoại lai bằng sử dụng một enzym giới hạn sao cho vị trí cài ADN ngoại
lai khơng làm mất khả năng sao chép (tái bản) của vectơ.
4) Cải biến thêm (nếu cần) các đầu 3’ và 5’ của phân tử ADN ngoại lai và vectơ
để hai phân tử này có các đầu sẵn sàng cho sự ghép nối với nhau.

5) Nối ADN vectơ với ADN ngoại lai trong điều kiện invitro để tạo nên một
phân tử vectơ tái tổ hợp nhờ sử dụng một enzym ligase thích hợp.
6) Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ để nó có thể nhân lên thành nhiều bản
sao (bước nhân dòng).
7) Sàng lọc quần thể các tế bào biến nạp để chọn ra các dòng tế bào mang vectơ
tái tổ hợp mang các đoạn ADN ngoại lai được quan tâm, rồi phân lập và nhân
chúng lên thành từng dòng tế bào riêng biệt.
8) Xác định đặc tính của mỗi dịng và sử dụng chúng cho các mục đích nghiên
cứu và/hoặc ứng dụng chúng trong thực tiễn.
Dưới đây chúng ta đề cập đến một số yếu tố liên quan đến các bước nêu trên.
1.1. TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH CÁC AXIT NUCLEIC

1.1.1. Quy trình tinh sạch các axit nucleic cơ bản
a) Loại protein nhờ dung môi hữu cơ
Phương pháp phổ biến nhất để loại protein lẫn trong dung dịch của các axit
nucleic là dùng các dung mơi hữu cơ (Hình 1). Thơng thường, dung dịch axit nucleic
và protein hịa tan trong nước sẽ được bổ sung một lượng phù hợp dung mơi hữu cơ,
ví dụ như phenol và chloroform. Việc bổ sung dung môi hữu cơ làm thay đổi thành
phần điện môi, làm mất nước và kết tụ các đại phân tử. Tuy vậy, những thay đổi này
thường ảnh hưởng tới protein rõ rệt hơn so với axit nucleic. Vì vậy, trong điều kiện
phù hợp, phần lớn protein sẽ kết tủa trong khi các axit nucleic vẫn ở dạng hòa tan. Sự
kết tụ của protein tạo nên một lớp trắng đục ở giữa hai pha nước và dung môi hữu cơ,
trong khi các axit nucleic vẫn ở dạng hòa tan trong pha nước. Lúc này, chỉ cần dùng
pipet hút pha nước, chúng ta có thể loại bỏ được các protein lẫn trong hỗn hợp.


ADN vµ ARN
trong pha n-íc

Bổ sung

dung mơi

ADN, ARN vµ
protein trong
pha n-íc

Lắc mạnh

Phenol
+
Chloroform

Ly tâm

Protein lín kÕt
tơ gi÷a 2 pha;
Protein nhá tan
trong dung môi
hữu cơ

Hỡnh 1. Dựng dung mụi hu c loại protein khỏi dịch chiết ADN và ARN.

Độ pH phù hợp cho tách chiết các axit nucleic là trung tính hoặc hơi kiềm (pH =
7,0 - 8,5). Trong khoảng pH này, axit nucleic tích điện âm và ưa nước, do vậy chúng
hòa tan mạnh trong nước. Ở pH cao hơn (pH kiềm) thì ARN có xu hướng bị thủy
phân; trong khi ở pH thấp hơn (pH axit), khả năng hòa tan trong nước của các axit
nucleic giảm. Tuy vậy, dựa vào đặc điểm này, khi muốn tinh sạch các axit nucleic có
phân tử lượng nhỏ, người ta có thể dùng pH axit. Lúc này, các ADN phân tử lượng
lớn sẽ kết tủa cùng protein, chỉ các ADN và ARN nhỏ cịn tan trong nước.
Dung mơi hữu cơ được dùng phổ biến nhất để kết tủa protein là phenol và nó

thường được trộn cùng chloroform để tạo nên hỗn hợp dung môi gây kết tủa protein
mạnh (hiệu quả hơn so với khi chúng được dùng riêng rẽ). Tỷ lệ thể tích trộn giữa hai
dung môi này thường là 1:1 hoặc 4:1. Ngồi ra, chloroform có thể được bổ sung thêm
isoamyalcohol với tỷ lệ 24:1. Việc bổ sung một lượng nhỏ isoamylalcohol giúp phân
tách hai pha nước và dung môi hữu cơ rõ ràng hơn, nhờ vậy việc hút pha nước bằng
pipet dễ thực hiện và không bị lẫn với dung môi hữu cơ.
Một vấn đề khi dùng phenol là nó dễ bị oxy hóa thành các hợp chất quinone
(màu hồng). Các hợp chất quinone có thể tạo nên các gốc tự do và làm biến tính các
axit nucleic. Để tránh phenol bị oxy hóa, các dung dịch phenol cần được bảo quản ở
nhiệt độ thấp, gói kín để tránh ánh sáng, hoặc bổ sung một số chất chống oxy hóa như
2-mercapthoethanol, DTT (dithiothreito) hoặc 8-hydroxy-quinoline. Một ưu điểm của
8-hydroxy-quinoline là chất này tạo cho pha dung mơi hữu cơ có màu vàng sáng, dễ
phân biệt với pha nước trong bước kết tủa protein. Ngoài ra, một chất tẩy như SDS
(sodium dodecyl sulfate) có tác dụng làm vỡ màng tế bào, phân giải các thành phần
lipid, đồng thời làm tăng cường sự biến tính và kết tủa protein, cũng có thể được bổ
sung vào hỗn hợp tách chiết và tinh sạch các axit nucleic.
Quy trình tinh sạch các axit nucleic bằng dung môi hữu cơ thường được tiến
hành cùng với ly tâm. Ly tâm giúp phân tách các pha dung môi nhanh hơn, gia tăng
tốc độ kết tụ protein ở giữa hai pha nước và dung môi hữu cơ. Một số quy trình tách
chiết axit nucleic cịn bổ sung thêm các chất làm tăng hiệu suất kết tủa protein.


Trong các quy trình tinh sạch axit nucleic cơ bản, sau khi ly tâm pha nước
thường ở trên pha dung môi hữu cơ. Nhưng trong một số trường hợp, để thu được các
axit nucleic có phân tử lượng lớn có độ nhớt cao và rất khó hút bằng pipet khi pha
nước ở trên, người ta có thể tăng nồng độ muối của pha nước; lúc này, sự phân lớp
nước và dung môi hữu cơ đổi chiều, nghĩa là pha nước ở dưới và việc dùng pipet hút
phần dung môi hữu cơ phía trên sẽ giúp loại bỏ đi các thành phần protein. Phần dịch
còn lại chứa hỗn hợp các axit nucleic có thể dùng cho các bước tinh sạch tiếp theo.
b) Làm kết tủa ADN và ARN

Các phương pháp gây kết tủa ADN và ARN nhằm mục đích tinh sạch và cô đặc
các axit nucleic. Bước này thường liên quan đến việc bổ sung muối (như natri acetate)
làm trung hòa điện tích âm của axit nucleic, do vậy làm giảm khả năng hịa tan của
chúng; sau đó bằng việc bổ sung alcohol (như ethanol hay isopropanol) để tiếp tục
làm giảm khả năng hòa tan của axit nucleic tới điểm kết tủa. Các yếu tố có thể ảnh
hưởng đến hiệu suất kết tủa axit nucleic là nồng độ và loại muối được sử dụng, nồng
độ và loại hợp chất nhóm alcohol, nhiệt độ và thời gian gây kết tủa. Kích thước của
axit nucleic cũng ảnh hưởng đến hiệu suất kết tủa. Thường thì các phân tử axit nucleic
có kích thước khoảng 50 - 100.000 nucleotit có hiệu suất kết tủa gần như nhau. Các
phân tử nhỏ (< 50 nucleotit) có thể kết tủa ở nồng độ muối và alcohol cao, trong khi các
phân tử lớn có thể đạt hiệu suất kết tủa tương đương ở nồng độ muối và alcohol thấp.
Các muối được dùng để trung hịa điện tích của axit nucleic có thể là các muối
chloride (Cl-) của K+ hoặc Na+, nhưng những muối này có xu hướng kết tủa cùng axit
nucleic trong dung mơi alcohol. Vì vậy, để tách chiết các axit nucleic các muối được
dùng phổ biến hơn cả là các muối acetate, nhờ chúng có khả năng hịa tan trong dung
mơi alcohol tốt hơn. Nồng độ các muối acetate được dùng trong bước kết tủa axit
nucleic là khoảng 0,3 M (trước khi bổ sung alcohol).
Các dung môi alcohol thường được dùng để kết tủa axit nucleic là ethanol và
isopropanol. Khi sử dụng ethanol, người ta thường hòa loãng một tỷ lệ 2:1 (với nước)
để gây kết tủa ADN, hoặc 2,2:1 để gây kết tủa ARN. Khi dùng isopropanol, tỷ lệ pha
loãng này thường là 1 - 1,5 : 1.
Các axit nucleic thường được gây kết tủa ở 4oC trong khoảng 30 phút. Tuy vậy,
trong một số thí nghiệm, thời gian gây kết tủa có thể kéo dài hơn (chẳng hạn như qua
đêm) hoặc có thể được thực hiện ở nhiệt độ thấp hơn (-20oC).
c) Các phương pháp bổ sung làm cô đặc các axit nucleic
Trong nhiều trường hợp, các axit nucleic cần được cô đặc thêm để tiến hành cho
các mục đích thí nghiệm khác nhau. Sau đây là một số phương pháp:
+ Kết tủa: việc làm kết tủa các axit nucleic sau đó pha lỗng trong dung dịch có
thể tích nhỏ hơn làm tăng nồng độ các axit nucleic. Đây là một phương pháp đơn
giản, an tồn và ít làm biến tính axit nucleic.

+ Bay hơi: các dung dịch chứa axit nucleic có thể cơ đặc bằng việc làm bay hơi
dung môi. Phương pháp bay hơi có thể thực hiện bằng máy cơ ADN hay máy cô lạnh
chân không. Nguyên tắc hoạt động của máy cô ADN là dùng một bộ phận gia nhiệt


làm bay hơi dung môi (và cả các hợp chất có phân tử lượng nhỏ) cùng với q trình ly
lâm, trong khi vẫn giữ thành phần axit nucleic trong dung dịch (để bay hơi, ống ly tâm
được mở nắp hoặc nắp được đục lỗ). Trong phương pháp cô lạnh chân không, nhiệt
độ thấp giữ mẫu ở dạng đông lạnh, nhưng nhờ một thiết bị gia nhiệt và giảm nhiệt
tuần hoàn trong buồng chân không làm dung môi “thăng hoa” và mẫu được cô đặc.
+ Lọc: phương pháp lọc qua màng cũng có thể giúp cơ đặc nhanh các axit
nucleic. Người ta thiết kế các bộ lọc lúc đầu khi ly tâm không cho các axit nucleic đi
qua mà chỉ cho nước và các phân tử nhỏ đi qua. Sau đó bằng việc rửa màng với dung
mơi thích hợp ở thể tích nhỏ hơn, các axit nucleic được “rửa trơi” khỏi màng và tạo
thành dung dịch có các nồng độ axit nucleic cao hơn.
+ Chiết suất với dung môi hữu cơ: Một phương pháp nhanh và đơn giản là dùng
hỗn hợp nước và butanol. Quy trình này giống như quy trình gây kết tủa protein.
Nhưng ở đây, do nước bị butanol hấp thụ một phần, nên thể tích pha nước giảm đi và
nồng độ axit nucleic tăng lên. Quy trình chiết xuất có thể lặp lại nhiều lần cho đến khi
thu được nồng độ axit nucleic cao như mong muốn.
+ Các phương pháp khác: Một số phương pháp khác có thể kể đến là thẩm tách,
chiết xuất từ gel điện di và sắc ký ái lực. Trong phương pháp sắc ký ái lực, axit
nucleic ban đầu được cho chạy qua cột ái lực và được lưu lại trong cột, sau đó được
rửa trơi bằng nước với thể tích nhỏ hơn. Thành phần cột ái lực có thể là silica hoặc
hydroxyapatite. Tuy nhiên, trong thực tế do thể tích dung mơi cần dùng để thu hồi axit
nucleic thường khá lớn, nên phương pháp này thường được dùng đề tinh sạch axit
nucleic hơn là để làm cô đặc thành phần dịch chiết.
d) Tinh sạch axit nucleic
Như đã nêu ở trên, các phân tử axit nucleic sau khi được chiết xuất có thể được
tinh sạch tiếp bằng cách gây kết tủa nhiều lần, hoặc bằng sắc ký ái lực hay một số

phương pháp khác. Một phương pháp thông dụng hiện nay là kết hợp giữa sắc ký ái
lực và ly tâm. Bước ly tâm giúp cho việc phân tách và thu hồi sản phẩm sắc ký nhanh
hơn. Nguyên tắc này là cơ sở để thiết kế các bộ kít chiết xuất và tinh sạch ADN hoặc
ARN hiện có mặt phổ biến trên thị trường (như kit của hãng Qiagen – Đức, v.v…)
1.1.2. Tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn
Dưới đây là ví dụ về một quy trình tách chiết ADN tổng số từ vi khuẩn:
Bước 1 - nuôi vi khuẩn: để thu sinh khối, tạo mơi trường ni cấy có điều kiện
nhiệt độ, pH và thành phần dinh dưỡng phù hợp. Sau đó thu lấy tế bào, ly tâm lạnh
(thường ở 4oC) với tốc độ khoảng 4000 vòng / phút để thu tế bào. Thơng thường từ 1
lít dịch ni cấy thu lấy khoảng 10 ml cặn vi khuẩn.
Bước 2 - phá màng tế bào vi khuẩn: có nhiều cách, như có thể đơng khơ cặn vi
khuẩn, rồi nghiền với SDS. SDS có tác dụng làm vỡ màng tế bào, phân tách các thành
phần lipid và giải phóng ADN. Có thể nghiền cặn vi khuẩn trong dung dịch đệm chứa
EDTA (Ethylendiamine tetraacetic acid); EDTA có xu hướng hấp thu các ion kim loại
nặng, bao gồm cả Mg2+, gây ức chế hoạt tính của các enzym phân giải ADN


(ADNase) và ARN (ARNase). Cũng có thể phá màng tế bào vi khuẩn bằng việc ủ với
enzym lysozym ở nhiệt độ phù hợp.
Bước 3 - loại bỏ protein của tế bào vi khuẩn: dịch nghiền tế bào vi khuẩn được ủ
với enzym protease K ở nhiệt độ 37oC trong 1 - 2 giờ, thêm vào hỗn hợp phenol chloroform (1 : 1 v/v), lắc nhẹ, ly tâm để thu kết tủa protein.
Bước 4 - kết tủa và thu ADN: Dùng 4/10 thể tích ethanol (100%) lạnh với 1/10
thể tích NaCOOH (3 M) và 5/10 dung dịch đệm chiết ADN, ủ với ARNase để thủy
phân ARN, ủ ở -20oC trong 2 - 3 giờ để tủa ADN. Ly tâm lạnh ở tốc độ 12.000 14.000 vòng / phút trong 15 phút để thu tủa ADN. ADN sau đó được rửa bằng ethanol
70 %. Để tủa khô tự nhiên hoặc bằng máy cơ ADN, hịa tan ADN trong nước siêu
sạch. Mẫu có thể đem bảo quản ở nhiệt độ âm sâu và dùng trong 1 - 2 tháng.
Đối với từng loại vi sinh vật, quy trình cơ bản trên đây có thể cải tiến với nồng
độ các thành phần, các bước tiến hành và thời giai ủ biến đổi cho phù hợp.
1.1.3. Tách chiết ADN từ các mô, tế bào động vật và thực vật
Các bước tiến hành về cơ bản cũng giống như tách chiết ADN ở vi khuẩn, nhưng

trong nhiều trường hợp các tế bào động, thực vật có thể phải nuôi cấy hoặc không cần
nuôi cấy. Tùy từng mẫu sinh phẩm, như tóc, lơng, trứng, máu, v.v… có thể dùng các
quy trình tách chiết với các điều kiện về hóa chất, dung mơi cải tiến cho phù hợp.
1.1.4. Tách chiết và tinh sạch ARN
Để tách chiết ARN, người ta thường bắt đầu từ chiết xuất axit nucleic tổng số
như nêu trên. Sau đó, tùy theo đặc điểm cấu trúc của từng loại ARN, các kỹ thuật tách
chiết ARN khác nhau được sử dụng. Dịch chiết sau khi đã làm sạch protein được ủ
với ADNase để thủy phân ADN, gây tủa để tách chiết ARN tổng số.
Đối với mARN của sinh vật nhân chuẩn, phương pháp tinh sạch phổ biến là
phương pháp sắc ký ái lực trên cột oligo(dT)-cellulose. Dựa vào cấu trúc phân tử của
mARN thường có đi poly(A), người ta thiết kế các cột ái lực mang các hạt có cấu
trúc polyoligo(dT). Dung dịch chứa mARN có hàm lượng muối cao sẽ trung hịa điện
tích của mARN và trình tự đi poly(A) của các phân tử này tạo liên kết bổ sung với
trình tự polyoligo(dT) trên cột sắc ký và vì vậy được lưu lại. Sau đó, việc bổ sung
dung dịch có nồng độ muối thấp (hoặc đơn giản là nước siêu sạch) giúp rửa trôi và thu
hồi mARN lúc này có mức độ tinh sạch cao.
Ngồi phương pháp sắc ký ái lực trên cột oligo(dT), các phân tử mARN cũng có
thể được tinh sạch bằng phương pháp “hấp phụ từ tính”. Theo phương pháp này, hỗn
hợp ARN tổng số được ủ với biotin-poly(dT) trong mơi trường có hàm lượng muối
cao để tạo phân tử lai giữa các trình tự poly(A) và poly(dT). Sau đó bằng việc bổ sung
streptavidin được gắn với một phân tử mang từ tính, chúng sẽ “từ tính hóa” các phân
tử mARN thơng qua cấu trúc biotin-poly(dT), và khi cho dung dịch hỗn hợp ARN
chảy qua ống có từ tính thì các phân tử mARN được giữ lại. Sau đó, bằng việc rửa với
dung dịch có nồng độ muối thấp (hoặc nước), ta sẽ thu được mARN có độ tinh sạch
cao (mặc dù có thể lẫn một lượng nhỏ steptavidin). Nguyên lý này là cơ sở thiết kế
nhiều bộ kit tinh sạch mARN thương phẩm (như PolyA Tract của hãng Promega).


1.1.5. Các phương pháp định tính và định lượng axit nucleic
a) Phương pháp quang phổ

Các cấu trúc vòng thơm (purin và pyrimidin) của các nucleotit cấu tạo nên ADN
và ARN làm cho các phân tử này có cường độ hấp thụ tia tử ngoại cực đại ở bước
sóng 260 nm (chính xác là bước sóng 257 nm, tương ứng với tia UV). Khi tia UV
được chiếu qua dung dịch axit nucleic, mức hấp thụ (viết tắt là A260 hay OD260) tương
quan với nồng độ của các axit nucleic. Tính chất này là nguyên lý cơ bản của việc
dùng quang phổ (giá trị A260) để ước tính nồng độ ADN và ARN có trong dung dịch.
Nếu trong dung dịch chỉ chứa các nucleotit đơn lẻ, thì do các nucleotit hịa tan
khắp dung dịch, nên cường độ hấp thụ của chúng lớn hơn khi chúng ở trong các phân
tử ADN và ARN. Sở dĩ như vậy là do cường độ hấp thụ tia UV chủ yếu do các vòng
purin và pyrimidin chứ không phải do khung đường-phosphate. Trong phân tử ADN
sợi kép, các vòng purin và pyrimidin bị “chắn” bởi khung đường-phosphate và do
chúng chồng lấp lên nhau, nên cường độ hấp thụ giảm. Các phân tử ARN và ADN có
cấu trúc mạch đơn với một số vùng sợi kép có mức hấp thụ trung bình. Nồng độ ADN
và ARN trong dung dịch thường được qui đổi từ chỉ số A260 theo công thức:
1 A260 của dung dịch ADN sợi kép (dsADN)

= 50 g

1 A260 của dung dịch ADN mạch đơn (ssADN)/ARN

= 40 g

1 A260 của dung dịch dNTP/oligonucleotit (nucleotit đơn) = 33 g
Khi tính nồng độ ADN, cũng cần lưu ý đến hệ số pha lỗng của dịch chiết. Từ đó
ta có cơng thức tính (đối với trường hợp áp dụng cho ADN sợi kép) là:
CADN (g/ml) = A260  50  (độ pha lỗng)
Ví dụ: một dịch chiết ADN tổng số (giả thiết gồm hầu hết là dsADN) được pha
loãng 20 lần, khi đo quang phổ thu được A260 bằng 0,7. Dịch chiết ADN đó có nồng
độ là: 0,7  50  20  70 g/ml.
Để kiểm tra độ tinh sạch của dung dịch axit nucleic, người ta thường đồng thời

đo giá trị quang phổ hấp thụ ở bước sóng 280 nm, đây là phổ hấp thụ cực đại của
protein (điều này chủ yếu là do cấu trúc vòng thơm của tryptophan). Độ tinh sạch của
dịch chiết có thể xác định qua tỉ số A260/A280. Dịch chiết chỉ chứa ADN tinh sạch có tỉ
số A260/A280 xấp xỉ 1,8. Nếu lẫn protein, tỉ số này thường thấp hơn 1,8. Nếu lẫn ARN,
tỉ số này lớn hơn 1,8. Dịch chiết chỉ chứa ARN tinh sạch có tỉ số A260/A280 xấp xỉ 2,0.
Phương pháp điện di
Việc phân tích mức độ tinh sạch và định lượng ADN cũng có thể thực hiện với
phương pháp điện di. Do các phân tử ADN ở pH trung tính tích điện âm, trên trường
điện di, nó di chuyển từ cực âm sang cực dương. Có nhiều phương pháp điện di khác
nhau được dùng trong nghiên cứu ADN, trong đó phổ biến nhất là điện di trên gel
agrose và điện di trên gel polyacrylamide bổ sung SDS (viết tắt là SDS-PAGE).


1.2. CÁC ENZYM DÙNG TRONG CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

Bước đầu tiên để có thể tạo ra các phân tử ADN tái tổ hợp là “cắt” một đoạn
ADN đích mong muốn và “gắn” nó vào một phân tử ADN khác (thường là vectơ hay
còn gọi là thể truyền). Chẳng hạn như, để nhân dòng một gen mong muốn, chúng ta
cần xác định được vị trí của gen đó và tách nó ra khỏi hệ gen, hoặc tạo ra cADN của
gen xuất phát từ mARN của nó. Q trình phân lập gen như vậy cần thực hiện chính
xác, nghĩa là khơng làm mất hay bổ sung thêm nucleotit vào trình tự của gen (nếu
khơng vì các mục đích nghiên cứu khác).
Sở dĩ kỹ thuật ADN tái tổ hợp có thể thực hiện được là nhờ ADN dù có nguồn
gốc sinh vật nào cũng đều có thành phần và cấu tạo giống nhau. Chúng đều là trình tự
của các deoxyribonucleotit được nối với nhau qua liên kết phosphodieste, và với hầu
hết các sinh vật (chỉ trừ một số virut), ADN đều có cấu trúc sợi kép. Do vậy, việc
“cắt” và “nối” các đoạn ADN thực chất là xúc tác hình thành liên kết phosphodieste
giữa các deoxyribonucleotit thuộc các phân tử ADN khác nhau.
Về lý thuyết, quá trình ghép nối trên đây có thể thực hiện được bằng các phương
pháp vật lý, hóa học hay bởi cơ chế enzym. Tuy nhiên, các phương pháp vật lý và hóa

học thường khơng hiệu quả nếu cần ghép nối ở các trình tự nucleotit đặc thù. Trong
khi đó, các phản ứng ghép nối nhờ enzym có tính đặc hiệu trình tự nucleotit cực kỳ
cao và diễn ra nhanh nên hiện được dùng phổ biến hơn cả.
Đến nay đã có hàng ngàn enzym đã được tìm thấy và sử dụng trong công nghệ
ADN tái tổ hợp. Dựa vào chức năng của những enzym này, người ta có thể chia
chúng thành một số nhóm chính như sau:
- Các enzym làm đứt gãy liên kết phosphodieste, gồm: các enzym
endonuclease (ví dụ: các enzym giới hạn, DNase I, Mung Bean nuclease, RNaseH,
RNase T1, RNase U2,…), các loại enzym exonuclease (ví dụ: exonuclease III,
exonuclease VII), một số enzym vừa có hoạt tính endonuclease vừa có hoạt tính
exonuclease (ví dụ: nuclease Bal 31, N. crassa nuclease, nucleaza S1, …)
- Các enzym nối khung đường-phosphate. Ví dụ: E. coli ligase, T4 ADN
ligase, T4 ARN ligase,…
- Các enzym tổng hợp liên kết phosphodieste mới. Ví dụ: ADN polymerase I,
T4 ADN polymerase, T7 ADN polymerase, ARN polymerase, enzym phiên mã ngược
(Reverse transcriptase), Poly(A) polymerase, Terminal deoxynucleotidyl transferase
(TdT), polynucleotit phosphorylase, …
- Các enzym gắn thêm hoặc loại gốc phosphate từ axit nucleic. Ví dụ: T4
polynucleotit kinase, alkaline phosphatase, tobacco acid pyrophosphatase, …
- Các enzym và protein bảo vệ, đóng gói, giãn xoắn ADN. Ví dụ: các ADN
methylase, protein liên kết mạch đơn (RecA, SSB …), các topoisomerase I và II, …
Nhìn chung, các enzym thuộc mỗi nhóm đều có chức năng chung như tên gọi của
chúng, nhưng từng enzym lại có những thuộc tính đặc thù nên chúng có thể được lựa
chọn dùng cho các mục đích thí nghiệm khác nhau. Trong phạm vi bài này, chúng ta
chỉ nêu ví dụ về một số enzym của mỗi nhóm (là những enzym được viết nghiêng ở


trên). Trong số các enzym này, các enzym giới hạn (restriction endonuclease) có vai
trị quan trọng hơn cả và khơng thể thiếu trong hầu hết các nghiên cứu liên quan đến
công nghệ ADN tái tổ hợp.

1.2.1. Các enzym giới hạn
Các enzym giới hạn là các enzym làm đứt gãy liên kết phosphodieste trong phân
tử ADN. Các enzym này không “cắt” các nucleotit ở các đầu tận cùng của ADN (các
enzym cắt ở đầu tận cùng được gọi là exonuclease). Điểm nhận biết trên phân tử ADN
của các enzym giới hạn thường là trình tự đặc hiệu phổ biến gồm từ 4 - 8 cặp bazơ
nitơ (bp) và được gọi là trình tự nhận biết hay vị trí giới hạn. Các enzym giới hạn
được chia làm một số lớp, trong đó 3 lớp cơ bản được nêu ở Bảng 1. Chúng ta sẽ chỉ
đề cập đến nhóm enzym giới hạn lớp II vì chúng là nhóm được dùng phổ biến hơn cả
với vai trò như những “chiếc kéo phân tử” để cắt các trình tự ADN mong muốn.
Bảng 1. Thuộc tính cơ bản của các lớp enzym giới hạn (restriction endonuclease)
Lớp

Đặc điểm hoạt tính enzym

I

Enzym đa chức năng nuclease và
methylase; đa tiểu phần kích
thước lớn (> 400.000 dalton)
Có các chức năng endonuclease
và methylase riêng rẽ
Enzym đa chức năng nuclease và
methylase; đa tiểu phần (khối
lượng 250.000 dalton)

II
III

a

Yếu tố đồng
hoạt động
ATP
2+
Mg
SAM
2+
Mg
ATP
a
2+
Mg
b
SAM

Đặc điểm phản ứng cơ chất
Cắt phân tử ADN sợi kép cách vị trí giới
hạn  4000 - 7000 bp
Thường cắt đối xứng phân tử ADN sợi
kép tại vị trí giới hạn
Có vị trí giới hạn gồm 5 hoặc 6 bp, nhưng
cắt cách vị trí này khoảng 10 - 27 bp về
phía đầu 3’

b

khơng thiết yếu nhưng có tác dụng làm tăng hoạt tính, SAM = S – adenosylmethionine

a) Các thuộc tính chung của các enzym giới hạn
Phần lớn các enzym giới hạn được tìm thấy trong tự nhiên ở vi khuẩn, mặc dù

cũng đã có enzym giới hạn đã được tìm thấy ở tảo lục Chlorella. Ở vi khuẩn, các
enzym giới hạn bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi sự lây nhiễm của virut bằng cách cắt (làm
giới hạn) các phân tử ADN virut xâm nhập vào tế bào. Vi khuẩn biến đổi các vị trí
giới hạn trên ADN của bản thân nó bởi cơ chế methyl hóa (gắn gốc –CH3; cịn gọi là
hoạt tính methylase), nhờ vậy ADN của vi khuẩn không bị tác động bởi các enzym
giới hạn do bản thân nó sinh ra. Các enzym giới hạn đầu tiên được phát hiện bởi
Werner Arber, Daniel Nathans và Hamilton O. Smith trong các năm 1962 - 1968, và
các nhà khoa học này đã được trao giải thưởng Nobel Sinh lý học vào năm 1978. Từ
đó đến nay đã có trên 1000 enzym giới hạn khác nhau được tìm thấy liên quan đến
hơn 120 trình tự giới hạn đặc thù. Các enzym giới hạn được đặt tên theo loài sinh vật
mà nó được tìm ra. Thường thì người ta sử dụng hệ thống 3 chữ cái. Chữ thứ nhất đại
diện cho tên chi, các chữ thứ 2 và 3 đại diện cho tên loài. Theo quy ước, các chữ cái
này được viết nghiêng hoặc gạch chân, theo sau là một số la mã. Đôi khi, một số chữ
cái được bổ sung để nhấn mạnh cho chủng vi khuẩn từ đó enzym giới hạn được tìm
thấy. Ví dụ, EcoRI được tìm thấy từ chủng E. coli RY13, cịn HindIII được tìm thấy từ


chủng Haemophilus influenza Rd. Tên các enzym giới hạn được đọc theo cách viết tắt,
ví dụ: BamHI được đọc là “Bam-hát-một”, EcoRI được đọc là “Êkô-rờ-một”, HindIII
được đọc là “Hin-đê-ba”.
Phần lớn các vị trí giới hạn có trình tự lặp lại đảo chiều (còn gọi là đối xứng qua
tâm; xem các ví dụ ở Bảng 2); nghĩa là, khi đọc theo một chiều (hoặc 5’→3’ hoặc
3’→5’) trình tự nucleotit ở hai mạch giống nhau. Ví dụ, vị trí giới hạn của EcoRI là:
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
Bảng 2. Đặc điểm của một số enzym giới hạn được dùng phổ biến

Enzym có trình
tự nhận biết 6 bp

Enzym có trình
tự nhận biết 4 bp

Enzym có trình
tự nhận biết 8 bp
Enzym có trình
tự nhận biết
khơng đối xứng

Tên enzym

Cách phát âm

Nguồn gốc enzym

BamHI

“Bam-hát-một”

BglII

“Bagel-hai”

EcoRI

“Êcô-rờ-một”

E. coli RY13

HaeII

“Hay-hai”

Haemophilus
aeypticus

HindIII

“Hin-đê-ba”

Haemophilus
influenzae Rd

PstI

“Pesti-một”

Providencia stuartii

SalI

“Sal-một”

Streptomyces albus

SmaI

“Sma-một”

Serratia marcescens

HpaII

“Hêpa-hai”

Haemophilus
parainfluenzae

AluI

“Alu-một”

Sau3A

“Sâu-ba-A”

Staphylococcus
aureus 3A

NotI

“Not-một”

Nocardia otitidiscaviarum

BstXI

“Besti-x-một”

Bacillus

amyloliquefaciens H
Bacillus globigi

Arthobacter luteus

Bacillus
stearothermophilus

Trình tự nhận biết (vị trí giới hạn)
5'-G^G A T C C-3'
3'-C C T A G^G-5'
5'-A^G A T C T-3'
3'-T C T A G^A-5'
5'-G^A A T T C-3'
3'-C T T A A^G-5'
5'-R G C G C^Y-3'
3'-Y^C G C G R-5'
5'-A^A G C T T-3'
3'-T T C G A^A-5'
5'-C T G C A^G-3'
3'-G^A C G T C-5'
5'-G^T C G A C-3'
3'-C A G C T^G-5'
5'-C C C^G G G-3'
3'-G G G^C C C-5'
5'-C^C G G-3'
3'-G G C^C-5'
5'-A G^C T-3'
3'-T C^G A-5'
5'-^G A T C -3'

3'- C T A G^-5'
5'-G C^G G C C G C-3'
3'-C G C C G G^C G-5'
5'-C C A N N N N N^N T G G-3'
3'-G G T N^N N N N N A C C-5'

Ghi chú: A = adenin, G = guanin, C = cytosin, T = thymin, R = purin (A/G), Y = pyrimidin (T/C), N = nucleotit bất kỳ


Tất nhiên, khi tạo phân tử ADN tái tổ hợp, Bảng 3. Một số enzym giới hạn có thể
phải chọn enzym giới hạn sao cho không cắt cắt ADN mạch đơn
vào vị trí trong gen. Nói cách khác, các gen
Tên enzym
Vị trí giới hạn
đích cần được cắt sao cho cấu trúc của nó cịn
DdeI
C^TNAG
ngun vẹn. Tuy nhiên, nếu trong trường hợp
HaeIII
GG^CC
chúng ta chỉ quan tâm đến một trình tự nhất
HgaI
GACGC^(N)5
định của gen, chẳng hạn như một promoter hay
HhaI
GCG^C
một enhancer, thì việc cắt có thể chỉ cần giới
HinfI
G^ANTC
HinPI

G^CGC
hạn ở vùng trình tự nucleotit đó.
MnlI
CCTC^ (N)7
Các enzym giới hạn được dùng phổ biến
RsaI
GT^AC
nhất có vị trí giới hạn gồm 4 bp (ví dụ như
TaqI
T^CGA
HhaI) hoặc 6 bp (ví dụ BamHI hay EcoRI). Tuy
vậy, một số enzym có trình tự nhận biết gồm 8 bp (như NotI) hoặc dài hơn (như
BstXI). Cũng có enzym giới hạn mà trình tự nhận biết của nó khơng có tính đối xứng
hoặc có thể cắt với cơ chất là ADN mạch đơn (xem Bảng 3), mặc dù phần lớn các
enzym giới hạn chỉ nhận biết và cắt ADN sợi kép.
b) Tần số xuất hiện vị trí giới hạn trên ADN
Do mỗi enzym giới hạn chỉ cắt ADN ở một trình tự nhận biết (vị trí giới hạn) đặc
thù, nên số vị trí mà một enzym giới hạn có thể cắt trên một phân tử ADN nhất định là
xác định và phụ thuộc vào số vị trí giới hạn có trên phân tử ADN đó. Khi chúng ta
dùng một loại enzym để cắt các bản sao của cùng một hệ gen, thì mỗi phân tử ADN
nhất định sẽ được cắt tại các vị trí giới hạn phân bố khắp hệ gen đặc thù với enzym đó.
Theo nguyên tắc xác suất, trên một phân tử ADN có kích thước đủ lớn thì sự
phân bố các nucleotit có thể được coi là ngẫu nhiên và các trình tự nucleotit đặc thù có
kích thước càng ngắn càng có tần suất bắt gặp cao hơn so với các trình tự nucleotit đặc
thù dài. Điều này có nghĩa là các enzym có vị trí giới hạn 4 bp sẽ cắt phân tử ADN
mau hơn so với các enzym có vị trí giới hạn 6 bp, và cả hai nhóm enzym này đều cắt
phân tử ADN mau hơn so với các enzym có trình tự nhận biết gồm 8 bp.
Hãy xét ví dụ ở một phân tử ADN lớn có sự phân bố các nucleotit ngẫu nhiên và
chứa 50% GC. Đối với phân tử ADN này, tại mỗi vị trí xác suất để bắt gặp 1 trong 4
loại nucleotit A, T, G hoặc C là như nhau. Vậy nên, xác suất để bắt gặp một trình tự

nhận biết, chẳng hạn 5’-CCGG -3’ của enzym HpaII, được tính như sau:
Xác suất bắt gặp C ở vị trí thứ nhất = ¼
Xác suất bắt gặp C ở vị trí thứ hai
= ¼
Xác suất bắt gặp G ở vị trí thứ ba
= ¼
Xác suất bắt gặp G ở vị trí thứ tư
= ¼
Và xác suất bắt gặp các nucleotit ở cả bốn vị trí như trên (5’-CCGG -3’) sẽ bằng
tích của các xác xuất thành phần = (¼)4 = 1/256. Nói cách khác, các đoạn cắt được tạo
ra bởi enzym HpaII sẽ có kích thước trung bình là 256 bp.


Tóm lại, có thể thấy tần số xuất hiện vị Bảng 4. Tần số cắt của enzym giới hạn trên
trí giới hạn trên ADN gồm các nucleotit phân phân tử ADN có các nucleotit ngẫu nhiên
bố ngẫu nhiên và thành phần GC 50% có
Số cặp nucleotit
Tần số cắt
thể ước tính bằng (¼)n, trong đó n là số cặp thuộc vị trí giới hạn
4
4
(¼) = 1 trong 256 bp
bazơ thuộc vị trí giới hạn của enzym tương
5
ứng (xem Bảng 4). Tuy vậy, trong thực tế,
5
(¼) = 1 trong 1024 bp
6
phần lớn các hệ gen khơng có sự phân bố
6

(¼) = 1 trong 4096 bp
8
hồn tồn ngẫu nhiên của các nucleotit, cũng
8
(¼) = 1 trong 65476bp
như thành phần AT và GC không phải lúc
n
n
(¼)
nào cũng tương đương. Chẳng hạn, người ta
thấy trình tự 5’-CG-3’ xuất hiện rất hiếm trên ADN ở sinh vật nhân thật, do đó tần số
xuất hiện vị trí giới hạn của enzym HpaII thấp hơn so với số liệu ước tính ở trên và
kích thước của các đoạn ADN được enzym này tạo ra thường khá lớn (> 256 bp).
c) Vị trí giới hạn và sự nhân dịng ADN
Các enzym giới hạn lớp II có thể cắt
ADN theo một số cách. Như được nêu trên
Bảng 2, một số enzym như SmaI (“smamột”) cắt ADN ở chính giữa trình tự nhận
biết và tạo ra các phân đoạn ADN đầu tù.
Các enzym khác cắt các phân tử ADN theo
kiểu “zigzắc” và tạo ra các đầu dính, hoặc
lệch về phía đầu 5’ như EcoRI (Hình 2),
hoặc lệch về phía đầu 3’ như PstI.

a) EcoRI cắt theo kiểu
zigzắc và tạo ra đầu
dính lệch về đầu 5’

Các enzym tạo ra đầu dính được
dùng nhiều hơn cả trong cơng nghệ ADN
tái tổ hợp vì các phân tử ADN khác nhau

nếu được cắt bởi cùng một enzym thuộc b) HaeIII cắt thẳng
và tạo ra đầu tù
nhóm này sẽ có trình bazơ ở các đầu giống
nhau và bổ sung cho nhau (vì vậy gọi là
đầu dính). Các đầu dính tạo điều kiện để
liên kết phosphodieste nối giữa các phân
Hình 2. Ví dụ về cách cắt của enzym giới hạn
tử ADN được hình thành dễ dàng khi bổ
sung enzym ADN ligase, từ đó tạo ra phân tử ADN tái tổ hợp mới. Như vậy có thể nói
phản ứng nối giữa các phân tử ADN nhờ các enzym ligase là nguyên lý cơ bản của sự
tạo ra phân tử ADN tái tổ hợp. Trong thực tế, các phân tử ADN đầu tù cũng nối được
với nhau nếu nồng độ enzym ADN ligase tăng cao, hoặc khi dùng một số enzym ADN
ligase có hoạt tính nối khung đường-phosphate mạnh, ví dụ như T4 ADN ligase (xem
mục 1.2.2.2 dưới đây).


1.2.2. Các loại enzym khác được dùng trong công nghệ ADN tái tổ hợp
1.2.2.1 Ví dụ về các enzym làm đứt gãy các liên kết phosphodieste không phải
enzym giới hạn
a) DNAase I: Được tách từ tuyến tụy bò; là một enzym endonuclease điển hình;
nghĩa là, nó chỉ cắt trong phân tử ADN, thường cắt cạnh một pyrimidine (T/C) tạo
nên các đoạn oligonucleotit có đầu 5’- nhơ ra ~4 nucleotit. Cơ chất của enzym này
gồm cả ADN mạch đơn và sợi kép; có thể cắt đứt ADN sợi kép nếu cofactor là Mn2+.
Ứng dụng:

thường được dùng để thủy phân ADN nhưng không làm hỏng ARN.

b) Mung Bean Nuclease:
Được tách từ chồi non cây đậu
răng ngựa, có hoạt tính

endonuclease trong các vùng
mạch đơn của ADN và ARN.
Ứng dụng:

thường được
dùng để “cắt tỉa” các đầu của
vectơ hoặc đoạn ADN cài,
chẳng hạn như để chuyển một
đầu dính thành đầu tù, hoặc để
loại bỏ một vị trí giới hạn ở
một đầu vectơ hoặc đoạn cài;
rất hữu ích để cài một phân
đoạn ADN vào một vectơ biểu
hiện theo đúng chiều và vào
đúng khung đọc (Hình 3).

Promoter
 Vectơ biểu
hiện chỉ còn
lại đầu tù

Mung Bean
nuclease

 Vectơ biểu hiện đã được
cắt bởi enzym giới hạn thứ
nhất (có hai đầu dính)

Đoạn ADN cài
được sửa đổi các

đầu giống vectơ
(các bước  - )

Vị trí giới hạn
của enzym giới
hạn thứ hai
Bổ sung enzym
giới hạn thứ hai

 Vectơ biểu
hiện có một
đầu tù và một
đầu dính
Bổ sung
T4 ADN ligase
 Vectơ biểu hiện mang
đoạn cài được “lắp” đúng
chiều và khung đọc tính
từ vị trí của promoter.

c) RNase H: Enzym này
có hoạt tính endonuclease,
nhưng khác với DNase I, nó
3. Sử dụng Mung Bean nuclease để cài một đoạn ADN
chỉ phân hủy đặc hiệu ARN Hình
vào véc tơ theo đúng chiều và khung đọc kể từ promoter.
mỗi khi có cấu trúc phân tử lai
ARN / ADN. Enzym này có ở nhiều sinh vật từ virut, vi khuẩn đến động vật có vú.
Tuy vậy, ở vi khuẩn và sinh vật nhân chuẩn, RNase H có hoạt tính endonuclease, cịn
enzym của một số virut có hoạt tính exonuclease hoạt động ở cả hai đầu 3’ và 5’.

Ứng dụng:

RNase H có thể ứng dụng cho một số mục đích khác nhau: (1) cắt một
trình tự đặc hiệu trên ADN bằng cách tạo ra một đoạn lai ADN / ARN với trình tự
ARN biết trước, rồi tiến hành lai và cắt bằng RNase H; (2) loại bỏ đầu poly(A) của
các phân tử mARN trong điện di, làm giảm hiện tượng nhiễu khi phân tích ARN,
bằng cách lai giữa mARN với trình tự ADN mã hóa của gen rồi cắt bằng RNase H;
(3) loại bỏ mARN trong quá trình tổng hợp cADN bằng phản ứng phiên mã ngược.


d) Exonuclease VII (viết
tắt là Exo VII): Được tìm thấy
ADN
từ E. coli, là một enzym
 Phiên mã và hoàn thiện mARN
exonuclease điển hình, nghĩa là
chỉ cắt liên kết phosphodieste
mARN
phía đầu phân tử; có hoạt tính
thủy phân ADN mạch đơn
 Lai ARN với ADN
(không cắt ADN sợi kép) theo
ADN
cả hai chiều 3’5’ và 5’3’.
mARN
Tuy cắt từ hai đầu, nhưng
nuclease S1
Exo VII
enzym này khơng có xu hướng
cắt từng nucleotit mà cắt thành

các đoạn dài 2 - 100 nucleotit.
 Điện di
Ứng dụng: dùng để cắt đầu
dính trên phân tử ADN sợi kép Gel trung tính
Gel biến tính
Gel biến tính
(chẳng hạn sau khi cắt bằng
enzym giới hạn) để tạo nên
phân tử ADN đầu tù; phối hợp
với nuclease S1 (xem dưới
đây) để xác định kích thước và
lập bản đồ các intron (Hình 4).
e) Nucleaza S1: Được Hình 4. Dùng phối hợp Exo VII và nuclease S1 để lập bản
tách từ Aspergillus oryzae; là đồ intron. Việc cắt phân tử lai giữa mARN và ADN hệ gen
enzym thủy phân ARN hoặc bằng Exo VII sẽ tạo ra đoạn ADN tương ứng với vùng
exon1-intron1-exon2; trong khi đó, phân tử lai này khi được
ADN khi những phân tử này ở cắt bằng nuclease S1 sẽ tạo ra các đoạn ADN thiếu intron.
trạng thái mạch đơn; vừa có
hoạt tính exonuclease vừa có hoạt tính endonuclease, nghĩa là có thể cắt ở bên trong
cũng như từ các đầu của ADN và ARN. Tuy nhiên, hoạt tính cắt ADN mạnh hơn hoạt
tính cắt ARN khoảng 5 lần. Nuclease S1 cắt các polynucleotit thành từng nucleotit
riêng rẽ. Tuy vậy, không cắt khi có cấu trúc ADN sợi kép hoặc khi có phân tử lai
ADN / ARN.
Ứng dụng: dùng cho một số mục đích khác nhau: (1) Cắt bỏ cấu trúc cặp tóc trong
tổng hợp cADN (vì vùng này có dạng mạch đơn); (2) Tạo các phân tử lai ARN / ADN
khơng có đầu thừa để xác định trật tự và chiều dài các đoạn mã hóa của gen; (3) phối
hợp với Exo VII để xác định kích thước và lập bản đồ các intron (Hình 4).
1.2.2.2. Ví dụ về các enzym nối khung đường - phosphat
a) E. coli ADN ligase: xúc tác phản ứng hình thành mối liên kết phosphodieste
giữa các nucleotit nằm kề nhau trên phân tử ADN: một nucleotit có nhóm 5’-,

nucleotit kia có nhóm 3’-OH. ADN ligase của E. coli dùng năng lượng từ NAD+, còn
ADN ligase của virut và động vật có vú được hoạt hóa bởi ATP.


Ứng dụng:

enzym này được dùng để nối các đoạn Okazaki được hình thành bởi
ADN polymerase trong quá trình sao chép ADN. E. coli ADN ligase có thể nối các
đoạn ADN có các đầu dính, nhưng hiệu quả nối các đoạn ADN đầu tù khơng cao (nếu
khơng có một số chất bổ sung như PEG).
b) T4 ADN ligase: được mã hóa bởi gen của thực khuẩn thể T4. Hoạt tính nối
khung đường-phosphat giống như E. coli ADN ligase, nhưng hiệu quả nối các phân tử
ADN đầu tù với nhau mạnh hơn. T4 ADN ligase dùng ATP làm nguồn năng lượng.
Tuy có hoạt tính nối các đoạn ADN sợi kép rất mạnh, song enzym này không hoạt
động với cơ chất là ADN mạch đơn, và không nối ADN với ARN.
Ứng dụng: Đây là một enzym nối khung mạnh, được dùng rộng rãi để nối các
phân đoạn ADN sợi kép với nhau, dù các phân tử này có cấu trúc đầu tù hay đầu dính.
c) T4 ARN ligase: được mã hóa bởi gen của thực khuẩn thể T4; có hoạt tính nối
khung giữa mạch đơn ARN với ADN hoặc ARN. Nghĩa là, enzym này có thể nối giữa
ADN với ADN, giữa ARN với ARN, cũng như giữa ADN với ARN. Như vậy, có thể
thấy sự khác biệt giữa T4 ARN ligase và T4 ADN ligase là T4 ARN ligase có thể nối
các phân tử axit nucleic mạch đơn bất kỳ với nhau và nó có thể hoạt động với cả cơ
chất là ADN hay ARN. Tuy vậy, enzym này thường không hoạt động với cơ chất là
ADN sợi kép, và hoạt tính nối ADN với ADN tương đối yếu.
Ứng dụng: được dùng để nối các phân đoạn ARN với nhau hoặc để nối dài các
mạch ARN hay ADN. Enzym này cũng được dùng để đánh dấu các trình tự ADN
hoặc ARN trong các nghiên cứu xác định trình tự và chức năng gen.
1.2.2.3. Ví dụ về các enzym tổng hợp liên kết phosphodieste mới
Ngoài các enzym ADN và ARN polymerase, dưới đây là một số enzym khác
thuộc nhóm này cũng được dùng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp.

a) Enzym phiên mã ngược (reverse transcriptase): việc phát hiện ra enzym này
bởi David Baltimore (năm 1970) từ retrovirut cũng có thể coi là một trong những cột
mốc quan trọng trong cuộc cách mạng về công nghệ ADN tái tổ hợp. Sự phát hiện ra
enzym này (12 năm sau khi Watson và Crick cơng bố mơ hình chuỗi xoắn kép ADN)
đã bổ sung thêm cho nguyên lý trung tâm của di truyền học (ADN  ARN 
prơtêin) là ARN cũng có thể dùng làm khuôn để tổng hợp nên ADN.
Reverse transcriptase từ retrovirut (như HIV) có 3 hoạt tính: (1) hoạt tính ADN
polymerase dùng ARN làm khuôn (để tổng hợp mạch cADN thứ nhất); (2) hoạt tính
ADN polymerase dùng ADN làm khn (để tổng hợp mạch cADN thứ hai); và (3)
hoạt tính của RNase H (phân giải ARN khi có đoạn lai ARN/ADN). Ba hoạt tính này
của reverse transcriptase giúp các retrovirut có thể tự tái bản hệ gen ARN của chúng
và tạo ra các phân tử ADN sợi kép (cADN) có thể kết hợp với hệ gen tế bào chủ.
Ứng dụng: là một công cụ mạnh để tổng hợp nên các cADN từ mạch khuôn ARN;
là thành phần không thể thiếu trong việc thiết lập các thư viện cADN; được dùng để
đánh dấu đầu 3’ của ADN; cắt bỏ các phân tử ARN khỏi phân tử lai ADN / ARN; sử
dụng trong các nghiên cứu xác định trình tự và chức năng gen.


b) Enzym poly(A) polymerase: có nguồn gốc từ nấm men; có hoạt tính chỉ dùng
ATP làm cơ chất (khác với enzym TdT dưới đây) để xúc tác phản ứng bổ sung adenin
vào đầu 3’-OH của ARN giúp tạo nên hoặc kéo dài đuôi poly(A) của ARN.
Ứng dụng: được dùng với hai ứng dụng chính: (1) đánh dấu đầu 3’ của ARN;
(2) lắp thêm đuôi polyA vào các mARN thiếu đoạn này để có thể nhân dịng cADN.
c) Terminal deoxynucleotidyl
transferase (TdT): tìm thấy từ
tuyến ức của bê; có hoạt tính gắn
vectơ
nucleotit monophosphat vào đầu
Đoạn ADN cài
3’-OH của một chuỗi polynucleotit

giống như poly(A) polymerase,
T4 ADN ligase
song chỉ hoạt động với cơ chất là
ADN và có thể lắp ráp bất kỳ một
loại dNTP nào vào đầu 3’-OH của
ADN mà không cần mạch khuôn
Vectơ đầu dính có xu
ADN. Enzym này cịn được gọi tắt
hướng tự đóng vịng
→ Hiệu suất tái tổ
là terminal transferase.
hợp thấp (25 – 30%)
Ứng dụng: là công cụ hiệu quả
trong tạo các thư viện cADN; giúp
gắn các đoạn trình tự đồng dạng
(polyA, polyT, polyG và polyC)
P
vào đầu 3’-OH của phân tử ADN
P
cần nhân dịng. TdT cịn được dùng
Vectơ khơng tự
đóng vịng → Hiệu
để đánh dấu đầu 3’ của ADN.
1.2.2.4. Ví dụ về các enzym
gắn thêm hoặc loại gốc phosphate
a) T4 polynucleotit kinase (T4
PNK): được mã hóa bởi gen của
phagơ T4; có hoạt tính xúc tác
chuyển nhóm - tận cùng của ATP
sang đầu 5’-OH của một chuỗi

polynucleotit hoặc của nucleotit
riêng lẻ (ADN hoặc ARN).
Ứng dụng: được dùng để đánh
dấu đầu 5’ (chẳng hạn bằng 32P)
của ADN và ARN; phối hợp với
enzym AP (nêu dưới đây) để hạn
chế hiện tượng vectơ tự đóng vòng
sau khi xử lý bằng enzym giới hạn
trong nhân dòng ADN (Hình 5).
b) Alkaline phosphatase (AP):

suất tái tổ hợp cao
(90 – 100%)

T4 ADN ligase
T4 PNK

Đoạn ADN cài
Alkaline
phosphatase

vectơ

Enzym
giới hạn

Hình 5. Dùng các alkaline phosphatase và T4 PNK để
làm tăng hiệu suất tạo vectơ tái tổ hợp (hình dưới),
thơng qua làm giảm số vectơ tự đóng vịng (hình trên).

được tìm thấy phổ biến từ vi khuẩn (như E. coli) đến động vật có vú (như từ hệ tiêu
hóa của bê); có hoạt tính ngược với T4 PNK, nghĩa là xúc tác phản ứng loại gốc -
khỏi đầu 5’- của chuỗi polynucleotit để tạo nên đầu 5’-OH. Alkaline phosphatase từ
E. coli và từ bê có cơ chất hoạt động là ADN, trong khi enzym này từ tơm có thể hoạt
động trên cả cơ chất là ADN hoặc ARN.
Ứng dụng: dùng để loại bỏ đi
Đoạn cài cADN và các
đầu 5’- của ADN hoặc ARN;
vị trí giới hạn của EcoRI
dùng để hạn chế hiện tượng tự đóng
M. EcoRI (EcoRI methylase)
vịng của các vectơ (Hình5).
1.2.2.5. Ví dụ về các enzym bảo
vệ ADN
ADN methylase: phần lớn tế
bào vi khuẩn có khả năng tự methyl
hóa các phân tử ADN của chính nó.
Hiện tượng methyl hóa giúp phân
biệt ADN của vi khuẩn với ADN
của virut và bảo vệ ADN của nó
khỏi tác động của enzym giới hạn;
ngồi ra, methyl hóa ADN cịn liên
quan đến việc phân biệt ADN mạch
khuôn và ADN mạch mới tổng hợp
trong sửa chữa ADN. Vi khuẩn có
hai nhóm ADN methylase chung là
dam- và dcm-methylase. Dam
methylase gắn nhóm methyl (-CH3)
vào vị trí N6 của adenine trong trình

tự 5’-GATC-3’, cịn dcm-methylase
gắn nhóm methyl vào vị trí C5 của
cytosine trong trình tự 5’CC(A/T)GG-3’ (nuclecotit gạch
chân được gắn gốc methyl).
Ngoài hai enzym methylase
chung này, vi khuẩn cịn có các
ADN methylase có vị trí nhận biết
tương đồng với các enzym giới hạn,
ví dụ như M. EcoRI (viết tắt của
EcoRI methylase) có trình tự methyl
hóa là GAATTC, M. HaeIII methyl
hóa ở GGCC, M. PstI ở CTGCAG
và M. TaqI ở trình tự TCGA, v.v…

Đoạn cài cADN có các vị trí giới
hạn EcoRI được methyl hóa
Gắn thêm đoạn nối mang trình tự nhận biết
của EcoRI vào 2 đầu cADN nhờ ADN ligase

Enzym giới hạn EcoRI

T4 ADN ligase

Enzym giới hạn EcoRI

vectơ

Hình 6. Các đoạn nối (8 – 12 bp) mang vị trí giới hạn
(ví dụ ở đây của EcoRI) có thể giúp gắn cADN vào
vectơ tại vị trí cắt của enzym giới hạn này, nếu như

các trình tự nhận biết của trong cADN đã được bảo vệ
(methyl) hóa bởi EcoRI methylase (M. EcoRI).


Ứng dụng:

ADN methylase được dùng để bảo vệ các trình tự nhận biết của enzym
giới hạn xuất hiện trong các phân tử cADN (Hình 6). Ngồi ra, nó cịn được dùng để
làm thay đổi hoạt tính đặc hiệu của enzym giới hạn, ví dụ như M. HpaII làm thay đổi
tính đặc hiệu của enzym giới hạn ScrFI vốn có trình tự giới hạn là CCNGG. Sau khi
xử lý ADN với M. HpaII, ScrFI chỉ cịn nhận ra các trình tự CCAGG và CCTGG.
1.3. CÁC VECTƠ (THỂ TRUYỀN) TRONG CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

Vectơ là phương tiện để vận chuyển, nhân bản hoặc biểu hiện các gen trong công
nghệ ADN tái tổ hợp. Đây thường các phân tử ADN nhỏ cho phép gắn các gen
(ADN) ngoại lai và có khả năng tái bản độc lập trong tế bào chủ. Đến nay đã có nhiều
loại vectơ được phát triển, bao gồm: các vectơ plasmid (có nguồn gốc vi khuẩn), các
vectơ phagơ (có nguồn gốc virut như phagơ ), cosmid (vectơ lai có cả thuộc tính của
plasmid và phagơ), vectơ Ti plasmid (dùng để nhân dòng và chuyển gen ở thực vật)
và các nhiễm sắc thể nhân tạo. Các loại vectơ khác nhau về một số thuộc tính phân tử,
loại tế bào chủ và kích thước tối đa các đoạn ADN cài mà chúng có thể nhân dịng.
Tùy thuộc vào kích thước đoạn ADN cài và tế bào chủ, người ta chọn loại vectơ nhân
dòng phù hợp. Ở mục này, chúng ta đề cập đến một số thuộc tính cơ bản của các loại
vectơ được dùng trong công nghệ ADN tái tổ hợp.
1.3.1. Vectơ nhân dòng plasmid
Plasmid vi khuẩn thường là một phân tử ADN kích thước nhỏ (2 - 5 kb), sợi kép,
dạng vịng, nằm ngồi nhiễm sắc thể và có khả năng tái bản độc lập nhờ nó có một
trình tự khởi đầu sao chép riêng (kí hiệu là ori). Trong một tế bào vi khuẩn thường có
từ 1 đến 50 plasmid (trung bình ~20). Tuy vậy, trong mơi trường có chất kháng sinh,
số lượng plasmid tăng nhanh. Chẳng hạn, khi ni E. coli trong mơi trường có

chloramphenicol, số plasmid trung bình trong mỗi tế bào tăng từ 20 lên khoảng 3500 4000 plasmid sau 12 giờ. Số plasmid tối đa có thể có trong mỗi tế bào thường do
chính các gen của plasmid điều khiển. Một tế bào vi khuẩn có thể có nhiều hơn một
loại plasmid. Các gen trên plasmid thường không liên kết với các gen trên nhiễm sắc
thể của tế bào chủ. Trong tự nhiên, mỗi plasmid chỉ chứa một số ít gen, thường là các
gen kháng chất kháng sinh, gen sinh độc tố (hoặc chất kháng sinh), gen giới tính, …
Các plasmid thường tái bản theo kiểu gián đoạn (kiểu tổng hợp các đoạn okazaki).
Tùy theo chức năng của plasmid trong tế bào chủ, người ta chia làm một số loại
plasmid khác nhau: như plasmid giới tính (F), plasmid kháng chất kháng sinh (R),
plasmid col (có gen mã hóa độc tố colicin giết các vi khuẩn khác). Các vectơ nhân
dịng plasmid được dùng trong cơng nghệ ADN tái tổ hợp thực chất là các sản phẩm
được biến đổi từ các plasmid tự nhiên này và đều tạo ra trong phịng thí nghiệm. Ở
đây, chúng ta chỉ đề cập đến các vectơ có nguồn gốc từ plasmid của E. coli.
Tất cả các vectơ nhân dịng có nguồn gốc từ E. coli plasmid đều có 3 đặc điểm:
1) Có một trình tự ori (khởi đầu tái bản ADN); trình tự này là thiết yếu để
plasmid có thể tái bản trong tế bào E. coli.
2) Có một gen chỉ thị chọn lọc. Gen này biểu hiện như một gen trội, nhờ vậy nó
giúp phân biệt được dễ dàng tế bào E. coli mang vectơ với các tế bào


E. coli khơng có vectơ. Trong các gen chỉ thị chọn lọc phổ biến có các gen
kháng chất kháng sinh, chẳng hạn như gen ampR kháng ampicillin, gen tetR
kháng tetracycline. Khi các vectơ mang những gen này được biến nạp vào các
quần thể vi khuẩn vốn khơng có tính kháng (nghĩa là mẫn cảm với các chất
kháng sinh) thì chỉ các tế bào vi khuẩn tiếp nhận vectơ mới trở nên có tính
kháng và có thể sống được trong mơi trường ni cấy có chất kháng sinh.
3) Có một hoặc một số vị trí giới hạn đặc thù. Thường thì mỗi vectơ chỉ có một
vị trí giới hạn duy nhất đối với một loại enzym giới hạn nhất định, nhưng nó
có thể có nhiều vị trí giới hạn tương ứng với enzym giới hạn khác nhau. Đây
là điểm để cài các đoạn ADN (hoặc gen) cần nhân dòng vào vectơ. Trong quy
trình tạo ADN tái tổ hợp cơ bản nhất, vectơ plasmid được cắt tại vị trí giới

hạn duy nhất của nó bằng enzym giới hạn tương ứng, rồi cài vào vị trí đó một
đoạn ADN cũng được cắt bởi cùng enzym giới hạn đó.
Hình 7 minh họa một vectơ nhân dịng có nguồn gốc từ E. coli plasmid, đó là
vectơ PUC19. Vectơ này dài 2686 bp và có một số đặc điểm sau giúp nó có thể nhân
dịng hiệu quả trong tế bào E. coli:
1) Nó có thể nhân lên thành 100 bản sao trong mỗi tế bào, nhờ vậy tốc độ nhân
SalI
dịng ADN thu được cao.
HincII
2) Nó mang gen chỉ thị chọn lọc ampR. EcoRI KpnI BamHI AccII PstI HindIII
3) Nó chứa một số vị trí giới hạn của
các enzym giới hạn khác nhau tập
SacI
BspMI
XbaI
SphI
XmaI
trung trong một vùng, gọi là vị trí đa
SmaI
nhân dịng (MCS) hay polylinker.
Vị trí đa nhân dịng (MSC; polylinker)
4) Vị trí đa nhân dịng được thiết kế
LacZ
thành một phần của gen lacZ+ mã
hóa enzym -galactosidase của E.
coli. Trong tự nhiên, enzym này
2686 / 0 kb
chuyển hóa lactose thành galactose
và glucose. Tuy vậy, trong điều kiện
ori

invitro, enzym này cịn có hoạt tính
pUC 19
xúc tác chuyển hóa một cơ chất
(2686 kb)
khơng mầu tên là X-gal thành một
hợp chất có màu xanh tím có tên là
5-brom-4-chlor-indigo. Nhờ vậy, có
thể phân biệt được vi khuẩn mang
amp
vectơ tái tổ hợp (chứa ADN cài gắn
vào vị trí đa nhân dịng và phá vỡ
pUC19.
gen lacZ+; có khuẩn lạc màu trắng) Hình 7. Vectơ nhân dịng plasmid
R
ori = trình tự khởi đầu tái bản, amp = gen chỉ thị
với các vi khuẩn không mang vectơ chọn lọc kháng kháng sinh ampicilline, lacZ+ =
tái tổ hợp (gen lacZ+ còn nguyên gen chỉ thị chọc lọc mã hóa -galactosidase.
vẹn, vì vậy -galactosidase được
+

R


biểu hiện và khuẩn lạc có màu xanh tím) trong mơi trường có X-gal. Quy
trình này được gọi là sàng lọc khuẩn lạc xanh – trắng.
Hình 8 minh họa quy trình cài một đoạn ADN vào vectơ nhân dịng pUC19.
Đầu tiên, pUC19 được cắt bằng một enzym giới hạn có một vị trí giới hạn duy nhất
trong MCS. Tiếp theo, người ta tiến hành tạo ra các đoạn ADN cài bằng cách cắt phân
tử ADN tiền thân bằng enzym giới hạn được dùng để cắt pUC19. Do thực tế sự phân
bố vị trí giới hạn trên phân tử ADN tiền thân khơng đều, nên các đoạn cắt được tạo ra

có kích thước khác nhau. Các đoạn cắt này sau đó được trộn với vectơ thu được từ
đầu tiên cùng với việc bổ sung ADN ligase. Enzym ADN ligase sẽ nối hai phân tử
ADN tạo nên vectơ tái tổ hợp. ADN plasmid tái tổ hợp sau đó được chuyển vào tế bào
E. coli, phổ biến bởi một trong hai cách: hoặc (i) ủ tế bào E. coli với hóa chất làm
tăng tính khả biến (khả năng tiếp nhận ADN ngoại lai) của vi khuẩn, hoặc (ii) sử dụng
phương pháp xung điện; trong phương pháp này, một dịng điện có hiệu điện thế cao
được truyền qua tế bào vi khuẩn trong thời gian cực ngắn (vài phần nghìn giây) làm
màng tế bào bị “đánh thủng” tạm thời và ADN có thể đi vào dễ dàng. Ở bước tiếp
theo, các tế bào sau khi biến nạp được nuôi trong môi trường chứa ampicillin. Các
khuẩn lạc sống được tương ứng với các tế bào đã biến nạp thành cơng và chứa vectơ
plamid. Quy trình sàng lọc khuẩn lạc xanh – trắng lúc này được dùng để phân biệt
giữa các tế bào mang vectơ tái tổ hợp (có đoạn ADN cài) với các tế bào mang vectơ
khơng tái tổ hợp
ADN cài
(khơng có đoạn
Các đoạn
làm hỏng
Plasmid pUC 19
ADN cài
ADN cài).
gen lacZ+
Trong thực
tế, hiện tượng
LacZ
Enzym
vectơ tự đóng
giới hạn
ADN ligase
amp
amp

amp
vịng (khơng có
đoạn ADN cài)
diễn ra phổ biến Vectơ không tái tổ hợp tạo
Vectơ sau khi được xử lý
Vectơ tái tổ hợp tạo cho
vì nó chỉ cần cho vi khuẩn có tính kháng
vi khuẩn có tính kháng
với enzym giới hạn
ampicilline đồng thời biểu
ampicilline nhưng không
một phân tử
hiện -galactosidase
biểu hiện -galactosidase
ADN duy nhất.
Để hạn chế điều Hình 8. Cài đoạn ADN cần nhân dòng vào vectơ pUC19 nhằm thu được
này, người ta vectơ tái tổ hợp. (Xem mô tả quy trình ở trong bài.)
thường xử lý
vectơ với enzym alkaline phosphatase (xem mục 1.2.2.4b) nhằm loại bỏ nhóm  ở
đầu 5’của vectơ trước khi thực hiện bước thứ ba; kết quả là vectơ thu được sẽ có đầu
5’-OH. Lúc này, vì thiếu đầu 5’-, ADN ligase sẽ không thể xúc tác phản ứng đóng
vịng vectơ. Đầu 5’-OH sau đó sẽ được sửa thành 5’- để thực hiện phản ứng nối với
đoạn ADN cài nhờ sự có mặt của enzym T4 PNK (xem mục 1.2.2.4a). Khi quy trình
này được sử dụng, hiệu suất thu vectơ tái tổ hợp thường tăng lên (xem Hình 5) và tần
số khuẩn lạc xanh thu được sau biến nạp giảm đi.
+

R

R

R


Trong nhiều trường hợp, việc cắt vectơ và ADN cài không chỉ liên quan đến một
enzym giới hạn duy nhất, mà phải dùng hai enzym giới hạn khác nhau. Lúc này hiện
tượng tự đóng vịng cũng khơng xảy ra vì hai đầu vectơ khơng có trình tự bổ sung với
nhau (khơng cịn đầu dính nên ADN ligase khơng thể nối chúng lại với nhau).
Việc lựa chọn quy trình tạo ADN tái tổ hợp dùng một hay hai enzym giới hạn
còn liên quan đến chiều gắn đoạn cài vào vectơ. Nếu chỉ dùng một enzym giới hạn,
đoạn cài sẽ có hai khả năng gắn vào vectơ với chiều ngược nhau, vì hai đầu của đoạn
cài có trình tự giống nhau (đo đặc điểm đối xứng qua tâm của phần lớn vị trí giới
hạn). Lúc này, việc dùng hai enzym giới hạn sẽ có ưu điểm là đoạn cài sẽ chỉ gắn vào
vectơ theo một chiều xác định, đo hai đầu của đoạn cài lúc này khác nhau.
Các quy trình tạo ADN tái tổ hợp trong thực tế cịn có nhiều cải tiến khác so với
quy trình cơ bản, cũng như đã có nhiều thế hệ vectơ plasmid cải tiến đã được tạo ra có
đặc điểm bổ sung thêm so với pUC19. Chẳng hạn, các vectơ plasmid có thể khác
nhau về trình tự của vị trí đa nhân dịng (để dùng cho các nhóm enzym giới hạn khác
nhau), hoặc được nối thêm một trình tự promoter phagơ hoạt động mạnh vào vùng
biên của đoạn MCS-lacZ. Việc nối thêm promoter phagơ sẽ giúp gen thuộc đoạn
ADN cài trong vectơ tái tổ hợp được phiên mã và tạo ra nên nhiều bản sao ARN nếu
trong tế bào có enzym ARN polymerase phù hợp với promoter đó. Lúc này, nếu các
phân tử ARN được đánh dấu phóng xạ (chẳng hạn bằng việc bổ sung các NTP chứa
đồng vị 32P vào môi trường nuôi cấy) hoặc được đánh dấu bằng các phương pháp
khác (ví dụ như đánh dấu huỳnh quang), thì chúng có thể được dùng làm mẫu dò cho
gen được nhân dòng để sử dụng cho các thí nghiệm phân tích di truyền tiếp theo.
Các vectơ nhân dịng plasmid có thể mang các đoạn cài có kích thước khoảng từ
5 đến 10 kb. Các plasmid mang đoạn cài lớn hơn thường kém bền và có xu hướng mất
trình tự ADN cài sau đó. Đây có lẽ là nhược điểm đáng kể nhất của vectơ plasmid.
Bảng 5. Ưu điểm và nhược điểm của vectơ nhân dòng plasmid

Ưu điểm
1. Cấu trúc tương đối đơn giản, kích thước nhỏ
2. Dễ tinh sạch và phân tích sản phẩm ADN tái tổ hợp
3. Có thể nhân lên một số lượng lớn trong tế bào chủ (hàng trăm bản sao / tế bào) với tốc độ nhanh; do
vậy, hiệu suất nhân dòng cao.
Nhược điểm
1. Hiệu suất biến nạp vectơ tái tổ hợp ở nhiều loại tế bào chủ (không phải vi khuẩn) thấp.

2.

Không mang được các đoạn ADN lớn (> 10 kb).

1.3.2. Vectơ nhân dòng phagơ
Phần lớn các vectơ nhân dòng phagơ có nguồn gốc từ ADN hệ gen của phagơ .
Vectơ phagơ  là phân tử ADN sợi kép, kích thước khoảng 48.502 bp. Vectơ nhân
dòng phagơ thường ưu thế hơn so với các vectơ plasmid về hiệu suất biến nạp vào các
tế bào chủ cao và tốc độ tái bản nhanh. Ngoài ra, các vectơ phagơ thường mang được
các đoạn ADN cài có kích thước lớn hơn (đến 30 kb). Vectơ phagơ có thể nhân dịng
ADN hiệu quả trong cả tế bào vi khuẩn và một số tế bào sinh vật nhân thật, trong khi
các vectơ plasmid thường nhân dịng khơng hiệu quả trong tế bào sinh vật nhân thật.


Một nhóm các vectơ nhân dịng có bản chất phagơ khác cũng được dùng rộng rãi
có nguồn gốc từ phagơ M13. Phagơ 13 có vật chất di truyền là ADN mạch đơn, chứa
10 gen với kích thước khoảng 6,5 kb, trong đó có một vùng gồm 507 nucleotit cho
phép gắn ADN ngoại lai mà không làm hỏng chức năng của phagơ. Từ hệ gen phagơ
M13 người ta gắn thêm gen lacZ làm gen chỉ thị. Đến nay, có rất nhiều vectơ nhân
dòng mới đã được thiết kế và chế tạo từ phagơ M13. Bluescript M13 là một trong
những vectơ phagơ như vậy hiện được dùng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp.
Bảng 6. Ưu điểm và nhược điểm của vectơ nhân dịng có nguồn gốc từ phagơ 

Ưu điểm
1. Hiệu quả biến nạp vào tế bào chủ thường cao hơn các vectơ plasmid (nhờ khả năng tự lây nhiễm,
đóng gói phân tử ADN tái tổ hợp và giải phóng khỏi tế bào chủ).
2. Có thể mang những đoạn ADN cài có kích thước lớn các vectơ plasmid (tới ~30 kb).
o
3. Rất bền khi được bảo quản ở nhiệt độ 4 C. Các dòng virut mang ADN tái tổ hợp có thể bảo quản
một thời gian dài (nhiều năm) khi chưa có nhu cầu sử dụng.
Nhược điểm
1. Kích thước lớn của vectơ (so với vectơ plasmid) làm việc phân tích trình tự phức tạp hơn.
2. Số bản sao của vectơ phagơ trong mỗi tế bào chủ thường thấp hơn so với vectơ plasmid.

1.3.3. Vectơ nhân dòng cosmid
Cosmid là một vectơ nhân tạo gồm một phần có cấu trúc plasmid với hai đầu cos
của phagơ  giúp vectơ có thể tự đóng gói thành phần tử ADN vịng sau khi được
biến nạp vào tế bào chủ. Vectơ này có thể mang đoạn ADN ngoại lai có kích thước
lớn khoảng 40 - 50 kb. Vectơ này vừa thừa hưởng được khả năng tự tái bản của
plasmid, vừa có khả năng tự đóng gói của phagơ .
1.3.4. Vectơ con thoi
Vectơ con thoi là nhóm vectơ vừa có khả năng tái bản trong tế bào vi khuẩn
(như E. coli, nhờ có trình tự ori), vừa có khả năng biến nạp và biểu hiện chức năng
trong các tế bào động vật có vú và các tế bào sinh vật nhân thật khác, như thực vật
hay nấm men; nói cách khác, chúng có thể dùng để biến nạp vào hai hay nhiều loại tế
bào chủ khác nhau. Một ví dụ về vectơ con thoi như vậy là vectơ có thể tái bản trong
tế bào E. coli (dùng gen kháng kháng sinh làm gen chỉ thị chọn lọc) và biểu hiện gen
tái tổ hợp trong tế bào nấm men (dùng gen dấu chuẩn khuyết dưỡng URA3 mã hóa
khả năng phục hồi sinh trưởng trong mơi trường thiếu uracin của chủng nấm men đột
biến ura3 làm gen chỉ thị chọn lọc). Đến nay, đã có nhiều loại vectơ con thoi E. colinấm men được chế tạo. Một số loại có khả năng tái bản thành nhiều bản sao trong
nhân tế bào, một số chỉ tái bản thành một bản sao duy nhất trong nhân tế bào, một số
có xu hướng kết hợp với nhiễm sắc thể nấm men và tái bản cùng hệ gen tế bào chủ.
1.3.5. Các vectơ biểu hiện

Vectơ biểu hiện thường là một vectơ nhân dịng được gắn thêm các trình tự điều
hịa thiết yếu giúp gen được nhân dòng (ADN cài) được phiên mã và dịch mã khi
vectơ được biến nạp vào tế bào chủ thích hợp. Vectơ biểu hiện thường được dùng để
tạo ra các sản phẩm protein do gen được nhân dịng mã hóa. Ví dụ như, cơng nghiệp
cơng nghệ sinh học có thể sản xuất được một loại protein dược liệu với hiệu suất cao
bằng việc tạo ra các vectơ biểu hiện mang gen tái tổ hợp mã hóa cho protein đó và


biến nạp chúng vào một tế bào chủ thích hợp. Để tạo vectơ biểu hiện, thường thì
người ta sử dụng ngay chính các vectơ nhân dịng, rồi bổ sung (gắn) thêm một
promoter (trình tự tín hiệu khởi đầu phiên mã) và nếu cần là một terminator (trình tự
tín hiệu kết thúc phiên mã) phù hợp với loại tế bào chủ mà ở đó gen nhân dịng được
dự kiến biểu hiện. Sự bổ sung các trình tự như vậy cũng có thể thực hiện trên phân tử
ADN cài. Chẳng hạn như, để có thể biểu hiện một gen có nguồn gốc sinh vật nhân
thật, người ta gắn thêm trình tự Shine-Dalgarno (trình tự khởi đầu dịch mã mARN của
E. coli) vào phía trước mã khởi đầu dịch mã (5’-AUG-3’) của gen sinh vật nhân thật
được mong muốn biểu hiện trước khi cài nó vào vectơ và biến nạp vào E. coli.
1.3.6. Các vectơ nhiễm sắc thể nhân tạo
Nhiễm sắc thể (NST) nhân tạo là các vectơ nhân dịng có thể mang các đoạn
ADN cài có kích thước lớn (đến hàng nghìn kb), từ đó tạo nên các phân tử ADN tái tổ
hợp có kích thước giống như các NST nhỏ của sinh vật nhân thật. Ở đây, chúng ta sẽ
xem hai ví dụ là NST nhân tạo nấm men (YAC) và NST nhân tạo vi khuẩn (BAC).
1.3.6.1. NST nhân tạo nấm men (YAC)
YAC là các vectơ nhân dịng có khả năng tự tái bản trong tế bào nấm men. Một
YAC thường có các trình tự sau (xem Hình 9):
1) Đầu mút NST (TEL) có ở hai đầu của mỗi vectơ. Cấu trúc đầu mút này là cần
thiết để NST có thể bền vững và ổn định trong tế bào nấm men.
2) Tâm động của nấm men (CEN). Trình tự này là thiết yếu để NST nhân tạo có
thể phân ly chính xác về các tế bào con khi tế bào nấm men phân chia.
3) Mỗi vai của NST nhân tạo có một gen chỉ thị để phát hiện được tế bào nấm

men mang YAC (ví dụ như các gen TRP1 và URA3 tương ứng mã hóa khả
năng phục hồi sinh trưởng trong môi trường thiếu trytophan và uracin của các
chủng nấm men đột biến trp1 và ura3 làm các gen chỉ thị chọn lọc ở mỗi vai).
4) Một trình tự khởi đầu tái bản ở nấm men (ARS). Trình tự này giúp vectơ có
thể tái bản trong tế bào nấm men.
5) Một vị trí đa nhân dịng mang các trình tự nhận biết duy nhất của các enzym
giới hạn được dùng làm điểm gắn ADN cần nhân dòng.
Các vectơ YAC thường có thể mang các đoạn ADN cài có kích thước dài đến
Vai trái

TEL

TRP1

ARS

Vai phải

CEN

Các vị trí giới
hạn để nhân
dịng (MCS)

URA3

TEL

Hình 9. Vectơ nhân dòng NST nhân tạo nấm men (YAC). Vectơ YAC gồm có cấu trúc đầu
mút NST của nấm men (TEL) ở mỗi đầu, một trình tự tâm động của nấm men (CEN), trên mỗi vai có

một gen chỉ thị chọn lọc (ở đây là TRP1 và URA3), một trình tự khởi đầu tái bản của nấm men
(ARS) và vị trí đa nhân dịng (MCS; là vị trí gắn đoạn ADN cần nhân dòng nhờ enzym giới hạn).

hàng trăm nghìn nucleotit (nghĩa là dài hơn nhiều so với các vectơ plasmid). Trong


thực tế, nó thường được dùng để nhân dịng các đoạn ADN dài từ 0,2 đến 2 Mb (1 Mb
= 1 megabase = 106 bp). Các YAC rất hiệu quả trong các nghiên cứu giải trình tự và
lập bản đồ vật lý các hệ gen kích thước lớn, như dự án Hệ gen người. Tuy vậy, một
nhược điểm của YAC là do có kích thước lớn, nó có thể tái tổ hợp với hệ gen của tế
bào chủ, làm việc lập bản đồ đơi đi khi gặp khó khăn, thậm chí khơng thực hiện được.
Trong tế bào E. coli, các YAC được tái bản giống như một plasmid đóng vịng
nhờ các đầu TEL được nối với nhau. Phân tử YAC đóng vịng được cắt bằng một
enzym giới hạn cắt vào vùng polylinker, trong khi một enzym giới hạn thứ hai cắt vào
giữa trình tự ở các đầu TEL. Bằng cách này vai trái và vai phải của YAC tách khỏi
nhau. Phân tử ADN cài kích thước lớn sẽ nối hai vai lại với nhau. Nhờ vậy, bằng cách
sử dụng môi trường chọn lọc cho cả hai gen TRP1 và URA3, có thể tìm ra các tế bào
nấm men mang vectơ tái tổ hợp có cả hai vai trái và phải của YAC.
1.3.6.2. NST nhân tạo vi khuẩn (BAC)
BAC thường được dùng để nhân dịng các đoạn ADN kích thước lớn đến 300 kb
trong tế bào E. coli. BAC chứa một trình tự khởi đầu sao chép của một plasmid có
trong tự nhiên gọi là yếu tố F, một vị trí đa nhân dịng, một gen chỉ thị chọn lọc và
thơng thường có thêm một số trình tự chức năng khác nữa. Mặc dù YAC có thể mang
được các đoạn cài lớn hơn BAC, song BAC lại có ưu điểm hơn YAC nhờ nó có thể
được thao tác giống với plasmid của vi khuẩn hơn. Khi được biến nạp vào tế bào E.
coli, điểm khởi đầu sao chép của yếu tố F giúp duy trì một bản sao duy nhất của BAC
trong mỗi tế bào. Không giống YAC, đối với BAC không xảy ra hiện tượng tái tổ hợp
với hệ gen tế bào chủ; vì vậy, BAC là vectơ bổ sung rất hiệu quả cho YAC trong các
nghiên cứu lập bản đồ vật lý của các hệ gen kích thước lớn.
Do khả năng mang được các đoạn ADN cài kích thước lớn, BAC cũng thường

được chọn làm vectơ trong các nghiên cứu điều hịa biểu hiện gen ở động vật có
xương sống (ví dụ ở chuột). Đó là vì promoter và các trình tự điều hịa của các gen
động vật có xương sống thường rất dài. Nhờ BAC, người ta hy vọng tồn bộ các trình
tự mã hóa và điều hịa của gen có thể được nhân dịng và biến nạp đồng thời vào tế
bào chủ, qua đó sự phân tích điều hịa biểu hiện của gen đó mới thực hiện được.
1.3.7. Vectơ nhân dòng Ti plasmid
Vectơ nhân dòng Ti là một plasmid kích thước lớn (~200 kb) tìm thấy ở vi khuẩn
gây nốt sần ở thực vật là Agrobacterium tumefaciens. Trong tự nhiên, A. tumefaciens
xâm nhập vào các mô thực vật qua các vết tổn thương ở rễ, rồi chuyển một đoạn ADN
trong plasmid (gọi là đoạn T-ADN) vào tế bào của cây. Đoạn T-ADN dài khoảng 10 20 kb, mang các gen tham gia tổng hợp auxin, cytokinin, opin (gọi chung là các gen
gây khối u) và gen tái bản plasmid (Ori). Ngoài vùng T-ADN, Ti plasmid mang một
vùng gen có vai trị quan trọng trong việc chuyển T-ADN vào tế bào thực vật gọi là
vùng gây độc Vir (virulence) có kích thước khoảng 40 kb. Khi T-ADN được chuyển
vào tế bào thực vật, các gen hoạt động và tăng cường sản sinh auxin, cytokinin và
opin làm cho các tế bào thực vật phân chia khơng kiểm sốt và hình thành các khối u.


Lợi dụng khả năng biến nạp tự nhiên T-ADN vào tế bào thực vật của vi khuẩn A.
tumefaciens, người ta chế tạo ra các vectơ nhân dòng Ti plasmid bằng cách cắt bỏ đi
các gen gây hại cho tế bào thực vật ở vùng T-ADN (các gen tổng hợp auxin,
cytokinin, opin, …) rồi thay vào đó các gen chỉ thị và một polylinker (để qua vị trí
này, một gen mong muốn sẽ được gắn vào vectơ trước khi biến nạp vào thực vật).
Các dịng A. tumefaciens thường có Ti plasmid kích thước lớn, chẳng hạn dịng
C58 có plasmid pTiC58 dài 194 kb, dịng Ach5 có plasmid pTiAch5 dài 213 kb. Kích
thước plasmid lớn như vậy thường khơng thuận lợi cho việc nhân dịng. Do đó, phần
lớn các Ti plasmid phải được “cắt gọt” thành các plasmid nhân tạo có kích thước
giảm đi nhiều mới sử dụng được làm vectơ nhân dòng và chuyển gen ở thực vật.
1.3.8. Các vectơ nhân dịng có nguồn gốc từ virut lây nhiễm sinh vật nhân thật
Phổ biến nhất là các vectơ được biến đổi từ hệ gen của virut SV40 (gây bệnh ở
khỉ) hoặc được biến đổi từ các nhóm adenovirut, retrovirut, baculovirut và virut

hecpet … Các vectơ thuộc nhóm này chủ yếu được dùng để nhân dịng và biểu hiện
các gen có nguồn gốc từ các sinh vật nhân thật bậc cao (như người hoặc thú) hoặc
được dùng để chuyển gen vào động vật bậc cao (như liệu pháp gen ở người).
1.4. CHUYỂN (BIẾN NẠP) VECTƠ TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ

Về lý thuyết, hầu hết các tế bào, dù là vi khuẩn, nấm men, thực vật, hay động vật
đều có thể dùng để nhân dịng ADN. Q trình nhân dịng thường liên quan đến việc
nuôi cấy các tế bào đã được pha lỗng trong các bình ni cấy. Mỗi cụm tế bào phát
triển từ một tế bào ban đầu (khuẩn lạc) có cấu trúc di truyền giống nhau và được gọi
là một dòng tế bào. Việc phân lập các dòng tế bào được thực hiện bằng cách cấy
chuyển các tế bào từ cùng một khuẩn lạc sang một ống nghiệm hay bình ni cấy
riêng có chứa mơi trường dinh dưỡng.
Nhờ kỹ thuật ni cấy tế bào, người ta có thể phân lập được các dòng tế bào
đồng nhất về di truyền. Trong trường hợp một phân tử ADN ngoại lai đã được kết hợp
ổn định vào một tế bào, thì cùng với sự phân chia của các tế bào này, phân tử ADN đó
sẽ được nhân lên (người ta gọi nó là ADN được nhân dòng). Tuy nhiên, để phân tử
ADN ngoại lai được coi là nhân dịng thành cơng, nó phải đảm bảo hai yêu cầu: thứ
nhất, nó phải có khả năng tự tái bản; thứ hai, sau khi tái bản nó phải được phân ly đều
về các tế bào con trong q trình phân bào. Thơng thường, phần lớn các phân tử ADN
ngoại lai tự phát khơng có được các tính chất này. Vì vậy, chúng cần được cài vào các
vectơ vốn được chế tạo có sẵn các thuộc tính tự tái bản và khả năng phân ly về các tế
bào con khi tế bào chủ chia.
Khả năng tiếp nhận ADN ngoại lai của tế bào được gọi là tính khả biến của tế
bào. Trừ một số vi khuẩn, còn hầu hết các tế bào chủ trong tự nhiên đều có tính khả
biến rất thấp. Để nâng cao tính khả biến, các tế bào chủ thường được xử lý với một số
hóa chất, chẳng hạn như các muối canxi (như CaCl2) và/hoặc một số chất khác (như
polyethylenglycon – PEG). Một số kỹ thuật khác cũng thường được dùng để nâng cao
hiệu quả biến nạp ADN vào các tế bào chủ. Trong đó, có lẽ phương pháp được dùng
rộng rãi nhất là xung điện. Không giống với phương pháp xử lý hóa chất có thể chỉ