Đồ án môn học Ứng dụng công nghệ sinh học trong quy trình sản xuất XanThan Gum

1

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM



ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
Đề tài: QUY TRÌNH SẢN XUẤT XANTHAN GUM
GVHD: Nguyễn Thị Thu Sang
Nhóm 2_lớp 11CDTP1
Nguyễn Thị Phương Dung 3005110049
Nguyễn Thị Thùy Dương 3005110041
Nguyễn Thị Oanh 3005110218
Võ Lan Phương 3005110228
Huỳnh Thị Phương Dung 3005110047

Tp.HCM, tháng 6 năm 2014

2

Lời mở đầu
Xanthan gum là một polysaccharide được sinh tổng hợp từ vi sinh vật. Có nhiều loại
polysaccharide được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật như alginate, curlane, dextran,
gellan, glucan, pullulan và xanthan. Trong số những loại này thì xanthan gum có vai
trò vượt trội hơn bởi có tính định hướng, ứng dụng nhiều.
Đối với ngành thực phẩm, những nhu cầu về gum tự nhiên đang có xu hướng giảm
xuống, trong khi đó xanthan lại có xu hướng tăng. Để hiểu hơn về tính chất, ứng
dụng và các cơ chế tổng hợp nên xanthan gum nhóm chúng em xin được tìm hiểu về

“Quy trình sản xuất xanthan gum”.
Tuy nhiên với số lượng khổng lồ các kiến thức đã biết nên việc lựa chọn những kiến
thức nào phù hợp sẽ không tránh khỏi những thiếu sót. Nhóm chúnng em rất mong
nhận được những ý kiến đóng góp của cô, để lần sau nhóm em viết tiểu luận đạt kết
quả cao hơn.












3

Mục lục

1. Tổng quan về xanthan gum 5
1.1. Giới thiệu về xanthan gum 5
1.1.1. Khái niệm 5
1.1.2. Lịch sử ra đời của xanthan gum: 5
1.1.3. Cấu tạo và tính chất 2
1.1.4. Tính chất 8
1.2. Tình hình sử dụng một số loại polysaccharide 8
1.3. Nguyên liệu sản xuất xanthan gum. 9
1.3.1. Vi sinh vật 9

1.3.2. Nguyên liệu khác: 11
2. Quy trình sản xuất xanthangum 15
2.1. Nhân giống 17
2.2. Chuẩn bị môi trường lên men. 18
2.3. Thanh trùng môi trường lên men 19
2.4. Lên men 19
2.5. Thanh trùng 25
2.6. Tách vi sinh vật 26
2.7. Kết tủa 27
2.8. Tách nước 29
2.9. Sấy 29
2.10. Nghiền 31
2.11. Đóng gói 32
3. Sản phẩm 32
3.1. Một số sản phẩm xanthan gum có trên thị trường. 32
3.2. Chỉ tiêu chất lượng của xanthan gum 33
3.3. Ứng dụng 35

4




Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
5

1. Tổng quan về xanthan gum
1.1. Giới thiệu về xanthan gum
1.1.1. Khái niệm
Xanthan gum là một polysaccharide được sử dụng như là một phụ gia thực phẩm và

chất điều chỉnh lưu biến. Là sản phẩm lên men của glucose và saccharose bởi
vi khuẩn Xanthomonas campestris.
Xanthomonas campestris là loại vi khuẩn gây ra bệnh mục đen trên cải, hoa lơ và các
loại rau lá mỏng khác.
1.1.2. Lịch sử ra đời của xanthan gum:
Cách đây rất lâu, con người đã tìm hiểu được rằng các loài Xanthomonas có
thể sản xuất ra những khối sền sệt.
Cuối năm 1950, xanthan đã được phát minh tại Northern Reaseach Center
(NRRC), Peoria, Illinois.
Bà Allene Rosalind Jeanes và cộng sự của bà ở Viện Nông Nghiệp Hoa Kỳ
(United States Department of Agriculture) đã tổ chức cuộc kiểm tra các loài vi sinh
vật có khả năng sản xuất ra các loại gum tan trong nước, trong số đó, xanthan là một
polysaccharide tổng hợp bằng phương pháp sinh học mà có tiềm năng ứng dụng rất
lớn so với các loại gum tan trong nước được sản xuất bằng phương pháp tự nhiên.
Đầu những năm 1960, xanthan trở thành sản phẩm thương mại bởi công ty
Kelco với tên thương mại là Kelzan (theo Whistler) nhưng không thích hợp cho
thương mại mãi đến năm 1964.
Năm 1969, xanthan đã được tổ chức FDA (the American Food and Drug
Administration) cho phép sử dụng làm phụ gia thực phẩm sau những nghiên cứu và
thử nghiệm trên động vật. Nó được phép sử dụng ở các nước: Hoa Kỳ, Canada, Châu
Âu (1982). Số kí hiệu là E415.
Các công ty sản xuất xanthan nổi tiếng: Merck, Pfizer và Kelco của Mĩ, Rhône
Poulenc và Sanofi-Elf của Pháp, Jungbunzlauer của Úc.

Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
6

1.1.3. Cấu tạo và tính chất
1.1.3.1. Cấu tạo
1.1.3.2. Cấu tạo phân tử

Xanthan bao gồm những cụm 5 gốc đường được lặp lại, mỗi cụm gồm 2 gốc
đường D - glucose, 2 gốc đường D - mannose, 1 gốc đường D - glucoronate và các
gốc acetate, pyruvate với số lượng thay đổi.
Mỗi cụm đơn vị của mạch chính trong chuỗi polysaccharide bao gồm các gốc
β – D – glucose, liên kết với nhau bằng liên kết β – 1, 4 glycoside. Yếu tố này giống
với cấu trúc của cellulose.
Mạch nhánh gồm 1 gốc glucoronate nằm ở giữa liên kết với 2 gốc mannose.
Vị trí thứ nhất của gốc D-glucoronate liên kết với vị trí thứ hai của 1 gốc D -
mannose, còn vị trí thứ tư của gốc D-glucoronate liên kết với vị trí thứ nhất của một
gốc mannose khác.
Mạch nhánh liên kết với mạch chính tại vị trí thứ 3 trên gốc cellulose của
mạch chính và vị trí thứ nhất trên gốc mannose của mạch nhánh.
Khoảng một nửa số gốc mannose ở cuối có nhóm acid pyruvic liên kết do
nhóm ketal tạo vòng tại vị trí 4 – 6 trên gốc mannose
Gốc mannose còn lại liên kết với một acetyl tại vị trí thứ 6.
Xanthan gum cũng chứa các ion dương hóa trị một như là Na, K.
Mạch nhánh và mạch thẳng xoắn chặt với nhau tạo thành hình dạng bền chặt
Hình 1.1: Cấu trúc một đơn vị cuả xanthangum
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
7

1.1.3.3. Khối lượng phân tử:
Có thể từ 0.9 triệu đến 1.6 triệu Dalton, nó phụ thuộc vào nguồn vi sinh vật và
điều kiện thực hiện quá trình lên men.
Đôi khi khối lượng phân tử xanthan cũng có thể lên đến 13 - 50 triệu Dalton.
Hình 1.2. cấu tạo của xanthan gum
1.1.3.4. Trạng thái phân tử:
Xanthan là phân tử sinh học xoắn đôi nhưng không đối xứng nhau.
Mạch nhánh và mạch thẳng xoắn chặt với nhau tạo thành hình dạng bền chặt.
Các phân tử có thể co lại hình xoắn ốc kép hình thành nên cấu trúc đặc

quánh, khi gặp một số điều kiện sẽ bị duỗi mạch làm thay đổi tính chất.
Mạch chính được mạch bên bảo vệ nên làm cho xanthan tương đối bền với acid,
kiềm và
enzyme.

1.1.3.5. Thành phần cấu tạo
Acid pyruvic là một thành phần rất quan trọng do nó tác động đến khả năng hòa
tan trong nước của polymer. Thành phần acid pyruvic trong xanthan khác nhau phụ
thuộc vào chủng Xanthomonas campestris (có những chủng sản xuất ra hàm lượng
acid pyruvic rất cao, có những chủng lại sản xuất ra với hàm lượng rất thấp), điều kiện
lên men và điều kiện thu hồi sản phẩm.


Bảng 1.1 Thành phần % của D – glucose, D – mannose, D – glucuronic acid,
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
8

pyruvate,
acetate trong polysaccharide do một số chủng vi khuẩn khác nhau tạo ra
.
Vi khuẩn D -

Gluc
D -

Ma
D –

Glucur
Pyruv

ate
Aceta
te
X.
c
amp
e
st
r
is

30,1

27,
14,9

7,1

6,5

X.vasculorum

34,9

30,
2

17,9 6,6 6,3
X.faseoli

30,9

28,
15,3

1,8

6,4

X.juglandis

33,2

30,
16,8

6,9

6,4

X.gummisuda
ns

34,8

30,
7

16,5 4,7 10
X.fragaria

24,6

26,
14

4,9

5,5


1.1.4. Tính chất
1.1.4.1. Tạo dung dịch có độ nhớt
Khi hòa tan trong nước, bị hidrate hóa một cách nhanh chóng, không bị
đóng cục tạo dung dịch có độ nhớt cao.
Xanthan gum có độ nhớt cao. Dung dịch có nồng độ khoảng 1% có độ nhớt
xấp xỉ 1000 cP khi đo ở 60 v/ph với thiết bị đo độ nhớt Brookfield model LVF ở
25
0
C.
Ảnh hưởng của muối: độ nhớt không bị ảnh hưởng khi thêm một lượng lớn
muối, như trong 250 g/l dung dịch NaCl chỉ làm tăng không đáng kể độ nhớt của dung
dịch xanthan.
1.1.4.2. Tính tương hợp của xathangum:
 Với alcohol
Tuy xanthan không hòa tan trực tiếp được trong alcohol nhưng lại có khả
năng tương thích với nó. Những sản phẩm có chứa xanthan trong công thức thành
phần thường chiếm đến60% dung môi alcohol như ethanol. Ta có thể sử dụng tính
chất này để làm cho cocktail, rượu cómùi chocolate trở nên đặc hơn.
 Với các loại enzyme

Hầu hết các dung dịch keo đều bị thoái hóa ở một giới hạn nào đó bới các
enzyme có mặt trong thực phẩm như cellulase, pectinase, amylase, protease. Tuy
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
9

nhiên, xanthan không bị thoái hóa bới chúng.
Khả năng kháng lại tác động của enzyme là do sự xắp xếp các nhánh chính và
nhánh phụ, sự xắp xếp này chống lại tác động của enzyme lên liên kết 1,4 trong
nhánh chính. Nhờ đó mà ngăn cản được sự ngưng trùng hợp do enzyme, acid và
kiềm. Ứng dụng thực tế, khả năng xanthan chống lại tác động của enzyme đã được
sử dụng trong một số sản phẩm thực phẩm như bánh mứt táo, thực phẩm có chứa tinh
bột, gia vị trộn…
1.1.4.3. Gel thuận nghịch về nhiệt độ:
Gel tạo thành khi làm nguội các hỗn hợp. Xanthan gum ở trạng thái keo có thể
thực hiện sự chuyển đổi cấu hình xoắn ốc đôi thành chuỗi đơn bằng cách tôi luyện ở
nhiệt độ 40 - 80
0
C. Ở cấu hình chuỗi đơn, mạng lưới liên kết yếu đi, hình thành nên
trạng thái giả dẻo (pseudoplastic) làm giảm độ nhớt của dung dịch.
Xanthan gum có khả năng kết hợp được với nhiều chất tạo gel, tạo sệt khác
nhau như locust bean gum, konjac, guar gum.
1.1.4.4. Khả năng hydrat hóa
Sự hiện diện của những chuỗi tích điện âm trong phân tử xanthan gum làm tăng
khả năng hydrate hóa và tạo nên dung dịch xanthan trong nước lạnh.
Xanthan gum là một chất háo nước, tan được trong nước nóng và nước lạnh.
Điều kiện lạnh đông/rã đông: nhờ khả năng liên kết với nước nên dung dịch
xanthan gum rất bền khi lạnh đông cũng như rã đông.
1.2. Tình hình sử dụng một số loại polysaccharide
Có rất nhiều loại polysaccharide được sinh tổng hợp bởi vi sinh vật như alginate,
curlane, dextran, gellan, glucan, pullulan và xanthan.

Trong số những loại này thì xanthan có vai trò vượt trội hơn bởi dễ dàng sản
xuất và được ứng dụng nhiều. Thực vậy, nó đang dần được sử dụng nhiều trong thực
phẩm và trong việc tạo ra chất độn cho mỹ phẩm.
Trong công nghiệp polysaccharide thì xanthan là một trong những đại diện
phát triển nhanh nhất.
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
10

Đối với ngành thực phẩm, những nhu cầu về gum tự nhiên đang có xu hướng
giảm xuống, trong khi đó xanthan lại có xu hướng tăng lên.
Khoảng 20.000 tấn xanthan được sản xuất theo phương pháp công nghiệp
từ giống vi khuẩn X. campestris mỗi năm.
Nhu cầu tiêu thụ xanthan trên toàn thế giới là khoảng 23 triệu kg/ năm và được
dự đoán là sẽ tiếp tục tăng lên 5-10% theo hằng năm.
1.3. Nguyên liệu sản xuất xanthan gum.
1.3.1. Vi sinh vật
1.3.1.1. Giống vi sinh vật
Xanthan được sản xuất từ vi khuẩn Xanthanmonas campestris được cô lập từ
cây cải bắp, nó chính là loại vi khuẩn gây ra bệnh nấm cho cây có màu đen.

Hình 2.1. Vi khuẩn Xanthomonas campestris

Hình 2.2. Cải bắp nhiễm vi khuẩn Xanthomonas campestris


Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
11

1.3.1.2. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn xanthomonas campestris

 Giới: vi khuẩn
 Ngành: Proteobacteria
 Lớp: Gamma Proteobacteria
 Bộ: Xanthomonadales
 Họ: Xanthomonadaceae
 Giống: Xanthomonas
Có dạng hình que đơn, thẳng, rộng 0,4-0,7 µm, dài 0,7-1,8µm
 Vi khuẩn Gram âm
 Có khả năng di động nhờ có tiên mao mọc ở cực
 Là loại vi khuẩn dị dưỡng, hiếu khí bắt buộc
 Không có khả khử nito, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính
 Phát triển trên môi trường dinh dưỡng agar, bị ức chế bởi 0,1%,
triphenyltetrazolium chloride.
Phần lớn chúng sống một mình hoặc theo từng cặp X.campestris làm thành đám
mucoid màu vàng, trơn nhẵn sống trên môi trường rắn, và những tế bào được bao quanh
bởi xanthangum ( polysaccharide ngoại bào). Công thức hóa học của sắc tố vàng được
xác định là môn hoặc dibromoaryl polynen.
Tính không ổn định thuộc về di chuyển của vi khuẩn X. Campestris sẽ ảnh
hưởng đến chất lượng cũng như số lượng xanthan xuất hiện khi nuôi cấy nó. Sự đột
biến gen có liên quan đến việc hình thành 3 dạng khác nhau: L (large) và S ( small) và
VS (very small). Trong khi dạng L sản xuất ra một lượng lớn xathan với những tính
chất lưu biến học mong muốn thì dạng S lại cho lượng sản phẩm ít và chất lượng thì
kém. Còn VS không tổng hợp xanthan.
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
12

Những chức năng của xathan chưa được nhận biết đầy đủ, nhưng có một bằng
chứng chắc chắn rằng có một lớp polysaccharide ở xung quanh màng tế bào, bảo vệ tế
bào tránh khỏi những tác động của môi trường xung quanh. Ví dụ như khả năng giữ
nước của xanthan, nó sẽ cung cấp một lớp màng bảo vệ dưới điều kiện môi trường hanh

khô.
1.3.1.3. Tiêu chí chọn giống
Giống vi khuẩn sử dụng phải đạt những chuẩn mực nhất định mới được phép sử
dụng. Các yếu tố cơ bản đối với giống vi khuẩn sử dụng lên men thu nhậ xanthan gồm:
- Giống vi khuẩn phải có khả năng sinh tổng hợp xanthan mạnh, sản phẩm
này có chất lượng và số lượng cao hơn hẳn các sản phẩm phụ khác trong quá trình trao
đổi chất của chúng.
- Giống phải có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm.
- Giống vi khuẩn có tính thích nghi cao hơn, đặc biệt phải thích nghi với
điều kiện sản xuất công nghiệp, trong đó có sự ổn định về nhiệt độ, pH,…
- Giống phải có tốc độ sinh sản và phát triển rất mạnh trong điều kiện môi
trường công nghiệp. Tính chất này này rất quan trọng vì khi nhiễm vi sinh vật lạ thì
giống dùng trong sản xuất phải có khả năng át chế sự phát triển của vi sinh vật lạ.
- Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản.
1.3.2. Nguyên liệu khác:
a. Nguồn cacbon:
Glucose và saccharose là hai nguồn carbon được sử dụng phổ biến để cung cấp
cho vi khuẩn Xanthanmonas campestris trong quá trình lên men thu nhận xanthan.
Trong đó glucose là nguồn carbon vi khuẩn Xanthanmonas campestris dễ sử dụng. Tuy
nhiên, ở nồng độ cao nó ảnh hưởng xấu tới quá trình lên men của vi khuẩn, theo các
nghiên cứu thì nồng độ glucose 2 – 4% w/w là môi trường lý tưởng cho quá trình lên
men.
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
13

Để thuận tiện và chủ động cho việc sản xuất, ta dùng syrup glucose làm nguồn
cung cấp carbon cho vi khuẩn. Syrup glucose làm nguồn cung cấp cho vi khuẩn.
Ở châu âu người ta dùng syrup bắp để làm nguồn nguyên liệu sản xuất xanthan.
Syrup bắp còn được gọi là high fructose corn syrup (HFCS) do có hàm lượng fuctose
rất cao, được sử dụng phổ biến trong các loại kẹo và đồ uống.

Syrup bắp không phải là loại đường tự nhiên như đường mía hay đường củ cải.
Vì HFCS có được sau quá trình xử lý công nghiệp phức tạp. Người ta sử dụng 3 loại
enzym là α-amylase, glucose amylase thùy phân tinh bột bắp thành đường glucose và
emzym isomerase chuyển hóa glucose thành fructose, tăng độ ngọt và khả năng hòa tan.
Sau đó, glucose tinh khiết được thêm vào hỗn hợp tạo ra HFCS. Gía trị tỉ lệ fructose:
glucose trong HFCS là 90:10, 42:43 hoặc 55:45
b. Nguồn nitơ
Vi khuẩn Xanthanmonas campestris có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ và nguồn
vô cơ. Vì vậy có thể dùng nước ngâm hạt ngũ cốc, dịch thủy phân casein, dịch chiết
nấm men, dịch chiết từ đậu nành, tuy nhiên nguồn nito thường được dùng nhất là muối
amoni. Xathan được sản xuất có chất lượng tốt nếu như X.campestris được nuôi dưỡng
trong một môi trường tổng hợp đơn giản bao gồm NH
4
Cl
2
, glucose và muối.
c. Nguồn khoáng và yếu tố sinh trưởng
Ngoài việc cung cấp các nguyên tố cơ bản thì để quá trình lên men được diễn ra
tốt nhất ta cũng cần cung cấp đầy đủ cho vi khuẩn các nguyên tố khoáng và các yếu tố
sinh trưởng.
Các muối vô cơ là nguồn chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với sự sinh trưởng
của vi sinh vật. Chúng có các chức năng sinh lý chủ yếu là: tham gia vào thành phần
của các hoạt tính ở các enzyme của vi sinh vật, duy trì tính ổn định của kết cấu các đại
phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào, khống chế
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
14

điện thế oxy hoá khử của tế bào và là nguồn vật chất sinh năng lượng đối với một số
loài vi sinh vật.
Bảng 1.2: Muối vô cơ và chức năng sinh lý của chúng

Nguyên tố Hợp chất sử dụng

Chức năng sinh lý
Tiêu chuẩn kĩ
th
u
ậ
t




P


KH
2
PO
4
,
K
2
HPO
4

Là thành phần của acid
nucleic, nucleoprotein,
phospholipid, coenzyme, ATP
Làm nên hệ thống đệm giúp điều

chỉnh pH môi trường.



S

(NH
4
)
2
SO
4
,
MgSO
4

Là thành phần của cá
c
aminoacid chứa S, một số vitamin;

glutathione có tác dụng điều chỉ
nh
điện thế oxy hoá khử trong tế bào.




Mg

MgSO
4

Là thành phần trung tâm
hoạt tính của enzyme phosphoryl
hoá hexose, dehydrogenase của
acid isocitric,
polymerase của acid nucle
ic,



Ca
CaCO
3

CaCl
2
,

Ca(NO
3
)
2

Tạo tính ổn định của một số
cofactor, enzyme duy trì, cần cho
sự dựng trạng thái cảm thụ của tế
bào.

TCVN
3912:1984


Na


NaCl
Thành phần của hệ thốn
g
chuyển vận của tế bào, duy trì á
p
suất thẩm thấu, duy trì tính ổn đị
nh
của một số enzyme.

Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
15



K

KH
2
PO
4

Là cofactor của một số enzyme

,
duy trì áp suất thẩm thấu của tế bào
,
là nhân tố ổn định của ribosome ở

một số vi khuẩn ưa mặn.


Fe

FeCl
3
.6H
2
O FeS0
4

Thành phần của sắc tố vi
khuẩn và một số enzyme, là vật
chất nguồn năng lượng của một số
vi khuẩn sắt, cần thiết để tổng hợp
chlorophyll và độc tố vi khuẩn
bạch hầu.

Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
16


2. Quy trình sản xuất xanthangum


Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
17

2.1. Nhân giống
Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men.
Quá trình nhân giống nhằm mục tiêu thu nhận được số tế bào cao hay nói cách
khác sản phẩm của quá trình sinh khối (thường tính là tổng lượng tế bào/ml). Nhân
giống còn có mục đích chuẩn bị cho quá trình lên men tiếp theo được diễn ra tốt hơn.
Môi trường nhân giống: dịch mail trong ống thạch nghiên chứa 10g/l glucose,
5g/l peptone, 3g/l dịch chiếc nấm men, 20g/l agar. Bảo quản ở điều kiện ở 4

0
C.
Các biến đổi:
- Hóa sinh: Trong quá trình nhân giống vi sinh vật xảy ra rất nhiều phản ứng
hóa sinh bên trong và bên ngoài tế bào làm xuất hiện nhiều sản phẩm trao đổi chất,
góp phần làm thành phần hóa học của môi trường thay đổi liên tục theo thời gian cấy.
- Hóa lý: Trong quá trình nhân giống xảy ra 1 số biến đổi về pha. Việc nhân
giống được thực hiện trong điều kiện hiếu khí nên việc sục không khí vào canh
trường sẽ làm tăng nồng độ oxy hòa tan trong pha lỏng.
- Vật lý: Trong quá trình sinh trưởng, 1 phần năng lượng sẽ tỏa ra ngoài
dưới dạng nhiệt năng. Hiện tượng này có thể làm tăng nhiệt độ canh trường khi nhân
giống vi sinh vật ở qui mô lớn. Do đó cần chú ý hiệu chỉnh nhiệt độ của canh
trường trong suốt quá trình nhân giống.
- Sinh học: Các tế bào vi sinh vật sẽ thực hiện quá trình trao đổi chất và sản
sinh ra nhiều thế hệ tế bào mới.
Thiết bị:
Trong sản xuất, tùy thuộc vào thể tích làm việc của thiết bị lên men mà lượng
giống cấy VSV cần cấy sẽ thay đổi ít hay nhiều. Do đó, số cấp nhân giống cũng sẽ
thay đổi để các nhà sản xuất thu được đúng lượng giống cần sử dụng. Nếu thể tích
bình lên men càng lớn thì lượng giống cấy càng lớn.
Nhân giống được chia làm hai giai đoạn:
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
18

- Nhân giống ở phòng thí nghiệm: sử dụng các ống nghiệm (cấp 1), bình tam
giác hoặc erlen(cấp 2 và 3), bình nuôi cấy(cấp 4).
- Nhân giống ở phân xưởng: sử dụng các bình lên men cho môi trường lỏng.
Bình lên men dùng để nuôi cấy giống VSV có cấu tạo tương tự như những bình lên
men dùng để nuôi cấy VSV thu nhận các sản phẩm trao đổi chất. Thiết bị có dạng hình
trụ đứng, bên trong có cánh khuấy và bộ phân sục khí. Nhiệt độ canh trường trong quá

trình nhân giống có thể hiệu chỉnh được nhờ lớp vỏ áo xung quanh thân trụ thiết bị.
Thông số công nghệ:

- Nhiệt độ: tối ưu là 28 – 30
0
C.
- pH trung tính là tối ưu cho sự phát triển của X. campestris.
2.2. Chuẩn bị môi trường lên men.
Mục đích: chuẩn bị cho quá trình lên men. Môi trường được phối trộn theo một
tỷ lệ nhất định đảm bảo nguồn dinh dưỡng cho vi khuẩn lên men. Sau khi được phối
trộn, môi trường này sẽ được thanh trùng để đảm bảo cho môi trường được vô trùng.
Thành phần môi trường dinh dường lên men tĩnh:

Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
19

Lên men tĩnh được thực hiện trong bình erlen 500ml có chứa 100ml môi trường
lên men được cấy chuyền từ môi trường 10% (v/v) trước khi nuôi cấy 24h.
Sau đó canh trường được ủ ở 30
0
C trong thiết bị khuấy với tốc độ 200v/p trong
96h. Mẫu sẽ được lấy ra thường xuyên để kiểm tra sinh khối, nồng độ xanthan gum và
đường sót.
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy bao gồm nhiều giai đoạn với những yêu cầu khác
nhau. Canh trường nhân giống ban đầu là 10L, sau đó nâng lên 100m
3
để đưa vào sản
xuất. Ở 2 cấp nhân giống liên tiếp, thể tích của môi trường 10 lần.
2.3. Thanh trùng môi trường lên men
Mục đích: chuẩn bị, đảm bảo về mặt vi sinh của môi trường trước khi đem đi lên

men.
Biến đổi: chủ yếu là biến đổi sinh học, ức chế, tiêu diệt các vi sinh vật nhiễm.
Thông số công nghệ:
- Nhiệt độ thanh trùng 70 – 75
0
C.
- Thời gian: 20 phút, sau đó đưa về 25 – 30
0
C là nhiệt độ tối thích cho quá
trình lên men xanthan gum.
Thiết bị: sử dụng thiết bị thsnh trùng dạng bản mỏng
- Bộ phận chính của thiết bị là những tấm hình chữ nhật rất mỏng, làm bằng
thép không gỉ. Mỗi tấm bảng có 4 lỗ tại 4 góc và hệ thống các đường rãnh trên khắp bề
mặt để tạo sự chảy rối và tăng diện tích truyền nhiệt.
- Khi ghép các tấm bảng mỏng lại với nhau trên bộ khung của thiết bị sẽ
hình thành nên những hệ thống đường vào và ra cho chất lỏng cần thanh trùng và chất
tải nhiệt.
2.4. Lên men
Mục đích: khai thác, vì quá trình lên men nhằm thu nhận sản phẩm trao đổi bậc 1
là polysaccharide ngoại bào của vi khuẩn Xanthomanas campestris.
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
20

Những biến đổi:
- Sinh học: có sự trao đổi chất giữa của vi khuẩn với môi trường trong quá
trình sinh trưởng, phát triển, số lượng tế bào vi khuẩn tăng.
- Vật lí: trong quá trình lên men toả nhiệt làm tăng nhiệt độ trong bình lên
men, do đó trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn có thải ra một phần năng lượng ra
bên ngoài dưới dạng nhiệt.
- Hoá lý: độ nhớt tăng lên do polysaccharide tạo ra ngày càng nhiều.

- Hoá sinh: vi khuẩn Xanthomonas campestris sử dụng cơ chất để sinh tổng
hợp ra xanthan gum, là một loại polysaccharide ngoại bào. Quá trình sinh tổng hợp
xanthan gum diễn ra như sau:
 Quá trình đường phân là giai đoạn phân huỷ hủy phân tử glucose tạo ra
acid pyruvic và NADH
2
. Được chia làm 2 giai đoạn:
 Giai đoạn đầu là phân cắt đường glucose thành 2 phân tử đường 3C:
AIPG và PDA.
 Giai đoạn 2 là biến đổi đường 3C thành acid pyruvic.
Sơ đồ: chu trình đường phân
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
21

 Chu trình tricarboxylic xảy ra trong cơ chất ty thể nhờ sự xúc tác của
nhiều hệ enzyme. Bản chất của các phản ứng xảy ra trong chu trình chủ yếu là
decacboxyl hoá và dehydro hoá acid pyruvic. Chu trình gồm 2 phần:
 Phân huỷ acid pyruvic tạo CO
2
và các coenzyme khử.
 Các coenzyme khử thực hiện chuỗi hô hấp để tạo H
2
O và tổng hợp ATP.

Hình 2.2. Chu trình Tricarbonxylic
Tương tự như thực vật bậc cao, vi sinh vật cũng có khả năng tổng hợp ra các
oligosaccharide. Lượng oligosaccharide và polysaccharide nội bào chiếm đến 60% khối
lượng khô của tế bào, còn polysaccharide ngoại bào thì vượt nhiều lần khối lượng tế
bào.Tất cả các oligosaccharide và polysaccharide đều được tổng hợp bằng cách kéo dài
chuỗi saccharide có trước nhờ việc thêm đơn vị monosacccharide. Đơn vị này sẽ tham

gia phản ứng ở dạng nucleotide – monosaccharide đã được hoạt hoá, thường là dẫn xuất
của uridin – diphosphat nhưng đôi khi cùng với nucleotide purin và pirimidin khác.
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
22

Bước đầu tiên của quá trình sinh tổng hợp xanthan là sự hấp thụ carbonhydrate.
Tiếp theo sau đó là quá trình phosphoryl cơ chất bằng enzyme hexokinase để có thể sử
dụng adenosine 5’ – triphosphat. Sự sinh tổng hợp có liên quan đến sự chuyển đổi cơ
chất được phosphoryl hoá thành các loại nucleotide đường khác nhau mà đòi hỏi cần có
sự tham gia của enzyme UDP – Glc pyrophosphorylase để kéo dài chuỗi
polysaccharide.
Trong X.campestris, chu trình Enter – Doudoroff cùng với chu trình tricarboxylic
acid là 2 cơ chế chủ yếu cho sự dị hoá đường glucose. Ngoài ra, một lượng nhỏ đường
glucose đi theo con đường pentose phosphat. Cuối cùng, hai hệ thống riêng biệt trên gặp
nhau, chuẩn bị cho sự hấp thụ glucose. Sinh tổng hợp xanthan, giống như hầu hết các
loại vi khuẩn sản sinh ra polysaccharide, sử dụng nhiều nguồn carbonhydrat hoạt hoá
khác nhau để tổng hợp nên polymer
Xanthan được tổng hợp bằng cách thêm lần lượt monosaccharide vào chuối
oligosaccharide từ đường nucleotide diphosphate cho đến khi tạo thành phân tử cho
isoprenoid lipid. Mạch chính của xanthan được hình thành từ sự thêm vào của D –
glucose – 1 phosphate và D – glucose từ 2 phân tử UDP – D- glucose. Sau đó, D –
mannose và D – glucoronic acid được thêm vào từ GDP – mannose và UDP –
glucoronic acid. Lần lượt nhóm O – Acetyl được vận chuyển từ acetyl – CoA đến phần
mannose còn lại.
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
23


Sự hình thành nên polysaccharide ngoại bào là một quá trình trùng hợp. Ngay
sau khi pentasaccharide lặp lại những đơn vị, ologomer được hình thành bằng sự vận

chuyển đến những chất béo khác ngay lặp tức, dần dần, chuỗi carbohydrate tăng dần
kích thước. Sự hình thành nên oligomer thông thường yêu cầu phải có sự thêm vào của
chuỗi oligosaccharide dài hơn cùng với đơn vị lặp lại cuối cùng được gắn trên
isoprenoid lipid diphosphat.
Mặc dù cấu trúc lặp lại của các đơn vị được xác định bởi sự vận chuyển liên tục
của những monosaccharide khác nhau và những nhóm acyl từ những chất cho tương
ứng dưới sự xúc tác của các enzyme đường đặc biệt, enzyme polymerase tham gia phản
ứng trùng hợp pentasaccharide thành chất đại phân tử có khối lượng phân tử là M > 10
6
.
Giai đoạn cuối cùng của sự tiết ra polysaccharide ngoại bào từ màng tế bào chất, băng
qua chất bao, những lớp màng ở bên ngoài khác và cuối cùng là thoát ra môi trường bên
ngoài, thì ít lí thuyết hơn so với những quá trình sinh tổng hợp trước đó. Cơ chế kết thúc
trong tất cả những vi khuẩn sản sinh ra polysaccharide bằng việc giải phóng polymer từ
isoprenoid lipid trước khi vận chuyển đến trạm cuối cùng. Rõ ràng, quá trình trên đòi
hỏi phải có một nguồn năng lượng và ta có thể coi nó tương tự như quá trình giải phóng
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
24

lipopolysaccharide ra khỏi những màng bên ngoài, ở đây, chất cung cấp năng lượng sẽ
là ATP.
Có một điểm cần chú ý ở đây là có rất nhiều gene ảnh hưởng đến sự tổng hợp
xanthan. Ở vi khuẩn Xanthomonas campestris thì sự tổng hợp xanthan được điều khiển
bởi nhóm 12 gen từ gen B đến gen M. Trong một nghiên cứu về Xanthomonas
campestris, khi sử dụng transposon mutagenesis, Harding đã phát hiện rằng có một
nhóm gene liên kết với nhau và chúng đóng vai trò là enzyme mã hoá cho quá trình lắp
ráp của pentasaccharide. Nhóm gene này được phân lập và phân tích bởi Thorne,
Vanderslice và đồng sự, được sắp xếp theo trình tự AND và bao gồm 12 gene, trong đó
có 7 gene cần cho sự vận chuyển monosaccharide và những đơn vị lặp lại nhóm acyl.
Những gene cần thiểt cho quá trình acyl hoá xanthan còn được kiểm nghiệm kĩ hơn bở

Marzocca và đồng sự. Một chất quan trọng khác trong việc hình thành nên tính di
truyền học của Xanthanmonas là sự có mặt của gene xanA và xanB. Những gene này
được cho là có liên quan đến sự sinh tổng hợp UDP – glucose và GDP – mannose. Gần
đây, chúng còn được cho là những gen mã hoá UDP – glucose pyrophosphorylase (cần
thiết cho sự sinh tổng hợp xanthan). Trên thực tế, qua sự phân tích về gene và sự sắp
xếp AND, có khoảng trên 20 gene thích hợp.
 Thiết bị lên men:
Xanthan là sản phẩm thương mại, được thực hiện bằng quá trình lên men tĩnh
truyền thống trong những bình lên men có động cơ khuấy (STR – stirred tank rate).
Bình lên men có cánh khuấy nhằm mục đích cung cấp oxy cho canh trường,
nhiệt độ giống cấy phải được điều khiển. Dung dịch đệm phosphate hoặc dung dịch
đệm khác phù hợp được bổ sung vào môi trường dinh dưỡng để duy trì pH ổn định của
canh trường trong khoảng 7. Bình lên men được trang bị hệ thốnh vô trùng, khuấy, điều
kiện hiếu khí, đièu chỉnh nhiệt độ, pH, bọt, mức độ hoà tan oxy. Môi trường lên men
trước khi cho vào thiết bị phải được thanh trùng. Sau đó giống vi khuẩn được cấy vào
Quy trình sản xuất xanthan gum nhóm 2
25

khoảng 5% - 10% thể tích môi trường. Môi trường dinh dưỡng yêu cầu phải có muối
khoáng (P, K, S, Mg, Ca…), nguyên tố vết, glucose hoặc carbohydrate, nguồn nitơ như
NH
4
Cl hoặc NH
4
NO
3
, nếu cần thiết phải bổ sung thêm các yếu tố sinh trưởng, gồm
vitamin và các acid amin cần thiết. Nguồn nitơ có thể dùng dịch chiết nấm men, dịch
men tiêu hóa…
 Thông số của thiết bị lên men tĩnh:

- Tốc độ khuấy cho phép: 1000 – 2000 v/ph, tốc độ tối ưu: 500 – 1000 v/ph.
- Tốc độ sục khí: 0,2 – 2 vvm, tối ưu: 0,5 – 1 vvm
- Nhiệt độ lên men: 20 – 35
0
C, tối ưu: 25 – 30
0
C
- Thời gian lên men: 96h
- pH: 5,5 – 8, tối ưu: 6,4 – 7,4.
- Oxy hoà tan: bão hòa 10% - 90%, tối ưu: bão hoà 20% - 60%.
2.5. Thanh trùng
Mục đích: chuẩn bị sau giai đoạn lên men, xanthan được thu nhận qua các quá
trình xuôi dòng. Canh trường sau lên men phải được thanh trùng nhằm mục đích tiêu
diệt hết các tế bào vi khuẩn Xanthanmonas chuẩn bị cho quá trình nhằm tách vi sinh vật
và kết tủa xanthan.
Biến đổi:
- Sinh học: vi khuẩn Xanthanmonas còn lại trong canh trường sẽ bị tiêu diệt
hết.
- Hoá lý: độ nhớt giảm do nhiệt độ tăng.
Thiết bị: dùng thiết bị thanh trùng hình trụ có cánh khuấy.
Thiết bị gồm 2 ống hình trụ đồng trục đường kính khác nhau. Trên trục có cánh
khuấy và thanh chắn thẳng đứng tháo lắp được, trục nối với motor truyền động.