Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen lúa nếp thơm và kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị SSR

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan rằng:
Đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa
học của PGS. TS. Phan Hữu Tôn.
Số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn là khách quan, trung
thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ bất kỳ một công trình nào.
Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông
tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Xuân Trường
i
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, em chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong khoa
Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến
thức trong bốn năm học tập. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học
không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu
để em bước vào đời.
Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Phan Hữu Tôn-Trưởng bộ
môn SHPT & CNSH Ứng dụng -khoa Công nghệ sinh học- trường Đại học Nông
Nghiệp Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện để em hoàn thành đề tài này.
Em xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình, hướng dẫn chỉ bảo của Ths. Nguyễn Văn
Hùng, cùng các anh chị làm việc tại Trung tâm bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây
trồng đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành quá trình thực tập này.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người luôn bên
cạnh động viên, quan tâm giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài
này.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng do thời gian có hạn, trình độ kĩ năng của
bản thân còn nhiều hạn chế nên bài báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót. Em kính
mong nhận được sự góp ý, nhận xét từ phía quý thầy, cô để kiến thức của em được
hoàn thiện hơn.

Em xin chân thành cảm ơn.
Hà Nội, ngày tháng năm 2014
Sinh viên
Nguyễn Xuân Trường
ii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU viii
TÓM TẮT ix
PHẦN I. MỞ ĐẦU 1
1.1.Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Tổng quan chung về bệnh bạc lá 3
2.1.1.Nguyên nhân gây bệnh 3
2.1.2. Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa 3
2.1.3. Đặc điểm phát sinh phát triển của bệnh và biện pháp phòng trừ 4
2.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo lúa nếp trong nước 5
2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa nếp kháng bệnh bạc lá
7
2.4. Nghiên cứu tính trạng mùi thơm 9
2.5. Các phương pháp đánh giá quan hệ di truyền giữa các mẫu giống 10
2.5.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị 10
2.5.2. Chỉ thị hình thái 11

2.5.3. Chỉ thị isozyme 11
2.5.4. Chỉ thị phân tử - chỉ thị DNA( Phan Hữu Tôn, 2005) 11
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14
3.1. Vật liệu nghiên cứu 14
iii
3.2. Phương pháp nghiên cứu 15
3.2.1. Bố trí thí nghiệm đồng ruộng 15
3.2.2. Kỹ thuật trồng và chăm sóc 15
3.2.3. Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học cơ bản 16
3.2.4. Phương pháp đánh giá mùi thơm 17
3.2.5. Phương pháp đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá bằng lây
nhiễm nhân tạo 17
3.3.Phương pháp xác định gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 bằng chỉ thị phân
tử 17
3.3.1. Phương pháp tách chiết DNA 17
3.3.2. Kiểm tra khả năng mang gen kháng Xa4, Xa7 bằng PCR 18
3.4. Phương pháp xử lý số liệu 19
PHẦN IV.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20
4.1. Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học 20
4.1.1. Một số chỉ tiêu sinh trưởng 20
4.1.2. Khả năng đẻ nhánh, tỉ lệ nhánh hữu hiệu 23
4.1.3. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 25
4.1.4. Kết quả đánh giá mùi thơm 28
4.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá 30
4.2.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp lây nhiễm
nhân tạo 30
4.2.2. Kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá bằng PCR 33
4.2.3. So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo 35
4.3. Đánh giá đa dạng di truyền bằng các chỉ thị phân tử SSR 37
4.3.1. Phân tích đa hình DNA của 25 giống lúa nếp bằng kỹ thuật PCR 37

4.3.2. Mối quan hệ di truyền của 25 giống lúa nếp 41
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46
5.1. Kết luận 46
5.2. Đề nghị 46
iv
TÀI LIỆU THAM KHẢO 47
v
DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Các mẫu giống lúa làm vật liệu đánh giá 14
Bảng 3.2. Thành phần dung dịch chiết tách 18
Bảng 3.3. Thành phần dung dịch TE 18
Bảng 3.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR của gen Xa4 và Xa7 19
Bảng 3.5. Danh sách các cặp mồi và nhiệt độ gắn mồi của các cặp mồi sử dụng
19
Bảng 4.1. Thời gian sinh trưởng, độ dài giai đoạn trỗ, chiều cao cây 20
Bảng 4.2. Số nhánh tối đa, số nhánh hữu hiệu, tỷ lệ nhánh hữu hiệu 23
Bảng 4.3. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 25
Bảng 4.4. Kết quả đánh giá mùi thơm 29
Bảng 4.5. Kết quả lây nhiễm nhân tạo với các dòng nhiễm chuẩn 30
Bảng 4.6. So sánh kết quả xác định gen kháng bằng PCR và kết quả lây nhiễm
nhân tạo của các mẫu giống 35
Bảng 4.7. Danh sách 25 mẫu giống tiến hành đánh giá đa dạng di truyền 37
Bảng 4.8. Hệ số tương đồng di truyền của 25 giống lúa nếp 42
vi
DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1. Đánh giá mùi thơm trên lá 29
Hình 4.2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IR24 31
32
Hình 4.3. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB4 32
32

Hình 4.4. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB7 32
Hình 4.5. Kết quả điện di đồ gen Xa4 với cặp mồi MP2 33
Hình 4.6. Kết quả điện di đồ gen Xa7 với cặp mồi P3 34
Hình 4.7. Kết quả điện di đồ PCR của mồi RM-154 39
Hình 4.8. Kết quả điện di đồ PCR của mồi RM-536 40
Hình 4.9. Biểu đồ hình cây của 25 giống lúa nếp tính hệ số di truyền theo Dice
44
và kiểu phân nhóm UPGMA 44
vii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU
AFLP Amplified Fragment Lenght Polymorphism
RAPD Random amplified polymorphic DNA
RFLP Restriction fragment length polymorphism
SSR Simple Sequence Repeat
DNA Acid Deoxyribo Nucleic
PCR – based marker Polymerase Chain Reaction– based marker
ALP Amplicon length polymorphism
DAF DNA amplification fingerpringting
SSCP Single strand conformation polymorphism
AP-PCR Arbitrary Primer – PCR
NST Nhiễm sắc thể
NSLT Năng suất lý thuyết
CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic
STT Số thứ tự
KH Ký hiệu
TGST Thời gian sinh trưởng
viii
TÓM TẮT
Hiện nay ở Việt Nam, lúa nếp chưa có nhiều có giống mới, chủ yếu là các

giống lúa truyền thống. Các giống này có chất lượng tốt nhưng năng suất thường
thấp, cây cao dễ đổ, thời gian sinh trưởng dài, dễ bị nhiễm bệnh. Các giống lúa nếp
cải tiến có năng suất cao, chống chịu sâu bệnh nhưng chất lượng lại kém. Nguồn gen
lúa nếp địa phương rất phong phú, có nhiều đặc điểm quý, có giá trị sử dụng cao là
vật liệu cho công tác chọn tạo giống. Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành khảo
sát đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính trên 50 mẫu giống lúa nếp, chọn ra
giống lúa nếp thấp cây, cảm ôn, thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao, chất
lượng tốt, có mùi thơm, có chứa các gen thơm, gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 bằng
chỉ thị phân tử. Kết quả chúng tôi thấy có 8 mẫu giống có mùi thơm trên hạt gạo. Có
43 giống mang gen kháng Xa7, 13 giống mang gen Xa4, trong đó có 8 giống mang cả
hai gen kháng Xa4 và Xa7 Qua việc xác định quan hệ di truyền của các giống lúa nếp
và kết hợp với các đặc điểm nông sinh học, khả năng kháng bệnh bạc lá, mùi thơm
chúng tôi chọn được 5 mẫu giống tương đối tốt, vừa có khả năng kháng bệnh vừa có
tiềm năng cho năng suất cao, chất lượng tốt là: Nếp Gà Gáy, 10132-3-2, 10861,
10912, 10923.
ix
PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1.Đặt vấn đề
Lúa nếp từ lâu đã đóng một vai trò rất quan trọng trong đời sống của người dân
Việt Nam. Đặc biệt là các dân tộc thiểu số, tại đây lúa nếp được coi là đặc sản là cây
lương thực chủ yếu. Đối với vùng đồng bằng, lúa nếp được sử dụng nhiều trong các
dịp lễ Tết, cúng bái Tổ tiên. Ngoài ra, lúa nếp còn là nguyên liệu của nhiều ngành công
nghiệp chế biến như rượu, bánh kẹo Do đó, việc chọn tạo ra các giống lúa nếp mới
có năng suất và chất lượng cao có ý nghĩa rất quan trọng.
Các giống lúa nếp đang được trồng hiện nay chủ yếu là các giống nếp địa
phương như Nếp Cái Hoa Vàng , Nếp Mỡ ….có chất lượng cao tuy nhiên thường phản
ứng với ánh sáng ngày ngắn, năng suất không cao, chống chịu sâu bệnh kém, đặc biệt
là nhiễm bệnh đạo ôn, bạc lá. Do vậy, việc lai tạo và chọn lọc các giống lúa nếp không
phản ứng với ánh sáng ngày ngắn, đồng thời cho năng suất cao, chất lượng tốt, chống
chịu sâu bệnh, đặc biệt là bệnh bạc lá thì nguồn gen đóng một vai trò rất quan trọng.

Nguồn gen càng phong phú đa dạng bao nhiêu thì khả năng chọn tạo ra giống càng
thành công bấy nhiêu. Để khảo sát các giống lúa nếp có chứa gen kháng bạc lá hay gen
mùi thơm bằng phương pháp truyền thống thì tốn nhiều thời gian, phụ thuộc vào điều
kiện môi trường, hiệu quả chưa cao mà đôi khi còn dễ nhầm lẫn.
Hiện nay, trong công tác lai tạo giống lúa mới, các nhà chọn giống thường
ghép cặp ngẫu nhiên giữa các giống khác nhau, điều này dẫn đến nhiều cặp lai không
cho ưu thế lai cao, do chúng có khoảng cách di truyền rất gần nhau. Ngày nay, phát
triển của các chỉ thị phân tử như AFLP, RAPD, RFLP, SSR đã trợ giúp cho việc xác
định khoảng cách di truyền giữa các mẫu giống nhanh chóng. Để từ đó lựa chọn cặp
lai cho ưu thế lai cao. Trong số các chỉ thị DNA thì chỉ thị SSR được sử dụng rộng rãi
và hiệu quả nhất trong nghiên cứu cấu trúc di truyền lúa trồng O.sativa. Hiện nay, đã
có hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được thiết lập, phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của
lúa( Giarrocco và cộng sự, 2007). Trong nghiên cứu này, sau khi tiến hành khảo sát
các mẫu giống chúng tôi sử dụng các chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền các
mẫu giống cho năng suất cao, chất lượng tốt, thơm, có chứa gen kháng bệnh bạc lá. Từ
đó chọn cặp lai giữa các mẫu giống để lai tạo giống lúa nếp mới.
1
1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích
- Phát hiện được các mẫu giống lúa nếp năng suất cao, chất lượng tốt, chứa gen
thơm, gen kháng bạc lá để làm vật liệu lai tạo giống lúa nếp mới.
- Xác định mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống thơm, chứa gen kháng
bệnh bạc lá từ đó ghép cặp lai cho ưu thế lai cao.
1.2.2. Yêu cầu
- Khảo sát các đặc tính nông sinh học, đánh giá mùi thơm các giống lúa nếp.
- Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo.
- Xác định sự có mặt của các gen kháng bạc lá Xa4, Xa7 ở các giống lúa nếp.
- Đánh giá đa dạng di truyền của các giống lúa nếp.
2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan chung về bệnh bạc lá
2.1.1.Nguyên nhân gây bệnh
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae là vi khuẩn hình gậy hai đầu hơi tròn,
có một lông roi ở một đầu, kích thước 1-2 x 0,5-0,9 µm, sống trên môi trường có
khuẩn lạc hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, vi khuẩn nhuộm gram âm, không có khả
năng khử NO
3
, không có dịch hoá gelatin, không tạo ra NH
3
, indol, có khả năng tạo
H
2
S.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trưởng 26 – 30
o
C, nhiệt độ tối thiểu
0 – 5
o
C, tối đa 40
o
C. Nhiệt độ gây chết là 53
o
C trong 10 phút, có thể sống trong phạm
vi pH 5,7 – 8,5, thích hợp nhất ở pH 6,8 – 7,2.
Vi khuẩn xâm nhiễm qua thuỷ khổng, lỗ khí ở trên mút lá và đặc biệt qua vết
thương xây xát trên lá. Khi đã tiếp xúc với bề mặt có màng nước ướt, vi khuẩn dễ dàng
di động tiến vào bên trong các lỗ khí, qua vết thương mà sinh sản nhân lên về số lượng
qua các bó mạch dẫn lan rộng đi.
Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên mặt lá
bệnh tiết ra những giọt keo vi khuẩn thông qua sự va chạm giữa các lá lúa nhờ mưa

gió mà truyền lan tới các lá, các cây khác để tiến hành lây nhiễm lặp lại trong nhiều
đợt sinh trưởng. Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp, song
nó còn tùy thuộc vào mưa gió, giông bão xảy ra trong vụ mùa mà bệnh có thể truyền
lan với phạm vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn với số lượng nhiều, đó chính
là một nguyên nhân quan trọng làm bệnh phát triển mạnh sau những đợt mưa gió vào
cuối vụ lúa xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta.
2.1.2. Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa
Năm 1960, Goto đã chỉ ra rằng: vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae gây
ra ba triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa ở nhiệt đới: bạc lá, héo xanh (Kresek
hay Wilt) và vàng nhợt (Goto, 1960).Những nghiên cứu trong nhà lưới chứng tỏ: hiện
tượng héo và bạc lá khác nhau một cách rõ ràng và độc lập. Héo và bạc lá những triệu
chứng do ảnh hưởng ban đầu của sự nhiễm bệnh, triệu chứng vàng nhợt là ảnh hưởng
sau (Mew, 1987).
3
Theo Lê Lương Tề (1980) thì ở Việt Nam, bệnh bạc lá lúa phát sinh phá hại
suốt từ thời kỳ mạ đến chín nhưng có triệu chứng điển hình là ở thời kỳ lúa cây trên
ruộng từ sau đẻ - trỗ, chín sữa.
Trên mạ, triệu chứng thể hiện không đặc trưng như ở trên lúa, do đó cũng dễ
nhầm lẫn với các triệu chứng khác. Chủ yếu vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mút
lá hoặc mép lá mạ những vết dài ngắn khác nhau màu xanh vàng rồi nâu bạc, lá dễ bị
khô.
Trên lá lúa, triệu chứng bệnh thể hiện rõ hơn, tuy có thể biến đổi ít nhiều tuỳ
theo giống lúa và điều kiện bên ngoài nhưng nói chung vết bệnh có những đặc điểm
điển hình sau đây:
- Vết bệnh ở mép lá, mút lá lan dần vào phiến lá hoặc lan thẳng xuống gân
chính, ở một số trường hợp vết bệnh có khi bắt đầu ở ngay giữa phiến lá.
- Vết bệnh lan rộng theo đường gợn sóng hoặc thẳng, mô bệnh xanh tái, vàng
lục, cuối cùng cháy khô có màu nâu xám.
- Thông thường ranh giới giữa mô bệnh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ rệt, có
giới hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi chỉ một đường viền màu

nâu sẫm, đứt quãng hay không đứt quãng.
Có thể căn cứ vào những đặc điểm triệu chứng trên để phát hiện bệnh. Tuy
nhiên nhiều khi vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều kiện bên
ngoài, nhất là ở mạ do vậy có thể nhầm lẫn với những hiện tượng khô đầu lá sinh lý.
2.1.3. Đặc điểm phát sinh phát triển của bệnh và biện pháp phòng trừ
Ở miền Bắc nước ta, bệnh có thể phát sinh phát triển ở tất cả các vụ trồng lúa.
Vụ chiêm xuân, bệnh thường phát sinh từ tháng 3 đến tháng 4, phát triển mạnh hơn từ
tháng 5 đến tháng 6 khi mà lúa chiêm xuân trỗ và chín. Tuy nhiên ở vụ chiêm xuân
bệnh thường nhẹ hơn, tác hại ít hơn so với vụ mùa.
Trong vụ mùa, bệnh thường phát sớm vào tháng 8 khi lúa đẻ nhánh đến làm
đòng, trỗ, chín sữa với các trà lúa sớm. Đối với các giống lúa mẫn cảm với thường bị
rất sớm và khá nặng, giảm năng suất nhiều. Các trà lúa cấy muộn trỗ vào tháng 10
thương bị bệnh nhẹ hơn, tác hại của bệnh cũng ít hơn.
4
Nhìn chung, bệnh phát triển mạnh vào giai đoạn cây lúa làm đòng đến chín
sữa, đây cũng là giai đoạn quyết định đến năng suất của lúa. Bệnh phát sinh phát triển
mạnh và truyền lan nhanh trong điều kiện nhiệt độ từ 26-30
o
C, ẩm độ cao từ 90% trở
lên. Nếu nhiệt độ đảm bảo cho bệnh phát triển thì ẩm độ và lượng mưa lớn có ý nghĩa
quyết định đến mức độ bị bệnh.
Biện pháp cơ bản nhất để phòng trừ bệnh bạc lá là dùng giống kháng bệnh, xây
dựng ruộng nhân giống không bệnh và điều chỉnh sinh trưởng của lúa bằng biện pháp
canh tác, nhất là kĩ thuật bón phân và nước. Đồng thời trên cơ sở các biện pháp đó
trong các trường hợp cụ thể cần kết hợp làm tốt khâu xử lý hạt giống và dùng vôi, kali,
phân hữu cơ, bón thúc sớm, giữ nước nông, đề phòng ngừa bệnh bạc lá và các bệnh
khác.
Cho đến nay thì biện pháp sử dụng giống kháng bệnh vẫn là biện pháp hiệu
quả và có một ý nghĩa rất lớn.
2.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo lúa nếp trong nước

Gạo nếp rất quan trọng trong đời sống của người dân Việt Nam, đặc biệt trong
những ngày lễ tết và các đám hiếu hỷ. Chúng được sử dụng để làm các loại bánh
truyền thống như bánh trưng, bánh dầy, bánh cốm, một số nơi nông dân còn dùng để
nấu các loại rượu ngon như rượu nếp cái, rượu nếp cẩm. Một số tỉnh lúa nếp được coi
là giống cây đặc sản như nếp cái hoa vàng ở Bắc Ninh, Nam Đinh và ở Miên Nam lúa
nếp cũng là một mặt hàng xuất khẩu đem lại lợi nhuận kinh tế cao. Tuy nhiên, công
tác chọn tạo giống lúa nếp chưa được quan tâm nhiều như các giống lúa tẻ. So với lúa
tẻ thì lúa nếp hiện có bộ giống còn khá nghèo nàn, có thể điểm ra một số giống đang
được trồng, tác giả chọn tạo và ưu nhược điểm của chúng.
Giống nếp 415 do viện Khoa học kỹ thuật Việt Nam chọn tạo từ tổ hợp lai
VN72 lai với một dòng lúa Japonica. Giống này thấp cây (90 – 100 cm), cảm ôn,
ngắn ngày cấy được cả 2 vụ trong năm, nhưng năng suất rất thấp, trung bình chỉ đạt 35
– 40 tạ/ha, cơm có dẻo nhưng không thơm. Nhiều giống lúa nếp đặc biệt là các giống
nếp địa phương (nếp cẩm, nếp cái hoa vàng…) bị nhiễm bệnh bạc lá, đạo ôn và rầy
nâu khá nặng, hiện vẫn được trồng ở một số nơi thuộc đồng bằng Bắc bộ. Giống nếp
D21, do Viện Di truyền Nông nghiệp lai tạo từ tổ hợp lai ĐV2 (nếp cái hoa vàng đột
5
biến) với nếp 412, được khu vực hóa từ năm 1998. Giống này cũng thấp cây, cảm ôn,
xôi dẻo và thơm nhưng năng suất cũng rất thấp chỉ đạt 30 – 35 tạ/ha, đặc biệt có thời
gian sinh trưởng quá dài vụ xuân tới 170 – 175 ngày, vụ mùa 135 – 140 ngày, nên hiện
không được nông dân ưa chuộng. Giống nếp cái hoa vàng, được trồng khá lâu năm ở
các tỉnh vùng đồng bằng sông Hồng, là giống cảm quang nên chỉ trồng được vụ mùa,
khá cứng cây, có chất lượng gạo tốt, xôi dẻo, thơm, cơm bóng, hạt to trung bình
26g/1000 hạt, nhưng năng suất thấp chỉ đạt 35 – 40 tạ/ha và chống chịu rầy nâu kém.
Giống này hiện một số nơi như Bắc Ninh, Bắc Giang… đang trồng như một giống lúa
đặc sản vì có chất lượng cao, giá bán đắt trên thị trường.
Giống nếp IRI 352 là giống nhập nội, được công nhận năm 1990, thấp cây (85 –
90 cm), là giống cảm ôn, thích ứng rộng, dạng hình khá đẹp. Giống có khả năng
chống chịu với rầy nâu tốt, chống đổ tốt, năng suất khá đạt 40 – 45 tạ/ha, xôi dẻo
nhưng không thơm. Hiện giống này đang được trồng khá phổ biến ở đồng bằng trung

du Bắc Bộ. Giống nếp 87 – dòng 2 là một dòng đột biến cao cây do viện Khoa học Kỹ
thuật nông nghiệp Việt Nam chọn lọc. Là giống cảm ôn, chiều cao cây từ 100 – 105
cm, cây cứng, đẻ nhánh khỏe, thời gian sinh trưởng tương đối ngắn bằng Q5. Năng
suất khá cao đạt 55 – 60 tạ/ha, xôi dẻo hơn nếp 352 và cũng đang trồng khá phổ biến.
Nếp TK90 do Viện Bảo vệ thực vật chọn lọc từ một giống lúa nếp địa phương Hòa
Bình, được công nhận từ năm 1991. Là giống cảm ôn, thời gian sinh trưởng trung
bình, vụ xuân 135 – 150 ngày, vụ mùa 110 – 115 ngày, năng suất đạt từ 31 – 50 tạ/ha.
Nếp TK90 có chất lượng trung bình, xôi dẻo và hơi thơm. Giống chống chịu
trung bình với bệnh bạc lá, đạo ôn nhưng bị nhiễm rầy nâu nặng, cây hơi yếu, dễ đổ và
cổ bông dài. Giống nếp K12 do Viện Cây lương thực và cây thực phẩm lai chọn tạo từ
tổ hợp lai BG90-2 X BR51-46-5, được khu vực hóa năm 1991. Là giống cảm ôn, chiều
cao trung bình từ 105 – 110 cm, thời gian sinh trưởng khá dài trung bình vụ xuân
chính vụ là 160 -165 ngày, vụ mùa 130 – 135 ngày. Năng suất bình quân đạt 35 – 40
tạ/ha, thâm canh tốt có thể đạt 50 – 55 tạ/ha, xôi dẻo nhưng không thơm, kháng bệnh
bạc lá và rầy nâu ở mức trung bình, chống đổ và đạo ôn khá. Tóm lại các giống lúa
nếp hiện nay thuộc vào 2 nhóm giống: nhóm giống chất lượng cao, năng suất thấp, và
chống chịu kém như nếp cái hoa vàng; nhóm năng suất khá nhưng chất lượng lại kém
như 415, TK90. Để đáp ứng với yêu cầu của sản xuất và người dân ngày một cao thì
6
cần thiết phải tạo được những giống lúa nếp vừa cho năng suất cao lại có chất lượng
tốt, xôi dẻo và thơm, cảm ôn và đặc biệt cần kháng bền vững với bệnh bạc lá, một loại
dịch bệnh đang phổ biến hiện nay ở các vùng trồng lúa miền Bắc là việc làm rất cần
thiết.
2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa nếp kháng bệnh bạc lá
Vào những năm 80 viện nghiên cứu lúa quốc tế đã xác định bản chất di truyền
tính chống bệnh bạc lá lúa là do gen quy định. Theo Sawaguchi và các nhà khoa học
trên thế giới đã xác định được 22 gen điều khiển tính kháng bệnh bạc lá lúa là Xa1,
xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, xa8, Xa10, Xa11, Xa12, xa13, Xa14, Xa15, Xa16, Xa17,
Xa18, Xa19, Xa20, Xa21, Xa22, Xa23, Xa24, trong đó có 3 gen lặn là xa5, xa8, xa13.
Mới đây, 3 gen kháng bệnh bạc lá là xa26(t), Xa27(t) và xa28(t) đã được Lee K.S phát

hiện (Lee, 1986).
Cùng với việc xác định các gen kiểm tra tính chống bệnh, thì việc xác định NST
và vị trí sắp xếp của các gen đó trên nhiễm sắc thể phục vụ đắc lực cho công tác chọn
tạo giống chống bệnh. Áp dụng chỉ thị phân tử DNA (RFLP, RADP, STS, AFLP ) có
thể xác định vị trí từng gen trên NST thông qua đoạn DNA dò đặc hiệu liên kết với gen
đó với khoảng cách gen nhất định, các kết quả cho thấy vị trí của một số gen như sau:
gen Xa4 nằm trên NST số 11, liên kết với chỉ thị Npb181 với khoảng cách di truyền là
1,7 cM, liên kết với chỉ thị Npb78 với khoảng cách di truyền là 1,7cM (Yoshmura và cs,
1992) gen xa5 nằm trên NST số 5 liên kết với RG556 (0-1 cM)(Mclouch và cs,1991),
Xa13 nằm trên NST số 8 liên kết với đoạn Z28 (5,1 cM)(Zang và cs,1994), Xa21 nằm
trên NST số 11 liên kết vói pTA818, pTA248 (0-1cM)(Ronald và cs,1992), Xa14 nằm
trên NST số 4, gen Xa1 và Xa2 cũng trên NST số 4;Xa3 và Xa4 cùng nằm trên NST số
11; gen Xa7 liên kết với xa5 trên NST số 5-dẫn theo Phan Hữu Tôn, 2005. Tuy nhiên,
việc áp dụng phương pháp RFLP, RADP thường mất nhiều thời gian, lượng DNA cần
tinh khiết, nhiều khi phải dùng đến phóng xạ nên khó áp dụng rộng rãi. Để khắc phục
được nhược điểm này người ta đề xuất chuyển sang phương pháp chọn lọc gián tiếp trên
cơ sở nhân DNA bằng kĩ thuật PCR, sau đó chạy điện di rồi xác định sự đa hình giữa
kiểu gen kháng, nhiễm.
Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh
bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống.
7
Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng phương
pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ
biến trong đánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa địa phương thu thập được
ở duyên hải Trung bộ và đồng bằng sông Cửu Long. Kết quả đã thu được 17 giống
mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7,
3 giống mang gen Xa14. Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp chỉ thị phân tử trong
nghiên cứu phát hiện gen kháng ở quần thể con lai giữa IR24/Barer đối với gen xa5
cho thấy độ chính xác lên tới 93,3% (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004). Bùi
Chí Bửu và cs cũng đã sử dụng chỉ thị phân tử để kiểm tra tổ hợp BC

4
F
4
của IR24 với
giống lúa địa phương mang gen kháng Xa4, xa5, xa13 với độ chính xác cao.
Ở miền Bắc, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng thành công trong nghiên cứu
bệnh bạc lá và chọn giống kháng bệnh. Từ năm 2000 cùng với sự hợp tác của các
chuyên gia Nhật Bản trong khuôn khổ dự án Jica, nhóm nghiên cứu về bệnh bạc lá của
trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội của PGS.TS. Phan Hữu Tôn và cs đã liên tục
công bố nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng chỉ thị
phân tử và kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn để tiến hành thu thập, phân lập và bảo quản các
chủng vi khuẩn bạc lá phổ biến ở miền Bắc. Đồng thời, để phục vụ cho chiến lược
chọn tạo giống lúa kháng bệnh, Phan Hữu Tôn cũng tiến hành lây nhiễm trên các dòng
đẳng gen nhằm kết luận gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn ở miền Bắc. Cho
đến nay, các gen xa5, Xa7, Xa21 đã được xác định là các gen kháng hầu hết các chủng
vi khuẩn. Các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc cũng được tiến hành đánh giá khả
năng kháng bệnh, kết quả cho thấy chúng không có khả năng kháng các chủng vi
khuẩn ở Việt Nam (Phan Hữu Tôn, 2004).
Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cs tiến hành việc tìm kiếm nguồn
gen kháng từ các giống lúa địa phương bằng cả hai phương pháp lây nhiễm nhân tạo
và PCR. Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu đã công bố của Phan Hữu Tôn thì trên cơ
sở điều tra 145 giống lúa địa phương đã phát hiện được 12 giống chứa gen xa5 và 2
giống chứa gen Xa7. Năm 2004, trên cơ sở tiếp tục điều tra 120 giống địa phương,
Phan Hữu Tôn và cs phát hiện được thêm 8 giống lúa địa phương chứa gen xa5. Các
kết quả nghiên cứu trên đều nhằm mục đích phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa
8
chống bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2003,
2007).
Đến nay, bước đầu có thể khẳng định các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, xa13,
Xa14 là các gen kháng thường có mặt trên các giống lúa địa phương ở Việt Nam. Các

gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng trong việc chọn tạo
giống lúa kháng bệnh, bởi chúng có khả năng kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn
phổ biến ở nước ta. Nhưng trong số các gen kháng hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7
có khả năng xuất hiện nhiều hơn xa5.
2.4. Nghiên cứu tính trạng mùi thơm
Trên thế giới, tính trạng mùi thơm đã đựợc nghiên cứu khoảng từ thập kỷ 80
của thế kỷ XX. Theo Lorieux et al. (1996) cho biết mùi thơm được tạo nên bởi hơn
một trăm loại chất dễ bay hơi khác nhau như hydrocarbon, aldehyde, keton, ester,
phenol, pyridine, pyrazine, 2-acetyl-1-proline và một số thành phần khác sinh ra khi
nấu cơm. Theo Bradbury et al. (2005a) thì mùi thơm chỉ có ở loài lúa trồng không có ở
các loài lúa dại, điều đó chứng tỏ mùi thơm do đột biến gen lặn gây lên xẩy ra trong
quá tiến hóa từ loài lúa dại thành loài lúa trồng. Có nhiều gen quy định các mùi thơm
khác nhau, và ít nhất có 6 nhiễm sắc thể chứa các gen quy định mùi thơm ở lúa đã
được xác định. Mỗi giống lúa có một kiểu chất thơm và do các gen khác nhau điều
khiển. Siddiq et al. (1986) đầu tiên đã phát hiện ra 2 gen lặn quy định mùi thơm trong
giống lúa Ấn độ T3 nằm trên nhiễm sắc thể số 5 và 9. Lorieux et al. (1996) lại xác
định có 3 locus gen lặn quy định mùi thơm ở lúa, một locus gen chính nằm trên nhiễm
sắc thể số 8 còn 2 locus kia, một nằm trên nhiễm sắc thể số 4 còn locus 3 nằm trên
nhiễm sắc thể số 12.
Sau đó, Tomar and Prassad (1997) đã phát hiện thêm một gen trội nữa quy
định mùi thơm ở giống lúa Baspatri, nằm trên nhiễm sắc thể số 11, là một giống lúa
địa phương của Ấn độ. Mặc dù vậy, theo Li et al. (2006) thì hầu hết mùi thơm của các
giống lúa đều được điều khiển bởi một gen lặn định vị nằm trên nhiễm sắc thể số 8 của
loài lúa O. sativa . Theo Buttery et al. (1983), thì chất 2-acetyl-1-proline (2-AP) là một
chất dễ bay hơi và là thành phần chính tạo nên mùi thơm của nhiều giống lúa. Đã có
rất nhiều công trình nghiên cứu chỉ ra rằng sự tổng hợp 2-AP có liên quan đến hoạt
tính của enzyme Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD2). Lorieux et al. (1996) đã
9
áp dụng chỉ thị phân tử để nghiên cứu gen điều khiển tính trạng mùi thơm này trên
quần thể NILs và đã khẳng gen qui định mùi thơm do một gen lặn quy định, ký hiệu

fgr, định vị trên nhiễm sắc thể số 8, liên kết chặt với chỉ thị RG28 với khoảng cách di
truyền là 5,8 cM. Sau đó, Bradbury et al. (2005b) đã sử dụng phương pháp khuyếch
đại alen đặc thù (ASA , Allele Specific Amplification) sử dụng cặp mồi SF6 có trình
tự mồi xuôi là: 5’-GCCGGTGCTCCTTTGTCATCA-3’ và trình tự mồi ngược là 5’-
TGTACCATCCCCACGGCTCAT-3’, đã phân biệt được các kiểu gen của cây lúa
đồng hợp tử thơm (biểu hiện một vạch băng dài 257 bp), cây dị hợp tử thơm (cho 2
vạch băng dài 355bp và 257bp) và không thơm (vạch băng dài 355bp). Gần đây, cũng
trên cơ sở trình tự DNA của gen sinh enzyme Betaine Aldehyde Dehydrogenase
(BAD2) Shu Xia Sun et al. (2008) đã chọn vị trí ghép cặp mồi đặc thù trên vùng exon
số 7 của gen, đã thiết kế 2 cặp mồi, một cho chỉ thị SSR Aro1 có motif (AG)9 với cặp
mồi có trình tự mồi xuôi là 5’-CATCTATCCTCCTCGGGCAACA-3’ và mồi ngược
là: 5’- GGCGGCGTCATATCCAACA-3’. Chỉ thị SSR thứ 2 tên là Aro7 có motif
(AGG)9 với cặp mồi có trình tự mồi xuôi là 5’-ATTTGCCTCCTGAGTCTG-3’ và
trình tự mồi ngược là: 5’-GAGGATGGGGAAGATAAA-3’, cũng phân biệt được sự
đa hình giữa các giống có mùi thơm như: Ch-29B, De và Ba và các giống không thơm
là Le và R2.
2.5. Các phương pháp đánh giá quan hệ di truyền giữa các mẫu giống
2.5.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị
Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gen khác nhau. Trình tự bộ
gen của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau do sự xuất hiện của một loài
đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do sự đột
biến xuất hiện tại một vị trí ở 1 gen nào đó trong bộ gen của 1 cá thể, làm cho gen đó
không biểu hiện hay khác đi thành một tính trạng khác với các cá thể cùng giống. Sự
khác biệt về mặt di truyền như vậy được gọi là tính đa dạng di truyền( trích dẫn bởi Lê
Văn Huy, 2005).
Sự khác nhau về mặt di truyền của các cá thể trong cùng một giống( hay các
giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính
trạng bên ngoài. Người ta thường tìm những dấu hiệu để nhận ra được sự khác nhau về
di truyền giữa các cá thể( hoặc giữa các giống) gọi là các chỉ thị.
10

Có 3 loại chỉ thị thường được sử dụng:
• Chỉ thị hình thái.
• Chỉ thị isozyme.
• Chỉ thị phân tử.
2.5.2. Chỉ thị hình thái
Gen chỉ thị bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó
mà người ta có thể phát hiện được. Tuy nhiên, nếu dựa vào những chỉ thị này để lập bản
đồ gen và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lượng chỉ thị ít do không phải những tính trạng
kiểu hình nào cũng có thể nhận diện được, đồng thời độ chính xác và độ tin cậy thấp.
2.5.3. Chỉ thị isozyme
Isozyme là các dạng khác nhau của một enzyme của một cá thể, cùng có chức
năng xúc tác cho một phản ứng( hoạt tính xúc tác tương tự hoặc giống nhau) nhưng lại
bị ức chế bởi những phân tử khác. Nói cách khác, isozyme là tất cả các dạng khác
nhau của 1 enzyme được mã hóa bởi một locus di truyền.
• Isozyme đơn gen.
• Isozyme đa gen.
Isozyme được dùng trong nhiều mục đích khác nhau, đặc biệt là trong nghiên
cứu đa dạng di truyền của động thực vật, khoảng cách lan rộng của hạt phấn, định
dạng giống
2.5.4. Chỉ thị phân tử - chỉ thị DNA( Phan Hữu Tôn, 2005)
 Chỉ thị AFLP( Amplified Fragment Lenght Polymorphism – Đa hình
độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)
AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết
hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng
những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR.
AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả
những dòng đẳng gen. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do
những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi hoặc thêm, mất đoạn giữa hai vị
trí cắt.
11

 Chỉ thị phân tử SSR (Simple Sequence Repeat- khuyếch đại cái đoạn
lặp lại đơn giản)
- Các trình tự lặp lại đơn giản (SSR) hay còn được biết đến như các
microsaterlite (vi vệ tinh) là những đoạn ngắn của DNA có chứa từ 2 đến 6 cặp base
có trình tự lặp lại liên tiếp và số trình tự lặp lại giao động từ 2 đến 40. Các trình tự lặp
lại đơn giản rất phổ biến ở hệ gen động vật cũng như thực vật. Chúng được phân bố
trong hệ gene và có tính đặc trưng co từng loài.
- SSR là kỹ thuật dựa trên phản ứng chuỗi PCR với mục tiêu đầu tiên là nhận
dạng các cặp trình tự đơn giản. Sau khi các trình tự lặp lại đơn giản này được nhận
dạng thì bước tiếp theo là xác định trình tự của DNA và thiết kế primer. Các trình tự
gần kề và trình tự lặp lại sẽ tạo nên SSR. SSR primer sau đó được sử dụng tương tự
như các RAPD primer.
- Kỹ thuật SSR có tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính đa hình rất
cao, có thể phân biệt được sự sai khác mà không xác định được bằng các marker khác
như RAPD va RFLP. SSR primer có từ 1 đến 12 locus (tùy vào loài) được tổ hợp trong
một ống phản ứng PCR. Do vậy, cho phép đồng thời ghi nhận các kiểu gen có nhiều
locus. Phản ứng không quá tốn kém, tiết kiệm được thời gian và hóa chất. Primer sử
dụng trong SSR dài hơn mồi RAPD và dựa trên trình tự đặc trưng vì thế nó tỏ ra đáng
tin cậy khi phát hiện cùng 1 locus và thích hợp cho việc nghiên cứu bản đồ gen. SSR
là marker đồng trội nên đã nhanh chóng thay thế RFLP và RAPD để trở thành công cụ
hữu hiệu trong các ứng dụng chọn tạo giống thực vật và nghiên cứu di truyền.
- Nhược điểm của phương pháp này là quá trình thiết kế mồi đắt, mỗi loại mồi
chỉ đặc trưng cho 1 locus đa hình. Để xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cần tách dòng và
đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn DNA của genome có chứa SSR. Hiện nay số
lượng primer thiết kế cho các loại cây trồng còn hạn chế, làm giảm hiệu quả của SSR
trong việc lập bản đồ gen. Một vấn đề khác cũng thường gặp phải trong sử dụng SSR
là việc xác định quan hệ giữa các alen với các marker phân tử là rất khó. SSR có thể
được phân bố ngẫu nhiên trong genom nhưng cũng có khi tập trung lại ở tâm động hay
eo thứ cấp của nhiễm sắc thể. Điều này hạn chế việc sử dụng các mẫu dò nhiều locus
trong phân tích liên kết di truyền và nghiên cứu quần thể.

12
 Chỉ thi AP-PCR( Arbitrary Primer – PCR)
Phương pháp dùng 2 đoạn mồi bất kỳ để nhân DNA bằng PCR, để xác định sự
đa hình của các kiểu gen( Phan Hữu Tôn, 2005).
 Chỉ thị RFLP( Restriction fragment length polymorphism)
RFLP là phương pháp được sử dụng lần đầu tiên vào năm 1975 để xác định đa
hình DNA nhằm lập bản đồ di truyền của 1 đột biến mẫn cảm nhiệt độ của các
serotype của adenovirus.
RFLP là phương pháp lai DNA – một kỹ thuật nhằm gắn liên kết có chọn lọc
những đặc thù của những sợi DNA đơn hoặc RNA dựa trên cơ sở ghép cặp bổ sung
những đoạn DNA sợi đơn tương ứng đã chuyển dính vào màng Nitrocellulose( Phan
Hữu Tôn, 2005).
 Chỉ thị ALP( Amplicon length polymorphism)
Sự đa hình chiều dài những đoạn DNA được nhân bản trên cơ sở của phương
pháp PCR.
 Chỉ thị RAPD( Random amplified polymorphic DNA)
Sự đa hình những đoạn DNA được nhân lên một cách ngẫu nhiên trên cơ sở
phương pháp PCR dùng một đoạn mồi.
 Chỉ thị DAF( DNA amplification fingerpringting)
Phương pháp nhân DNA in vân tay dùng rất nhiều đoạn mồi đơn ngắn.
 Chỉ thị SSCP( Single strand conformation polymorphism)
Sự đa hình về cấu trúc sợi DNA, trong genome có một số vị trí DNA tại đó mở
xoắn tạo thành 2 sợi đơn. Những vị trí này được sử dụng để nghiên cứu sự đa dạng
genome sinh vật. Ngoài ra, còn được dùng làm chỉ thị liên quan đến các gen tính trạng
khác.
13
PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu nghiên cứu
- Vật liệu nghiên cứu gồm 50 mẫu giống lúa nếp bao gồm các giống lúa nếp
thường và nếp Cẩm đang được lưu giữ giống tại Trung tâm Bảo tồn và phát triển

nguồn gen cây trồng – Đại học Nông ngiệp Hà Nội.
Các dòng đẳng gen chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau: IRBB4, IRBB7
và giống nhiễm chuẩn IR24.
- Giống lúa đối chứng là TK90.
- 6 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.ozyzae phổ biến ở miền Bắc Việt
Nam được lưu giữ tại Bộ môn Sinh học phân tử và CNSH ứng dụng.
- Các hóa chất trang thiết bị cần thiết khác.
Bảng 3.1. Các mẫu giống lúa làm vật liệu đánh giá
STT Tên Giống STT Tên Giống STT Tên Giống
1 Nếp Gà Gáy 18 10941 35 10739-1-2
2 NCHV 19 10912 36 10884-1
3 NCHV ĐB 20 10913 37 10884-3
4 10132-3-1 21 10914 38 10879
5 10132-3-2 22 10915 39 10891-1
6 10132-3-3 23 10916 40 10891-2c
7 10132-6 24 10919 41 10891-3c
8 10180-2 25 10921-1 42 11298-3
9 10180-6 26 10921-2 43 10894c
10 10222-1 27 10923 44 10898c
11 10222-2 28 10924 45 10899c
12 10147 29 10926 46 K. Lếch 1
13 10165 30 10900 47 11066
14 10299 31 10901 48 11069-1
15 10811 32 10902 49 11069-2
16 10861 33 10903 50 11070-1
17 10883 34 10907
51 TK 90
14
- Nghiên cứu được tiến hành vào vụ xuân năm 2014 từ tháng 1/2014 đến tháng
6/2014.

- Các thí nghiệm ngoài đồng ruộng được bố trí tại ruộng thí nghiệm của Trung
tâm Bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng.
- Các thí nghiệm trong phòng được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh học
phân tử, Bộ môn Sinh học phân tử và CNSH Ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học.
3.2. Phương pháp nghiên cứu
3.2.1. Bố trí thí nghiệm đồng ruộng
Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô một giống không nhắc lại: mỗi
giống cấy 5m
2
; hàng-hàng: 18-20cm; cây-cây: 10-11cm, cấy một dảnh; mật độ 42
khóm/m
2
.
3.2.2. Kỹ thuật trồng và chăm sóc
- Cày bừa, làm giầm đất, nhặt cỏ sách sẽ, san phẳng ruộng.
- Gieo mạ, gieo theo đúng luống, ô.
- Bón phân:
Lượng bón: 120kg N + 90kg P
2
O
5
+ 60kg K
2
O /ha
Cách bón:
+ Bón lót: 100% P
2
O
5
+ 20% N sau lần bừa cuối cùng.

+ Bón thúc lần 1: 50% N + 40% K
2
O thúc đẻ nhánh kết hợp làm cỏ.
+ Bón thúc lần 2: Bón lượng phân còn lại bón nuôi đòng kết hợp làm cỏ.
- Làm cỏ: Trộn thuốc trừ cỏ với đạm qua các lần bón phân.
- Phun thuốc: Phun 2 giai đoạn, phòng trừ sâu đục thân, cuốn lá và bệnh khô
vằn. Phòng trừ kịp thời khi thấy xuất hiện dấu hiệu bệnh.
15
3.2.3. Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học cơ bản
Được đánh giá theo Tiêu chuẩn ngành quy phạm sử dụng giá trị canh tác và
sử dụng giống lúa 10TCN-558-2002 ngày 06 tháng 12 năm 2002.
- Tính tổng thời gian sinh trưởng: Tổng số ngày từ khi gieo đến lúc hạt chín
(85% số hạt trên bông đã chín).
- Số nhánh tối đa trên khóm: Đếm số nhánh trong giai đoạn lúa vươn lóng làm
đòng, đếm 5-10 khóm lấy giá trị trung bình.
- Số nhánh hữu hiệu/ khóm: Số nhánh có khả năng tạo thành bông đếm 5-10
khóm lấy giá trị trung bình.
- Kích thước lá đòng: đo chiều dài, chiều rộng lá đòng vào giai đoạn làm đòng.
Phân loại theo tác giả Nguyễn Văn Hiển.
- Chiều dài lá đòng: đo từ cổ đến chóp lá; <25 cm: lá đòng ngắn, 25-35cm: lá
đòng trung bình, >35cm: lá đòng dài.
- Chiều rộng: đo chỗ to nhất của lá đòng; <0.8 cm: lá đòng hẹp, 0.8-1.7cm: lá
đòng trung bình, >1.7cm: lá đòng rộng (Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa,
1996).
- Độ dài giai đoạn trỗ: số ngày từ bắt đầu trỗ (10% số cây có bông thoát khỏi
bẹ lá đòng khoảng 5cm) đến kết thúc trỗ (80% số cây trỗ): không quá 3 ngày: tập
trung-1 điểm; 4-7 ngày: trung bình-3 điểm; hơn 7 ngày: dài-5 điểm.
- Chiều dài bông: đo chiều dài trục chính từ cổ bông đến hết chiều dài bông: 3
điểm: bông ngắn; 5 điểm: bông trung bình; 7 điểm: bông dài.
- Độ thoát cổ bông: Quan sát khả năng trỗ thoát cổ bông của quần thể: 1

điểm:thoát vừa; 3 điểm:thoát trung bình; 5 điểm: vừa đúng cổ bông; 7 điểm: thoát một
phần; 9 điểm: không thoát được.
- Chiều cao cây cuối cùng: Đo từ sát mặt đất đến mút đầu bông không kể râu
hạt của 10 cây. Theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giá nguồn gen lúa” của IRRI, chiều
cao cây lúa được chia thành 3 mức ứng với thang điểm:
16