Bài giảng Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu

Kỹ thuật miễn dịch đánh dấu
Trần Thị Tơn Hồi, PhD.
Bộ môn YDHCS – Khoa Y Dược
ĐHQGHN


Miễn dịch đánh dấu
 Phản ứng kháng nguyên – kháng thể được phát hiện

nhờ một chất đánh dấu
 Chất đánh dấu thường dùng:


Chất phóng xạ: 125I, 32P,



Huỳnh quang



Enzym: peroxidase

35S


ELISA - Enzyme-linked
immunosorbent assay
 Chất đánh dấu: enzym

 Phản ứng enzym – cơ chất đặc hiệu, thường

tạo màu


Phản ứng peroxidase


ELISA cạnh tranh
 Yếu tố cần được phát hiện sẽ cạnh tranh với

yếu tố đã biết được đánh dấu
 Enzym xúc tác phản ứng tạo màu
 Có thể cạnh tranh giữa các kháng nguyên,
hoặc cạnh tranh giữa các kháng thể


ELISA không cạnh tranh
 Phát hiện tương tác kháng nguyên – kháng

thể đặc hiệu nhờ phản ứng tạo màu xúc tác
bởi enzym đánh dấu
 Khơng có sự cạnh tranh giữa yếu tố miễn

dịch cần được phát hiện (kháng nguyên hoặc
kháng thể) với yếu tố miễn dịch đã biết được
đánh dấu


Một số kỹ thuật ELISA

Chất chuẩn
 Theo định nghĩa của Cơ quan đo lường hợp pháp

quốc tế (OIML ): Mẫu chuẩn là một vật liệu hay một
chất mà một hay nhiều tính chất của chúng đủ đồng
nhất và được tạo nên để chuẩn hoá một dụng cụ,
đánh giá một phương pháp đo hoặc để xác định giá
trị đối với các vật liệu.
 Dải chất chuẩn đã biết chính xác nồng độ
 Tạo đường cong chuẩn -> phân tích kết quả với mẫu
chưa biết
 Giúp loại trừ sai số hệ thống


Tiến hành thí nghiệm
 Dụng cụ:


Đĩa 96 giếng có tế bào đã cố định



Pipet

 Hóa chất


Thuốc nhuộm



Dung dịch rửa



Dung dịch thôi màu


Tiến hành thí nghiệm
 Bổ sung 100 ul thuốc nhuộm vào mỗi giếng
 Ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng

 Đổ bỏ thuốc nhuộm thừa
 Rửa 5 lần bằng dung dịch rửa
 Để khơ ở nhiệt độ phịng
 Bổ sung 100 ul dung dịch thôi màu vào mỗi

giếng, lắc nhẹ
 Quan sát kết quả và nhận xét


Miễn dịch huỳnh quang


Miễn dịch huỳnh quang
 Chất đánh dấu: thuốc nhuộm huỳnh quang
 Thường gắn với kháng thể
 Cũng có thuốc nhuộm có thể nhận biết và

bám trực tiếp vào phân tử sinh học cần quan
sát

Nhuộm DAPI
Molecular Probes –The Handbook

BODIPY FL C5-ceramide


Huỳnh quang
 Các phân tử huỳnh quang hấp thụ ánh sáng

có bước sóng nhất định rồi tái phát xạ ra ánh
sáng ở mức năng lượng thấp hơn
Tức là:
 Nếu ta chiếu một ánh sáng màu nhất định lên

một mẫu vật, ta có thể thu được ánh sáng với
màu khác phát ra từ mẫu vật đó.


Huỳnh quang

Phân tử kích hoạt
Khi hẩp thụ năng
lượng từ photon,
phân tử được kích
hoạt lên mức năng
lượng cao hơn

Electrons ở mức năng lượng nảy không ổn
định và sẽ trở lại mức năng lượng thơng
thường  giải phóng năng lượng thừa dưới
dạng nhiệt hay quang năng.
Do một phần năng lượng đã
bị mất đi dưới dạng nhiệt,
photon được giải phóng có
mức năng lượng thấp hơn
photon kích hoạt phân tử
 có bước sóng dài hơn và
có thay đổi về màu
Mức năng lượng
thơng thường


Nhuộm miễn dịch huỳnh quang
– Ví dụ
 Cố định mẫu sinh phẩm (vi khuẩn) trên lam kính/lá

kính
 Ủ với kháng thể đặc hiệu (kháng thể sơ cấp)
 Rửa bỏ kháng thể thừa, còn lại phức kháng thể - vi
khuẩn
 Phát hiện vi khuẩn bằng cách ủ với kháng thể thứ
cấp gắn huỳnh quang kháng kháng thể sơ cấp ->
phát sáng dưới kính hiển vi huỳnh quang


Nhuộm miễn dịch huỳnh quang
 Nhuộm trực tiếp

Lắng đọng IgM ở các thể cytoid
trong mẫu sinh thiết da của bệnh
nhân viêm da bệnh lichen phẳng


Nhuộm miễn dịch huỳnh quang
 Nhuộm gián tiếp

Phát hiện ANA