Bài giảng Công nghệ ADN tái tổ hợp

Đại học quốc gia hà nội
Khoa y duoc

CễNG NGH
ADN TI TỔ HỢP

Dinh Doan Long @VNU-SMP


Nội dung
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp đuợc thực hiện nhu thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp

Dinh Doan Long @VNU-SMP


Nội dung
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp đợc thực hiện nh thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp

Dinh Doan Long @VNU-SMP
3


Khái niệm chung

ADN tái tổ hợp (recombinant
DNA) đợc dùng để chỉ các
phân tử ADN đợc tạo ra từ hai
hay nhiều phân đoạn ADN
xuất xứ từ các nguồn gốc khác
nhau.
Trong thực tế, công nghệ ADN
tái tổ hợp đôi khi đuợc dùng
đồng nghĩa với các thuật ngữ
tách
dòng
phân
tử
(molecular/DNA cloning), hay
kỹ thuật di truyền (genetic
engineering).

4


Khái niệm chung

Mục đích

1. Phân lập các gen từ hỗn hợp nhiều gen trong tế
bào, để có thể phân tích và nghiên cứu từng
gen riêng lẻ.
2. Nhân một dòng gen đà đợc phân lập lên một số
lợng lớn, để đáp ứng đủ cho nhu cầu nghiên

cứu.
3. Khả năng tạo ra những gen/tổ hợp gen mới.
Vật liệu tách dòng gen

1. ADN
2. mARN (sư dơng kü tht RT-PCR).
5


Dinh Doan Long @VNU-SMP
6


Nội dung
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp đuợc thực hiện nhu thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp

Dinh Doan Long @VNU-SMP
7


ADN tái tổ hợp thực hiện nh thế nào?

Các bớc cơ bản thực hiện ADn tái tổ hợp

1. Chọn nguồn gen cần tách dòng chứa trình tự quan tâm.
2. Chuẩn bị ADN ngoại lai có các đầu 3, 5 phù hợp.

3. Chọn lọc véctơ phù hợp.
4. Cải biến đầu 3 và 5của véctơ và phân tử ADN ngoại lai.
5. Nối phân tử ADN véctơ và ADN ngoại lai.
6. Đa véctơ tái tổ hợp vào tế bào chủ và nhân lên.
7. Sàng lọc để chọn các dòng tế bào mang véctơ tái tổ hợp.
8. Xác định đặc tính các dòng, và sử dụng các dòng cho các
mục đích nghiên cứu khác nhau.
Dinh Doan Long @VNU-SMP
8


Nội dung
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp đợc thực hiện nh thế nào?
Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp

Dinh Doan Long @VNU-SMP
9


Tách chiết và tinh sạch axit nucleic

Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết ADN

Các dung môi hữu cơ làm mất nớc, thay đổi môi trờng
điện môi kết tủa các phân tử nh protein & ADN,
trong đó các phân tử protein bị ảnh hởng rõ hơn.
Độ pH thờng trung tính hoặc hơi kiềm (7,0 8,5).

Phenol, chloroform, isoamylalcohol thờng đợc dùng để
kết tủa protein (vd. Chloroform/isoamylalcohol 24/1).
 Mét sè hỵp chÊt chèng oxy hãa nh 2-mercapthoethanol,
DTT (dithiothreito), 8-hydroxyquinoline làm giảm nguy
cơ gây biến tính axit nucleic. SDS làm vỡ màng tế bào.
Các dung môi alcohol (vd. EtOH, MeOH, 2-propanol) đợc dùng để kết tủa axit nucleic. Các muối (vd. acetate)
trung hòa điện tích và làm giảm khả năng hòa tan của
các axit nucleic. To kết tña -20oC / 0oC (1/2h – 24h).
10


Tách chiết và tinh sạch axit nucleic

Một số nguyên tắc cơ bản Tách chiết aRN

Để tách chiết mARN, ngời ta thêng dïng cét Oligo dT –
celluloza, hc cét hÊp thụ từ tính với biotin-oligo(dT).
Định tính và định lợng ADN dựa trên phơng pháp điện di
và đo quang phổ ở các bớc sóng 260 và 280 nm.
1,0 A260nm  50 g / ml dsADN
 1,0 A260nm  40 g / ml ssADN / ARN
 1,0 A260nm  33 g / ml dNTP / oligonucleotide

Dinh Doan Long @VNU-SMP
11


Nội dung
Khái niệm chung
ADN tái tổ hợp đợc thực hiện nh thế nào?

Tách chiết và tinh sạch các axit nucleic
Tạo véctơ tái tổ hợp
Các loại enzym sử dụng trong ADN tái tổ hợp

Dinh Doan Long @VNU-SMP
12


Các đặc điểm cơ bản của véctơ tách (nhân) dòng

1. Kích thớc càng nhỏ, kích thớc đoạn xen càng lớn.
2. Trình tự nucleotit đợc biết
đầy đủ.
3. Có khả năng tự sao chÐp
trong tÕ bµo chđ.

4. Cã thĨ nhËn biÕt nhê các gen
chỉ thị / hoặc gen đánh dấu.
5. Có vị trí gắn phân tử ADN
ngoại lai (vị trí đa tách dßng
– polycloning site / MCS).

13


Các đặc điểm cơ bản của véctơ tách (nhân) dòng

14

véctơ plasmid

Kích thớc 1
200 kb, sợi kép,
vòng.
pBR332 do
Bolivar và
Rodiguez
(1977) thiết
kế cho phép
mang đoạn
ADN cài đến
6 kb.

pBR332
4363 bp

15


plasmid

Nhóm pUC là
nhóm véctơ
plasmid thuộc
thế hệ thứ 3.
Chứa cả điểm
khởi đầu sao
chép của phage
M13 cho phép

tách dòng nhờ
véctơ helper.
 Thêng mang
dÊu chuÈn lµ
Ampr vµ LacZ.
16


Plasmid pUC

17


Plasmid pUC

Các plasmid pUC
sao chép theo kiểu
khi không có
véctơ trợ giúp
(helper).
Khi có các véctơ
helper (vd. M13), các
plasmid pUC sao chép
theo kiểu vòng lăn, tạo
mạch đơn và giải
phóng ra ngoµi nhê
protein vá virut.
18

Plasmid pM13

Bản chất là
phân tử ADN
mạch đơn.
Không làm
phân giải tế
bào chủ khi
giải phóng
khỏi tế bào
nên tách dòng
thuận tiện

19


véctơ plasmid

u điểm

Cấu trúc đơn giản, kích thuớc nhỏ.
Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp.
Có thể nhân lên với số lợng lớn, tốc độ nhanh.
Nhợc điểm

Đôi khi, hiệu suất biến nạp vào tế bào chủ thấp.
Không hiệu quả khi biến nạp ở eukaryote.
Không tách dòng đuợc các phân đoạn ADN kích
thuớc lín (> 10 kb).
Dinh Doan Long @VNU-SMP

20