Tài liệu Chương 2: Công nghệ DNA tái tổ hợp doc

Nhập môn Công nghệ sinh học
31
Chương 2

Công nghệ DNA tái tổ hợp

I. Mở đầu
Công nghệ DNA tái tổ hợp được hình thành từ những năm 1970 nhờ
sự phát triển của các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các
quá trình sinh học ở mức độ phân tử. Từ đó, cho phép phân lập, phân tích và
thao tác trên các nucleic acid theo nhiều phương thức khác nhau, giúp hiểu
biết sâu sắc các lĩnh vực mới của sinh học như công nghệ sinh học, bào chế
các loại thuốc mới, y học phân tử và liệu pháp gen.
Sự khám phá ra các enzyme hạn chế (restriction endonuclease) trong
những năm đầu 1970 là sự phát triển then chốt (key development) không chỉ
cho khả năng phân tích DNA hiệu quả hơn, mà còn cung cấp khả năng cắt
các phân tử DNA để tạo ra các đoạn DNA tái tổ hợp mới, một quá trình mà
ngày nay được gọi là tạo dòng gen (gene cloning). Phương thức tạo dòng
này đã báo hiệu một kỷ nguyên mới trong thao tác, phân tích và khai thác
các phân tử nucleic acid.
Tạo dòng gen đã cho ra nhiều phát minh quan trọng và cung cấp
những hiểu biết giá trị trong cấu trúc, chức năng và sự điều hòa hoạt động
của gen. Từ những ứng dụng đầu tiên của chúng, các phương pháp xây dựng
thư viện gen (gene library) được hình thành và phát triển, và hiện nay được
xem như là nền tảng cơ sở cho nhiều thí nghiệm hóa sinh và sinh học phân
tử. Mặc dù phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction-PCR) để
khuếch đại gen cho phép phân tích gen nhanh hơn nhưng trong nhiều trường
hợp kỹ thuật tạo dòng gen vẫn còn hữu ích và là một yêu cầu tuyệt đối.
Những phần dưới đây cung cấp một bức tranh tổng quát về các quá trình cơ
bản của công nghệ DNA tái tổ hợp.

II. Phân lập đoạn DNA/gen
Một số phương pháp phân lập gen để thực hiện kỹ thuật tái tổ hợp
DNA đã được sử dụng là:

Nhập môn Công nghệ sinh học
32
1. Tách các đoạn DNA từ genome
Phương pháp này được thực hiện như sau: DNA hệ gen (genomic
DNA) của một sinh vật được cắt thành các đoạn nhỏ dài khoảng 20 kb (kích
thước thích hợp tùy thuộc vào loại vector nhận chúng) bằng enzyme hạn chế
rồi gắn vào vector để xây dựng thư viện genome (genomic library).
Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae
.
Thông thư
4 bp, ví dụ như Mbo - -
.
(clone).
.
Nhập môn Công nghệ sinh học
33
(physical mapping).

2. Sinh tổng hợp cDNA từ mRNA
Đoạn DNA được tổng hợp dựa trên khuôn mẫu mRNA được gọi là
cDNA (complementary DNA). ba
như sau:
- .
- - 2 (Mg
2+
.

- .
mRNA-cDNA (khi tổng hợp sợi th E.
coli
(đ
E. coli
5
.
- 1.
. Sợi đ
bacteriophage (cDNA library).

3. Phân lập đoạn DNA bằng phương pháp PCR
Ngoài hai phương pháp trên, hiện nay người ta sử dụng rất phổ biến
phương pháp PCR để phân lập một trình tự nucleotide (gen) từ genome của
Nhập môn Công nghệ sinh học
34
sinh vật dựa trên các primer đặc hiệu cho trình tự đó. Phương pháp PCR đơn
giản và ít tốn thời gian hơn hai phương pháp trên, mà hiệu quả vẫn rất cao.

2.1.

PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học
hiện đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh
dấu một bư

các enzyme hạn chế và kỹ thuật Southern blot (phân tích DNA).
AAAAAA 3’ mRNA
AAAAAA 3’ mRNA
TTTTTT 5’ sợi cDNA thứ nhất

TTTTTT 5’

AAAAAA 3’
TTTTTT 5’
AAAAAA 3’
TTTTTT 5’ cDNA sợi đôi
Nuclease S1
DNA polymerase I
Tổng hợp sợi cDNA thứ hai
Biến tính nhiệt và xử lý
RNase H để phá hủy sợi
mRNA
Tổng hợp sợi cDNA thứ
nhất trên khuôn mẫu
mRNA
Reverse transcriptase
Gắn oligo(dT) primer
5’
5’
5’
3’
Đầu 3’ của cDNA tạo
thành vòng cặp tóc
5’
3’

AAAAAA 3’ mRNA
TTTTTT

Mô
(ví dụ: não)
Sinh tan tế bào
và tinh sạch mRNA
Nhập môn Công nghệ sinh học
35
in vitro đ
- đ
20 nucleotide.

▪ Nguyên tắc của PCR
Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở
vi khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus
tide (dATP,
dCTP, dGTP và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn
DNA nhất
, nhờ vậy có thể đủ số lượng để
tách ra, phân tích trình tự hoặc tạo dòng. P
DNA 3’ -
5’
- ).
Nguyên tắc của PCR được trình
đầu tạo ra các đoạn DNA có chiều dài xác
định. Nếu biết trình tự của đoạn gen cần khuếch đại thì có thể tổng hợp nhân
tạo các primer tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng kỹ thu
- , qua đó từ 10
-6

g
DNA ban đầu có thể khuếch đại lên tới trên 1
PCR bao gồm ba giai đoạn có nhiệt độ khác nhau:
- Gây biến tính (denaturation) ở 90-95
o
C. Trong giai đoạn biến tính,
phân tử DNA khuôn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn
(single strands). Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị
dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trước đó).
- Gắn primer (annealing) ở 40-65
o
C. Trong giai đoạn này các primer
gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các primer bị
lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo
thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi
đơn. Các liên kết ion ổn định hơ đoạn nhỏ (các primer đ
Nhập môn Công nghệ sinh học
36
) và trên các đ đôi đó (khuôn mẫu và primer)
enzyme Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.




Hình 2.2. Sơ đ phản ứng chuỗi polymerase (PCR)

- Kéo dài phân tử (extension) ở 70-72
o
C. Đây là khoảng nhiệt độ tối
thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bắt đầu từ các vị trí có

primer theo chiều 5’ 3’. Các primer
có mối liên kết ion mạnh hơn các lực phá v
. Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do
nhiệt đ . Enzyme Taq
polymerase bổ sung các dNTP từ 5’ 3’.

III. Tạo dòng (gắn) đoạn DNA/gen vào vector
1. Enzyme hạn chế
Việc phát hiện ra các enzyme hạn chế (restriction enzyme) của vi
khuẩn cắt DNA ở những trình tự đặc trưng, đã giúp cho việc thao tác gen dễ
dàng hơn, vì nó có thể giảm chiều dài của các phân tử DNA thành một tập
hợp bao gồm các đoạn ngắn hơn.
Các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để
ngăn cản DNA ngoại lai (của bacteriophage) tiếp quản bộ máy tổng hợp
Gen đích
DNA khuôn mẫu
Khuếch đại theo hàm mũ
Chu kỳ 35
2
2
= 4 2
3
= 8 2
4
= 16 2
36
= 68 tỷ bản sao
bản sao bản sao bản sao
Nhập môn Công nghệ sinh học
37

protein của tế bào. DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của
enzyme hạn chế, nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa
(methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không thể bị
nhận biết bởi các enzyme hạn chế.
Mỗi enzyme hạn chế nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc trưng
chứa 4 hoặc 6 cặp nucleotide. Ví dụ: enzyme EcoRI chiết từ E. coli cắt trình
tự GAATTC, enzyme TaqI của Thermus aquaticus cắt trình tự TCGA (Hình
2.3). Hiện nay, có trên 900 enzyme hạn chế khác nhau đã được tinh sạch từ
hơn 230 chủng vi khuẩn. Các enzyme hạn chế cắt gãy các phân tử DNA sợi
đôi theo hai cách khác nhau như trình bày ở hình 2.3:

Pvu
II (
Proteus vulgaris
)
Eco
RI (
Escherichia coli
)


(A1) (A2)
Rs
AI (
Rhodopseudomonas sphaeroides
)
Taq
I (
Thermus aquaticus
)

(B1) (B2)
Hình 2.3. Các kiểu cắt và nhận biết trình tự nucleotide của enzyme hạn chế.
(A1): tạo ra đầu bằng và (A2): tạo ra đầu so le với trình tự 6 nucleotide. (B1): tạo
ra đầu bằng và (B2): tạo ra đầu so le với trình tự 4 nucleotide.

- Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng
(Hình 2.3, A1 và B1).
Nhập môn Công nghệ sinh học
38
- Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng
để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu dính) (Hình 2.3, A2 và B2).
Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị
trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ. Các đoạn DNA được
cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di
agarose gel để nghiên cứu. Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả
các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú
tương hợp nhau về cấu trúc. Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có
thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác. Sự tương tự
này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm
thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau. Chúng là những phân tử DNA
mạch vòng đóng-sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại
lai (foreign DNA) dùng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA.

2. Các vector được dùng để tạo dòng các đoạn DNA
in vitro
5’-PO
4
.

.
Trong thực tế, các đoạn DNA được gắn với nhau để tạo ra phân tử
DNA tái tổ hợp thường không phải là các đoạn ngẫu nhiên của DNA hệ gen,
mà thay vào đó là một trong các đoạn DNA mang một gen từ sinh vật
eukaryote hoặc vi khuẩn và một đoạn DNA khác thường là một phân tử
vector (vector molecule) hoạt động như là một vật truyền để chuyển gen
quan tâm vào trong một vi khuẩn hoặc một tế bào eukaryote. Hai loại vector
được sử dụng phổ biến nhất là một loại có nguồn gốc từ các plasmid của vi
Nhập môn Công nghệ sinh học
39
khuẩn và một loại khác có nguồn gốc virus xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn
(bacteriophage, viết tắt là phage).

2.1. Plasmid vector
1-
.
đặc đ
.
đư
i) hay multiple cloning sites (vùng
3-
:
- . 2.600 bp, mang gen
Amp
r
và gen lacZ’ lacZ’
.
N có ưu điểm k
lacZ’
.

- . 3.000 bp, mang gen
Amp
r
, gen lacZ
.
- .
2.6).
Nhập môn Công nghệ sinh học
40





2.4. Plasmid vector pUC19. Vùng tạo dòng (từ 396-447) được gắn vào gen
lacZ’, nhưng không can thiệp vào chức năng của gen.




2.5. Plasmid vector pGEM -T Easy. Loại vector này đã được mở sẵn ở
vùng tạo dòng trên gen lacZ mang hai đầu T, thích hợp cho việc gắn các sản phẩm
PCR do chúng có mang hai đầu A.

AGTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCATAATCATGGTCAT

EcoRI SacI KpnI BamHI XbaI HincII PstI SphI HindIII
SmaI
XmaI
AccI

SalI
1
lacZ’ ThrIleMetThr(Met)
400 420 440 460
Nhập môn Công nghệ sinh học
41










2.6. Plasmid vector pBluescript II SK (+/-). Vector này mang vùng tạo
dòng (multiple cloning sites-MCS) ở vị trí từ 598-826 trên gen lacZ’, và các vị trí
gắn primer khác nhau dùng cho phân tích trình tự đoạn DNA ngoại lai.

, DNA của plasmid được
in vitro
- (
của plasmid (ligation).
TTGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTCGAC…

…GGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCCACCGCGGTGGAGCTC…





…CAGCTTTTGTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATTGCGCGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCC
M13-20 primer binding site T7 primer binding site KS primer binding site…

…KS primer binding site… SK primer binding site

T3 primer binding site M13 reverse primer binding site
BssHII T7 Promoter KpnI DraII XhoI SalI
ApaI
EcoO1091
ClaI HindIII EcoRV EcoRI PstI SmaI BamHI SpeI XbaI EagI BstXI SacII SacI
Bsp1061 NotI
T3 Promoter BssHII β-gal α-fragment